KR20060136408A - 단편화 ｒｎａ의 범용적 증폭 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 범용 유전자 발현 프로파일링을 위해 단편화 RNA, 예를 들어 보관된 고정된 파라핀-포매 조직 물질 (FPET RNA) 또는 다른 임상적 생검 조직 시료로부터 얻은 RNA를 사용하는 방법에 관한 것이다.
범용 유전자 발현 프로파일링, 단편화 RNA, 고정된 파라핀-포매 조직 물질,임상적 생검 조직 시료, 폴리아데닐화
Description
본 발명은 다양한 방법에 의한 유전자 발현 프로파일링을 위한 RNA의 제조 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 고정된 파라핀-포매 조직 (FPET)으로부터 얻은 것과 같은, 하나 이상의 RNA 종이 그의 3' 말단에서 단편화되고(되거나) 차단되는 RNA를 포함하는 RNA의 범용적 증폭에 특히 유용하다. 본 발명의 방법은 폴리아데닐화가 결핍된 RNA 종을 검출하기 위해 또한 유용하다. 또한, 유전자 발현 프로파일링에 유용한 증강된 RT-PCR 방법을 제공한다.
유전자 발현 프로파일링은 생물학 연구 및 임상 실무에서 중요성이 증가하고 있다. 유전자 발현 프로파일링은 다양한 암 종류를 분류하기 위해 (예를 들어 Golub et al., Science 286: 531-537 (1999); Bhattacharjae et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 13790-13795 (2001); Chen-Hsiang et al., Bioin, formatics 17 (Suppl. 1): S316-S322 (2001); Ramaswamy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 15149-15154 (2001); Martin et al., Cancer Res. 60: 2232-2238 (2000); West et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 11462-11467 (2001); Sortie et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98: 10869-10874 (2001); Yan et al., Cancer Res. 61: 8375-8380 (2001)) 참조), 및 유방암 (Van't Veer et al., Nature 415:530-536 (200)) 및 폐암 (Beer et al., Nat. Med. 8:816-24 (2002))과 같은 암의 임상 결과를 예측하기 위해 사용된다.
샘플에서 mRNA 발현의 정량을 위해 가장 일반적으로 사용되는 당업계에 공지된 방법은 노던 블로팅 및 동일계내 (in situ) 혼성화 (Parker & Barnes, Methods in Molecular Biology 106:247-283 (1999)), RNAse 보호 분석 (Hod, Biotechniquies 13:852-854 (1992)), 마이크로어레이 (microarray) (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93(2): 106-149 (1996)) 및 역전사 중합효소 연쇄 반응 (RT-PCR) (Weis et al., Trends in Genetics 8:263-264 (1992))를 포함한다. 별법으로, DNA 이중체 (duplex), RNA 이중체 및 DNA-RNA 하이브리드 이중체 또는 DNA-단백질 이중체를 포함하는 특이적 이중체를 인지할 수 있는 항체가 사용될 수 있다. 이들 중에 감도, 재현성 및 큰 운동학 범위 때문에, 실시간 RT-PCR이 고효율 (high-throughput) 정밀 발현 프로파일링을 위한 방법으로 선택되고 있다.
유전자 발현 프로파일링이 잠재적으로 유용한 많은 상황에서, RNA의 선행 증폭 없이는 분석을 위한 물질이 불충분하다. RNA는 주형으로서 역할을 할 수 없으므로, RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링에서 제1 단계는 RNA 주형의 cDNA로의 역전사이고, 그후 PCR 반응에서 그의 지수 증폭이 이어진다. mRNA를 cDNA로 전환시키는 것은 전형적으로 역전사효소 (RT)의 존재 하에 mRNA의 올리고 dT 프라이밍(priming)에 의해 수행된다. 그러나, 상기 단계는 mRNA 공급원이 10-20년 정도 오랫동안 보관할 수 있고 RNA가 거의 분해되지 않는 고정된 파라핀-포매 조직 샘플인 경우 무효하다 (Lewis et al., J. Pathol. 195:66-71 (2001)).
FPET 샘플은 임상 종양학에서 유전자 발현 프로파일링을 위한 가장 널리 이용가능한 RNA 공급원이고, 보관된 FPET 샘플은 임상 종양학에서 유전자 발현 프로파일링을 위한 중요한 RNA 공급원이므로, 상기 조직 샘플을 사용하는 유전자 발현 프로파일링을 가능하게 하고 그 효능을 개선하는 방법이 반드시 필요하다.
<발명의 개요>
본 발명은 매우 작거나 매우 단편화된 RNA 샘플의 광범한 증폭을 가능하게 하는 샘플 제조 방법을 제공한다. 본 발명의 방법은 RT-PCR 및 혼성화 어레이를 포함하는 RNA 분석 방법의 감도를 개선시킨다. 추가로, 본 발명의 방법은 보관된 파라핀 포매 조직 샘플 내의 단편화되고(되거나) 차단된 mRNA 종을 포함한 모든 발현된 유전자의 mRNA 수준의 측정을 허용한다. 본 방법은 또한 폴리아데닐화되지 않은 mRNA, 예를 들어 히스톤 및 비코딩 RNA, 예를 들어 마이크로RNA (miRNA)의 측정을 허용한다. 본 발명은 부가적으로 단편화 RNA 샘플의 유전자 발현 프로파일링에 사용된 RT-PCR의 감도를 증가시키는 증강된 역전사 단계 및 변형된 PCR 단계를 추가로 포함할 수 있다.
한 측면에서, 본 발명은 (a) 단편화 RNA를 폴리아데닐화시키는 단계, 및 (b) 단계 (a)에서 얻은 폴리아데닐화된 단편화 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계를 포함하는, 유전자 발현 분석을 위한 단편화되고(되거나) 차단된 RNA 종을 포함할 수 있는 다수의 RNA 종을 제조하는 방법에 관한 것이다.
전형적으로, 단편화 RNA 내의 RNA 종의 크기는 약 20 염기 내지 약 2000 염기, 보다 종종 약 50 내지 약 300 염기이다.
폴리아데닐화는 예를 들어 이. 콜라이 (E. coli) 폴리A 중합효소를 사용하여 수행할 수 있다.
단편화 RNA 내의 적어도 일부의 RNA 종은 3' 말단에서 차단될 수 있기 때문에, 본 발명의 방법은 부가적으로 탈차단 (deblocking) 단계를 포함할 수 있다. 탈차단은 통상의 시약을 사용함으로써, 예를 들어 포스파타제 효소, 예를 들어 송아지 알칼리성 포스파타제 (CIP), 세균 알칼리성 포스파타제, 새우 알칼리성 포스파타제, 또는 그의 변이체를 사용하거나, 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK: polynucleotide kinase), 예를 들어 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (T4 PNK), 또는 그의 변이체를 사용하여 수행할 수 있다.
한 실시태양에서, 상기 단계 (a)에서 얻은 폴리아데닐화된 단편화 RNA는 역전사효소 및 올리고-dT 프라이머로 처리하여 cDNA로 전환되고, 여기서 올리고-dT 프라이머는 임의로 RNA 중합효소 프로모터 (예를 들어 T7 RNA 중합효소 프로모터) 서열을 함유할 수 있다.
다른 실시태양에서, 상기 단계 (a)에서 얻은 폴리아데닐화된 단편화 RNA를 cDNA로 전환시키기 전에 폴리아데닐화제, 예를 들어 CIP 또는 PNK가 제거된다.
추가의 실시태양에서, 폴리아데닐화된 단편화 RNA는 폴리아데닐화제, 예를 들어 CIP 또는 PNK의 사전 제거 없이 cDNA로 전환된다.
추가의 실시태양에서, 폴리아데닐화된 단편화 RNA는 cDNA로 및 후속적으로 이중가닥 cDNA로의 전환 전에, 예를 들어 rRNA 서열의 제거에 의해 농축된다.
또다른 실시태양에서, 폴리아데닐화된 단편화 RNA는 cDNA로 전환되기 전에 고정된다.
특정 실시태양에서, 폴리아데닐화된 단편화 RNA는 고상 비드 포맷에 혼성화된다. 원하는 경우 고정된 폴리아데닐화된 단편화 RNA는 cDNA로 전환 전에 농축된다. 농축은 비드 고정된 상보성 rRNA 올리고뉴클레오티드에 혼성화함으로써 rRNA 서열의 제거를 포함할 수 있다.
또 다른 실시태양에서, RNA는 고정된 파라핀-포매 조직 샘플, 예를 들어 종양 샘플로부터 얻은 mRNA이고, 여기서 종양은 암, 예를 들어 유방암, 결장암, 폐암, 전립선암, 간세포암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 신장암, 암종, 흑색종, 또는 뇌암일 수 있다.
본 발명의 방법은 (c) 상기 단계 (b)에서 얻은 cDNA 내에 존재하는 1종 이상의 cDNA 종을 주형으로서 사용하는 PCR 증폭 단계를 추가로 포함할 수 있다.
특정 실시태양에서, PCR 증폭은 약 40 사이클을 포함하고, 이 중 처음 5 사이클, 또는 처음 2 내지 5 사이클, 또는 처음 2 사이클은 보다 낮은 어닐링/연장 온도, 예를 들어 약 40℃ 내지 58℃, 예를 들어 약 50℃의 온도에서 수행된다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 방법은 (d) 단계 (b)에서 얻은 cDNA를 이중가닥 DNA로 전환시키고; (e) 단계 (d)에서 얻은 이중가닥 DNA를 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 전사시켜 증폭된 상보성 RNA (cRNA)를 얻음으로써 RNA를 증폭시키는 단계를 추가로 포함한다.
본 발명의 방법의 다른 실시태양에서, 단계 (a)에서 얻은 폴리아데닐화된 단편화 RNA는 역전사효소 및 연장된 역방향 프라이머를 사용하는 처리에 의해 cDNA로 전환되고, 수득한 cDNA는 표적 앰플리콘을 기초로 설계된 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 프로브를 사용하는 PCR에 의해 증폭된다.
다른 측면에서, 본 발명은 RNA를 역전사효소 및 연장된 프라이머를 사용하는 처리에 의해 cDNA로 전환시키고, 수득한 cDNA를 표적 앰플리콘을 기초로 설계된 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 프로브를 사용하는 PCR에 의해 증폭하는 것을 포함하는, 증강된 cDNA 합성 방법에 관한 것이다. RNA는 단편화될 수 있고, 그의 적어도 일부는 폴리아데닐화되지 않을 수 있다.
또다른 측면에서, 본 발명은 (a) 다수의 RNA를 폴리아데닐화시키고; (b) 폴리아데닐화된 RNA를 역전사효소 및 올리고 dT 또는 올리고 dT-T7 프라이머에 의해 cDNA로 전환시키는 단계를 포함하는, 유전자 발현 분석을 위한 다수의 RNA 종을 포함하는 RNA를 제조하는 방법에 관한 것이다.
추가의 측면에서, 본 발명은 (a) 다수의 RNA를 폴리아데닐화시키고; (b) 폴리아데닐화된 RNA를 역전사효소 및 T7 RNA 중합효소 프로모터를 함유하는 올리고 dT-T7 프라이머에 의해 cDNA로 전환시키고, (c) 단계 (b)에서 얻은 이중가닥 DNA를 T7 RNA 중합효소를 사용하여 시험관내 전사시켜 증폭된 상보성 RNA (cRNA)를 얻는 단계를 포함하는, 유전자 발현 분석을 위한 다수의 RNA 종을 포함하는 RNA를 제조하는 방법에 관한 것이다.
도 1은 유전자 발현을 측정하기 위해 사용된 본 발명에서 증폭 과정의 전체 작업 흐름도이다. 상기 도면에서, FPET는 "고정된 파라핀-포매 조직"이고, PNK는 "폴리뉴클레오티드 키나제"이고, CIP는 "송아지 소장 알칼리성 포스파타제"이고, EPAP는 "이. 콜라이 폴리A 중합효소"이고, TdT는 "터미날 트랜스퍼라제"이고, IVT는 "시험관내 전사"이고, rNTP는 "리보뉴클레오시드-5'-트리포스페이트"이고, dNTP는 "2'-데옥시리보뉴클레오시드-5'-트리포스페이트"이고, ATP는 "아데노신-5'-트리포스페이트"이다. T7-(T)24는 역전사효소를 사용한 cDNA 합성을 위한 프라이머이고, 폴리데옥시아데닐레이트의 5' 말단에 부착된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열이다. T7-(N)15는 역전사효소를 사용한 cDNA 합성을 위한 프라이머이고, 랜덤한 데옥시-펜타데카머의 5' 말단에 부착된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열이다. 도 1에서, 본 발명의 3가지 대표적인 프로토콜 (A, B 및 C)이 있다. 과정 A 및 B는 FPET RNA를 사용하여 개시하고, 1) 말단 뉴클레오티드 상의 3'OH의 직접 또는 간접 차단해제, 2) 3' 말단의 폴리 A 테일링 (tailing), 3) T7 RNA 중합효소 프로모터를 포함시켜 올리고 dT-프라이밍된 이중가닥 cDNA 합성, 및 4) 시험관내 전사에 의한 RNA 증폭을 포함한다. 과정 C (도표의 중간)는 FPET RNA를 사용하여 개시하고, 1) T7 RNA 중합효소 프로모터를 갖는 T7-(N)15 프라이머를 사용하여 이중가닥 cDNA를 직접 합성하고, 2) 시험관내 전사에 의한 RNA 증폭을 포함한다.
도 2는 12개의 상이한 유방암 환자의 생검으로부터 단리된 FPET RNA의 겔 사진이다. 레인 M1 및 M2는 각 밴드 크기가 염기로 표시된 RNA 마커 (marker)를 보여준다. 레인 1-4, 5-8 및 9-12는 각각 1, 6 및 17년 동안 보관된 종양 생검의 밴드이다. 샘플은 RNA 6000 나노칩을 사용한 Agilent 2100 Bioanalyzer로 모세관 전 기영동에 의해 분석하였다.
도 3은 유방 종양 FPET RNA, 랜덤하게 분해된 유방 종양 RNA 및 무손상 유방 종양 RNA의 선택된 유전자 발현 분석을 보여준다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7700으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. cDNA 합성은 유전자 특이적 프라이머 (GSP) 또는 올리고 (dT)12- l8로 프라이밍하였다. 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다.
도 4는 유방 종양 FPET RNA의 선택된 유전자 발현 분석을 보여준다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7700으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. cDNA 합성은 폴리아데닐화되지 않은 주형 RNA를 사용하여 GSP 또는 올리고 (dT)12-18로 프라이밍하거나 (FPET/GSP 및 FPET/dT) cDNA 합성은 폴리아데닐화된 주형 RNA를 사용하여 올리고 (dT)12-18로 프라이밍하였다 (FPET-pA/dT). 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다.
도 5는 시험관 내에서 전사된 cRNA의 유전자 발현 분석을 보여준다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7700으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))로 분석하였다. RNA 폴리아데닐화는 0.2 단위의 EPAP를 사용하여 수행하고, cDNA 합성은 도 4에서와 같이 수행하였다 (주형 cRNA 생성용 물질 및 방법 참조). 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다. 삽입 사진: 0, 0.1 또는 0.2 단위의 EPAP로 처리된 cRNA의 Agilent 2100 겔 사진이다. 레인 M은 각 밴드의 크기가 염기로 표시된 RNA 마커를 보여준다.
