KR20060136481A - 핵산 탐지 시스템 - Google Patents

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정재안
최영호
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액세스 바이오 인코포레이티드
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Abstract

본 발명은 5' 및 3' 말단부에 다른 헵텐으로 식별화된 프라이머 및 선택적으로 핵산 착물을 형성하기 위해 헵텐으로 식별화된 dNTP를 포함하는 핵산 증폭 믹스를 포함하는 컨테이너; 특이적 결합 파트너와 핵산 착물의 결합에 적합한 시약 조건을 포함하는 저장소 영역을 포함하는 측방 유동 검사 장치; 리포터 염료 또는 다른 헵텐과 연결 또는 접합되며, 핵산 착물에 대해 특이적인 결합 파트너를 포함하는 염료 영역; 및 핵산 착물의 다른 양태에 특이적인 다른 특이적 결합 파트너를 포함하는 검사 영역을 포함하는 표적 핵산의 탐지를 위한 시스템에 관한 것이다.
핵산 탐지 시스템, 측방 유동 검사 장치

Description

핵산 탐지 시스템{Nucleic acid detection system}
본 발명은 측방 유동 핵산 탐지 시스템을 사용하는 핵산 분자의 고민감성 탐지의 분야에 관한 것이다.
예방 의학의 발전은 군인들이 열대 또는 아열대 지역에 배치되었을 때 모기 매개 뎅기열과 같은 질병으로부터 현재의 군인들을 보호하는 방향으로 나아가고 있다. 야전에서 취할 수 있는 예방 조치에도 불구하고, 일부 군인들은 여전히 뎅기열 또는 더욱 심각한 뎅기 바이러스성 출혈열/뎅기 쇼크 증후군(DHF/DSS)에 감염되고 있다. 질병의 빠른 현장 단계 탐지는 적절한 치료와 질병의 추가 발생의 예방에 중요하다.
플라비바이러스 과는 황열, 뎅기열, 서나일열 및 일본 뇌염을 일으키는 바이러스를 포함하는 거의 70 종의 바이러스를 포함한다. 세계 여행의 증가 때문에, 이런 바이러스의 출현은 더욱 빈번히 열대 지역 바깥에서 발생해왔다. 미국 대륙에서, 세인트 루이스 뇌염 바이러스의 출현과 서나일 바이러스의 출현은 뉴욕에서 시작되어 미국 동부 해안 전역으로 확장되었다. 또한, 두 개의 모기 병원 매개 곤충인 이집트숲모기(Aedes aegypti) 및 흰줄숲모기(Aedes albopictus)는 미국에 존재하고 특정한 상황하에서, 각 곤충은 뎅기 바이러스를 전염시킬 수 있다. CDC에 따 르면, 이런 타입의 전염은 1980, 1986 및 1995년에 남 텍사스에서 탐지되었고 북 멕시코에서의 뎅기 유행병과 관련이 있었다.
뎅기열과 DHF/DSS는 인간의 가장 중요한 절지동물 매개 바이러스 질병으로 떠오르고 있다(Gubler and Clark, Emerg Infect Dis. 1995 Apr-Jun; 1(2):55-7). 4가지 뎅기 바이러스 형태(DEN-1, DEN-2, DEN-3 및 DEN-4)가 있고, 각각은 인간에게 질병을 일으킬 수 있다. 4가지 뎅기 바이러스 혈청형의 보존딘 3'-비암호화 서열은 세계의 다른 지역으로부터의 뎅기 바이러스들을 정량적으로 동정하기 위해서 (2002-2003부터 MIDRP STO A/L에 의해 지원된) 택맨계 RT-PCR을 개발하는데 성공적으로 사용되었다.
중합효소 연쇄반응(PCR)은 정확한 병원균 정보를 제공하나, 엄격한 샘플 준비, 제한된 저장 수명의 복합 반응 성분, 정밀한 온도 제어기, 정교한 하드웨어, 복잡한 탐지 방법 및 훈련된 사람이 필요하며, 이 모든 것은 야전 또는 생화학 공격과 같은 경우와 같은 "실시간" 상태에서 확보하기 어렵다.
이것은 실험적 진단에 적합하나, 생물학적 감염의 특성과 존재의 빠른 평가가 그 충격을 최소화하는데 중요한 "실시간" 야전 상태에서는 용도가 제한적이다. 단백질 탐지 방법으로 사용된 크로마토그래피 측방 평가 원리는 DNA 탐지 시스템으로 개발될 수 있다.
대부분의 탐지 시스템에서 중요한 링크는 비 중합효소 연쇄반응 핵산 기초 방법을 통해 생물학적 병원체의 존재로부터 특정 표적 서열에 반응하는 특징적이고, 탐지가능한 신호를 유도하는 것이다.
본 발명은 크로마토그래피 측방 유동 분석법과 함께 유로퓸 캡슐화 미세입자 및/또는 전기전도도와 같은 신호 증폭 시스템에 관한 것이다. 이 시스템은 통상적인 면역크로마토그래피 분석법의 모든 장점: 1) 원 스텝 2) 야전 가용가능 3) 안정한 시약 사용 4) 특별한 저장 장비 필요 없음 5) 빠른 결과를 가진 개량된 핵산 탐지 시스템이다. 증폭 신호는 정량적 결과 또는 정성적 결과를 알려 주는 소형 휴대용 리더기로 측정된다.
본 발명은 혈청형 특이적 표적 핵산 탐지용 형광 핵산 시약 키트의 대규모 생산에 관한 것이다. 본 발명은 민감하고, 특이적이며 안정한 동결건조 키트 성분에 관한 것이다. 뎅기 바이러스 또는 뎅기 바이러스 cDNA를 포함하는 바이러스와 같은 배양된 병원체의 다양한 농도가 탐지될 수 있다.
한 실시예에서, 본 발명의 시스템은 유전자 증폭을 위한 즉시 사용가능한 동결건조 시약 패드를 사용한다. 반응 기질은 버퍼, dNPT's, RNAase 억제제, 역전사효소, 뎅기 바이러스 혈청형 특이적 프라이머(DEN-1, -2, -3, -4)와 같은 식별화된 특이적 프라이머, 저급 프라이머, 바이오틴 dUPT, 태크 폴리머라제, 내부 기준 mRNA, 및 기준 mRNA 특이적 프라이머를 포함할 수 있다. 바이오틴 dUTP는 측방 유동 분석법을 사용하여 탐지하고 지시 신호를 증폭하기 위해서 핵산 증폭 생산물을 식별화하는데 첨가된다. 형광 프라이머는 이중 가닥 PCR 생산물(Nazarenko et al., Nucleic Acid Res. 2002 May 1;30(9):e37) 속에 혼합될 때 이들의 형광 강도를 증가시키고 뎅기 혈청형을 동정하기 위해서 PCR 생산물을 측방 유동 면역크로마토그래피 분석법에 적용하도록 되어 있다.
본 발명의 한 바람직한 시스템에서, 시간 분해 형광 기술, 바람직하게는 항-헵텐 항체와 결합된 유로퓸 삽입 미세 입자들을 기초로 한 시스템 및 신호 탐지를 위한 시간 분해 공초점 스캐닝 장치가 사용된다. 이런 특징이 분석 장치에 추가 민감도를 제공한다. 이런 높은 민감한 크로마토그래피 측방 유동 신호 증폭 시스템은 형광 탐지 시스템보다 적은 임계 사이클 번호(Ct)를 필요로 한다. 본 발명의 PCT 생산물 탐지 시스템은 빠르며(<30분), 한 단계 형식이고 안정하다(1년 이상 동안 <30℃에서 저장). 이 분석 장치는 작동이 쉽고, 저렴하고, 휴대용이며, 열 안정 시약을 사용하고 특별한 저장 조건을 갖지 않는다. 이런 특징은 미숙련자에 의해 실시간 상황에서 이 분석 장치를 빠르고 쉽고, 즉시 사용가능한 RT-PCR 키트로 만든다.
본 발명의 탐지 시스템은 일본 뇌염 바이러스, 황열 바이러스, 서나일 바이러스, 천연두 등을 포함하는 플라비바이러스를 포함하는 군사적으로 중요한 바이러스와 같은 병원체들을 포함하나 이에 한정되지 않는 임의의 유기체를 탐지하는데 사용될 수 있다. 다른 병원체들은 탄저균과 같은 박테리아를 포함한다.
본 발명은 표적 핵산 탐지의 유로퓸 기초 및/또는 전기전도도 기초 방법을 사용하여 비 유전자 증폭을 기초로 한 표적 핵산 기초 탐지에 관한 것이다.
본 발명의 핵산 기초 탐지 시스템은 엄격한 샘플 준비, 제한된 저장 수명의 복합 반응 성분, 정밀한 온도 제어, 정교한 하드웨어, 복잡한 탐지 방법 또는 훈련된 사람 없이 생물학적 병원체로부터의 저 농도의 특이적 게놈 DNA 서열로부터 신호를 증폭시킨다. 또한 이 방법은 독특하고, 특이적이며, 단순하며, 증폭 시스템은 야전-배치용 탐지 모듈에서 쉽게 작동된다.
본 발명의 특정한 예에서, 본 발명은 뎅기 3'-비 암호화 지역을 기초로 한 분석 시스템의 실시간 역전사효소 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR) 기술을 즉시 사용가능한 뎅기 바이러스 탐지 및 진단 시스템에 사용하는 것이다. 측방 유동 면역크로마토그래피 분석법을 사용하는 야전 배치용이며 사용가 친화적인 진단 장치는 실시간 형광 증폭기(thermal cycler)에 의해 및 없이 나타내어진다. 본 발명은 실시간 PCR 및/또는 통상적인 PCR의 이중 사용이 가능하다.
본 발명은 RT 반응과 공동으로 혈청형 특이 정보의 상세한 분석 결과에 관한 것이다. 다중 PCR 반응은 단일 튜브(도 4)에서 수행될 수 있다. RT 반응과 PCR 반응을 위한 모든 반응 성분들은 적절한 제제를 가진 기질에서 동결건조된다. 바이오틴 dUTP 또는 식별화된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 형광 식별화된 비콘(beacon) 프라이머는 PCR 생산물을 식별화하고 실시간 형광 증폭기 또는 측방 유동 탐지 키트를 사용하는데 첨가된다. 뎅기 바이러스의 4개의 혈청형은 단일 PCR 반응에서 동정될 수 있다. 이 반응 키트는 1년 이상 실온에서 저장할 수 있다.