도 6A는 PNK (레인 1), PNK 버퍼 대조군 (레인 2), CIP (레인 3) 또는 CIP 버퍼 대조군 (레인 4)으로 처리된 FPET RNA의 겔 사진을 보여준다. 도 6B는 PNK 버퍼 대조군, 이어서 EPAP 버퍼 대조군 (레인 1), PNK, 이어서 EPAP 버퍼 대조군 (레인 2), PNK 버퍼 대조군, 이어서 EPAP, 또는 PNK, 이어서 EPAP (레인 4)로 처리된 FPET RNA의 겔 사진을 보여준다. 샘플은 RNA 6000 나노칩을 사용한 Agilent 2100 Bioanalyzer로 모세관 전기영동에 의해 분석하였다. 레인 M1 및 M2는 각 밴드의 크기가 염기로 표시된 RNA 마커를 보여준다.
도 7은 유방 종양 FPET RNA의 선택된 유전자 발현 분석을 보여준다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7700으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. 유전자 발현 분석 전에, RNA를 PNK (+PNK) 또는 버퍼 대조군(-PNK)으로 처리한 후, EPAP에 의해 폴리아데닐화시켰다. 이어서, RNA를 역전사효소 및 올리고 dT 프라이머 (+PNK/올리고 dT 및 -PNK/올리고 dT) 또는 유전자 특이적 프라이머 (+PNK/GSP 및 -PNK/GSP)를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다. 삽입 사진: PNK 또는 버퍼 대조군으로 처리한 후 EPAP로 처리한 FPET RNA의 Agilent 2100 겔 사진. 레인 M은 각 밴드의 크기가 염기로 표시된 RNA 마커를 보여준다.
도 8은 유방 종양 FPET RNA의 선택된 유전자 발현 분석을 보여준다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7700으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. 유전자 발현 분석 전에, RNA를 CIP (+CIP) 또는 버퍼 대조군 (-CIP)로 처리한 후, EPAP로 폴리아데닐화시켰다. 이어서, RNA를 역전사효소 및 올리고 dT 프라이머(+CIP/올리고 dT 및 -CIP/올리고 dT) 또는 유전자 특이적 프라이머 (+CIP/GSP 및 -CIP/GSP)를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다. 삽입 사진: CIP 또는 버퍼 대조군으로 처리한 후 EPAP로 처리한 Agilent 2100 겔 사진. 레인 M은 각 밴드의 크기가 염기로 표시된 RNA 마커를 보여준다.
도 9는 유방 종양 FPET RNA의 96개 유전자 패널 발현 분석을 보여준다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7700으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. 유전자 발현 분석 전에, RNA를 PNK로, 이어서 EPAP로 처리하였다. 이어서, RNA를 역전사효소 및 올리고 dT 프라이머(pA dT) 또는 유전자 특이적 프라이머(pA GSPl)를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. 폴리아데닐화되지 않은 RNA도 또한 상기한 바와 같이 (비처리된 dT 및 비처리된 GSP1) cDNA로 전환시켰다. 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다. 결과의 통계학적 분석은 표 1에 나타내었다.
도 10A-C는 증폭된 및 비증폭된 FPET RNA의 46개 유전자 패널 발현 분석을 보여준다. 3개의 상이한 RNA를 프로파일링하였다. 무손상의 범용 총 RNA (스트라타젠 (Stratagene, 미국 캘리포니아주 라 졸라))는 도 10A에 도시하고, 태반 FPET RNA (포르말린으로 1.5 내지 2시간 처리되고 파라핀 포매된 태반에서 유래 (바이오파톨로지 사이언시스 메디컬 코포레이션 (Biopathology Sciences Medical Corporation, 미국 캘리포니아주 샌프란시스코))는 도 10B에 도시하고, 유방 종양 FPET RNA (클리노믹스 바이오사이언시스 (Clinomics BioSciences), 미국 매사추세 츠주 피츠필드)는 도 10C에 도시한다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7700으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. 유전자 발현 분석 전에, 2개의 별개의 RNA 샘플을 PNK로, 이어서 EPAP로 처리한 후, 역전사효소 및 올리고 dT-T7 프라이머를 사용하여 cDNA로 전환시켰다. DNA 중합효소 I 및 RNAseH를 사용하여 cDNA를 이중가닥으로 만들고, IVT [IVT (테일링된-1) 및 IVT (테일링된-2)]로 증폭시킨 후, TaqMan(등록상표)로 분석하였다. 대조군으로서, 비 PNK/비 EPAP-처리된 FPET RNA를 이중가닥 cDNA로 전환시키고, 분석하기 전에 상기한 바와 같이 IVT로 증폭시키거나 [IVT (비테일링된)], TaqMan(등록상표)로 GSP에 의해 cDNA로 전환시켰다 (GSP). 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다. 삽입된 표는 각각의 RNA 샘플에 대해 프로파일링된 46개 유전자의 총 평균 Ct를 보여준다. 또한, 프로파일링된 46개 유전자에 대한 비증폭된 (GSP) RNA 샘플과 증폭된 (IVT) RNA 샘플 사이의 피어슨 (Pearson) 상관계수 (R)를 보여준다.
도 11은 단편화된 FPET RNA의 유전자 특이적 프라이밍을 증가시키기 위한 전략을 보여주는 모식도이다. 이 도면에서, FPET는 "고정된 파라핀-포매 조직이고, MeGppp는 mRNA의 5' 메틸화 구아닐레이트 CAP 구조이고, A100-300은 mRNA의 3' 폴리A 트랙이고, RT는 역전사효소이고, PCR은 중합효소 연쇄 반응이고, 앰플리콘은 PCR에 의해 증폭되는 mRNA의 영역이고, GSP는 유전자 특이적 프라이머이다. 연장된 역방향 프라이머 (10b, 20b 및 30b)는 역방향 프라이머와 동일하지만, 약 10, 20 및 30 염기를 앰플리콘 내로 추가로 연장시킨다. 30b RT 프라이머의 3' 및 정방향 프라이 머의 3' 말단은 단일 염기에 의해 분리되어 있다.
도 12는 유방 종양 FPET RNA (클리노믹스 168)의 선택된 유전자 발현 분석을 보여준다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7700으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. 유전자 특이적 프라이머 (표준 프라이머) 또는 연장된 역방향 프라이머 (10b, 20b 및 30b 프라이머)를 사용하여 cDNA 합성을 프라이밍하였다. 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다.
도 13은 유전자 발현 측정에 사용되는 본 발명의 개선된 비드 기반 증폭 공정의 전체적인 처리 흐름을 보여주는 모식도이다. 이 도면에서, FPET는 "고정된 파라핀-포매 조직"이고, PNK는 "폴리뉴클레오티드 키나제"이고, EPAP는 "이. 콜라이 폴리A 중합효소"이고, 0-T7-(TTT)는 자성 폴리스티렌 비드에 부착된 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열 및 올리고데옥시티미딜레이트 서열로 이루어지는 cDNA 합성을 위한 고상의 고정된 프라이머이고, RT는 "역전사효소"이고, RNAse H는 "리보뉴클레아제 H"이고, DNA pol I는 "DNA 중합효소 I"이고, IVT는 "시험관내 전사"이고, cRNA는 IVT에 의해 생성된 "상보성 RNA"이고, O-(-) rRNA는 비드 고정된 상보성 리보좀 RNA 서열 (짧은 DNA 올리고뉴클레오티드로서 합성됨)이다. 개선된 비드 기반 프로토콜은 도면의 중앙부 (진한 화살표)로 표시하였다. 과정은 일반적으로 50-200 ng의 FPET RNA로 시작하고, 1) PNK를 사용한 말단 뉴클레오티드 상의 3'OH의 차단해제, 2) PNK 단계로부터의 정화 없이 FPET RNA 3'의 직접 EPAP 폴리 A 테일링, 3) 폴리아데닐화된 FPET RNA의 비드에 고정된 올리고 dT-T7 RNA 중합효소 프로모터 서열에 대한 혼성화, 4) RT를 사용한 cDNA 합성, 5) RNAse H에 의한 RNA 부분 분해 및 DNA 중합효소 I를 사용한 제2 가닥 DNA 합성 및 6) 시험관내 전사에 의한 RNA 증폭을 수반한다. IVT의 제2 라운드에 대한 선택적인 과정은 단계 7 (파선 화살표)로 도시하였다. 단계 2'에 도시된 다른 선택적인 단계는 리보좀 rRNA 단편 (점선 화살표)의 결실을 수반한다.
도 14는 다양한 PNK 정화 변형, 이어서 EPAP에 의한 폴리아데닐화의 결과를 보여준다. 좌측 패널은 Agilent 2100 Bioanalyzer를 이용한 마이크로모세관 전기영동에 의한 FPET RNA 크기를 보여준다. 레인 설명: 래더, 200 염기 (최저) 내지 6000 염기의 RNA 분자량 마커; SM, 비변형된 FPET RNA. 1-6, 우측 패널에 설명된 PNK 정화 조건. P/C는 페놀/클로로포름이고; DEPC-30 컬럼은 CHROMA SPIN™ DEPC-H20 30 컬럼이고, 열 불활성화 조건은 65℃, 20분이었다. EPAP 정화 후의 회수율은 투입 FPET RNA (1000 ng)에 비례한다.
도 15는 증폭된 유방 종양 FPET RNA (클리노믹스 바이오사이언시스)의 47개 유전자 패널 발현 분석을 보여준다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7900으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다. 삽입된 표는 각각의 정화 조건에 대해 프로파일링된 47개 유전자의 총 평균 Ct 및 각각의 IVT에 대한 cRNA 수득량을 보여준다. 정화 조건은 하기 실시예 2에서 설명된다.
도 16은 실시예 3에 기재되는 비-비드 기반 (유리 IVT) 및 비드 기반 (고상 IVT)에 의해 증폭된 태반 FPET RNA의 47개 유전자 패널 발현 분석을 보여준다. 비 교를 위해, 비증폭된 출발 물질 (SM)의 프로파일도 나타낸다. 태반은 포르말린으로 1.5-2h 동안 처리되고, 바이오파톨로지 사이언시스 메디컬 코포레이션에 의해 파라핀 포매되었다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7900으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다. 삽입된 표는 각각의 정화 조건에 대해 프로파일링된 47개 유전자의 총 평균 Ct 및 각각의 IVT에 대한 cRNA 수득량을 보여준다. 또한, 표준화 후의 수득량 (수득량; C조정된)도 제시된다. 표준화 식은 다음과 같다.
cRNA 수득량/2(평균 ct.-SM Ct.)
도 17A-C는 증폭된 태반 FPET RNA의 47개 유전자 패널 발현 분석을 보여준다. 태반은 포르말린으로 1.5-2h 동안 처리되고, 바이오파톨로지 사이언시스 메디컬 코포레이션에 의해 파라핀 포매되었다. 발현은 ABI Prism(등록상표) 7900으로 실시간 정량적 RT-PCR (TaqMan(등록상표))에 의해 분석하였다. 상대적 수득량은 역치 사이클 (Ct)로 측정한다. 삽입된 표는 각각의 FRA 조건에 대해 프로파일링된 47개 유전자의 총 평균 Ct 및 각각의 IVT에 대한 cRNA 수득량을 보여준다. 3개의 FRA 조건은 하기 실시예 4에 기재되어 있다. 도 17A 및 17B는 각각 제1 및 제2 증폭으로부터 얻은 결과를 보여준다. 도 17C는 제1 및 제2 IVT (조건 3)의 비교를 보여준다.
A. 정의
달리 정의하지 않으면, 본원에 사용된 기술 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 일반적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, NY 1994)]에서는 당업계의 숙련인에게 본원에서 사용된 많은 용어에 대한 일반적인 지침을 제공한다.
용어 "폴리아데닐화" 또는 "폴리 A 테일링"은 RNA, 예를 들어 mRNA의 3' 말단에 일련의 아데닐레이트 분자 (폴리(A))을 첨가하는 것을 의미한다.
"폴리아데닐화 효능"은 폴리 A 첨가가 일어나는 용이함을 의미하고, 이는 RNA의 3'-말단 리보스 잔기에서 유리 3'-히드록실 (3' OH)기의 이용가능성에 의존한다.
"폴리아데닐화의 차단" 또는 RNA의 "차단된 3' 말단"은 폴리아데닐화 반응을 위한 RNA의 3'-말단 리보스 잔기의 이용가능성을 차단하는 것을 의미한다. 이는 예를 들어 RNA의 3' 말단이 RNA의 3' 말단에 폴리 A 테일의 첨가를 허용하기 위해 제거해야 할 필요가 있는 각종 포스페이트 에스테르, 일반적으로 2'-3' 시클릭 포스페이트, 2'-모노포스페이트 및 3'-모노포스페이트를 함유하기 때문에 일어날 수 있다.
"탈인산화"는 효소적 기술, 예를 들어 송아지 소장 포스파타제 (CIP) 또는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK)를 사용하는 것을 포함하지만 이에 제한되지 않는 임의의 방법에 의한 포스페이트 에스테르 (상기함)의 제거를 의미한다.
"역치 사이클 (Ct)"는 PCR 반응에서 증폭된 핵산의 상대적 수득량을 의미한다. TaqMan PCR 동안, Taq 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성은 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 검출하는 제3 올리고뉴클레오티드 프라이머 (Taq 중합효소에 의해 비-연장성인) 상에 존재하는 켄칭된 리포터 (reporter) 염료를 절단하여 방출하기 위해 이용된다. 한 분자의 리포터 염료는 각각의 새로 합성된 핵산 분자에 대해 유리되고, 상기 켄칭되지 않은 리포터 염료의 검출은 증폭의 정량적 해석 또는 증폭 반응에서 상기 지점까지 증폭된 생성물의 양에 대한 기초를 제공한다. 형광 시그날이 통계학상 유의한 것으로 처음 기록될 때의 지점이 역치 사이클 (Ct)이다. Ct값이 낮을수록, mRNA가 보다 풍부하고 발현 프로파일링 어레이에서 핵산 (cDNA 또는 폴리 A mRNA 또는 분해된 mRNA)의 성능이 더 우수하다.
용어 "마이크로어레이"는 기판 상의 혼성화가능 어레이 요소의 질서정연한 (ordered) 배열을 의미한다.
용어 "폴리뉴클레오티드"는 단수 또는 복수로 사용될 때 일반적으로 임의의 폴리리보뉴클레오티드 또는 폴리데옥시리보뉴클레오티드를 의미하고, 이는 비변형된 RNA 또는 DNA, 또는 변형된 RNA 또는 DNA일 수 있다. 따라서, 예를 들어 본원에서 정의되는 폴리뉴클레오티드는 비제한적으로 단일가닥 및 이중가닥 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 영역을 포함하는 DNA, 단일가닥 및 이중가닥 RNA, 및 단일가닥 및 이중가닥 영역을 포함하는 RNA, 단일가닥 또는 보다 일반적으로 이중가닥이거나 단일가닥 및 이중가닥 영역을 포함할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하는 하이브리드 분자를 포함한다. 또한, 본원에서 사용되는 용어 "폴리뉴클레오티드"는 RNA 또는 DNA 또는 RNA와 DNA를 모두 포함하는 삼중가닥 영역을 의미한다. 상기 영역에서 가닥은 동일한 분자로부터 또는 상이한 분자로부터의 것일 수 있다. 영역은 하나 이상의 분자를 모두 포함할 수 있지만, 보다 일반적으로 분자의 일부의 영역만을 포함한다. 삼중나선 영역의 분자 중 하나는 종종 올리고뉴클레오티드이다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 구체적으로 하나 이상의 변형된 염기를 함유하는 DNA 및 RNA를 포함한다. 따라서, 안정성을 위해 또는 다른 이유로 변형된 주쇄를 갖는 DNA 또는 RNA는 본원에서 의도되는 "폴리뉴클레오티드"이다. 더욱이, 이상 염기, 예를 들어 이노신, 또는 변형된 염기, 예를 들어 삼중수소화 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA가 본원에 정의된 용어 "폴리뉴클레오티드"에 포함된다. 일반적으로, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 비변형된 폴리뉴클레오티드의 모든 화학적, 효소적 및(또는) 대사적으로 변형된 형태뿐 아니라, 바이러스 및 단순 및 복합 세포를 포함하는 세포에 특징적인 DNA 및 RNA의 화학 형태를 포괄한다.
용어 "올리고뉴클레오티드"는 단일가닥 데옥시리보뉴클레오티드, 단일가닥 또는 이중가닥 리보뉴클레오티드, RNA:DNA 하이브리드 및 이중가닥 DNA를 비제한적으로 포함하는 비교적 짧은 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 올리고뉴클레오티드, 예를 들어 단일가닥 DNA 프로브 올리고뉴클레오티드는 종종 화학적 방법에 의해, 예를 들어, 상업적으로 입수가능한 자동화 올리고뉴클레오티드 합성기를 사용하여 합성된다. 그러나, 올리고뉴클레오티드는 시험관내 재조합 DNA 매개 기술을 포함하는 다양한 다른 방법에 의해, 및 세포 및 유기체에서 DNA의 발현에 의해 제조할 수 있다.
상호교환가능하게 사용되는 용어 "차등 발현된 유전자", "차등 유전자 발현" 및 그의 동의어는 그의 발현이 정상 또는 비교 대상에서 그의 발현에 비해 질병, 구체적으로 암, 예를 들어 유방암에 걸린 대상에서 더 높거나 더 낮은 수준으로 활성화되는 유전자를 의미한다. 상기 용어는 또한 그의 발현이 동일한 질병의 상이한 단계에서 더 높거나 더 낮은 수준으로 활성화되는 유전자를 포함한다. 차등 발현된 유전자는 핵산 수준 또는 단백질 수준에서 활성화되거나 억제될 수 있거나, 상이한 폴리펩티드 생성물을 생성하기 위해 대안적인 스플라이싱 (splicing) 처리될 수 있음도 이해된다. 상기 차이는 예를 들어 폴리펩티드의 mRNA 수준, 표면 발현, 분비 또는 다른 분할에서의 변화로 증명될 수 있다. 차등 유전자 발현은 2개 이상의 유전자 사이의 발현의 비교, 또는 2개 이상의 유전자 사이의 발현비의 비교, 또는 심지어 동일한 유전자의 2개의 상이하게 처리된 생성물의 비교를 포함할 수 있고, 이는 정상 대상과 질병, 구체적으로 암에 걸린 대상 사이 또는 동일한 질병의 다양한 단계 사이에서 다르다. 차등 발현은 예를 들어, 정상 및 질병 세포 사이에서 또는 상이한 질병 사건 또는 질병 단계에 있는 세포들 사이에서 유전자 또는 그의 발현 생성물에서 일시적 또는 세포성 발현 패턴에서의 정량적 및 정성적 차이를 모두 포함한다. 본 발명을 위해, "차등 유전자 발현"은 정상 및 질병에 걸린 대상에서, 또는 질병에 걸린 대상에서 질병 발병의 다양한 단계에서 제시된 유전자의 발현 사이에 적어도 약 2배, 바람직하게는 적어도 약 4배, 보다 바람직하게는 적어도 약 6배, 가장 바람직하게는 적어도 약 10배 차이가 있을 때 존재하는 것으로 간주된다.
용어 "유전자 증폭"은 유전자 또는 유전자 단편의 다수 카피가 특정 세포 또는 세포주에서 형성되는 과정을 의미한다. 복제된 영역 (일련의 증폭된 DNA)은 종종 "앰플리콘"으로 불린다. 보통, 생산된 메신저 RNA (mRNA)의 양, 즉, 유전자 발현의 수준은 또한 발현된 특정 유전자로 이루어진 카피의 수에 비례하여 증가한다.
용어 "스플라이싱" 및 "RNA 스플라이싱"은 상호교환가능하게 사용되고, 인트론 (intron)을 제거하고 엑손 (exon)을 연결하여, 진핵 세포의 세포질 내로 이동하는 연속 코딩 서열을 갖는 성숙 mRNA를 생산하는 RNA 프로세싱을 의미한다.
이론상, 용어 "엑손"은 성숙 RNA 생성물에서 제시되는 비연속 유전자의 임의의 단편을 의미한다 (B. Lewin. Genes IV Cell Press, Cambridge Mass. 1990). 이론상, 용어 "인트론"은 전사되지만 그의 양쪽 상의 엑손을 함께 스플라이싱함으로써 전사체 내로부터 제거되는 DNA의 임의의 단편을 의미한다. 작동적으로, 엑손 서열은 서열 번호로 정의되는 바와 같은 유전자의 mRNA 서열에서 발생한다. 작동적으로, 인트론 서열은 엑손 서열에 의해 양끝이 에워싸인, 5' 및 3' 겅계에서 GT 및 AG 스플라이스 컨센서스 서열을 갖는 유전자의 게놈 DNA 내의 개재 서열이다.
본원에서 사용되는 용어 "종양"은 악성이든지 양성이든지에 무관하게 모든 신생물 세포 성장 및 증식, 및 모든 전암성 및 암성 세포 및 조직을 의미한다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 조절되지 않는 세포 성장을 특징으로 하는 포유동물의 생리학적 병을 의미하거나 설명한다. 암의 예는 유방암, 결장암, 폐암, 전립선암, 간세포암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 신장암, 암종, 흑색종 및 뇌암을 포함하지만 이로 제한되지 않는다.
암의 "병리학"은 환자의 안녕 (well-being)을 손상하는 모든 현상을 포함한다. 이는 비제한적으로 비정상 또는 제어가능하지 않은 세포 성장, 전이, 이웃 세포의 정상 기능의 저해, 사이토킨 또는 다른 분비성 생성물의 비정상 수준의 방출, 염증 또는 면역 반응의 억제 또는 악화 등을 포함한다.
B. 상세한 설명
본 발명의 실행은 달리 나타내지 않으면 당업계의 기술 범위 내에 있는 분자생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학 및 생화학의 통상의 기술을 사용할 것이다. 상기 기술은 문헌, 예를 들어 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2nd edition (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984); "Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Handbook of Experimental Immunology", 4th edition (D.M. Weir & C.C. Blackwell, eds., Blaclcwell Science Inc., 1987); "Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells" (J.M. Miller & M.P. Calos, eds., 1987); "Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); 및 "PCR: The Polymerase Chain Reaction" (Mullis et al., eds., 1994)]에 충분히 설명되어 있다. 구체적인 프로토콜은 하기 실시예의 재료 및 방법란에 기술된다.
앞서 논의된 바와 같이, 유전자 발현 프로파일링은 생물학 연구 및 임상 실무의 중요한 도구가 되고 있다.
실시간
역전사효소
PCR
(RT-
PCR
)
유전자 발현 프로파일링 기술 중에서, 가장 민감하고 가장 탄력적인 정량 방법은 RT-PCR이고, 이는 유전자 발현의 패턴을 특성화하고, 밀접하게 관련된 mRNA 사이를 구별하고, RNA 구조를 분석하기 위해 약물 처리와 함께 또는 약물 처리 없이 정상 및 종양 조직에서 상이한 샘플 집단에서 mRNA 수준을 비교하기 위해 사용될 수 있다.
RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링에서 제1 단계는 RNA 주형의 cDNA로 역전사이고, 이후 PCR 반응으로 그의 지수 증폭이 이어진다. 가장 흔히 사용되는 2가지 역전사효소는 조류 골수아세포증 바이러스 역전사효소 (AMV-RT) 및 몰로니 (Moloney) 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT)이다. 역전사 단계는 일반적으로 발현 프로파일링의 목표 및 상황에 따라 유전자 특이적 프라이머, 랜덤 헥사머, 또는 올리고-dT 프라이머를 사용하여 프라이밍된다. 예를 들어 추출된 RNA는 제조자의 지시에 따라 GeneAmp RNA PCR 키트 (퍼킨 엘머 (Perkin Elmer), 미국 캘리포니아주)를 사용하여 역전사될 수 있다. 이어서 유도된 cDNA는 후속적인 PCR 반응에서 주형으로서 사용될 수 있다.
PCR 단계는 다양한 열안정성 DNA-의존성 DNA 중합효소를 사용할 수 있지만 일반적으로 5'-3'뉴클레아제 활성을 갖지만 3'-5' 교정 엔도뉴클레아제 활성이 없는 Taq DNA 중합효소를 사용한다. 따라서, TaqMan(등록상표) PCR은 일반적으로 그의 표적 앰플리콘에 결합된 혼성화 프로브를 가수분해하기 위해 Taq 또는 Th 중합효소의 5'-뉴클레아제 활성을 이용하지만, 동등한 5' 뉴클레아제 활성을 갖는 임의의 효소가 사용될 수 있다. PCR 반응의 전형적인 앰플리콘을 생성하기 위해 2개의 올리고뉴클레오티드 프라이머가 사용된다. 제3 올리고뉴클레오티드 또는 프로브는 2개의 PCR 프라이머 사이에 위치하는 뉴클레오티드 서열을 검출하기 위해 설계된다. 프로브는 Taq DNA 중합효소에 의해 비연장성이고, 리포터 형광 염료 및 켄처 (quencher) 형광 염료로 표지된다. 리포터 염료로부터 임의의 레이저-유도 방사는 2개의 염료가 프로브 상에 있으므로 서로 가까이 위치할 때 켄칭 염료에 의해 켄칭된다. 증폭 반응 동안, Taq DNA 중합효소는 프로브를 주형-의존 방식으로 절단한다. 생성된 프로브 단편은 용액 중에서 해리되고, 방출된 리포터 염료로부터의 시그날은 제2 형광단의 켄칭 효과를 벗어난다. 한 분자의 리포터 염료는 합성된 각각의 새로운 분자에 대해 방출되고, 켄칭되지 않은 리포터 염료의 검출은 데이타의 정량적 해석을 위한 기초를 제공한다.
TaqMan(등록상표) RT-PCR은 상업적으로 입수가능한 장비, 예를 들어, ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ (퍼킨-엘머-어플라이드 바이오시스템즈 (Perkin-Elmer-Applied Biosystems), 미국 캘리포니아주 포스터 시티)) 또는 Lightcycler (로슈 몰레큘라 바이오케미칼스 (Roche Molecular Biochemicals), 독일 만하임)를 사용하여 수행할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, 5' 뉴클레아제 과정은 실시간 정량적 PCR 장치, 예를 들어 ABI PRISM 7700™ Sequence Detection System™ 상에서 실행된다. 상기 시스템은 열순환기 (thermocycler), 레이저, 전하결합 소자 (CCD), 카메라 및 컴퓨터로 이루어진다. 시스템은 샘플을 열순환기 상에서 96-웰 포맷에서 증폭시킨다. 증폭하는 동안, 레이저-유도된 형광 시그날은 모든 96웰에 대해 광섬유 케이블을 통해 실시간으로 수집되고, CCD에서 검출된다. 시스템은 장치를 실행하고 데이타를 분석하기 위한 소프트웨어를 포함한다.
5'-뉴클레아제 분석 데이타는 처음에 Ct, 또는 역치 사이클로서 표시한다. 상기 논의한 바와 같이, 형광값은 매 사이클 동안 기록되고 증폭 반응에서 상기 지점까지 증폭된 생성물의 양을 나타낸다. 형광 시그날이 통계학상 유의한 것으로 처음 기록될 때의 지점이 역치 사이클 (Ct)이다.
오차 및 샘플간 변동의 영향을 최소화하기 위해, RT-PCR은 보통 내부 표준물을 사용하여 수행한다. 이상적인 내부 표준물은 상이한 조직 사이에 일정한 수준으로 발현되고, 실험 처리에 의해 영향을 받지 않는다. 유전자 발현의 패턴을 표준화하기 위해 가장 빈번하게 사용된 RNA는 하우스키핑 (housekeeping) 유전자 글리세르알데히드-3-포스페이트-데히드로게나제 (GAPDH) 및 β-액틴에 대한 mRNA이다.
RT-PCR 기술의 가장 최근의 변형은 실시간 정량적 PCR이고, 이는 이중-표지된 플루오리게닉 (fluorigenic) 프로브 (즉, TaqMan(등록상표) 프로브)를 통해 PCR 생성물 축적을 측정한다. 실시간 PCR은 각각의 표적 서열에 대한 내부 경쟁자가 표준화를 위해 사용되는 정량적 경쟁 PCR, 및 샘플 내에 함유된 표준화 유전자 또는 RT-PCR을 위한 하우스키핑 유전자를 사용하는 정량적 비교 PCR 모두에 상용성이다. 추가의 상세한 내용은 예를 들어 문헌 [Held et al., Genome Research 6:986-994 (1996)]을 참조한다.
마이크로어레이
분석
유전자 발현 프로파일링을 위해 선택되는 다른 방법은 종종 마이크로어레이 기술이다. 본 방법에서, 관심있는 폴리뉴클레오티드 서열 (cDNA 및 올리고뉴클레오티드 포함)이 마이크로칩 기판 상에 플레이팅되거나 어레이된다. 이어서 어레이된 서열은 관심있는 세포 또는 조직으로부터의 특이적 DNA 프로브와 혼성화된다. RT-PCR 방법에서와 마찬가지로, mRNA의 공급원은 일반적으로 인간 종양 또는 종양 세포주, 및 대응하는 정상 조직 또는 세포주로부터 단리된 총 RNA이다. 따라서 RNA는 다양한 일차 종양 또는 종양 세포주로부터 단리될 수 있다. mRNA 공급원이 일차 종양인 경우, mRNA는 예를 들어 일상적인 임상 실무에서 정기적으로 제조되고 보존되는 동결되거나 보관된 파라핀 포매되고 고정된 (예를 들어, 포르말린-고정된) 조직 샘플로부터 추출될 수 있다.