샘플에서 프로브와 표적 핵산의 결합이 본 발명의 측방 유도 시스템을 사용하여 분석될 수 있는 한 형광, 화학발광, 효소 또는 임의의 다른 염료 기초 시스템을 포함하는 임의의 적절한 탐지 시스템이 사용될 수 있다는 것을 알아야 한다. 이런 염료 시스템은 플루오레세인계 레이블을 가진 분자 비콘 타입 시스템을 포함할 수 있고 또는 콜로이드성 금 결합 아비딘을 가진 바이오틴 레이블 또는 스트렙타비딘 파트너 또는 유로퓸과 같은 란탄족 원소와 같은 임의의 다른 탐지가능한 결합성 화합물을 포함할 수 있다. 다른 형태의 탐지 레이블과 방법은 본 발명의 범위 내에 있다.
본 발명은 자가 수행 장치에 관한 것이다. 이 빠른 핵산 탐지 시스템은 샘플 첨가 후 검사 결과를 만들기 위해 정확한 양으로 모든 시약과 성분들을 함유한다. 또한 본 시스템은 프로브 올리고뉴클레오티드 조성물을 기초로 한 뉴클레오티드 표적 서열 동정과 정확하게 일치하도록 하기 위해 붙박이 가열 패드를 가질 수 있다.
샘플에서 생물학적 병원체의 표적 DNA는 유로퓸 입자-식별화 올리코뉴클레오티드, 라이트 어드레세블 다이렉트 일렉트릭 리드아웃(LADER) 또는 전기전도도를 가진 유로퓸 입자-식별화 펩타이드 핵산(PANs)과 반응할 수 있다. 측방 유동 분석 시스템과 공동으로 사용하는 이 유로퓸 식별화 올리고머 및 전기전도도 탐지 방법은 콜로이드 금 미세 입자와 비교하여 10 내지 1,000 배의 민감도를 증가시킬 수 있다(도 5). 이들 두 개의 신호 증폭 시스템은 103 표적/100㎕(=10 aM)보다 높이 민감도를 증가시킬 수 있다. 또한, 이런 탐지 시스템들과 크로마토그래피 측방 유동 분석법을 결합하면 평형 플레이트 분석법과 비교하여 10배 이상의 민감도를 증가시킬 수 있다(Hampe etal. Anal Biochem 2001; 176-187).
한 양태에서, 본 발명은 저장소 영역, 염료 영역 및 검사 영역을 포함하는 표적 핵산 탐지용 측방 유동 장치에 관한 것이고, 여기서 저장소 영역은 헵텐으로 식별화된 프라이머 및/또는 헵텐으로 식별화된 dNTP를 포함하는 즉시 사용가능한 핵산 증폭 믹스를 포함하며; 염료 영역은 리포터 염료와 연결된 제 1 형태의 헵텐에 대한 특이적 결합 파트너를 포함하고; 검사 영역은 제 2 형태의 헵텐에 대한 특이적 결합 파트너를 포함한다. 상기 장치는 하나 이상의 제 2 형태의 헵텐을 가진 저장소를 포함할 수 있고 여기서 여러 형태의 표적 핵산이 탐지된다. 제 1 형태의 헵텐은 바이오틴일 수 있고, 이의 특이적 결합 파트너는 만일 단일 형태의 표적 핵산이 탐지되는 경우 스트렙타비딘 또는 플루오로포어 또는 올리고펩타이드에 특이적인 항체일 수 있다. 표적 핵산의 소스는 병원체일 수 있고, 뎅기 바이러스일 수 있고 뎅기 바이러스 입자의 혈청형은 다른 데 2 형태의 헵텐을 사용하여 탐지될 수 있다. 또한, 프라이머는 분자 비콘 형태일 수 있다.
본 발명은 샘플에서 표적 핵산의 존재를 분석하는 방법에 관한 것으로, 샘플을 상기한 장치의 저장소 영역과 접촉시키는 단계를 포함하며, 만일 표적 핵산이 샘플에 존재하면, 표적 핵산은 증폭되고 적어도 두 가지 형태의 헵텐으로 식별화되며 제 1 헵텐이 리포터 염료와 연결된 특이적 결합 파트너와 결합된 염료 영역으로 운반되며 모세관 작용에 의해 검사 영역을 통해 더 운반되며 검사 영역상의 제 2 형태의 헵텐-특이적 결합 파트너와 결합되고, 표적 핵산의 탐지는 표적 핵산이 샘플에 존재한다는 것을 나타낸다. 상기 저장소는 하나 이상의 다른 제 2 형태의 헵텐을 포함할 수 있으며 여기서 여러 형태의 표적 핵산이 탐지된다. 제 1 형태의 헵텐은 바이오틴일 수 있고, 이의 특이적 결합 파트너는 스트렙타비딘일 수 있으며 리포터 염료는 유로퓸 또는 금일 수 있다. 제 2 형태의 헵텐은 바이오틴, 플루오로포어, 또는 올리고펩타이드일 수 있고, 이의 특이적 결합 파트너는 만일 단일 형태의 표적 핵산이 탐지되는 경우 스트렙타비딘 또는 플루오로포어 또는 올리고펩타이드에 특이적인 항체일 수 있다. 제 2 형태의 헵텐은 여러 형태의 플루오로포어 또는 여러 형태의 올리고펩타이드일 수 있고 이의 특이적 결합 파트너는 각 형태의 플루오로포어 또는 올리고펩타이드에 특이적인 항체일 수 있다. 표적 핵산의 소스는 병원체일 수 있다.
본 발명은 샘플에서 표적 핵산의 존재를 분석하는 방법에 관한 것으로, 샘플을 상기한 장치의 저장소 영역과 접촉시키는 단계를 포함하며, 만일 표적 핵산이 샘플에 존재하면, 표적 핵산은 증폭되고 적어도 두 가지 형태의 헵텐으로 식별화되며 제 1 헵텐이 리포터 염료와 연결된 특이적 결합 파트너와 결합된 염료 영역으로 운반되며 모세관 작용에 의해 검사 영역을 통해 더 운반되며 검사 영역상의 제 2 형태의 헵텐-특이적 결합 파트너와 결합되고, 표적 핵산의 탐지는 표적 핵산이 샘플에 존재한다는 것을 나타내며, 여기서 탐지는 라이트 어드레서블 다이렉트 일렉트릭 리드아웃 또는 리포터 염료의 탐지에 의한 것이다. 검사 영역에서 잡종화는 측방 유동 장치의 붙박이 가열 패드에 의해 제어될 수 있다. 헵텐은 바이오틴일 수 있고, 이의 특이적 결합 파트너는 스트렙타비딘이고 리포터 염료는 유로퓸 또는 금일 수 있다.
본 발명은 샘플에서 표적 핵산의 존재를 분석하는 방법에 관한 것으로, 샘플을 상기한 장치의 저장소 영역과 접촉시키는 단계를 포함하며, 만일 표적 핵산이 샘플에 존재하면, 표적 핵산은 모세관 작용에 의해 검사 영역을 통해 운반되며 유로퓸으로 식별화된 표적 특이적 올리고뉴클레오티와 결합된다. 또한, 표적 핵산은 검사 영역에 운반되기 전에 증폭될 수 있다. 전기전도도와 유로퓸 탐지가 사용되는 민감한 분석법을 사용한다면 증폭은 필수적이지 않다.
본 발명에서, 본 출원에서, "a" 및 "an"은 하나 및 여러 대상을 나타내는데 사용된다.
본 명세서에 사용된, "여러 형태의 표적 핵산" 이란 용어는 여러 아이소폼 또는 4개의 혈형청을 가질 수 있는 뎅기 바이러스와 같은 표적 핵산의 여러 혈청형을 의미한다.
본 명세서에 사용된 프로브 세팅에 사용되는 "핵산" 또는 "올리고뉴클레오티드"란 용어는 임의의 한 줄의 뉴클레오티드를 의미한다. 따라서, DNA, RNA 또는 PNA가 포함된다.
본 명세서에 사용된 "핵산 증폭"이란 용어는 중합효소 연쇄반응(PCR), 리가아제 연쇄반응(LCR), Qβ레플리카제, 표준치환분석법(SDA), 핵산 서열-기초 증폭(NASBA) 또는 캐스케이드 회전 사이클 증폭(CRCA)을 의미한다.
본 명세서에 사용된 대로, 핵산 증폭의 내용에서 "즉시 사용가능한" 이란 용어는 표적 핵산을 포함하는 샘플과 접촉하자마자 표적 핵산 증폭을 수행하기 위해 필요한 시약과 효소의 전부를 의미한다.
한 양태에서, 본 발명은 핵산 탐지를 위해 신호를 일으키는 것이다. 본 방법은 신호를 민감하게 측정하기 위해 여러 레이블 또는 헵텐을 사용하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 양태에서, 즉시 사용가능한 핵산 증폭 프리-믹스는 컨테이너에 포함될 수 있다. 샘플은 프리-믹스에 첨가될 수 있고 핵산 증폭이 수행될 수 있다. 프리-믹스는 5' 및/또는 3' 말단에서 다르게 식별화된 프라이머를 포함하는 핵산 증폭을 위한 시약들을 함유할 수 있다. 실시간 PCR 사용의 경우, 단일 프라이머의 5' 및 3' 말단은 분자 비콘 스타일에서 다르게 식별화될 수 있으며 한 말단에는 플루오로포어이고 다른 말단에는 소광제이다. 이런 레이블의 각각은 헵텐으로 생각할 수 있는데, 이는 이런 레이블에 대한 항체들은 이용가능하며 발생할 수 있기 때문이다. 또한, 증폭 생산물의 바디는 바이오틴과 같은 헵텐 식별화 dNTP로 선택적으로 식별화될 수 있다. 프리-믹스는 건조되거나 동결 건조될 수 잇으며 프리-믹스는 등온 증폭 PCR 및/또는 실시간 PCR에 의한 증폭에 적합할 수 있다.
측방 유동 분석의 경우에, 염료 영역으로 유동할 수 있는 표적 핵산(주로 절단됨)을 함유하는 헵텐화되거나 식별화된 증폭 핵산 도는 비 증폭 게놈 DNA는 저장소 영역에서 측방 유동 분석 장치에서 접촉되며, 이 저장소 영역은 잡종화 상태 또는 항체/항원 결합 상태 또는 다른 특이적 결합 쌍 상태에 적합한 시약들을 함유한다.