마이크로어레이 기술의 구체적인 실시태양에서, cDNA 클론의 PCR 증폭된 삽입체 (insert)는 기판에 치밀 어레이로 도포된다. 바람직하게는 적어도 10,000 뉴클레오티드 서열이 기판에 도포된다. 각각 10,000 요소로 마이크로칩 상에 고정된 마이크로어레이된 유전자는 엄격한 조건 하의 혼성화에 적합하다. 형광 표지된 cDNA 프로브는 관심있는 조직으로부터 추출된 RNA의 역전사에 의해 형광 뉴클레오티드를 포함시켜 생성될 수 있다. 칩에 도포된 표지된 cDNA 프로브는 어레이 상의 각각의 DNA 점에 특이적으로 혼성화한다. 비특이적으로 결합된 프로브를 제거하기 위한 엄격한 세척 후, 칩을 공초점 레이저 현미경에 의해 또는 다른 검출 방법, 예를 들어 CCD 카메라에 의해 스캐닝한다. 각각의 어레이된 요소의 혼성화의 정량화는 대응하는 mRNA 풍부도의 평가를 허용한다. 이중 색상 형광을 이용하여, 2개의 RNA 공급원로부터 생성된 개별적으로 표지된 cDNA 프로브가 쌍으로 어레이에 혼성화된다. 따라서 각각의 구체화된 유전자에 대응하는 2개의 공급원로부터 전사체의 상대적인 풍부도가 동시에 결정된다. 소형화된 (miniaturized) 규모의 혼성화는 많은 수의 유전자에 대한 발현 패턴의 편리하고 신속한 평가를 제공한다. 상기 방법은 세포당 몇개의 카피로 발현되는 희귀 (rare) 전사체를 검출하기 위해 및 발현 수준에서 적어도 약 2배 차이를 재현가능하게 검출하기 위해 요구되는 감도를 갖는 것으로 보인다 (Schena et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 93(2):106-149 (1996)). 마이크로어레이 분석은 제조자의 프로토콜에 따라 상업적으로 입수가능한 장비에 의해, 예를 들어 Affymetrix GenChip 기술 또는 Incyte 마이크로어레이 기술을 사용함으로써 수행할 수 있다.
유전자 발현의 대규모 분석을 위한 마이크로어레이 방법의 개발에 의해 다양한 종양 종류에서 암 분류 및 결과 예측의 분자 마커를 체계적으로 검색할 수 있다.
유전자 발현 프로파일링을 위한 RNA 추출 및 증폭
RT-PCR 및 마이크로어레이 기술에 의한 유전자 발현 프로파일링에서 공통적인 단계는 생물학적 샘플로부터 mRNA의 추출이다.
mRNA 추출의 일반적인 방법은 당업계에 공지되어 있고, 분자생물학의 표준 교재 [Ausubel et al., Current Protocols of Molecular Biology, John Wiley and Sons (1997) 포함]에 개시되어 있다. 파라핀 포매 조직으로부터 RNA를 추출하는 방법은 예를 들어 문헌 [Rupp and Locker, Lab Invest. 56:A67 (1987) 및 De Andres et al., BioTechniques 18:42044 (1995)]에 개시되어 있다. 특히, RNA 단리는 시판회사, 예를 들어 퀴아겐 (Qiagen)으로부터 제조사의 지시에 따라 정제 키트, 버퍼 세트 및 프로테아제를 사용하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 배양액의 세포로부터의 전체 RNA는 퀴아겐 RNeasy 미니컬럼을 사용하여 단리할 수 있다. 다른 시판되는 RNA 단리 키트는 MasterPureTM 완전 DNA 및 RNA 정제 키트 (에피센터 (Epicentre), 미국 위스콘신주 메디슨) 및 파라핀 차단 RNA 단리 키트 (앰비온, 인크. (Ambion, Inc.))을 포함한다. 조직 샘플로부터의 총 RNA는 RNA Stat-60 (텔-테스트 (Tel-Test))를 사용하여 단리할 수 있다. 종양으로부터 제조된 RNA는 예를 들어 염화세슘 밀도 구배 원심분리에 의해 단리할 수 있다.
필요한 경우, DNA는 RNA 단리의 다양한 단계에서 DNase 또는 당업계에 잘 알려진 다른 기술에 의해 제거될 수 있다. 정제 후 RNA 농도의 분석 후, RNA를 임의의 공지의 발현 유전자 프로파일링 방법, 예를 들어 리포터 프로브의 5' 엑소뉴클레아제와 결합된 RT-PCR (TaqMan(등록상표) 타입 분석), 플랩 (flap) 엔도뉴클레아제 분석 (Cleavase and Invader 타입 분석), 올리고뉴클레오티드 혼성화 어레이, cDNA 혼성화 어레이, 올리고뉴클레오티드 라이게이션 분석, 3' 단일 뉴클레오티드 연장 분석, 및 생물학적 샘플 내에 특이적 mRNA 서열의 풍부도를 평가하기 위해 설계된 다른 분석으로 처리하기 전에 RNA 복구 및(또는) 증폭 단계가 필요할 수 있다.
시판 제품의 이용가능성 및 조직으로부터 RNA의 단리에 관한 이용가능한 광범한 지식에도 불구하고, 고정된 파라핀-포매 조직 시료 (FPET)로부터 핵산 (RNA)의 단리 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 그의 사용은 어렵다.
mRNA를 그의 자연 상태로 추출하고 유지하는 것이 어렵다는 것은 잘 알려져 있으며, 결과적으로, 다양한 생물학적 공급원, 구체적으로 보관된 고정된 파라핀-포매 조직 (FPET)으로부터 회복된 mRNA는 종종 단편화되고(되거나) 분해된다. 도 2는 1 내지 17년 보관된 포르말린-고정된 파라핀-포매된 (PFE) 유방암 샘플로부터 단리된 RNA의 예를 도시한다. RNA 분해는 보관 시간에 따라 진행하고, 17년의 보관 후 RNA는 평균 크기가 약 100 염기가 된다. 비교하면, 무손상 mRNA는 평균 크기가 약 1800-2000 염기이다.
상기 논의한 바와 같이, mRNA를 추출한 후 일반적으로 프라이머 의존 효소인 역전사효소 (RT)를 사용하여 cDNA로 전환시킨다. 무손상 mRNA의 cDNA로의 범용적 전환은 RT의 존재 하에 mRNA의 올리고 dT 프라이밍에 의해 효율적으로 수행된다.
PCR 반응 동안 올리고 dT를 사용하는 효과적인 프라이밍은 mRNA의 3' 말단에서 폴리 A 트랙의 존재에 의해 가능해진다. 도 3은 무손상 mRNA가 RT 및 올리고 dT 프라이밍에 의해 생성된 cDNA를 사용하는 TaqMan 분석에 의해 효율적으로 프로파일링될 수 있음을 보여준다. 또한 알 수 있는 바와 같이, 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 합성에 의한 고정된 파라핀 포매된 (FPET) 또는 랜덤하게 분해된 RNA (알칼리성 가수분해에 의해 수득한)의 프로파일링은 무손상 RNA에 비해 수득된 보다 낮은 TaqMan 시그날 (보다 높은 Ct)에 의해 판단할 때 극히 비효율적이다. 프로파일링된 유전자에 대해, 무손상 RNA로부터의 시그날은 FPET RNA로부터의 대응하는 시그날보다 평균 500-1000배 더 크다.
본 발명자들은 올리고 dT 프라이밍에 의한 FPET mRNA의 cDNA로 비효율적인 전환이 대부분의 분해된 mRNA가 폴리A 테일을 함유하지 않는다는 사실에 의한 것일 수 있다고 생각한다. 중요하게는, 도 3은 또한 분해된 RNA는 유전자-특이적 프라이머 (GSP)를 사용하여 효율적으로 프로파일링될 수 있음을 보여준다. 이는 발현된 유전자의 대부분의 영역이 무손상 mRNA에 대해 예상된 비율로 랜덤하게 단편화 RNA 내에 존재하는 것을 나타낸다. 상기 결과는 단편화된, 예를 들어 FPET mRNA 추출물에 대한 효과적인 범용 유전자 발현 프로파일링을 수행하는 것이 가능할 것임을 제시한다.
이를 위해, 먼저 RNA를 폴리아데닐화시킨 후 올리고 dT 프라이밍된 RT를 수행함으로써 FPET RNA를 전체적으로 역전사하는 것이 시도되어 왔다. 도 4에 도시된 바와 같이, 올리고 dT 프라이밍 전의 FPET RNA의 폴리아데닐화는 3개의 mRNA의 TaqMan 분석에 의해 평가시에 RNA의 cDNA로의 전환을 약 2 내지 4배 증가시켰다. 이 결과는 폴리아데닐화가 전체적인 역전사 및 후속 유전자 발현 프로파일링을 위한, 단편화된, 예를 들어 FPET RNA의 제조를 위한 유용한 방법일 수 있음을 시사하는 것으로 해석되었다. 그러나, 상기 시그날 증폭은 현재 사용되는 방법 중 RT에 의한 mRNA의 선택 영역의 cDNA로의 전환을 프라이밍하는 가장 효율적인 방법인 유전자 특이적 프라이머 (GSP)를 사용한 프라이밍에 의해 얻어지는 것의 일부에 불과하였다.
본 발명의 기초를 이루는 한 인식은 단편화 RNA의 cDNA로의 제한된 전환이, 단편화 RNA에서, RNA 단편의 큰 비율의 3' 말단이 차단되어 폴리아데닐화에 이용될 수 없다는 사실 때문이라는 것이다.
단편화된, 예를 들어 FPET RNA의 폴리아데닐화 수준을 모니터링하고 RNA 3' 말단이 차단되지 않을 때 유전자 발현 프로파일링에 대한 그의 효과를 결정하기 위한 모델 시스템이 개발되었다. 3개 유전자의 RNA 단편 (~100 염기)을 시험관내 전사 (IVT)에 의해 생성시킨 후, 모아서 폴리아데닐화시켰다. 폴리아데닐화는 Agilent 2100 BioAnalyzer로 모세관 전기영동으로 분석하였다. 도 5의 삽입 사진은 0.1 및 0.2 단위의 이. 콜라이 폴리A 중합효소 (EPAP)를 사용한 RNA의 테일링이 20 내지 200 아데닐레이트를 RNA에 추가함을 보여준다. 이어서, 폴리아데닐화된 RNA를 올리고 dT 프라이밍을 사용하여 cDNA로 역전사시키고, TaqMan 분석으로 분석하였다 (도 5). 도에서 알 수 있는 바와 같이, RNA (0.2 EPAP/올리고-dT)의 폴리아데닐화는 테일링되지 않은 RNA에 비해 TaqMan 시그날을 크게 증가시켰다.
상기 결과를 기초로 하여, 단편화된 FPET RNA의 대부분의 3' 말단이 아마도 통상 3' P04 또는 시클릭 2'-3' P04를 생성시키는 세포 RNAse를 사용한 효소 가수분해에 의해 차단되었다고 가정되었다. 상기 변형은 FPET RNA의 폴리아데닐화를 효과적으로 차단할 것이다.
본 발명의 방법의 변형에 따르면, 단편화된 mRNA의 cDNA로의 효과적인 전환은 RNA의 3' 말단의 차단해제로 출발한다. 송아지 알칼리성 포스파타제 (CIP) 또는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK)와 같은 임의의 포스파타제를 사용하여 일반적으로 분해된 RNA의 3' 말단 리보스 잔기에 생성된 2'-3' 시클릭 포스페이트, 2'-모노포스페이트 및 3'-모노포스페이트를 제거할 수 있다. 이것은 FPET RNA의 3' 말단에 폴리 A 중합효소에 의한 효율적인 폴리 A 첨가를 보장한다. PNK (또한 3'-포스파타제임)는 데옥시뉴클레오시드 3'-모노포스페이트, 데옥시뉴클레오시드 3'-, 5' 디포스페이트 및 3'-포스포릴-폴리뉴클레오티드의 3'-포스포릴기의 가수분해를 촉매한다. 세균 알칼리성 포스파타제, 새우 알칼리성 포스파타제, 및 그의 유도체와 같은 다른 포스파타제가 또한 상기 탈인산화 반응을 수행하기 위해 사용될 수 있다. 이제 3' 말단은 이용가능한 유리 3'OH를 갖는다.
탈인산화와 같은 효소 반응 후 mRNA 또는 FPET mRNA의 폴리아데닐화 또는 "폴리 A 테일링"은 아데닐레이트 분자 또는 폴리 (A)를 RNA의 3'OH 말단에 부가하는 것을 포함한다. 한 실시태양에서, 이는 이. 콜라이 폴리 A 중합효소를 사용하여 수행된다. 그러나, 당업계의 숙련인이 이해하는 바와 같이, 다른 폴리 A 중합효소도 또한 사용될 수 있다.
구체적인 실시태양
본 발명의 3가지 대표적인 프로토콜 (A, B 및 C)를 도 1에 예시한다. 과정 A 및 B는 FPET RNA를 사용하여 개시하고, 1) 말단 뉴클레오티드 상의 3'OH의 직접 또는 간접 차단해제, 2) 3' 말단의 폴리 A 테일링, 3) T7 RNA 중합효소 프로모터를 포함시켜 올리고 dT-프라이밍된 이중가닥 cDNA 합성, 및 4) 시험관내 전사에 의한 RNA 증폭을 포함한다.
과정 C (도표에서 중앙 화살표)는 FPET RNA를 사용하여 개시하고, 1) T7 RNA 중합효소 프로모터를 포함시켜 T7-(N)15 프라이밍된 이중가닥 cDNA 합성, 2) 시험관내 전사에 의한 RNA 증폭을 포함한다.
구체적으로, 프로토콜 A는 FPET cDNA의 말단 뉴클레오티드 상의 유리 3'OH를 사용하여 cDNA를 생성하는 랜덤 프라이밍된 (헥사머) cDNA 합성을 포함한다. 이어서 FPET cDNA는 터미날 트랜스퍼라제 (TdT) 및 dATP를 사용하여 테일링된다. 이어서 폴리 dA-테일링된 cDNA는 DNA 중합효소 I (Klenow) 및 T7-(dT)24 프라이머를 사용하여 이중가닥 DNA로 전환된다. 이어서 상기 물질은 T7 RNA 중합효소 및 rNTP를 사용하여 증폭되어 FPET RNA (+ 가닥)를 생성한다. 상기 물질은 TaqMan(등록상표)에 의한 유전자 발현 분석에 적합하다. (+) 가닥 프로브를 함유하는 마이크로어레이에 적합한 표적으로 되기 위해, FPET RNA는 비오티닐화된 dNTP, 랜덤 프라이머 및 RT의 존재 하에 (-) 가닥 cDNA로 전환될 필요가 있다. 상기 물질은 이제 범용 유전자 발현 프로파일링을 수행하기 위해 마이크로어레이에 혼성화하기에 적합하다. 이중가닥 프로브를 함유하는 마이크로어레이에 대해, 상기 최종 단계는 필수적이지 않다. 이 경우, IVT 단계는 프로토콜 B (하기)에서와 같이 비오틴-rNTP를 포함해야 한다.