핵산은 핵산의 표적 핵산 착물에 대한 특이적 결합 파트너와 핵산에 부착된 헵텐을 함유하는 염료 영역으로 이동할 수 있다. 따라서, 특이적 결합 파트너는 표적-특이적 올리고뉴클레오티드, 헵텐들의 하나에 대한 항체, 바이오틴에 고 친화력으로 결합하는 스트렙타비딘과 같은 고 친화력 리간드일 수 있다. 특이적 결합 파트너는 표적 핵산-특이적 염료, 바람직하게는 고 민감성 염료와 연결 또는 결합될 수 있다. 선택적으로, 특이적 결합 파트너는 다른 레이블과 더욱 헵텐화될 수 있다. 또한, 올리고뉴클레오티드 특이적 결합 파트너의 경우에, 레이블은 레이블이 임의의 수단에 의해 탐지될 수 있는 한, 유로퓸, 플루오로포어, FITC, 바이오틴, 올리고펩타이드 등일 수 있다.
착물이 검사 영역으로 이동함에 따라, 검사 영역은 표적 핵산에 특이적인 올리고뉴클레오티드와 같은 표적 핵산 착물에서 다른 헵텐들의 하나에 대한 다른 특이적 결합 파트너로 고정될 수 있고, 이와 동시에 착물과 검사 영역 상의 다른 특이적 결합 파트너의 결합은 표적 핵산의 존재를 나타낸다. 염료 영역에 사용되며 검사 영역에서 고정된 올리고뉴클레오티드는 펩타이드 핵산 또는 RNA일 수 있다. 검사 영역 상에서 고정된 DNA 올리고뉴클레오티드의 경우에, 표적 핵산 착물과 검사 영역 상의 올리고뉴클레오티드와의 잡종화는 고 민감성 LADER 분석에 의해 측정될 수 있는 전기전도도 신호를 발생시킨다. 또한 유로퓸 식별화된 올리고뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드 또는 검사 영역 상에 고정된 PNA으로 잡종화될 때, LADER 분석법과 유로퓸 분석법의 민감성이 결합된 고 민감성 분석법이 만들어진다. 예를 들어, 한 쪽에 유로퓸 식별화된 부분이 결합될 때 유로퓸은 강한 신호를 만들어낼 것이다. 만일 유로퓸 식별화된 영역이 고정 핵산에 결합되지 않고, 핵산의 비 유로퓸 식별화된 부분이 결합되는 경우, LADER 전도도는 대안적인 분석법으로 사용할 수 있다.
본 발명의 다른 양태에서, 검사 영역은 표적 핵산을 더욱 차별화하고 특이적이게 하기 위해 표적 특이적 올리고뉴클레오티드 및/또는 헵텐들의 하나를 위한 적어도 하나의 다른 특이적 결합 파트너로 고정될 수 있다. 따라서, 한 구체적인 실시예에서, 5' 레이블 또는 3' 레이블에 특이적인 것과 같은 표적 핵산 상의 헵텐들의 하나에 대한 특이적 결합 파트너는 표적 핵산의 탐지가 더 큰 민감도로 이루어지도록 하기 위해서 고정될 수 있다.
상세한 설명은 PCR의 핵산 증폭 방법을 사용하여 뎅기 바이러스를 탐지하는 것을 예로 들고 있으나, 임의의 병원체는 PCR, LCR, NASBA 등과 같은 임의의 화학적으로 구동된 핵산 증폭 방법을 사용하여 탐지할 수 있다는 것을 알아야 한다.
역전사효소 중합효소 연쇄반응(RT- PCR )
역전사효소 중합효소 연쇄반응(RT-PCR)은 정확한 바이러스성 병원체 동정을 제공하나, 현재 통상적으로 사용되는 것과 같이, 엄격한 샘플 준비, 제한된 저장 수명의 복합 반응 성분, 정밀한 온도 제어, 정교한 하드웨어, 복잡한 탐지 방법 또는 훈련된 사람을 필요로 한다. 이 반응은 실험용 진단에 적합하나, "실시간" 야전 상태에서는 용도가 제한적이다.
본 발명의 시스템은 뎅기 바이러스 탐지를 포함하는 지네릭(generic) 및 혈청형-특이적 미생물 탐지를 위한 RT-PCR 시약 키트의 생산을 최적화하고 생산을 대형화한다. 특별한 동결 건조 프로토콜은 단일 튜브에서 RT 반응 다중 PCT 반응을 위한 모든 성분을 함유하며 건조되고 즉시 사용가능한 뎅기 분석 키트를 만들도록 개발되었다. 이런 키트는 형광 PCR 증폭기와 같은 일반적인 증폭기 또는 실시간 PCR 증폭기에서 사용될 수 있다.
바이러스성 RNA의 추출
바이러스 RNAs는 QiAamp RNA 핸드북(Qiagen Inc. Valencia, CA 91355)에 따른 뎅기-감염 혈청과 같이, 바이러스 감염 혈청의 바이러스 현탁액을 통해 추출된다.
분자 비콘 혈청형 특이적 프라이머의 기획 합성
분자 비콘은 형광 리포터와 소광제 분자와 같은 스템 앤 루프 구조(stem and loop structure)를 형성하고 내부 리포터 신호를 갖는 "헤어핀" 올리고뉴클레오티드이다. 이들이 헤어핀 구조를 형성할 때, 형광 리포터와 소광제 분자들은 서로 근접하게 되어 형광이 억제된다. 이들이 상보적 표적 서열과 결합하는 경우, 이들의 형광을 일으키는 통상적인 전이를 일으킨다(Bonnet et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1999 May 25; 96(11):6171-6). 헤어핀 분자 비콘은 형광 PCR 프라이머 또는 형광 프로브로 사용될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 프라이머가 플루오로포어를 가진 헤어핀 구조를 형성하기 위해 변형될 때, 이 프라이머는 PCR 생산물의 형성시 8배까지 증가하는 프라이머의 낮은 최초 형광을 제공할 수 있다(Nazarenko et al., Nucleic Acids Res. 2002 May 1;30(9):e37). 헤어핀 올리고뉴클레오티드는 선형 프라이머 정도로 효과적이며 프라이머-다이머와 미스프리밍(mispriming)을 막음으로 PCR에 대한 추가 특이성을 제공한다.
이런 종래의 연구를 기초로 하여, 상부 프라이머는 헤어핀 구조를 형성하기 위해 변형될 수 있다(도 1). 헤어핀 프라이머를 제조하기 위해서, 프라이머의 3' 말단에 상보적인 5' 꼬리는 연장된다. 5' 꼬리는 용융점 이하의 온도에서 뭉툭한 말단 헤어핀을 형성한다. 리포터 플루오레센(6-FAMTM(520nm), HEXTM(556nm), Texas Red®(603nm), Boddipsy®(640nm) 등)은 3' 말단부로부터 제 3 또는 제 4 베이스(T)로 식별화된다. 소광제 플루오레센(520nm부터 700nm까지 범위의 Iowa blackTM 소광 범위)은 3' 말단에 대한 상보적 서열인 연장된 5' 말단으로 식별화된다. 모든 리포터 염료와 소광제들은 인티그레이티드 DNA 테크놀러지(Coralville, IA)와 몰레큘러 프로브(Eugene, OR)로부터 구입할 수 있다. 예상적 제 2 구조와 형광 식별화 위치는 도 2에 나타내어진다.
본 발명의 다른 양태에서, 플루오레센은 측방 유동 빠른 원 스텝 동정 검사 키트를 사용하여 혈청형 특이적 PCR 생산물 동정하기 위해서 항-헵텐 항체와 반응하는 헵텐 항원으로 작용한다.
안티 -센스 프라이머 및 RT 프라이머의 기획 합성
뎅기 1-3의 3-비 암호화 서열 중에서 우수한 상동관계를 가진 지네릭 안티-센스 프라이머 DV-L1(뉴클레오티드 잔류물 368-388)은 이런 바이러스들을 위한 RT 프라이머로 지정된다. 비록 뎅기 4 게놈은 DV-L1 서열과 현저한 상동 관계를 공유할지라도, 도 3에 도시된 대로, DV-L1 프라이머 내에 5개의 뉴클레오티드 불일치가 있다. 따라서, 개개의 안티-센스 프라이머 DV-L2는 뎅기 4 바이러스 탐지를 위한 RT 반응에 특이적으로 사용된다. 이들 두 개의 안티-센스 프라이머(DV-L1 및 DV-L2)는 전부 4개의 뎅기 바이러스 혈청형에 대해 RNA를 전사하도록 설정된 지네릭 RT 프라이머로 사용된다(Houng et a., 2001 J. Virol. Meth. 95:24-35).
단일 튜브에서 다중 RT- PCR 반응
RT 반응과 다중 PCR 반응은 단일 튜브에서 수행될 수 있다(도 4). RT 반응과 PCR 반응의 모든 반응 성분들은 적절한 제제를 가진 기질에서 동결건조된다. 바이오틴 dUTP와 식별화된 올리고뉴클레오티드 프라이머 및 형광 식별화된 비콘 프라이머들은 PCR 생산물을 식별화하고 실시간 형광 증폭기 또는 측방 유동 탐지 키트를 사용하여 탐지하기 위해 첨가된다. 뎅기 바이러스의 4개의 혈청형은 단일 PCR 반응에서 동정될 수 있다. 이 반응 키트는 1년 이상 동안 실온에서 저장할 수 있다.
PCR 결과 동정
상업적으로 이용가능한 실시간 형광 PCR 시스템은 본 발명의 즉시 사용할 수 있는 키트에 사용될 수 있다. 형광 탐지 시스템에 따라, 즉시 사용가능한 키트는 주문 생산을 위해 적용될 수 있다. 또한, 본 키트는 실시간 증폭기 없이 비 이상적인 실험 조건하에서 사용될 수 있다.
측방 유동 면역크로마토그래피 분석 방법은 증폭된 PCR 생산물을 동정하기 위한 다른 시스템이다. 본 방법은 독특하고, 특이적이며 야전 배치용 시스템에서 쉽게 작동한다. 본 시스템은 실질적으로 모든 생물학적 병원체와 바이러스에 작용하며 미국이 뎅기 풍토성 지역에 배치되는 경우와 같은 야전 또는 "실시간" 상태에서 확고한 결과를 제공한다.
비 PCR 측방 유동 핵산 탐지
빠르고, 자가 수행 핵산 탐지 시스템의 구성은 도 23에 도시되며, 샘플 첨가 후에 검사 결과를 얻기 위해 정확한 양으로 모든 시약과 성분들을 함유한다. 또한 본 시스템은 프로브 올리고뉴클레오티드 조성물을 기초로 한 뉴클레오티드 표적 서열 동정과 정확하게 일치하도록 하기 위해 붙박이 가열 패드를 가질 수 있다. 샘플은 샘플의 pH를 최적화하기 위한 버퍼, 샘플에서 모든 성분들을 현탁하기 위한 세제, 장치를 통해 적절한 유동을 발생시키기 위한 다공성 필터를 함유하는 저장소 패드를 먼저 통과한다. 상기 샘플은 모세관 작용에 의해 뒤이어서 샘플에서 생물학적 병원체의 표적 DNA가 유로퓸 입자-식별화된 올리고뉴클레오티드 또는 펩타이드 핵산(PNAs)과 반응하는 염료 영역으로 흐른다. 이렇게 형성된 반응 착물은 포획 올리고뉴클레오티드 도전성 검사 및 대조 영역에 삽입되는 곳인 전개막을 통해 이동한다. 최초의 유로퓸 식별화된 프로브 반응은 표적 뉴클레오티드 서열의 개시를 허용한다.