프로토콜 B는 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK) 또는 [pH2 처리 (0.01M HCl 또는 말레산)]에 이어 송아지 소장 알칼리성 포스파타제 (CIP)에 의한 FPET RNA의 3'-말단 뉴클레오티드의 2'OH 및(또는) 3'OH의 차단해제를 포함한다. 이에 의해 RNA는 이. 콜라이 폴리A 중합효소 및 ATP를 사용하여 3' 말단 뉴클레오티드에서 효율적으로 폴리아데닐화될 수 있다. 폴리아데닐화에 이어, RNA는 프라이머로서 올리고 dT 또는 올리고 dT-T7을 사용하여 역전사효소에 의해 cDNA로 전환된다. 올리고 dT 프라이밍된 cDNA는 TaqMan(등록상표) 분석에 의한 유전자 발현 분석에 직접 사용될 수 있다. 상기 방법은 FPET RNA의 양이 제한적인 아닌 경우 바람직하다. FPET RNA의 양이 제한적이면, 바람직한 방법은 올리고 dT-T7 프라이밍된 cDNA를 사용하고, DNA 중합효소 I 및 RNAse H를 사용하여 이를 이중가닥 DNA로 전환시키고, 후속적으로 T7 RNA 중합효소 및 rNTP를 사용하여 이를 증폭시키는 것이다. 샘플을 마이크로어레이 분석에 사용해야 하는 경우, 올리고 dT-T7 프라이밍된 cDNA는 상기한 바와 같이 이중가닥 DNA로 전환되고, 후속적으로 T7 RNA 중합효소 및 비오티닐화된 rNTP를 사용하여 증폭된다. 다시, 상기 프로토콜에 의해 FPET RNA 또는 보다 일반적인 의미에서 임의의 기원의 단편화 RNA를 사용하는 범용 유전자 발현 프로파일링이 가능해진다.
본 발명의 부가적인 프로토콜을 도 11에 나타낸다. 상기 프로토콜에서, RT 단계는 정상 RT 조건 하에 도시된 바와 같은 보다 긴 역방향 프라이머 (10 염기, 20 염기 및 30 염기)를 사용함으로써 증강된다. 보다 긴 프라이머는 단편화 RNA의 프라이밍을 증가시킬 수 있어서 PCR 단계를 위한 보다 많은 cDNA 표적을 생성시킨다. 추가로, 보다 긴 프라이머는 그렇지 않으면 효소 활성을 차단하는 포르말린-변형된 염기를 가교시켜 역전사를 도울 수 있다. 부가적인 변형은 50℃에서 PCR의 초기 2회 사이클을 수행하는 것을 포함한다. 이것은 보다 낮은 어닐링 온도에 의해 보다 많은 표적 cDNA의 증폭을 가능하게 한다. 상기 단계는 모두 보다 강한 유전자 발현 시그날을 생성시킨다.
추가의 실시태양은 상기 논의한 바와 같이 단편화 RNA 프로토콜 (FRA)의 범용적 증폭에 대해 몇 가지 추가의 개선을 제공한다. 상기 개선된 과정은 보다 소량 (50 ng)의 고도로 단편화된 FPET RNA 샘플의 전체적인 역전사 및 증폭을 자동화 가능한 고상 비드 포맷으로 가능하게 한다. 또한, 상기 개선은 상기 논의한 FRA에 관련된 효소 단계 사이의 정화 횟수를 감소시켜 과정을 보다 고효율 과정으로 만든다. 또한, 개선은 완전한 단편화 RNA 트랜스크립톰 (transcriptome)이 비드 상에 보관되는 것을 가능하게 한다. 단편화되었지만, 보관된 RNA는 쉽게 재증폭되어 생검 또는 절단된 종양 조직 및 보관된 파라핀 포매 조직 샘플에서 모든 발현된 유전자의 mRNA 수준의 재현가능한 측정을 허용한다. 최종적으로, 상기 과정은 또한 유전자 발현 분석의 감도를 증가시키는 mRNA의 농축 단계를 쉽게 포함할 수도 있다.
신속한 범용 FPET RNA 증폭 과정은 발현 프로파일링될 수 있는 유전자의 수 및 일반적으로 제한된 양의 가치있는 임상 샘플을 사용하여 수행할 수 있는 연구의 수를 크게 증가시켜야 한다.
개선된 비드 기반 프로토콜을 생성시키기 위해 포함되는, 기본 프로토콜에 대한 특정 개선 및 변경은 다음과 같다:
(a) PNK를 사용한 FPET RNA의 3' 말단의 탈차단과 EPAP를 사용한 RNA의 폴리아데닐화 사이의 정화 단계의 제거;
(b) 단계 (a)에서 얻은 폴리아데닐화된 단편화 RNA의 고상 비드 포맷에 대한 혼성화; 이 단계는 단계 (c) 전의 혼성화를 통한 rRNA 서열의 제거에 의해 mRNA에 대한 선택적인 농축 단계를 가능하게 한다;
(c) 단계 (b)의 비드 고정된 RNA의 cDNA로의 전환 및 및 후속적으로 이중가닥 DNA로의 전환;
(d) 단계 (c)에서 얻은 이중가닥 DNA를 RNA 중합효소를 사용하는 시험관내 전사에 적용시켜 RNA의 증폭. 비드에 대한 단계 (c) 및 (d)의 수행은 또한 효소 단계 사이의 정화 시간을 감소시킨다;
(e) 출발 FPET RNA 샘플 크기의 200 ng으로부터 50 ng으로의 감소;
(f) 비드 고정된 이중가닥 DNA로서 FPET RNA 라이브러리를 보관하고, 부가적인 RNA를 제조하기 위해 물질을 재증폭할 수 있는 능력.
개선은 도 13에 제시되어 있다. 방법은 FPET RNA (일반적으로 50-200 ng)으로 출발하고, 1) PNK를 사용한 말단 뉴클레오티드 상의 3'OH의 차단해제, 2) PNK 단계로부터의 정화 없이 FPET RNA 3'의 직접 EPAP 폴리 A 테일링, 3) 폴리아데닐화된 FPET RNA의 비드에 고정된 올리고 dT-T7 RNA 중합효소 프로모터 서열에 대한 혼성화, 4) RT를 사용한 cDNA 합성, 5) RNAse H에 의한 부분 RNA 분해 및 DNA 중합효소 I을 사용한 제2 가닥 DNA 합성 및 6) 시험관내 전사에 의한 RNA 증폭을 수반한다. IVT의 제2 라운드에 대한 선택적인 과정은 단계 7 (파선 화살표)로 도시하였다. 단계 2'에 도시된 다른 선택적인 단계는 리보좀 rRNA 단편 (점선 화살표)의 결실을 수반한다.
핵산 혼성화에 사용되는 비드는 상업적으로 입수가능한 마이크로비드, 예를 들어 Dynal 2.8-㎛ 자기 스트렙타비딘 비드 (M-280) 또는 Dynabead(등록상표) MyOne™ 스트렙타비딘 (다이날 바이오테크 (Dynal Biotech), 노르웨이 오슬로)일 수 있다. 스트렙타비딘 비드는 5' 또는 3' 비오티닐화된 핵산에 쉽게 부착될 수 있다. 비드 기재 고정된 올리고 dT는 mRNA 정제 (Hornes, E. and Korsnes, L. (1990), Genet. Anal. Tech. Appl. 7:145; Jacobsen, K., Breivold, E. and Hornes, E. (1990) Nucleic Acids Res. 18: 3669) 및 후속 aRNA 증폭 (Eberwine, J.(l 995), Biotechniques 20:584)에 매우 유용하였다.
단편화 RNA의 3' 말단의 탈인산화, 폴리아데닐화, 연장된 프라이머를 사용하는 후속 역전사, 및 증강된 PCR을 포함하여 본 발명의 추가의 상세한 내용은 하기 비제한적인 실시예에 의해 설명된다.
참조
실시예
1
하기 실시예 1에서, 다음 방법을 사용하였다.
FPET
RNA 추출 과정
RNA는 3-10 ㎛ 절편 (각 환자에 대해)으로부터 추출하였다. 파라핀을 크실렌 추출, 이어서 에탄올 세척에 의해 제거하였다. RNA를 MasterPureTM 정제 키트 (에피센터 테크놀로지스 (Epicentre Technologies), 미국 위스콘신주 메디슨)를 사용하여 섹션된 조직 블록으로부터 단리하고, DNase I 단계를 포함하였다. FPET RNA를 공급처(클론테크 (Clontech), 미국 팔로 알토)에서 제시한 바와 같이 CHROMA SPINTM DEPC-H20 30 컬럼을 통해 여과하여 추가로 정제하였다. 간단히 설명하면, 30 ㎕의 50-300 ng/㎕ FPET RNA를 컬럼 (2500 rpm (664 x g)에서 5분 동안 5417C 에펜도르프 원심분리기에서 예비 회전시킴)에 로딩하고, 컬럼을 통해 회전시키고 (예비 회전시와 동일 조건), -80℃에서 보관하였다. 도 2는 1 내지 17년 보관된 포르말린 고정된, 파라핀 포매된 (FPE) 유방암 샘플로부터 단리한 RNA의 예를 보여준다.
양성 대조군 상보성 RNA (
cRNA
) 합성
유전자 HER2, GAPDH, 및 CYP를 위한 앰플리콘에 상보성인 작은 RNA 단편은 2 단계로 생성시켰다. 1) 상기 유전자를 위한 앰플리콘에 상보성이고 그의 5' 말단에 T7 RNA 중합효소 부위를 포함하는 단일가닥 DNA 단편을 합성하고 (IDT, 미국 아이오와주 코랄빌), PCR에 의해 증폭하였다. 2) PCR 생성물은 CHROMA SPINTM TE-30 컬럼을 사용하여 정제하고, cRNA를 AmpliScribeTM T7 전사 키트 (에피센터 테크놀로지스)를 통해 생성시키고, CHROMA SPINTM DEPC-H20 30 컬럼을 사용하여 정제하였다.
FPET
RNA 3'말단의
탈인산화
FPET RNA의 3'-말단을 2'-3' 시클릭 포스페이트, 2'-모노포스페이트 및 3'-모노포스페이트를 제거하기 위해 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK) 또는 0.01M HCl 및 송아지 알칼리성 포스파타제 (CIP)로 처리하였다. 이들 다양한 포스페이트 에스테르는 분해된 RNA의 3' 말단 리보스 잔기에서 일반적으로 발견되고, FPET RNA의 3' 말단에 효율적인 폴리 A 첨가를 보장하기 위해 제거될 필요가 있다.
PNK
처리
20 ㎕ 반응 부피에서, 100-5000 ng의 FPET RNA를 37℃에서 1시간 동안 1X PNK 버퍼 (70 mM Tris-HCl pH 7.6, 10 mM MgCl2, 5 mM 디티오트레이톨) 중 20 단위의 PNK (엔이바이오랩스 (NEBiolabs), 미국 매사추세츠주 비벌리) 및 40 단위의 RNaseOUT™ (인비트로겐 (Invitrogen), 미국 캘리포니아주 칼스배드)와 함께 인큐베이팅하였다. 20 ㎕의 RNAse 부재 H20를 첨가하고 40 ㎕의 페놀:CHCl3:IAA (25:24:1) pH 6.6 (앰비온, 인크., 미국 텍사스주 오스틴)로 추출하여 반응을 종결하였다. 14,000 x g에서 1-2분 동안 원심분리한 후, 수상을 제거하고, CHROMA SPINTM DEPC-H20 30 컬럼 상에 통과시키고 Savant 스피드 진공을 사용하여 부피를 12.5 ㎕로 감소시켰다.
CIP 처리
20 ㎕ 반응 부피에서, 100-5000 ng의 FPET RNA를 25℃에서 10 mM HCl 중에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다. 이어서 FPET RNA를 상기한 바와 같이 CHROMA SPINTM DEPC-H20 30 컬럼 상에 통과시키고, 1X NEBuffer 3 (10 mM NaCl, 5 mM Tris-HCl, pH 7.9, 1 mM MgCl2, 1mM 디티오트레이톨) 중에서 10 단위의 CIP (뉴 잉글랜드 바이오랩스 (New England Biolabs), 미국 매사추세츠주 비벌리) 및 40 단위의 RNaseOUTTM (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드)와 함께 37℃에서 30분 동안 인큐베이팅하였다. 20 ㎕의 RNAse 부재 H20를 첨가하고 40 ㎕의 페놀:CHCl3:IAA (25:24:1) pH 6.6 (앰비온 인크.)로 추출하여 반응을 종결하였다. 14,000 x g에서 1-2분 동안 원심분리한 후, 수상을 제거하고, CHROMA SPINTM DEPC-H20 30 컬럼 상에 통과시키고 Savant 스피드 진공을 사용하여 부피를 12.5 ㎕로 감소시켰다.
FPET
RNA의
폴리아데닐화
100-5000 ng의 탈포스포릴화 FPET RNA를 37℃에서 (20 ㎕ 반응 부피) 1X EPAP 버퍼 (앰비온 인크.) 중 1.0 단위의 이. 콜라이 폴리 A 중합효소 (EPAP), 1 mM ATP 및 40 단위의 RNAseOUTTM (인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드)와 함께 15분 동안 인큐베이팅하였다. 20 ㎕의 RNAse 부재 H20를 첨가하고 40 ㎕의 페놀:CHCl3:IAA (25:24:1) pH 6.6 (앰비온 인크.)로 추출하여 반응을 종결하였다. 14,000 x g에서 1-2분 동안 원심분리한 후, 수상을 제거하고, CHROMA SPINTM DEPC-H20 30 컬럼 상에 통과시켰다.
FPET
RNA 분석
RNA는 RiboGreen 형광 방법 (몰레큘라 프로브스 (Molecular Probes))를 사용하여 정량하였다. RNA 크기는 Agilent 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지스 (Agilent Technologies), 미국 캘리포니아주)를 사용하는 마이크로모세관 전기영동에 의해 분석하였다.
TaqMan
(등록상표)
프라이머
/
프로브
각 유전자에 대해, 본 발명자들은 유전자에 대한 적절한 mRNA 참조 서열 (REFSEQ) 번호를 확인하고 NCBI Entrez Nucleotide 데이타베이스를 통해 서열을 입수하였다. 프라이머 및 프로브는 Primer Express (어플라이드 바이오시스템즈) 및 Primer 3 프로그램 [Steve Rozen and Helen J. Skaletsky (2000), Primer3 on the WWW for general users and for biologist programmers. In: Krawetz S, Misener S (eds) Bioinformatics Methods and Protocols: Methods in Molecular Biology. Humana Press, Totowa, NJ, pp 365-386]를 사용하여 설계하였다. 올리고뉴클레오티드는 바이오리서치 테크놀로지스 인크 (Biosearch Technologies Inc., 미국 캘리포니아주 노바토) 및 인테그레이티드 디엔에이 테크놀로지스 (Integrated DNA Technologies, 미국 아이오와주 코랄빌)에서 공급되었다. 앰플리콘 크기는 85 염기로 제한하였다. 플루오로게닉 (Fluorogenic) 프로브는 5'-FAM 및 3'-BHQ1로 이중 표지하였다.
역전사
역전사는 RT-PCR용 SuperScript™ 제1 가닥 합성 키트 (인비트로겐 코퍼레이션, 미국 캘리포니아주 칼스배드)를 사용하여 수행하였다. 반응은 총 FPET RNA (3-50 ng/㎕) 및 모아진 유전자 특이적 프라이머 (각각 100 nM) 또는 올리고(dT) 프라이머 (25 ng/㎕) 또는 올리고(dT)-T7 프라이머 (0.25-5.0 μM)를 사용하여 수행된다. 연장된 프라이머 역전사를 위해, 반응은 설명된 바와 같이 제1 가닥 cDNA 합성 키트용 Omniscript 역전사효소 (퀴아겐, 미국 캘리포니아주 발렌시아)를 사용하여 수행하였다. 총 FPET RNA (3-50 ng/㎕) 및 모아진 연장된 유전자 특이적 프라이머는 각각 3-50 ng/㎕ 및 100 nM (각 프라이머)의 농도로 사용되었다.
제2 가닥 DNA 합성
100-5000 ng FPET RNA로부터 유도된 제1 가닥 cDNA 합성 생성물을 16℃에서 1X 제2 가닥 버퍼 [20 mM Tris-HCl, pH 6.9; 4.6 mM MgCl2; 90 mM KC1; 0.15 mM β-NAD+; 10 mM (NH4)2S04], 0.2 mM dNTP 믹스, 10 유닛 DNA 리가제, 40 단위 DNA 중합효소 1, 및 2 단위 RNase H (모든 시약은 인비트로겐, 미국 캘리포니아주 칼스배드) 중에서 2시간 동안 인큐베이팅하였다 (150 ㎕ 반응 부피). 이어서, 9 유닛 T4 DNA 중합효소 (엔이바이오랩스)를 첨가하고, 반응 혼합물을 추가로 15분 동안 인큐베이팅하였다. DNA를 캐리어로서 5 ㎍의 글리코겐과 함께 5M 아세트산암모늄 및 100% 에탄올을 사용하여 침전시켰다.
시험관내
전사 (
IVT
)
침전된 ds-DNA (상기 제조된)를 8 ㎕ 뉴클레아제 부재 H20에 재현탁시키고, IVT 반응 (총 20 ㎕)을 MEGAscriptTM T7 키트 (앰비온 인크.)를 사용하여 수행하고, 4시간 동안 37℃에서 진행시켰다. 후속적으로, 반응 부피를 뉴클레아제 부재 H20로 40 ㎕로 증가시키고, cRNA를 3M 아세트산나트륨 및 100% 에탄올로 침전시켰다. 침전된 cRNA를 20-40 ㎕ 뉴클레아제 부재 H20 중에 재현탁시켰다.
TaqMan
(등록상표) 유전자 발현 프로파일링
ABI 7900(등록상표) 운전을 위해, TaqMan(등록상표) 반응을 1X Universal PCR Master Mix 및 1 ng의 전체 RNA의 동등물로부터 제조된 cDNA로 구성된 2개의 5 ㎕ 반응물 중에서 수행하였다. 최종 프라이머 및 프로브 농도는 각각 0.9 μM (각각의 프라이머) 및 0.2 μM이었다. PCR 사이클링은 ABI Prism(등록상표) 7900으로 95℃ 10분 x 1 사이클, 95℃ 20초, 60℃ 45초 x 40 사이클로 수행하였다. 7700 운전을 위해, TaqMan(등록상표) 반응을 1X PCR 버퍼 A, 4 μM MgCl2, 0.2 μM dNTP, 0.025 U/㎕ AmpliTaq GoldTM DNA 중합효소 (어플라이드 바이오시스템즈), 및 및 2.5 ng의 전체 RNA의 동등물로부터 제조된 cDNA로 구성된 3개의 25 ㎕ 반응물 중에서 수행하였다. 최종 프라이머 및 프로브 농도는 상기한 바와 같다. PCR 사이클링은 상기한 바와 같이 ABI Prism(등록상표) 7700으로 수행하였다. 변형된 PCR 프라이밍 실험을 위해, PCR 사이클링은 ABI Prism(등록상표) 7700으로 95℃ 10분 x 1 사이클, 95℃ 20초, 50℃ 2분 x 2 사이클, 95℃ 20초, 60℃ 45초 x 38 사이클로 수행하였다.
실시예
1
표준 프로토콜
RNA를 각각 2'-3' 시클릭 포스파타제 활성 및 3' 포스파타제 활성을 갖는 효소인 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK) 또는 송아지 소장 알칼리성 포스파타제 (CIP)로 처리하였다. 처리된 FPET RNA의 모세관 전기영동 [Agilent 2100] 분석은 비처리된 RNA에 비해 효소 처리된 RNA의 이동성이 경미하게 감소한 것에 의해 판단되는 바와 같이 FPET RNA의 PNK 또는 CIP 처리가 차단 포스페이트를 제거함을 시사하였다 (도 6A). 전기영동 이동성의 감소는 대전된 포스페이트기의 제거가 FPET RNA의 전하/질량비를 감소시킬 것이기 때문에 예상되었다.
FPET RNA의 3' 말단으로부터 차단 포스페이트가 효과적으로 제거되면, RNA의 폴리아데닐화가 가능하여야 한다. FPET RNA를 PNK로 처리한 후 EPAP로 처리하면 (+PNK/+EPAP), FPET RNA의 전기영동 이동성이 유의하게 감소하였다 (도 6B). 이동성 변경이 단순히 탈인산화가 아니라 폴리아데닐화에 의한 것인지를 확인하기 위해서, PNK 단독 처리 (+PNK/-EPAP) 및 비처리 (-PNK/-EPAP) 대조군을 포함하였다. 이동성의 유일한 유의한 감소는 PNK와 EPAP를 모두 처리한 경우에 관찰되었다. 따라서, 차단해제, 탈인산화 단계 (PNK 또는 CIP 처리)에 이어 EPAP에 의한 폴리아데닐화 단계의 조합이 아마도 FPET RNA를 폴리아데닐화된 형태로 효율적으로 전환시켰다. 상기 폴리아데닐화된 RNA는 올리고 dT 프라이머 및 RT를 사용하는 범용적 cDNA 합성에 적합해야 한다.
범용적 cDNA 합성에 대한 폴리아데닐화의 유효성을 시험하기 위해, FPET RNA는 PNK 또는 CIP를 사용하거나 사용하지 않고 처리한 후 EPAP에 의해 폴리아데닐화되고, cDNA 풍부도는 TaqMan(등록상표) RT-PCR에 의해 측정한다. PNK (도 7) 또는 CIP (도 8) 처리 후 폴리아데닐화 및 올리고-dT 프라이밍된 RT-PCR은 비-PNK (4-32배) 또는 비-CIP (8-16배) 처리된 샘플에 비해 cDNA 수득량을 유의하게 증가시켰다. 이는 3' 말단을 차단해제하면 폴리아데닐화 및 올리고 dT 프라이밍된 cDNA 합성의 효능을 크게 증가시키는 것을 나타내었다. 예상되는 바와 같이, 폴리아데닐화는 GSP 프라이밍된 cDNA 합성에 거의 영향을 끼치지 않았다. 중요하게는, GSP 양성 대조군은 상기 범용적 프라이밍 방법이 현재 가장 효과적인 프라이밍 방법인 GSP 프라이밍만큼 효과적으로 cDNA를 25-50% 증폭시킨 것을 나타내었다.
추가의 실험에서, cDNA를 각각 올리고 dT 프라이머 또는 GSP 프라이머를 사용하여 폴리아데닐화된 FPET RNA (PNK 및 EPAP 처리된) 및 폴리아데닐화되지 않은 FPET RNA로부터 합성하였다. 본 실험에서, 96개의 모아진 GSP 프라이머를 사용하였고, 96 유전자의 발현을 TaqMan(등록상표) RT-PCR (1 ng FPET RNA/웰을 사용함, 384 웰; ABI Prism(등록상표) 7900 기구)에 의해 분석하였다. 도 9에 나타낸 데이타는 GSP-프라이밍된 (pA_GSP1) cDNA에 대한 Ct값의 유사성에 의해 판단할 때 폴리아데닐화된 FPET RNA가 효율적으로 cDNA (pA-dT)로 전환되었음을 증명한다. 많은 유전자에 대해, 폴리아데닐화된 FPET RNA는 GSP 프라이밍보다 올리고 dT 프라이밍을 사용하여 보다 우수한 시그날을 제공한다. 표 1은 도 9로부터 데이타의 통계학적 요약을 보여준다. 좌측 패널은 올리고 dT를 사용하는 RT 전에 FPET RNA의 폴리아데닐화는 유전자의 77%를 검출한 반면 (Ct < 38), 폴리아데닐화되지 않은 RNA는 단지 16% 검출가능한 유전자를 생성시킴을 나타낸다. 더욱이, 폴리아데닐화된 RNA의 GSP 및 올리고 dT 프라이밍에 의해 생성된 cDNA의 유전자 발현 프로필 사이에 유의한 상관관계가 존재한다 (피어슨 R=0.77). GSP 및 폴리아데닐화되지 않은 올리고 dT 프라이밍된 RT에 의해 생성된 cDNA의 유전자 발현 프로필 사이에는 상관관계가 없다 (R=0.11).
상기 방법에 대한 다른 유용한 개선은 FPET RNA를 폴리아데닐화에 이어 범용적으로 증폭될 수 있도록 올리고 dT 프라이머 상에 T7 RNA 중합효소 부위를 포함시키는 것이다. 도 10 (A-C)는 3가지 상이한 RNA 공급원로부터 46개 유전자의 발현에 대한 폴리아데닐화 및 시험관내 전사 (IVT) [T7 RNA 중합효소 증폭 (Van Gelder et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 87(5): 1663-7 (1990)]의 효과를 증명하고, 도 10A는 고품질 무손상 RNA (스트라타젠)으로부터 발현 프로파일을 보여준다. IVT는 GSP 프라이밍된 RT에 의해 생성된 cDNA (GSP; 비-증폭된 대조군), 및 후속적으로 IVT에 의해 증폭되는 올리고 dT-T7 프라이밍된 RT에 의해 생성된 cDNA (No EPAP IVT)를 비교할 때 모든 46개 유전자 (삽입 사진 참조)의 평균 TaqMan 시그날을 ~6배 증가시켰다. cDNA 합성 및 IVT 전에 RNA의 폴리아데닐화는 총 TaqMan 시그날에 대해 부가적인 효과가 없었다 (EPAP IVT-1 및 IVT-2). 도 10B 및 10C는 각각 중정도 분해된 FPET RNA (바이오패쓰 플라센타 (BioPath Placenta)) 및 거의 분해되지 않은 FPET RNA (클리노믹스 168)로부터 생성된 유전자 발현 프로필을 보여준다. 이들 경우에, 폴리아데닐화는 RNA의 IVT 증폭에 필수적인 단계이었다. 도시된 바와 같이, 이중 실험로부터 평균 TaqMan 시그날 (EPAP IVT 평균)은 폴리아데닐화되지 않은 RNA로부터 IVT에 의해 생성된 시그날 (No EPAP IVT)보다 ~2.5 Ct (6배) 더 낮았다. 중요하게는, 유전자 프로파일은 피어슨 상관계수 (R=0.91-0.96)로 나타낼 때 IVT 후에 유지된다. 요약하면, 분해된 FPET RNA의 폴리아데닐화는 샘플 내에 존재하는 각각의 유전자에 대응하는 cDNA를 전체적으로 합성하기 위해 유용한 방법이다. 상기 cDNA는 IVT에 의해 유전자 시그날을 정확하고 재현가능하게 추가로 증폭하기 위해 사용될 수 있다.
유전자 발현 시그날의 증강을 위한 다른 개선이 도 12에 도시된다. 본 예에서, 프라이머를 연장시킬 때 6개 유전자의 검출이 증강되었다. 프라이머 길이를 표준 역방향 프라이머 (GSP) 길이를 넘어 20-30 염기를 더 연장시키면 유전자 발현 시그날을 10-15배 증가시켰다. 추가로, 후속 PCR의 처음 2 사이클을 60℃보다는 50℃에서 수행하는 경우, 유전자 발현 시그날은 수배 더 증가하였다.
참조
실시예
2
달리 나타내지 않으면, 하기 실시예 2-5에서 아래 재료 및 방법을 사용하였다.
재료
MyOne 스트렙타비딘-코팅된 미세구: 다이날, 2 mL, 10 mg/mL.
비오틴-에버윈 (Eberwine) 프라이머: IDT, 100 pmol/μL 원액 (100 uM).
5'-비오틴-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3'
(서열 1)
T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK): 뉴 잉글랜드 바이오랩스, 2,500 단위, 10 U/μL. w/a 10X 반응 버퍼로 입수.
RNase 억제제: 어플라이드 바이오시스템즈, 20 U/μL.
뉴클레아제 부재 H20: 앰비온.
폴리(A) 테일링 키트: 앰비온. 키트에 사용된 품목 - 이. 콜라이 폴리(A) 중합효소 (EPAP) 효소 (2 U/μL), 5X 반응 버퍼, 10 mM ATP.
Superscript RT 제1 가닥 시스템: 인비트로겐. 키트에 사용된 품목 - 10X RT 버퍼, 0.1 M DTT, 10 mM dNTP 믹스 (주의: dNTP 믹스는 제2 가닥 합성에서 또한 사용된다), 2 U/μL RNase H (제2 가닥 합성에서 사용됨).
Superscript II RT 효소: 인비트로겐, 200 U/μL. 5X RT 버퍼로 입수, 이는 사전-RT 세척 단계를 위해 1X RT 버퍼를 생성하기 위해 사용된다.
0.1M MgCl2: 앰비온. 1M 원액으로 입수하고 후속적으로 1:10로 희석함.
5X 제2 가닥 버퍼: 인비트로겐. DNA 리가제: 인비트로겐, 10 U/μL.
DNA 중합효소 I: 인비트로겐, 10 U/μL.
T4 DNA 중합효소: 인비트로겐, 5 U/μL.
글리코겐: 앰비온, 5 mg/mL.
5M 아세트산암모늄: 앰비온.
100% 에탄올: SigmaMEGAScript-T7 IVT 키트: 앰비온. 키트에 사용된 품목- 10X IVT 버퍼, 75 mM NTP, 효소 믹스.
3M 아세트산나트륨: 앰비온.
방법
PNK
및
EPAP
처리
200-300 ng의 FPET RNA에 대해: FPET RNA를 1X PNK 버퍼 (70 mM Tris-HCl, pH 7.6, 10 mM MgCl2, 5 mM 디티오트레이톨), 1 U/㎕ RNase 억제제 (어플라이드 바이오시스템즈) 및 1 U/㎕의 PNK (엔이바이오랩스) 중에서 37℃에서 30분 동안 20 ㎕ 반응 부피에서 인큐베이팅하였다. PNK 처리 후에, FPET RNA를 1X EPAP 버퍼 (앰비온), 1 mM ATP, 1.5 U/㎕ RNase 억제제 및 0.025 U/㎕ EPAP (앰비온)을 반응 혼합물에 최종 농도로 첨가하여 직접 폴리아데닐화시켰다. 혼합물을 37℃에서 15분 동안 40 ㎕ 반응 부피로, 이어서 70℃에서 5분 동안 인큐베이팅하였다.