시간 분해 형광에 의한 측방 유동 분석법
초-민감성 시간 분해 형광(TRF) 염료는 측방 유동 분석 형식에 사용된다. 이 염료는 측방 유동 분석의 유익한 양태를 유지하면서 민감도를 향상시킨다. 나노크기의 TRF 염료는 β-다이케톤에 의해 포획된 30,000-2,000,000 유로퓸 분자를 함유하며, 공지된 란탄족 킬레이트의 최고 양자 수율의 하나를 가진다(Harma, Technology Review 126/2002, TEKES, National Technology Agency, Helsinki 2002). 이런 캡슐화는 염료의 형광 효과에 실질적으로 영향을 미치지 않는다. 통상적인 100 nm 크기의 유로퓸 입자의 경우에, 형광 수율은 약 3,000 분자의 플루오레센과 동일하다. 비교해보면, 피코빌리프로틴 B-PE(공지된 최고의 형광 물질)는 약 30 플루오레센 분자와 동일한 형광 수율을 가진다. 100 nm 입자는 피코빌리프로틴 B-PE의 지름의 열 배이고 부피/질량은 1000 배 더 크기 때문에, 세라딘 유로퓸 입자들은 몰 농도 기준으로, B-PE보다 100 배 이상 형광을 나타내나, 부피/질량 기준으로는 단지 10 % 형광을 나타낸다(Seradyn, Color-RichTM Dyed and Fluoro-MaxTM Fluorescent Microparticles Technical Bulletins 1999). TRF 염료 입자에 의한 측방 유동 분석법은 pg/ml 수준까지 탐지 민감도를 증가시킬 수 있는데, 이것은 임계 사이클 번호(Ct)가 10 사이클까지 감소할 수 있는 것을 의미한다. 이 특징은 추가 민감도를 제공한다.
본 시스템은 복잡하고 고가의 자동 장비가 필요 없는 단순하고 자가 수행인 원 스텝 방법을 필요로 한다. 본 발명의 자가 수행 분석 스트립을 함유하는 소형 플라스틱 조각의 예와 이의 검사 결과를 도 5에 나타내었다.
단일 샘플링과 추가 절차 단계가 없는 다중 검출대상 물질 탐지는 본 발명에 제공된 분석 시스템으로 가능하다. 다양한 항체-염료 결합체가 염료 패드 영역에 삽입되고 각 리포터 염료에 특이적인 항체는 막 상의 개별 지역에 각각 고정되는 경우에, 각 검사 라인은 각 특이적 뎅기 혈청형에 대한 뚜렷한 정보를 제공할 것디다(도 6).
야전 배치용 탐지 시스템
야전 배치용 탐지 시스템을 고려하고 있다. 스트립 판독기는 샘플의 존재를 탐지하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 시간 분해 란탄족 발광을 측정하기 위한 장치가 사용될 수 있고, 이 장치는 질소 레이저, 회절 격자 분광기, 전하 결합 장치(CCD) 및 시간 격자를 위한 기계적 절단기가 장착된다.
본 발명은 하기한 구체적인 실시예에 의해 범위가 한정되지 않는다. 또한 명세서에 기술된 것 이외에 본 발명의 다양한 변형물은 다음 설명과 첨부된 도면으로부터 당업자에게 명백할 것이다. 이런 변형물은 본 발명의 청구범위에 해당하는 것으로 생각된다. 아래 실시예들은 본 발명을 제한하려는 것이 아니고 단지 예시로서 제공된다.
본 발명은 상세한 설명과 단지 예시적이며 본 발명을 제한하지 않는 첨부된 도면에 의해 더욱 잘 이해될 것이다.
도 1a 및 1b는 변형된 혈청형-특이적 상부 프라이머; 및 프라이머를 사용하여 제조한 헤어핀 구조를 나타낸다.
도 2는 분자 비콘 뎅기 바이러스 혈청형 특이적 상부 프라이머의 구조를 나타낸다.
도 3은 PCT 안티-센스 프라이머 및 RT 반응 프라이머를 위한 하부 프라이머를 나타낸다.
도 4는 다중 PCR 증폭의 다이어그램을 나타낸다.
도 5a-5b는 본 발명의 분석 시스템을 나타낸다. 5a는 검사 전의 시스템의 검사 장치를 나타낸다. 장치는 적어도 두 개의 주요 부분인, 장치의 바닥 부분의 샘플 웰과 중간 부분의 결과 판독창을 가진다. 5b는 분석 후의 결과를 나타낸다. 두 개의 선은 양성을 나타내며 한 선은 음성을 나타낸다. 기준 라인은 내부 빌트인 기준으로 작용한다. 분석이 적절하게 수행된다면 나타나야 한다.
도 6은 다중 PCR 생산물 동정 분석법을 나타낸다.
도 7은 PCR 생산물 동정 장치의 그림을 나타낸다.
도 8은 측방 유동 장치의 구성을 나타낸다.
도 9는 5' 아미노 변형체 연결 형태 2 포워드 프라이머의 구조를 나타낸다.
도 10은 식별화된 PCR 생산물을 가진 면역크로마토그래피 PCR 생산물 동정 분석 장치의 구성을 나타낸다(스트립 형식).
도 11은 식별화된 PCR 생산물을 가진 면역크로마토그래피 PCR 생산물 동정 분석 장치의 구성을 나타낸다(디바이스 형식).
도 12는 5' 바이오티닐화된 포워드 프라이머의 구조를 나타낸다.
도 13은 5' 로다민 레드 식별화된 리버스 프라이머의 구조를 나타낸다.
도 14는 합성 올리고펩타이드 식별화된 리버스 프라이머의 구조를 나타낸다.
도 15는 스트립 검사를 위한 분석 절차를 나타낸다.
도 16은 디바이스 형식 분석을 위한 분석 절차를 나타낸다.
도 17은 뎅기 바이러스 혈청형 1 탐지를 위한 실시간 PCR과 빠른 PCR 생성물 분석 키트의 비교 결과를 나타낸다. 양 검사는 1.5mM MgCl2로 수행하였다. 라인 A: 4,340,000 복사물/검사, 라인 B: 868,000 복사물/검사, 라인 C: 173,600 복사물/검사, 라인 D: 34,720 복사물/검사, 라인 E: 6,944 복사물/검사, 라인 F: 1,388 복사물/검사, 라인 G: 277 복사물/검사, 라인 H: 55 복사물/검사, 라인 I: 주형 없음
도 18은 뎅기 바이러스 혈청형 2 탐지를 위한 실시간 PCR과 빠른 PCR 생성물 분석 키트의 비교 결과를 나타낸다. 라인 A: 3,720,000 복사물/검사, 라인 B: 1,240,000 복사물/검사, 라인 C: 413,000 복사물/검사, 라인 D: 138,000 복사물/검 사, 라인 E: 45,900 복사물/검사, 라인 F: 15,300 복사물/검사, 라인 G: 5,100 복사물/검사, 라인 H: 1,700 복사물/검사, 라인 I: 567 복사물/검사, 라인 J: 189 복사물/검사, 라인 K: 63 복사물/검사, 라인 L: 복사물/검사, 라인 M: 주형 없음
도 19는 뎅기 바이러스 혈청형 3 탐지를 위한 실시간 PCR과 빠른 PCR 생성물 분석 키트의 비교 결과를 나타낸다. 양 검사는 1.5mM MgCl2로 수행하였다. 라인 A: 5,090,000 복사물/검사, 라인 B: 1,018,000 복사물/검사, 라인 C: 203,600 복사물/검사, 라인 D: 40,720 복사물/검사, 라인 E: 8,144 복사물/검사, 라인 F: 1,628 복사물/검사, 라인 G: 325 복사물/검사, 라인 H: 65 복사물/검사, 라인 I: 주형 없음
도 20은 라이트 어드레서블 다이렉트 일렉트릭 리드아웃(LADER)의 원리를 나타낸다.
도 21은 판독 장치의 개략도와 EDDA 형식으로 CBT 칩을 위한 접촉 헤드의 확대도를 나타낸다.
도 22는 20개 뉴클레오티드 긴 캡쳐 프로브로 변형되고 잡종화 전과 후 자체가 페로세늄(FcAc) 레이블로 변형된 매칭 표적을 가진 Os-레이블이 공유결합된 전극의 전기화학적 행동을 나타낸다.
도 23은 전기전도 분석법을 사용하는 자가 수행 빠른 핵산 탐지 시스템의 구성을 나타낸다.
도 24는 시간 분해 형광 발광 및/또는 전도도 변화 탐지를 사용하는 생물학적 병원체 특이적 DNA의 탐지를 위한 분석 원리의 그림을 나타낸다.
도 25a - 25b는 가열 시스템을 위한 구성을 나타낸다.
도 26a 및 b는 가열 시스템을 위한 구성을 나타낸다.
도 27a 및 b는 가열 시스템을 위한 구성을 나타낸다.
도 28은 장치 커넥터를 위한 공간을 가진 검사 장치의 그림을 나타낸다.
도 29는 통합 DNA 샘플러인 유전자 현장 진단(GPOCT) 장치를 나타낸다.
도 30은 GPOCT 장치의 상세한 실시예를 나타낸다.
도 31은 GPOCT 장치의 상세한 실시예를 나타낸다.
이하는 양성 대조군을 위한 뎅기 바이러스 cDNA와 내부 대조군을 위한 토끼 글로빈 mRNA를 나타내는 계단식 절차이다. 증폭 PCR 생산물 동정 시스템의 전체 디자인을 기술한다.
실시예 1
분자 비콘 프라이머의 설계
비콘 디자이너 2(Bio-Rad) 프라이머와 프로브 설계 소프트웨어를 사용하여 분자 비콘 프라이머를 설계하였다.
이중 식별화된 분자 비콘 프라이머들의 제조
다양한 리포터 플루오레센(Oregon Green®(517nm), 6-FAMTM(520nm), HEXTM(556nm), TAMRATM(573nm), Texas Red®, Bodipsy®(640nm) 등)은 3' 말단으로부터 제 3 또는 제 4 베이스(T)로 식별화된다. 소광제 플루오레센(520nm부터 700nm 까지 범위의 Iowa blackTM 소광 범위)은 3' 말단에 대한 상보적 서열인 연장된 5' 말단으로 식별화된다. 모든 리포터 염료와 소광제들은 인티그레이티드 DNA 테크놀러지(Coralville, IA)와 몰레큘러 프로브(Eugene, OR)로부터 구입할 수 있다.
내부 품질 대조 시스템
즉시 사용가능한 키트는 1ng의 토끼 글로빈 mRNA와 내부 반응 대조군으로서 두 개의 각각이 글로빈 특이적 PCR 프라이머를 함유한다. 토끼 글로빈 mRNA의 PCR 생산물은 대조 지역에서 측방 유동 동정 키트에 의해 탐지된다. 이 대조 지역 강도는 반 정량적 결과에 대한 참조 값으로 사용될 수 있다.
즉시 사용가능한 RT- PCR 반응 키트
셀룰로오스, 유리 섬유, 폴리에스터, 또는 레이온 등과 같은 다양한 기질 수단을 평가하였다. 아래 나열된 제제화된 성분들은 동결건조기에서 일정한 진공하에서 건조하였다. 기질은 최적의 반응 재구성과 RT 반응에 대해 선택하였다.
제제화된 성분의 목록
RT-PCT 버퍼,
적절한 농도의 MgCl2
dNTP's
바이오틴 dUTP(바이오틴-16-dUTP 또는 바이오틴-21-dUTP)
RNAse 억제제
역전사효소
식별화된 뎅기 바이러스 혈청형 특이적 프라이머(형태 1, 2, 3, 4)
식별화된 하부 프라이머
토끼 글로빈 mRNA
두 개의 글로빈-특이적 PCR 프라이머
태크 중합효소
안정제(RNase/DNase 제거 BSA 및 과당 등)
이 단계의 주요 목적은 RT-PCR 반응하에서 모든 성분과 재구성과 함께 최적의 동결 건조 조건과 주요 성분 저장 조건을 찾는 것이다. 버퍼, 세제, 과당 및 폴리머와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 화학물질 및 단백질과 다른 생물학적 폴리머와 같은 생물학적 재료의 다양한 조합은 최고의 조건을 찾기 위해 시험하였다. 즉시 사용가능한 RT-PCR 키트는 iCycler IQTM(BioRad) 및 ABI 7700 실시간 형광 증폭기에 의해 검사하였다. MgCl2 농도는 성공적인 측방 유동 분석에 중요한 요소이다. MgCl2 농도의 바람직한 범위는 상기 소정량의 MgCl2 프라이머 디머로서 약 1.5mM보다 더 높지 않고 펄스 포티지브 결과를 보여준다. 바이오틴 dUTP의 첨가는 이의 더 뛰어난 포획 능력 또는 더 뛰어난 지시자 결합 능력 때문에 민감도를 증가시킨다(표 1). 기질 억제는 식별화되고 식별화되지 않은 비율을 제어하고 과량의 포획량과 지시자 량을 사용하여 극복하였다.
표 1은 식별화된 프라이머에 의한 증폭 PCR 결과와 식별화된 프라이머에 의한 증폭 PCR 결과 및 뎅기 바이러스 혈청형 2 탐지를 위한 바이오틴 dUTP 혼합 사 이의 비교 데이터를 나타낸다.
뎅기 바이러스 증폭 PCR 결과들 사이의 비교 데이터
복사물 수/검사 식별화된 프라이머 식별화된 프라이머 및 바이오틴 dUTP 혼합
1000/검사 ++ +++
200/검사 + ++
50/검사 +/- +
실시예 2
측방 유동 빠른 PCR 생산물 동정 검사 키트
검사의 구성
본 발명의 검사 키트는 자가 수행 장치로 설계되었다. 도 7에 도시된 측방 유동 빠른 PCR 생산물 동정 검사 키트는 샘플 첨가 후에 검사 결과를 발생시키기 위해서 저장소 패드에 정확한 양으로 모든 시약과 성분들을 함유한다. 분석 원리와 구성은 도 8에 기술된다. 샘플은 샘플의 pH를 최적화하기 위한 버퍼, 샘플에서 모든 성분들을 현탁하기 위한 세제, 식별화된 프라이머와 바이오틴화된 dUTP와 같은 미반응 기질을 분리하기 위한 세파로스 비드와 같은 분리 컬럼 재료 등 및 장치를 통해 적절한 유동을 발생시키기 위한 다공성 저장소를 포함하는 저장소 패드를 통해 먼저 통과한다. 상기 샘플은 모세관 작용에 의해 뒤이어서 샘플에서 생물학적 병원체의 표적 DNA가 유로퓸 입자-식별화된 올리고뉴클레오티드 또는 펩타이드 핵산(PNAs)과 반응하는 염료 영역으로 흐른다. 이렇게 형성된 반응 착물은 항-형광 염료 항체가 검사 및 대조 영역에 삽입된 전개막을 통해 이동한다.
검사는 최소의 훈련을 받은 사람에 의해 현장에서 수행될 수 있고 결과는 일회용 검사 카드에 한두 방울의 DNA 추출 샘플을 첨가한 후 10분 내에 얻을 수 있다. 식별화된 스트렙타비딘과 표적 DNA 착물은 검사 및 대조 영역에서 포획된다. 검사 영역은 각 혈청형 특이적 PCR 생산물을 구별하고 이 영역은 유로퓸이 신호 탐지 레이블로 사용될 때 시간 분해 형광 스캐닝 장치가 장착된 판독기에 의해 탐지될 수 있다. 각각의 대조 영역은 내부 품질 대조 시스템으로 임의의 증폭된 PCR 생산물을 탐지한다. 이 대조 영역 반응은 주요 검사 성분들이 적절하게 작용하게 한다.
포획 항-염료 항체 고정의 준비
형광 염료에 대한 항체는 신호 향상과 형광 염료로 식별화된 PCR 생산물의 보조 탐지를 위한 독특한 기회를 제공한다. 다양한 항-플루오로포어 항체는 몰레큘러 프로브(Eugene, OR)로부터 구입할 수 있다. 각 항체는 0.5 내지 1mm의 두께를 가진 0.5 내지 2mg/ml의 다양한 농도에서 인쇄 장치(BioDot Corp)를 사용하여 인쇄된다. 가시 밴드의 품질과 항체의 결합 특성은 폰세아우스 방법(Ponceau's method)으로 탐지될 수 있다(Hassen, J., et al, J. Clin. Lab. Immunol., 24:107, 1987).
항- 헵텐 항체 접합 미세입자의 제조
유로퓸 입자들
다양한 입자-크기(50nm - 300nm)의 유로퓸 입자들은 세라딘(Indianapolis, Indiana) 및 몰레큘러 프로브(Eugene, OR)로부터 구입하였다. 유로퓸 킬레이트 나노입자들의 카복실기는 30분 동안 10 mmol/L N-(3-다이메틸아미노프로필)-N'-에틸카보다이이미드와 100 mmol/L N-하이드록시설포숙신이미드로 활성화하였다. 활성화된 입자를 pH 6.1인 50mM MES 버퍼로 한 번 세척하였다. 항체 또는 스트렙타비딘을 5 mg/L 첨가하였다. 2시간 배양한 후에, 항체 또는 스트렙타비딘 코팅 입자들을 6.1 pH인 50mM MES 버퍼로 3회 세척하였다.
금 입자들
다양한 입자-크기(20nm - 200nm) 금 입자들을 브리티시 바이오셀 인터네셔날(UK)로부터 구입하였다. 접합을 최적화하기 위해, 콜로이드성 금 용액의 pH를 6.5로 조절하였다. 항체 또는 스트렙타비딘을 5 mg/L 첨가하였다. 15분 배양한 후에, 2g/L의 소혈청 알부민을 첨가하였다. 항체 또는 스트렙타비딘 코팅 입자들을 7.4 pH인 10mM 인산염 버퍼로 2회 세척하였다.
스트렙타비딘에 대한 미세입자 접합의 최적화
스트렙타비딘의 농도, 접합체의 제제의 봉쇄 및 접합체의 저장의 효과를 다양한 조건하에서 측정하였다. 공유 가교 결합이 형성되었다. 접합 수율과 실행 가능성 확대는 최적의 시스템을 선택하는데 중요한 결정 요소이다.
항- 헵텐 항체에 대한 미세 입자 접합의 최적화
항-헵텐 항체의 농도, 접합체의 제제의 봉쇄 및 접합체의 저장의 효과를 다양한 조건하에서 측정하였다. 공유 가교 결합이 형성되었다. 접합 수율과 실행 가능성 확대는 최적의 시스템을 선택하는데 중요한 결정 요소이다.
키트 제제
염료 영역
이 단계의 주요 목적은 식별화된 스트렙타비딘 또는 습식 분석 조건하에서 항체의 배출과 함께 최적의 염료-스트렙타비딘 또는 헵텐-항체 접합체 저장 조건을 찾는 것이다. 버퍼, 세제, 과당 및 폴리머와 같은 그러나 이에 한정되지 않는 화학물질 및 단백질과 다른 생물학적 폴리머와 같은 생물학적 재료의 다양한 조합은 최고의 조건을 찾기 위해 시험하였다.
저장소 영역
샘플은 저장소 영역에 제공되기 때문에, 샘플은 화학물질과 생물학적 물질이 다양한 조합으로 분석을 위한 최적 조건으로 조절하였다.
전개막
이 성분은 핵산 샘플의 모세관 이동을 용이하게 때문에 핵산을 효과적으로 유동화시키며, 식별화된 표적 핵산과 포획 스트렙타비딘에 결합된 식별화된 표적 핵산 사이에 면역 반응을 허용하며 오랜 시간 동안 강한 모세관 작용을 제공한다. 적절한 안정제를 가진 세제의 최적 농도가 중요하다.
측방 유동 분석장치
이 시스템의 구성은 항원-항체 면역크로마토그래피 분석장치와 유사하나, 스트렙타비딘은 콜로이드성 금 입자와 접합되며 신호는 스트렙타비딘-바이오틴 상호작용에 의해 발생할 수 있다. 혈청형 2 특이적 프라이머는 로다민 레드와 같은 형광 헵텐으로 식별화하였다. 항-로다민 레드 항체는 나이트로셀룰로오스 막 상에 고정되었다. 샘플은 저장소 패드를 먼저 통과하고 모세관 작용에 의해 뎅기 바이러스의 혈청형 특이적 PCR 생산물이 콜로이드성 금 접합 스트렙타비딘과 반응하는 염료 영역으로 유동한다. 이렇게 형성된 반응 착물은 항-형광 염료 항체가 검사 및 대조 영역에 삽입된 전개막을 통해 이동한다.