50 ng의 FPET RNA에 대해: PNK 및 EPAP 처리는 상기한 바와 동일하되, 반응 부피는 각각 5 ㎕ 및 10 ㎕ (부피)로 감소하였다.
T7
-올리고 dT
프라이머
-자기
비드
복합체를 사용하는
폴리아데닐화된
FPET
RNA의
역전사
T7
-올리고 dT
프라이머
-자기
비드
복합체의 제조
Dynabeads(등록상표) MyOneTM 스트렙타비딘 (다이날 바이오테크) 스톡 비드 용기를 4℃ 보관고에서 꺼내어 비드를 충분히 재현탁시키기 위해서 격렬하게 볼텍싱하였다. 40 ㎕ (400 ㎍) 비드를 0.5 mL 마이크로원심분리기 튜브에 넣고, 탁상용 마이크로원심분리기에서 비드를 회전시켜 (< 5초) 튜브 기저부에 액체를 모았다. 상자성 비드를 펠렛화하고 응집시켜 비드 성능을 감소시킬 수 있기 때문에, 상자성 비드를 함유하는 튜브의 과도한 원심분리를 피해야 한다. 튜브를 MPC-S 자기 랙 (다이날 바이오테크)에, 튜브 힌지가 자석을 대면하고 비드가 튜브의 측면에 모이도록 (~2분) 놓는다. 튜브를 랙으로부터 꺼내지 않으면서 개방하고, 상등액을 피펫팅하였다. 튜브를 랙으로부터 꺼내고, 비드를 100 μL 1X B&W 버퍼 (5mM Tris-HCl pH 7.3, 0.5 mM EDTA, 1M NaCl)에 재현탁시켜 세척하였다. 튜브를 잠깐 동안 회전시켜 액체를 수집한 후, 자기 튜브 랙에 놓았다. 비드를 튜브의 측면에 수집하고, 상등액을 상기한 바와 같이 제거하고, 1X B&W 버퍼 세척을 반복하여 총 2회 세척하였다. 최종 세척 상등액을 제거한 후, 비드를 25 μM Eberwine T7 올리고 dT 프라이머
(5'-비오틴 GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTVN-3') (서열 1)을 함유하는 40 μL 1X B&W 버퍼에 재현탁시켰다. 에펜도르프 열혼합기 (850 rpm)에서 실온에서 15분 동안 인큐베이션을 수행하였다. 비드를 자석 (~2분) 상에서 현탁시키고, 상등액을 제거하고, 비드를 100 μL 1X B&W 버퍼로 2회 세척하였다. 비드를 80 μL 비드 보관 버퍼 (1X PBS, 70% EtOH)에 재현탁시키고 4℃에서 사용시까지 보관하였다.
T7
-올리고 dT
비드의
폴리아데닐화된
FPET
RNA에 대한
혼성화
200-300 ng의 FPET RNA에 대해: PNK/EPAP 인큐베이션 동안, 앞서 제조한 프라이머-비드 용액을 4℃ 보관고에서 꺼냈다. 비드를 재현탁시키기 위해 튜브를 가볍게 치고, 잠깐동안 회전시켜 액체를 수집하였다. 20 μL (100 μg)의 비드를 0.5 mL 튜브 내로 분취하고, 튜브를 약 2분 동안 자석 상에 놓았다. 상등액을 제거하고, 비드를 100 μL 1X B&W 버퍼로 2회 세척하였다. 최종 세척 상등액을 70℃ EPAP 불활성화 단계 동안 제거하였다. 70℃ 인큐베이션이 완료된 후, EPAP 반응물을 함유하는 튜브를 충분히 회전시켜 액체를 수집한 다음, 반응 내용물을 프라이머-비드 복합체를 함유하는 튜브에 옮겼다. 비드를 재현탁시키기 위해 튜브를 가볍게 치고 잠깐동안 회전시키고, 실온에서 열혼합기 (850 rpm) 상에서 5분 동안 인큐베이팅하였다. 튜브를 자기 랙 상에 약 2분 동안 놓고, 상등액을 제거하였다.
50 ng의 FPET RNA에 대해: 5 μL (25 ㎍)의 비드를 분취하는 것을 제외하고는 상기한 바와 동일하였다.
제1 가닥 cDNA 합성
역전사는 RT-PCR용 SuperScriptTM 제1 가닥 합성 키트 (인비트로겐 코포레이션)를 사용하여 수행하였다.
200-300 ng의 FPET RNA에 대해: 비드를 100 μL 1X RT 버퍼 (20 mM Tris-HCl pH 8.4, 50 mM KCl)로 1회 세척하였다. 비드를 1X RT 버퍼, 5 mM MgCl2, 10 mM DTT, 0.5 mM dNTP, 1 U/μL RNase 억제제 및 10 U/μL SuperScript II RT를 함유하는 20 μL RT 반응 혼합물에 재현탁시키고, 42℃에서 열혼합기 (850 rpm) 상에서 50분 동안 인큐베이팅하였다.
50 ng의 FPET RNA에 대해: 비드를 5 μL 1X RT 버퍼에 재현탁시키는 것을 제외하고는 상기한 바와 동일하였다.
제2 가닥 cDNA 합성
200-300 ng의 FPET RNA에 대해: 제1 가닥 cDNA 반응물을 열혼합기로부터 꺼내고, 130 μL의 다음 제2 가닥 반응 혼합물을 첨가하였다: 1.15X 제2 가닥 버퍼, 0.23 mM dNTP 믹스, 0.077 U/μL DNA 리가제, 0.31 U/μL DNA 중합효소 I 및 0.015 U/μL RNase H. 튜브를 가볍게 쳐서 혼합하고, 잠깐동안 회전시켰다. 2시간 동안 16℃에서 열혼합기 (850 rpm) 상에서 인큐베이팅하였다.
50 ng의 FPET RNA에 대해: 32.5 μL의 제2 가닥 반응 혼합물을 첨가하는 것을 제외하고는 상기한 바와 동일하였다.
제2 가닥 DNA 정화/
시험관내
전사
200/300 ng 및 50 ng의 FPET RNA에 대해: 제2 가닥 반응 튜브를 열혼합기로부터 꺼내어, 잠깐동안 회전시키고 자기 랙 상에 약 2분 동안 놓았다. 상등액을 제거하고, 비드를 100 μL 1X IVT 세척 버퍼 (400 mM Tris pH 7.3, 70 mM MgCl2, 100 mM NaCl, 20 mM 스퍼미딘)로 2회 세척하였다.
시험관내 전사를 위해 MEGAScript-T7 IVT 키트 (앰비온)를 사용하였다. 비드를 20 μL IVT 마스터 믹스 (앰비온에서 설명된 바와 같이 제조함)에 재현탁시키고, 튜브를 가볍게 쳐서 혼합하였다. 잠깐동안 회전시키고 37℃에서 4시간 동안 열혼합기 (1000 rpm) 상에서 인큐베이팅하였다.
IVT
정화
튜브를 열혼합기로부터 꺼내어, 잠깐동안 회전시키고 자기 랙 상에 약 2분 동안 놓았다. 상등액을 1.5 mL 마이크로원심분리기 튜브에 옮기고 하기 시약을 순서대로 첨가하였다.
뉴클레아제 부재 H20: 20 ㎕
5 mg/mL 글리코겐 (앰비온): 1 ㎕
3M 아세트산나트륨 (앰비온): 4 ㎕
100% 에탄올 (시그마 (Sigma)): 100 ㎕
튜브를 볼텍싱하고 -20℃에서 1시간 내지 밤새 인큐베이팅하였다. 튜브를 냉장장치된 에펜도르프 원심분리기에서 14,000 rpm에서 20분 (4℃) 동안 회전시켜 cRNA를 펠렛화하였다. 상등액을 제거하고, 500 μL 70% 에탄올 용액을 첨가하여 펠렛을 세척하였다. 튜브를 냉장장치된 에펜도르프 원심분리기에서 14,000 rpm에서 3분 (4℃) 동안 회전시켰다. 피펫을 사용하여 튜브로부터 가능한 한 많은 알콜을 제거하고, 튜브를 증기 후드에 방치하여 (상부를 개방시켜) 나머지 알콜을 증발시켰다 (5-10분). cRNA 펠렛을 40 μL 뉴클레아제 부재 H2O에 재현탁시켰다.
FPET
RNA 분석
RNA는 RiboGreen 형광 방법 (몰레큘라 프로브스)를 사용하여 정량하였다. RNA 크기는 Agilent 2100 Bioanalyzer (애질런트 테크놀로지스)를 사용하는 마이크로모세관 전기영동에 의해 분석하였다.
TaqMan
(등록상표) 유전자 발현 프로파일링
TaqMan(등록상표) 반응을 1X Universal PCR Master Mix 및 1 ng의 cRNA로 이루어진 5 ㎕ 반응물에서 이중으로 수행하였다. 최종 프라이머 및 프로브 농도는 각각 0.9 μM (각각의 프라이머) 및 0.2 μM이었다. PCR 사이클링은 ABI Prism(등록상표) 7900으로 95℃ 10분 x 1 사이클, 95℃ 20초, 60℃ 45초 x 40 사이클로 수행하였다.
실시예
2
FPET
RNA 3'말단의
탈인산화와
폴리아데닐화
사이의 정화 단계의 제거
FPET RNA의 3'-말단을 2'-3' 시클릭 포스페이트, 2'-모노포스페이트 및 3'-모노포스페이트를 제거하기 위해 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK)로 처리하였다. 이들 다양한 포스페이트 에스테르는 분해된 RNA의 3' 말단 리보스 잔기에서 일반적으로 발견되고, FPET RNA의 3' 말단에 효율적인 폴리 A 첨가를 보장하기 위해 제거될 필요가 있다.
상기한 바와 같이, PNK를 사용하는 표준 탈인산화 단계를 20 ㎕의 RNAse 부재 H2O를 첨가하고 40 ㎕의 페놀:CHCl3:IAA (25:24:1) pH 6.6 (앰비온, 인크)로 추출하여 종결하였다. 14,000 x g에서 1-2분 동안 원심분리한 후, 수상을 제거하고, CHROMA SPINTM DEPC-H2O 30 컬럼 상에 통과시키고 Savant 스피드 진공을 사용하여 부피를 12.5 ㎕로 감소시켰다. 이제 RNA는 20 ㎕ 부피에서 EPAP를 사용하는 표준 폴리아데닐화 반응을 위해 준비되었다.
방법을 능률적으로 하기 위해, 본 발명자들은 도 2에 나타낸 바와 같이 과정에 대한 몇가지 변형을 시도하였다. 1000 ng의 유방암 FPET RNA (클리노믹스)를 사용하는 PNK 반응 후, EPAP를 사용하는 폴리아데닐화 전에 6가지 정화 조건을 시험하였다. 정화 조건 1은 앞서 논의된 표준 프로토콜과 본질적으로 동일하되, 샘플 부피 감소 단계를 생략하였다 (스피드-진공). 이는 샘플 부피를 더 크게 하여 최종 EPAP 반응 부피를 증가시킬 필요가 있었다 (40 ㎕). 40 ㎕ 반응 부피는 도 14에 도시된 바와 같이 5가지 모든 정화 조건에 대해 일정하게 유지되었다. 5가지 변형된 정화 조건에 따른 폴리아데닐화된 RNA의 마이크로모세관 전기영동 분석 (도 14, 좌측 패널)은 평균 크기가 90 뉴클레오티드 (nt)인 출발 물질 (SM)에 비해 평균 50-140개의 아데닐레이트가 RNA에 첨가된 것을 나타냈다 (예를 들어, 조건 1에 대해; 150-90 = 60 아데닐레이트). 이들 결과는 5가지 모든 조건이 허용되는 크기의 폴리아데닐화된 FPET RNA를 생성시켰음을 나타낸다. 흥미롭게도, EPAP 정화 단계 후 회수된 RNA의 비율은 5가지 모든 PNK 정화 조건이 표준 방법인 조건 6 (도 14, 우측 하부)보다 더 우수하였음을 나타낸다. 더욱이, 무정화 조건 (5)가 최고 수득량을 제공하였다. 회수율은 투입 RNA에 상대적이고, 몇몇 경우에 폴리아데닐화로부터 질량 증가에 의해 100%보다 크다. 폴리아데닐화된 RNA의 품질을 추가로 평가하기 위해, 4개의 샘플을 나머지 표준 IVT 과정으로 수행하고, 본 발명자들의 선행 특허 출원 (39740.0003PR)에 개략된 바와 같이 TaqMan(등록상표) RT-PCR에 의해 발현 프로파일링하였다. 도 15는 조건 2-5에 대한 증폭된 RNA의 47개 유전자 패널 프로파일을 보여준다. 모든 프로파일이 비증폭된 RNA (SM) 및 표준 처리 RNA (조건 6)과 높은 일치성 (R≥ 0.91)을 보였다. 무정화 조건 5는 최저 평균 Ct (36.0) 및 최고 IVT 수득량 (95.8 ㎍)을 제공하였고, 따라서 EPAP 처리 (단계 2, 도 13)를 위한 표준 과정으로 채택하였다.
실시예
3
폴리아데닐화된
FPET
RNA의
T7
프로모터-올리고 dT
비드에
대한
혼성화
, 이중가닥 cDNA 합성 및
IVT
본 발명의 표준 방법의 다른 개선은 폴리아데닐화된 FPET RNA의 자성 폴리스티렌 비드에 컨쥬게이팅된 T7 프로모터-올리고 dT 프라이머에 대한 혼성화를 포함한다. 이것은 모든 후속 효소 단계를 최소 정화 단계를 사용하여 고체 지지체에 대해 수행할 수 있도록 한다. 예를 들어, 반응 사이의 페놀-CHCl3 추출 및 스핀 컬럼 크로마토그래피에 대한 필요성을 제거한다. 또한, 비드를 자동화 과정에 사용하면 효율을 크게 증가시킬 수 있다. 추가로, 보관된 비드 컨쥬게이팅된-cDNA 라이브러리는 쉽게 재증폭되어 부가적인 cRNA를 생성시킬 수 있다. 도 16은 표준 용액 비-비드 기반 IVT 방법 (유리 IVT)에 의해 생성된 태반 cRNA 및 도 13에 개관된 고상 비드 기반 IVT 방법 (고상 IVT)에 의해 생성된 cRNA에 대한 47개 유전자 발현 프로필을 보여준다. 비교를 위해, 비증폭된 태반 FPET RNA도 도시하였다 (SM). 다시, 두 IVT 방법은 비처리 RNA (R≥0.94)와 크게 일치하는 cRNA를 생성시켰다. 전통적인 비-비드 IVT 방법이 비드 기반 IVT 방법보다 1.74배 많은 cRNA를 생성시켰지만, 평균 Ct는 0.74 더 높았다. RNA의 양을 출발 물질 RNA와 동일한 평균 Ct를 생성시키도록 조절하면, 상대적인 수득량 (Ct 조정)은 거의 동일하다 (21.66 대 20.79). 따라서, 비드 기반 IVT 방법은 증폭 및 신뢰성의 측면에서 비-비드 기반 방법과 거의 동일하게 효율적이다. 두 IVT 방법이 동일량의 RNA (1 ng/웰)를 사용할 때 출발 물질과 동일한 수준의 RT-PCR 감도 (평균 Ct/질량 RNA)를 달성하지 않지만, 이들은 감도 상실에 대해 조정한 후 100배의 RNA 증폭을 계속 달성한다.