측방 유동 뎅기 바이러스 혈청형 2 검사는 뎅기 바이러스 혈청형 2 특이적 PCR 증폭을 성공적으로 탐지하고 동정하기 위해 성공적으로 사용하였다. 뎅기 바이러스 혈청형 2 검사의 탐지 한계는 <1 펨토(femto) 몰/검사에 상응하는 <100pg/검사이었다. 이론적으로, 이 민감도는 뎅기 바이러스 cDNA의 싱글 디짓 복사물로부터 증폭된 PCR 생산물을 탐지하는데 충분하다.
보고된 뎅기 바이러스 혈청형 2 검사는 최소의 훈련을 받은 사람에 의해 현장에서 수행될 수 있고 결과는 일회용 검사 카드에 PCR 생산물을 첨가한 후 10분 내에 얻을 수 있다. 또한 본 시스템은 복잡하고 고가의 실험 장비가 필요 없는 단순하고 자가 수행인 원 스텝 방법이다.
실시예 3
플루오레센 아이소티오시아네이트 ( FITC ) 접합 올리고뉴클레오티드의 제조
플루오레센 아이소티오시아네이트(FITC)를 시그마로부터 구입하였다. 접합의 경우에, 뎅기 바이러스 2 포워드 프라이머의 5'는 12개 탄소 사슬(C12) 아미노 변형체 링커로 변형시켰다(도 9). FITC는 통상적인 절차를 사용하여 변형된 올리고머에 부착되었다.
측방 유동 분석의 준비
스트렙타비딘은 콜로이드성 금 입자와 접합되고 신호는 항원-항체 반응에 의해 발생할 수 있다. 바이오틴 분자는 리버스 프라이머(DV. L1)의 5'말단에서 접합된다. FITC 분자는 포워드 프라이머(DV2.U)의 5' 말단부에서 접합된다. 상기 변형된 포워드 및 리버스 프라이머를 가진 증폭된 PCR 생산물은 바이오틴 및 FITC 분자 모두를 함유한다. 바이오틴 dUTP는 PCR 증폭하는 동안 혼합된다. 이 샘플이 검사 스트립에 사용되는 경우, 증폭된 PCR 생산물의 바이오틴 태그는 스트렙타비딘으로 접합된 콜로이드성 금과 반응한다. 그런 후에 PCR 생산물-금 접합 착물은 크로마토그래피 모세관 힘에 의해 나이트로셀룰로오스 막을 통해 이동한다. 상기 착물은 고정된 항-FITC 항체에 의해 포획된다. 포획된 금 또는 유로퓸 입자의 양에 따라, 가시 신호가 발생한다(도 10). 장치 형식 구조는 도 11에 도시된다.
형태 1, 형태 2 및 형태 3의 바이오틴 식별화된 포워드 프라이머의 제조
바이오틴 분자는 뎅기 바이러스 포워드 프라이머(DV1.U, DV2.U, 및 DV3.U.)의 5' 말단부에서 접합된다. 각 포워드 프라이머는 5' 말단부에서 6개의 탄소 사슬(C6) 링커로 변형시켰다(도 12).
로다민 레드 식별화된 리버스 프라이머(DV.L1)의 제조
리버스 프라이머를 리버스 프라이머의 5' 말단부(DV.L1)에서 접합된 로다민 레드 분자로 변형시켰다(도 13).
올리고펩타이드 식별화된 리버스 프라이머(DV2.U)의 제조
포워드 프라이머를 프라이머(DV2.U)의 5' 말단부에서 접합된 합성 올리고펩타이드 분자로 변형시켰다(도 14).
스트립 형식 분석을 위한 분석 순서(도 15)
1) 샘플 사용
다양한 주형 농도에서 증폭된 PCR 생산물, 금 또는 유로퓸 접합체 및 버퍼를 혼합하고, 나이트로셀룰로오스 막 상에 첨가하여 접촉시켰다.
2) 분석 버퍼
PBS 함유 세제를 통상적인 방법에 따라 제조하였다.
3) 분석
10분 후에 검사 결과를 읽었다.
장치 형식 분석을 위한 분석 순서(도 16)
1) 샘플 사용
다양한 주형 농도에서 증폭된 PCR 생산물, 예를 들어, 2㎕의 PCR 생산물을 샘플 웰에 첨가하였다.
2) 분석 버퍼
PBS 함유 세제를 통상적인 방법에 따라 제조하였고 신호 탐지 레이블에 특이적인 현상액 여러 방울을 나이트로셀룰로오스 상의 장치와 접촉시켰다.
3) 분석
10분 후에 검사 결과를 읽었다.
도 17, 18 및 19는 뎅기 혈청형 1, 2 및 3을 위한 실시간 PCR 및 빠른 PCR 생산물 분석 키트의 비교 결과를 제공한다.
실시예 4
전기전도도와 유로퓸 식별화된 올리고뉴클레오티드에 의한 측방 유동 분석
라이트 어드레세블 다이렉트 일렉트릭 리드아웃(LADER)의 원리는 단일 가닥("분리")과 이중 가닥("전도도") 형태에서 올리고뉴클레오티드의 전도도의 차이를 기초로 한다. 이 전도도 차이는 스위치로 생각될 수 있다. 분자 전기 회로는 포획 프로브를 전극에 연결하고, 전극-도너/-억셉터 착물(DA)을 부착시키고 용해된 활성 성분을 첨가함으로써 제조된다. 전기-도너/-억셉터 착물은 제 2의 라이트 유도 스위치로 작용한다. 입사광은 D부터 A까지 전하 이동을 유도하고 프로브가 잡화된다면 이것으로부터 전하는 전극으로 이동될 수 있다. 활성 성분에 의한 DA-착물의 전하 재충전은 회로를 닫고 연속적인 사이클링은 고 증폭된 리드아웃 신호를 발생시킨다. LADER 원리는 광합성 반응 중심의 보호 및 LADER 기술을 위한 전기화학적 착물로서 유사한 시스템을 개시하는 유럽특허 1144685 B1에 개시되며 독일특허 19921940 C2의 내용은 전기전도도 기술의 작업에 대해 전체가 참조로 포함된다.
도너/억셉터 착물은 광 주입 후 100ps 내에서 포르피린-도너로부터 치논(chinon) 억셉터로 전자를 이동할 수 있는 반응 중심으로서 광합성에서 공지된 염료/단백질 착물에서 잘 작동한다. 이 염료/단백질 착무은 치논-억셉터와 잔존하는 (아포)단백질로 쉽게 분해될 수 있다. 치논-억셉터는 아포-단백질의 프로브-결합 치논-억셉터에 대한 재구성 후에 한편으로는 올리고뉴클레오티드 포획 프로브 및 다른 한편으로는 (아포)단백질에 공유 결합할 수 있는 방식으로 변형된다.
이 방법은 도 20의 반응 계획에서 기술된다. 유비퀴논(UQ) 결핍 광합성 반응 중심은 재구성되고 이중 가닥 DNA에 결합된 UQ에 가교된다. 도너는 포르피린 시스템으로 나타내어지는 반면 유비퀴논 모이어티는 억셉터를 형성한다. 제 1 단계(1)에서 조사는 다음 단계(2)에서 일시적으로 안정한 전하 분리 상태 P+-UQ-로 진행하는 들뜬 상태 P*-UQ를 만들어낸다. 이 상태로부터 전자는 DNA(3) 위부터 P+-UQ-를 P+-UQ로 산화하는 전극(4)으로 당겨져서 측정가능한 양극 광전류를 형성한다. 최초 상태로 돌아가는 사이클은 자체가 시스템을 P-UQ로 환원시킴으로써 산화되는 환원제 사이토그롬 C2 +(X)에 의해 폐쇄된다.
판독결과는 읽고 해석할 수 있으며 각 개별 지점에서 참조 신호와 측정 신호 사이의 자동 비교에 의해 정성적 및 정량적으로 확인된다. 도 21은 판독기의 개략도와 EDDA 형식에서 CBT 칩을 위한 접촉 헤드의 확대도를 도시한다. 판독기는 부분적으로 현상되고 간단한 "프레스 바텀(press bottom)"에 의해 수행하는 것이 필요한 모든 유체 처리 단계가 가능하다. 바코드 칩의 참조 측정 데이터(잡종화 전)는 내부 버퍼에 저장되고 잡종화 후에 실제 측정 데이터와 비교된다. 전극당 차이 값은 외부 컴퓨터 스크린에 디스플레이되고 추가로 가공될 수 있다.
이중 가닥 DNA 대 단일 가닥 DNA의 전도도 및 결합 터널링 변수(associated tunnelling parameter)(β)는 전기화학적 임피던스 스펙트로스코피에 의한 다양한 길이의 DNA 단일 및 이중 가닥을 위한 전자 이동 속도 상수의 결정에 의해 추가로 조사하였다. 20개 뉴클레오티드 긴 캡쳐 프로브로 변형되고 잡종화 전과 후 자체가 페로세늄(FcAc) 레이블로 변형된 매칭 표적을 가진 Os-레이블이 공유결합된 전극의 전기화학적 행동을 나타낸다. 단일 가닥 상태에서, 예상한 대로 포획 프로브의 먼 말단부에 Os-레이블에 영향을 줄 수 있는 전기화학적 반응이 있다. 잡종화 후 페로세늄 레이블(FcAc-피크)에 의한 추가 피크가 나타난다. 이것은 포획 프로브의 먼 말단부에서 Os-레이블은 전기화학적으로 스캔될 수 있으마, 잡종화의 효율은 100%에 가깝다는 것을 나타낸다(포획 프로브와 표적을 나타내는 레이블의 두 피크는 높이가 거의 동일하다).
전기전도도 탐지기에 의한 크로마토그래피 분석
자가 수행 빠른 핵산 탐지 시스템(도 23)의 구성은 샘플 첨가 후 검사 결과를 만들기 위해 정확한 양으로 모든 시약과 성분들을 함유한다. 또한 본 시스템은 프로브 올리고뉴클레오티드 조성물을 기초로 한 뉴클레오티드 표적 서열 동정과 정확하게 일치하도록 하기 위해 붙박이 가열 패드를 가질 수 있다. 분석 원리는 도 24의 다이어그램에 기술된다. 샘플은 샘플의 pH를 최적화하기 위한 버퍼, 샘플에서 모든 성분들을 현탁하기 위한 세제, 장치를 통해 적절한 유동을 발생시키기 위한 다공성 필터를 함유하는 저장소 패드를 먼저 통과한다. 상기 샘플은 모세관 작용에 의해 뒤이어서 샘플에서 생물학적 병원체의 표적 DNA가 유로퓸 입자-식별화된 올리고뉴클레오티드와 반응하는 염료 영역으로 흐른다. 이렇게 형성된 반응 착물은 포획 올리고뉴클레오티드 도전성 검사 및 대조 영역에 적절하게 삽입되는 곳인 전개막을 통해 이동한다. 최초의 유로퓸 식별화된 프로브 반응은 표적 뉴클레오티드 서열의 개시를 허용한다.
제안된 검사는 최소의 훈련을 받은 사람에 의해 현장에서 수행될 수 있고 결과는 일회용 검사 카드에 한두 방울의 DNA 추출 샘플을 첨가한 후 30분 내에 얻을 수 있다. 식별화된 올리고뉴클레오티드 프로브와 표적 DNA 착물은 전도도 식별화 검사 및 대조 영역에서 포획된다. 검사 영역은 표적 서열을 나타내고 이 영역은 시간 분해 형광 스캐닝 장치 및/또는 전기전도도 판도기가 장착된 판독기에 의해 탐지될 수 있다. 각각의 대조 영역은 유로퓸-식별화된 올리고뉴클레오티드의 카운터 올리고뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 이 대조 영역 반응은 주요 검사 성분들이 적절하게 작용하게 한다.
크로마토그래피 측방 유동 분석장치는 증폭 시스템이다. 액체 샘플에서 표적 DNAs는 모세관 힘에 의해 막을 통해 이동할 때 막 상의 대전된 검사 영역에 대한 전기 친화도에 의해 꾸준히 농축된다. 비록 분자가 매우 낮은 농도로 존재할지라도, 검사 영역에서 분자의 실제 농도는 샘플에서의 농도보다 훨씬 높다.
붙박이 가열 패드
측방 유동 분석장치는 베이스 보드 상의 고 저항 금속(예를 들어, 니켈/크롬 합금은 가열 목적에 사용할 수 있다)이 인쇄된 가열 PCB/PCP(인쇄회로종이) 상에 장착될 수 있다. 본 시스템은 낮은 가격에 비교적 정확한 온도 모니터와 컨트롤을 가질 수 있다. 샘플 구성은 도 25a-5c, 도 26a-26b 및 도 27a-27b에 도시된다.
검사 장치의 다이어그램
검사 키트는 두 개의 창을 가진 일회용 플라스틱 케이스로 제조되며, 하나의 창은 대조 및 검사 영역을 보여주며, 다른 하나는 도 28에 도시된 대로 샘플을 받기 위한 웰을 제공한다.
장치 내부는 두 개의 패드를 가진 검사 스트립이다. 제 1 패드는 일정한 검사 결과를 확보하기 위해서 버퍼, 세제, 및 화학물질을 함유하며 특별히 제제화된 버퍼 시스템으로 표적 올리고뉴클레오티드 접합 유로퓸 입자들을 함유한다. 제 2 패드는 반응막을 이미 통과한 과량의 유체를 제거하기 위한 것이다. 두 가지 형태의 올리고뉴클레오티드는 얇은 선인 나이트로셀룰로오스 막의 검사 및 대조 영역 상에 개별적으로 고정된다. 표적 생물학적 병원체에 특이적인 올리고뉴클레오티드는 검사 영역에서 고정되는 반면, 유로퓸 식별화된 프로브에 특이적인 다른 올리고뉴클레오티드는 대조 영역에서 고정된다. 장비 커넥터들은 시간 분해 형광 또는 전도도 레이블이 사용되는 상황에서 전도도를 측정하기 위한 장비들이 상기 분석장치와 연결되도록 하기 위해서 포함된다.
실시예 5
전기전도도 및 유로퓸 식별화된 펩타이드 핵산( PNAs )에 의한 측방 유동 분석법
표적 DNA 탐지용 프로브로서 핵산을 사용하는 실시예 4에 기술된 모든 방법과 절차는 프로브로서 펩타이드 핵산의 사용뿐만 아니라 다양한 가열 패드와 검사 장치의 사용에 적용가능하다.
실시예 6
HLA - DQ α 서열 다형성의 탐지
HLA-DQα2 유전자 위치는 유전자 마커로서 개별 동정의 정밀 분석에 사용될 수 있다. 다양한 분석 기술은 PCR-증폭 DNA에서 유전자 변이를 탐지하는데 사용되었다.
다양한 헵텐 또는 형광 헵텐은 프라이머와 프로브에서 식별화될 수 있다. 따라서, 다양한 서열과 크기의 올리고펩타이드는 헵텐으로 사용될 수 있고; 에피토프로 작용할 수 있는 다른 소형 분자들은 헵텐으로 사용될 수 있고 표 2에 도시된 다양한 형광 헵텐이 사용될 수 있다.
리포터 염료를 위한 형광 최대값
Orgon Green®488-X (517nm)
G-FAM 플루오레센 (520nm)
Rhodamine GreenTM-X (527nm)
Orgon Green®514 (530nm)
TETTM (536nm)
JOE (547nm)
HEXTM (556nm)
Cy3TM (563nm)
TAMRATM (573nm)
Rohdamine RedTM-X (580nm)
ROXTM (602nm)
Texas Red®-X (603nm)
Bodipy®630/650-X (640nm)
Bodipy®650/665-X+ (660nm)
Cy5TM (662nm)
Cy5.5TM (707nm)
항-헵텐 항체들은 상기 헵테의 카운터 부분으로 사용된다. 많은 항-헵텐 항체들은 몰레뷸러 프로브와 같은 회사들로부터 상업적으로 구입할 수 있다. 게다가, 항-헵텐 항체들은 고체 기질 상에 고정될 수 있거나 다양한 입자들과 접합될 수 있다. "다양한 입자들"이란 콜로이드성 금, 라텍스 입자들, 자석 또는 상자성 입자들, 유로퓸 삽입 라텍스 입자 등을 의미한다.
실시예 7
유전자 현장검사
본 발명의 다른 실시예에서, 본 발명은 원 스텝 또는 단순 스텝 통합 유전자 분석 시스템을 제공하는 것을 목적으로 하는 유전자 현장검사(GPOCT)에 관한 것이다. 흡수 패드는 반응 패드와 연결된 기질에 연결되며, 포획된 항체 또는 항원은 유전자 현장검사 장치를 위해 직선 또는 점선 측방 유동 분석법으로 기질 상에 고정된다. 반응 샘플(증폭 샘플)이 사용되고 다음 기질로 이동하는 시약 지역은 반응 패드 상에 있다.
실시예 1 - 샘플 추출 시스템.
도 29를 참조하면, 추출 시스템의 제한되지 않는 실시예는 용액을 제거하는 저장소 시스템과 DNA 또는 RNA 샘플을 농축하는 버퍼 성분을 포함할 수 있고, 특별한 처리를 한 다중 층 흡수제 및 제한 없이 시제와 알칼린 버퍼를 함유하는 추출 용액을 포함할 수 있다.
이 버퍼는 세포 벽 또는 막을 파괴할 수 있고 DNA 또는 RNA와 같은 유전자 샘플을 용액 속에 노출시킬 수 있다. 프로테아제는 단백질과 셀 벽과 같은 히스톤을 제거하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 각각의 용액 캡슐 또는 다층 막이 사용될 수 있다.
다른 다양한 종류의 저장소, 탄소 필터, 이온 교환 필터가 사용될 수 있다. 또한, 필터는 60,000부터 300,000D 이상 범위의 분자량 한도를 가진 반투과막일 수 있고 눌러 붙지 않게 코팅될 수 있다.
필터 시스템은 모든 잠재적인 억제제, 소형 분자들, 이온 및 단백질을 제거한다. 그 결과, 샘플은 최초 추출 용액으로부터 10 내지 1000배로 농축될 수 있다.
실시예 2 - 원료 샘플 또는 추출된 DNA 샘플로부터의 통합 시스템.
도 29에 도시된 대로, 통합 시스템은 필터 장치가 대부분의 이온과 소형 분자 및 단백질을 흡수하는 다층 필터 시스템과 연결된 샘플 입구 영역을 포함한다. 이 부분은 기능성 여과 및 농축기로 작동한다. 여과 시스템은 모세관과 같이 빠른 열 전달을 위한 매우 얇은 튜브와 추가로 연결된다. 쉽고 빠르게 온도를 제어하기 위해서, 튜브의 표면상에 붙박이 금속 인쇄는 뜨거운 코일과 같이 작용할 수 있다. 얇은 튜브 내부는 고체 기질 속에 삽입된 소정의 성분들을 보관하고 동결 건조하기 위한 영역일 수 있다. 얇은 튜브는 반응 패드와 연결되며, 반응 패드는 나이트로셀룰로오스 막에 추가로 연결되며, 나이트로셀룰로오스 막은 흡수 패드에 추가로 연결된다.
실시예 3 - 증폭 및 탐지 부분 개관
정제된 샘플을 사용하며, 다른 실시예에서, 샘플을 사용하고 샘플의 유동 속도를 제어하는 롤러 시스템을 통과한다. 그런 후에 샘플은 열 센서와 가열 제어 회로를 통과하고 모든 필요한 시약을 함유하는 패드; 동결 건조된 미리 제제화된 시약 패드로 이루어질 수 있고 PCR 반응을 위한 증폭 챔버를 통과하며, 이 챔버(패드)는 태그 중합효소, dNTP, 프라이머(꼬리표 붙여짐), 다른 식별화 모노머 등을 포함한다.
샘플이 증폭 챔버를 통과함에 따라, 측방 유동 분석장치의 반응 패드와 접촉한다. 측방 유동 분석장치에 있는 동안, 샘플은 결과 창을 통해 흐르고, 결과는 점 또는 직선 또는 어떤 종류의 탐지가능한 신호에 의해 나타내어질 수 있고 흡수 패드로 흘러간다.
본 발명의 장치의 부품은 이하에서 상세하게 기술된다.
1. 열 센서와 가열 제어 회로 장치.
다양한 종류의 도전성 잉크는 폴리에스터, 폴리카보네이트 또는 폴리스타이렌과 같은 유연한 기질의 표면상에 인쇄될 수 있다. 선택적으로, 탄소, 탄소/은 혼합물, 은, 은/은 염화물, 금, 백금, UV 경화 유전성, 열 경화 유전성 도전성 잉크와 같은 다양한 종류의 도전성 잉크는 기판상에 인쇄될 수 있고 30℃ 내지 100℃ 범위로 변하는 온도의 열 순환을 일으키는 적절한 열을 발생시킨다. 따라서, 온도 센서와 온도 제어기는 전류와 저항을 탐지하고 제어함으로써 성취될 수 있다.