실시예
4
50 ng 및 200 ng
FPET
RNA를 사용한 RNA 증폭의 비교
임상 병력이 있는 보관된 FPET 샘플은 소급 임상 연구에 매우 가치가 있다. 따라서, 연구를 위해 임상 조력자로부터 환자당 1 또는 2개 초과의 5 미크론 FPET 절편을 얻는 것이 종종 어렵다. 따라서, 1 마이크로그램 미만의 RNA, 바람직하게는 100 ng 미만의 RNA로부터 출발하여 FPET RNA의 IVT 증폭을 최적화할 필요성이 존재한다. 도 17은 비드 기재 프로토콜에 의해 증폭된 FPET RNA의 200 ng (조건 1) 및 50 ng (조건 2 및 3)으로부터의 47개 유전자 발현 프로필을 보여준다. 제1 50 ng RNA 증폭 (조건 2)에 대해, RNA 대 비드 질량의 비 및 각 단계의 반응 부피는 표준 200 ng RNA 증폭과 동일하였다. 제2 50 ng RNA 증폭 (조건 3)에 대해, RNA 대 비드 질량의 비는 동일하였지만, 반응 부피는 부피의 1/4로 비례적으로 감소하였다. 두 50 ng RNA 증폭은 거의 동일량의 cRNA를 생성시켰지만, 200 ng RNA 증폭보다 10배 더 적었다. FPET RNA 양의 1/4로 출발하였기 때문에 50 ng 반응으로부터 4배 더 낮은 수득량을 예상하였지만, FPET RNA를 200 ng으로부터 50 ng으로 증폭을 저하시킬 때 설명할 수 없지만 효능이 2.5배 감소하였다. 그러나, 50 ng 증폭에서 유도된 두 발현 프로파일은 200 ng RNA 증폭 (R≥0.97)과 매우 큰 상관관계를 계속 보인다. 또한, 50 ng 부피 규모의 증폭 (조건 3)에 대한 평균 Ct는 200 ng RNA 증폭과 동등하였다. 따라서, 규모 감소 (1/4 부피) 형태를 50 ng FPET RNA 증폭 과정으로서 채용하였다.
실시예
5
50 ng 및 200 ng의
FPET
RNA를 사용하는 2차 증폭의 비교
상기 언급한 바와 같이, cDNA FPET 라이브러리를 비드 상에 보관하는 부가적인 잇점은 이들이 쉽게 재증폭될 수 있다는 점이다. 2차 IVT의 예로서, 상기 실험으로부터 컨쥬게이팅된 cDNA를 함유하는 보관된 비드를 1회 세척하고, IVT 버퍼에 재현탁시키고 원래의 IVT 프로토콜에 따라 증폭시켰다. 도 17b는 상기 실험 결과를 보여준다. 다시, 두 50 ng RNA 증폭은 거의 동일량의 cRNA를 생성시켰지만, 이는 200 ng RNA 증폭보다 10배 더 작았다. 추가로, 3개의 모든 2차 증폭은 대응하는 1차 증폭보다 약 1/3 더 많은 RNA를 생성시켰다. 높은 수준의 신뢰도가 3개의 2차 증폭 사이에 유지되었다 (R≥0.95). 또한, 각각의 개별 조건에 대한 1차 및 2차 증폭은 높은 수준의 일치성을 유지하였다 (R≥0.97). 조건 3 (FRA-1/4 부피: 50 ng/25 ㎍) 1차 및 2차 IVT에 대한 발현 프로파일은 도 17c에 도시하였다.
본원에 걸쳐 언급된 모든 참고문헌은 본원에 참고로 포함된다.
당업계의 숙련인은 본 발명의 실시에 사용될 수 있는, 본원에 개시된 것과 유사하거나 동등한 많은 방법 및 물질을 인식할 것이다. 실제로, 본 발명은 기재된 방법 및 물질에 결코 제한되지 않는다. 본 발명을 위해, 하기 용어가 정의된다.
<110> GENOMIC HEALTH, INC.
KIEFER, MICHAEL C.
HOYT, KENNETH W.
<120> UNIVERSAL AMPLIFICATION OF FRAGMENTED
RNA
<130> 39740-0003PCT
<140> PCT/US2004/043163
<141> 2004-12-21
<150> US 60/532,684
<151> 2003-12-23
<160> 1
<170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1
<211> 63
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> oligonucleotide dT primer
<220>
<221> misc_feature
<222> 63
<223> n= a, t, g or c
<400> 1
ggccagtgaa ttgtaatacg actcactata gggaggcggt tttttttttt tttttttttt 60
tvn 63
Claims (55)
- (a) 단편화 RNA를 폴리아데닐화시키는 단계, 및(b) 단계 (a)에서 얻은 폴리아데닐화된 단편화 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계를 포함하는, 유전자 발현 분석을 위한 다수의 RNA 종을 포함하는 단편화 RNA의 제조 방법.
- 제1항에 있어서, 단편화 RNA 내의 RNA 종의 크기가 약 20 염기 내지 약 2000 염기인 방법.
- 제1항에 있어서, 단편화 RNA 내의 RNA 종의 크기가 약 50 염기 내지 약 300 염기인 방법.
- 제1항에 있어서, 폴리아데닐화를 이. 콜라이 (E. coli) 폴리A 중합효소를 사용하여 수행하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (a) 전에 단편화 RNA 종의 3' 말단을 탈차단제로 탈차단하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 탈차단제가 포스파타제 효소인 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 포스파타제가 송아지 알칼리성 포스파타제 (CIP), 세균 알칼리성 포스파타제, 새우 알칼리성 포스파타제, 및 이들의 변이체로 이루어진 군 중에서 선택되는 것인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 탈차단제가 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK: polynucleotide kinase), 또는 그의 변이체인 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드 키나제가 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (T4 PNK), 또는 그의 변이체인 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 탈차단제를 폴리아데닐화 단계 (a)를 수행하기 전에 제거하는 방법.
- 제5항에 있어서, 폴리아데닐화 단계 (a)를 탈차단제의 사전 제거 없이 수행하는 방법.
- 제11항에 있어서, 상기 탈차단제가 폴리뉴클레오티드 키나제 (PNK)인 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 얻은 폴리아데닐화된 단편화 RNA를 역전사효소 및 올리고-dT 프라이머를 사용하는 처리에 의해 cDNA로 전환시키는 방법.
- 제13항에 있어서, 상기 역전사효소가 조류 골수아세포증 바이러스 역전사효소 (AMV-RT), 몰로니 쥐 백혈병 바이러스 역전사효소 (MMLV-RT), 및 이. 콜라이에서 발현되는 재조합 이종이량체 역전사효소로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
- 제14항에 있어서, 상기 올리고-dT 프라이머가 RNA 중합효소 프로모터 서열을 포함하는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 상기 프로모터가 T7 RNA 중합효소 프로모터인 방법.
- 제13항에 있어서, 단계 (a)에서 얻은 상기 폴리아데닐화된 단편화 RNA를 cDNA로 전환시키기 전에 고정시키는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 고정을 비드 상에 수행하는 방법.
- 제18항에 있어서, 고정된 폴리아데닐화된 단편화 RNA를 cDNA로 전환시키기 전에 농축시키는 방법.
- 제19항에 있어서, 농축이 비드 고정된 상보성 rRNA 올리고뉴클레오티드에 대한 혼성화에 의한 rRNA 서열의 제거를 포함하는 것인 방법.
- 제13항에 있어서, RNA가 고정된 파라핀-포매 조직 샘플로부터 얻은 mRNA인 방법.
- 제21항에 있어서, 상기 조직 샘플이 종양으로부터 얻은 것인 방법.
- 제22항에 있어서, 상기 종양이 암인 방법.
- 제23항에 있어서, 상기 암이 유방암, 결장암, 폐암, 전립선암, 간세포암, 위암, 췌장암, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 요로암, 갑상선암, 신장암, 암종, 흑색종 및 뇌암으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
- 제15항에 있어서, 단계 (b)에서 얻은 cDNA에 존재하는 1종 이상의 cDNA 종을 주형으로서 사용하는 (c) PCR 증폭 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제25항에 있어서, PCR 증폭이 40 사이클을 포함하고, 처음 5 사이클을 보다 낮은 어닐링/연장 온도에서 수행하는 방법.
- 제26항에 있어서, PCR 증폭이 40 사이클을 포함하고, 처음 2 사이클을 보다 낮은 어닐링/연장 온도에서 수행하는 방법.
- 제25항에 있어서, PCR 증폭이 40 사이클을 포함하고, 처음 2 내지 5 사이클을 약 40℃ 내지 58℃의 온도에서 수행하는 방법.
- 제28항에 있어서, 상기 초기 사이클을 약 50℃의 온도에서 수행하는 방법.
- 제15항에 있어서,(d) 단계 (b)에서 얻은 cDNA를 이중가닥 DNA로 전환시키는 단계; 및(e) 단계 (d)에서 얻은 이중가닥 DNA를 RNA 중합효소를 사용하는 시험관내 전사에 적용하여 RNA를 증폭시킴으로써 증폭된 상보성 RNA (cRNA)를 얻는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제30항에 있어서, 단계 (d)에서 cDNA를, RNaseH 및 DNA 중합효소 I을 사용하여 이중가닥 DNA로 전환시키는 방법.
- 제30항에 있어서, 단계 (e)로부터 증폭된 cRNA를 RT-PCR에 의한 유전자 발현 프로파일링 분석에서 주형으로서 직접 사용하는 방법.
- 제30항에 있어서, 단계 (e)가 증폭된 cRNA를 검출가능 표지로 표지하는 것을 포함하는 것인 방법.
- 제33항에 있어서, 검출가능 표지가 비오틴 또는 형광 표지인 방법.
- 제30항에 있어서, 단계 (e)에서 얻은 증폭된 cRNA를 마이크로어레이에 혼성화시키는 것을 포함하는 방법.
- 제1항에 있어서, 단계 (a)에서 얻은 폴리아데닐화된 단편화 RNA를 역전사효소 및 연장된 역방향 프라이머로의 처리에 의해 cDNA로 전환시키고, 수득한 cDNA를 표적 앰플리콘을 기초로 하여 설계된 비-연장된 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 프로브를 사용하는 PCR에 의해 증폭시키는 방법.
- 제36항에 있어서, 연장된 역방향 프라이머가 유전자 특이적 역방향 PCR 프라이머보다 10개의 염기를 앰플리콘 내에 추가로 연장하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 연장된 역방향 프라이머가 유전자 특이적 역방향 PCR 프라이머보다 20개의 염기를 앰플리콘 내에 추가로 연장하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 연장된 역방향 프라이머가 유전자 특이적 역방향 PCR 프라이머보다 30개의 염기를 앰플리콘 내에 추가로 연장하는 것인 방법.
- 제36항에 있어서, 연장된 역방향 프라이머가 정방향 PCR 프라이머의 1 염기 내에서 앰플리콘 내로 연장하는 것인 방법.
- 역전사효소 및 연장된 프라이머로 처리하여 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계 및표적 앰플리콘을 기초로 하여 설계된 정방향 및 역방향 PCR 프라이머 및 프로브를 사용하는 PCR에 의해 수득한 cDNA를 증폭시키는 단계를 포함하는 증강된 cDNA 합성 방법.
- 제41항에 있어서, 상기 RNA를 단편화시키는 방법.
- 제42항에 있어서, 상기 단편화 RNA의 적어도 일부가 폴리아데닐화되지 않는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 연장된 역방향 프라이머가 역방향 PCR 프라이머 (GSP)보다 10개의 염기를 앰플리콘 내에 추가로 연장하는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 연장된 역방향 프라이머가 역방향 PCR 프라이머 (GSP)보다 20개의 염기를 앰플리콘 내에 추가로 연장하는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 연장된 역방향 프라이머가 역방향 PCR 프라이머 (GSP)보다 30개의 염기를 앰플리콘 내에 추가로 연장하는 것인 방법.
- 제43항에 있어서, 연장된 역방향 프라이머가 정방향 PCR 프라이머의 1개의 염기 내로 연장하는 것인 방법.
- (a) 다수의 RNA를 폴리아데닐화시키는 단계; 및(b) 역전사효소 및 올리고 dT 또는 올리고 dT-T7 프라이머에 의해 폴리아데닐화된 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계를 포함하는, 유전자 발현 분석을 위한 다수의 RNA 종을 포함하는 RNA의 제조 방법.
- 제48항에 있어서, 상기 RNA가 차단된 3'-말단을 갖는 RNA 종을 포함하는 것인 방법.
- 제49항에 있어서, 단계 (a) 전에 상기 차단된 RNA 종을 탈차단하는 것을 포함하는 방법.
- 제48항에 있어서, 올리고 dT 프라이밍된 cDNA를 유전자 발현 분석을 위해 직접 사용하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제51항에 있어서, 상기 유전자 발현 분석을 TaqMan(등록상표)에 의해 수행하는 방법.
- 제48항에 있어서,DNA 중합효소 I 및 RNAse H를 사용하여 올리고 dT-T7 프라이밍된 cDNA를 이중가닥 DNA로 전환시키는 단계 및T7 RNA 중합효소 및 rNTP를 사용하여 이중가닥 DNA를 증폭시키는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- 제48항에 있어서,올리고 dT-T7 프라이밍된 cDNA를 이중가닥 DNA로 전환시키는 단계 및T7 RNA 중합효소 및 비오티닐화된 rNTP를 사용하여 이중가닥 DNA를 증폭하는 단계를 추가로 포함하는 방법.
- (a) 다수의 RNA를 폴리아데닐화시키는 단계;(b) 역전사효소 및 T7 RNA 중합효소 프로모터를 함유하는 올리고 dT-T7 프라이머에 의해 폴리아데닐화된 RNA를 cDNA로 전환시키는 단계 및(c) 단계 (b)에서 얻은 이중가닥 DNA를 T7 RNA 중합효소를 사용하는 시험관내 전사에 적용하여 증폭된 상보성 RNA (cRNA)를 얻는 단계를 포함하는, 유전자 발현 분석을 위한 다수의 RNA 종을 포함하는 RNA의 제조 방법.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US53268403P | 2003-12-23 | 2003-12-23 | |
| US60/532,684 | 2003-12-23 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20070000438A KR20070000438A (ko) | 2007-01-02 |
| KR20060136408A true KR20060136408A (ko) | 2007-01-02 |
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