열 순환은 둘 또는 셋의 다른 온도를 설정하고 20-40 마다 반복적으로 그 온도에서 순환시킴으로써 성취될 수 있다. 열 순환 조건은 프라이머 서열에 따라 최적화될 필요가 있다.
2. 증폭 패드
증폭 패드는 PCR 또는 RFPCR과 같은 동온 증폭을 위한 모든 시약을 함유한다. 모든 시약들은 미리 혼합될 수 있고 최적으로 제제화되고 동결 건조될 수 있다. 모든 시약들이란, 증폭 반응을 위해 필수 성분을 의미한다. 이런 시약들은 제한 없이 다음 성분을 포함한다: 역전사효소, DNA 중합효소, 태그 중합효소, PNAs 프라이머, 식별화된 프라이머, dNTPs, 식별화된 dUTP, 버퍼 및 단백질, BSA(소 혈청 알부민) 및 EDTA와 같은 안정제. 증폭 패드는 특정한 부피의 샘플 사용으로 재구성될 수 있다. 프라이머는 증폭 반응을 향상시키고 기질 억제를 막기 위해 유리 비드 또는 라텍스 비드로 고정될 수 있다. "기질 억제"는 반응하지 않은 프라이머가 안티-태그 항체와 중합 폴리머 사이의 반응을 억제할 수 있다는 것을 의미한다. "프라이머"는 올리고뉴클레오티드 또는 PNA(펩타이드 핵산) 및 올리고뉴클레오티드 잡종을 의미한다. "유리 비드" 또는 "라텍스 입자"는 미세 입자들을 의미한다. 미세 입자들은 0.01 - 10.0㎛ 지름의 크기로 사용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 실시예를 위한 지름은 0.1 - 10.0㎛의 범위일 수 있다.
미국특허 제 6,153,425호는 탐지 시스템을 개시하나, '425 특허는 증폭 패드에서 미세 입자들은 기질 억제를 막기 위해 사용될 수 있다는 것을 개시 또는 암시하고 있지 않다.
유전자 칩
유전자 현장검사 장치의 다른 양태에서, 본 발명은 단백질 칩과 유전자 칩에 관한 것이다. 유전자 칩에 관해서, 구체적인 실시예는 유전자 현장검사 장치를 기술하면서 논의하였다. 바람직한 실시예에서, 상기 장치는 DNA 또는 RNA 정제 챔버와 연결된 핵산 추출기를 포함할 수 있고, DNA 또는 RNA 정제 챔버는 증폭 또는 잡종화 챔버에 추가로 연결되며 증폭 또는 잡종화 챔버는 발생된 신호를 보여주는 결과 창에 연결된다(도 30). 유전자 현장검사 장치는 상기한 검사 스트립을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 실시예에서, 샘플은 추출 버퍼 용기에 첨가된다. 추출된 DNA 샘플은 유전자 POCT에 추가로 첨가될 수 있으며 결과는 육안 또는 신호 판독기에 의해 30분 후에 읽을 수 있다(도 31). 유전자 POCT 방법은 빠르며 민감성이 높다.
본 명세서에서 인용된 모든 참조문헌은 전체가 참조로 포함된다.
당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여, 본 명세서에 구체적으로 기술된 본 발명의 특이적 실시예와 여러 동일물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 이런 동일물은 본 발명의 청구범위에 포함되는 것으로 생각된다.
본 발명의 내용 중에 있음
SEQUENCE LISTING <110> ACCESS BIO, INC. Jung, Jaean Choi, Young Ho Kim, Youngsun <120> NUCLEIC ACID DETECTION SYSTEM <130> 13010-05PCT <150> US 60/560,197 <151> 2004-04-07 <150> US 60/567,845 <151> 2004-05-03 <160> 12 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified serotype-specific upper primers <400> 1 acaccagggg aagctgtatc ctgg 24 <210> 2 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified serotype-specific upper primers <400> 2 ttaggaacac caggggaagc tgtatcctgg 30 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified serotype-specific upper primers <400> 3 aaggtgagat gaagctgtag tctc 24 <210> 4 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified serotype-specific upper primers <400> 4 gagactaagg tgagatgaag ctgtagtctc 30 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified serotype-specific upper primers <400> 5 agcactgagg gaagctgtac ctcc 24 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified serotype-specific upper primers <400> 6 ggaggtagca ctgagggaag ctgtacctcc 30 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified serotype-specific upper primers <400> 7 aagccaggag gaagctgtac tcct 24 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified serotype-specific upper primers <400> 8 aggagtaagc caggaggaag ctgtactcct 30 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lower primers for PCR anti-sense primer and RT reaction primer <400> 9 cattccattt tctggcgttc t 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> lower primers for PCR anti-sense primer and RT reaction primer <400> 10 caatccatct tgcggcgctc t 21 <210> 11 <211> 25 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligopeptide molecule conjugated at the 5' end of the primer (DV2.U) <400> 11 Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ser Thr Arg Cys Gln Pro Leu Glu Leu Ala 1 5 10 15 Gly Leu Gly Phe Ala Glu Leu Gln Asp 20 25 <210> 12 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligopeptide molecule conjugated at the 5' end of the primer (DV2.U) <400> 12 Lys Lys Ile Asp Thr Glu Glu Val Glu Gly 1 5 10

Claims (20)

  1. 5' 및 3' 말단부에 다른 헵텐으로 식별화된 프라이머 및 선택적으로 핵산 착물을 형성하기 위해 헵텐으로 식별화된 dNTP를 포함하는 핵산 증폭 믹스를 포함하는 컨테이너; 특이적 결합 파트너와 핵산 착물의 결합에 적합한 시약 조건을 포함하는 저장소 영역을 포함하는 측방 유동 검사 장치; 리포터 염료 또는 다른 헵텐과 연결 또는 접합되며, 핵산 착물에 대해 특이적인 결합 파트너를 포함하는 염료 영역; 및 핵산 착물의 다른 양태에 특이적인 다른 특이적 결합 파트너를 포함하는 검사 영역을 포함하는 표적 핵산 탐지 시스템.
  2. 제 1 항에 있어서,
    핵산 증폭 믹스는 건조되거나 동결 건조되고 등온 증폭, PCR 및/또는 실시간 PCR에 적합한 표적 핵산 탐지 시스템.
  3. 제 1 항에 있어서,
    프리-믹스는 다중 형태의 헵텐을 포함하고 표적 핵산의 다중 형태는 탐지되는 표적 핵산 탐지 시스템.
  4. 제 1 항에 있어서,
    특이적 결합을 위한 핵산 착물은 핵산 상의 헵텐 또는 핵산을 포함하는 표적 핵산 탐지 시스템.
  5. 제 4 항에 있어서,
    헵텐은 바이오틴, 플루오포어 또는 올리고펩타이드인 표적 핵산 탐지 시스템.
  6. 제 5 항에 있어서,
    특이적 결합 파트너는 스트렙타비딘, 헵텐 특이적 항체 또는 표적 핵산에 대한 상보적 올리고뉴클레오티드인 표적 핵산 탐지 시스템.
  7. 제 6 항에 있어서,
    리포터 염료는 유로퓸, 금 또는 플루오로포어인 표적 핵산 탐지 시스템.
  8. 제 3 항에 있어서,
    다중 형태의 헵텐은 플루오로포어 또는 올리고펩타이드의 다중 형태인 표적 핵산 탐지 시스템.
  9. 제 1 항에 있어서,
    염료 영역에서의 특이적 결합 파트너와 다른 특이적 결합 파트너는 검사 영역에서 고정되는 표적 핵산 탐지 시스템.
  10. 제 9 항에 있어서,
    검사 영역에서 고정된 특이적 파트너는 헵텐에 대한 항체 및/또는 표적 핵산에 대한 상보적 올리고뉴클레오티드 또는 PNA인 표적 핵산 탐지 시스템.
  11. 제 10 항에 있어서,
    검사 영역 상에서 고정된 특이적 결합 파트너는 DNA인 표적 핵산 탐지 시스템.
  12. 제 11 항에 있어서,
    전기전도도를 위한 분석 판독을 위한 커넥터를 포함하는 표적 핵산 탐지 시스템.
  13. 제 1 항에 있어서,
    표적 핵산의 소스는 병원체인 표적 핵산 탐지 시스템.
  14. 제 13 항에 있어서,
    병원체는 플라비바이러스 과에 속하는 바이러스인 표적 핵산 탐지 시스템.
  15. 제 14 항에 있어서,
    바이러스는 뎅기 바이러스인 표적 핵산 탐지 시스템.
  16. 제 15 항에 있어서,
    뎅기 바이러스 입자들의 혈청형은 이들을 식별하기 위한 여러 개의 다른 헵텐을 가진 프라이머를 식별화함으로써 탐지되는 표적 핵산 탐지 시스템.
  17. 제 1 항에 있어서,
    프라이머는 플루오로포어에 의해 한 말단에서 식별화되고 소광제에 의해 다른 말단에서 식별화되고 선택적으로 식별화된 dNTP는 바이오틴에 의해 식별화되는 표적 핵산 탐지 시스템.
  18. 샘플을 표적 핵산 특이적 식별화된 프라이머 및 선택적으로 제 1 항에 따른 식별화된 dNTP를 포함하는 프리-믹스를 함유하는 컨테이너에 접촉시키는 단계, 이렇게 얻은 증폭된 핵산을 측방 유동 장치의 저장소 영역에 접촉하는 단계 및 핵산 착물과 검사 영역 상의 특이적 결합 파트너의 결합을 분석하는 단계를 포함하여 샘플에서 표적 핵산의 존재를 분석하는 방법.
  19. 샘플을 제 1 항에 따른 측방 유동 장치의 저장소 영역과 접촉시키는 단계를 포함하고, 염료 영역은 리포터 염료로 식별화된 표적 핵산 특이적 올리고뉴클레오티드를 포함하고 식별화된 올리고뉴클레오티드는 핵산 착물을 형성하는 표적핵산과 결합하고, 검사 영역은 올리고뉴클레오티드로 고정되며, 식별화된 올리고뉴클레오티드와 고정된 올리고뉴클레오티드의 결합은 표적 핵산의 존재에 대해 양성 신호를 나타내는 샘플에서 표적 핵산의 존재를 분석하는 방법.
  20. 제 19 항에 있어서,
    신호는 리포터 염료 또는 전기전도도에 의해 읽히는 샘플에서 표적 핵산의 존재를 분석하는 방법.
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