KR20060124743A - 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체, 및 이들의합성방법 - Google Patents

데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체, 및 이들의합성방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20060124743A
KR20060124743A KR1020067017883A KR20067017883A KR20060124743A KR 20060124743 A KR20060124743 A KR 20060124743A KR 1020067017883 A KR1020067017883 A KR 1020067017883A KR 20067017883 A KR20067017883 A KR 20067017883A KR 20060124743 A KR20060124743 A KR 20060124743A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
substituted
nitro
atom
heteroaryl
amino
Prior art date
Application number
KR1020067017883A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101228104B1 (ko
Inventor
마이클 에이. 팔라디노
요시오 하야시
조지 케네쓰 로이드
벤자민 니콜슨
Original Assignee
니리어스 파마슈티컬즈, 인코퍼레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 니리어스 파마슈티컬즈, 인코퍼레이션 filed Critical 니리어스 파마슈티컬즈, 인코퍼레이션
Publication of KR20060124743A publication Critical patent/KR20060124743A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101228104B1 publication Critical patent/KR101228104B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D405/00—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom
    • C07D405/14—Heterocyclic compounds containing both one or more hetero rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, and one or more rings having nitrogen as the only ring hetero atom containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/496—Non-condensed piperazines containing further heterocyclic rings, e.g. rifampin, thiothixene or sparfloxacin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/08—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease
    • A61P19/10—Drugs for skeletal disorders for bone diseases, e.g. rachitism, Paget's disease for osteoporosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
    • A61P27/02—Ophthalmic agents
    • A61P27/06—Antiglaucoma agents or miotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/10—Antimycotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/02—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings
    • C07D403/06—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing two hetero rings linked by a carbon chain containing only aliphatic carbon atoms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D403/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00
    • C07D403/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D401/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D407/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00
    • C07D407/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having oxygen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D405/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physical Education & Sports Medicine (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Ophthalmology & Optometry (AREA)
  • Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Cardiology (AREA)
  • Heart & Thoracic Surgery (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)

Abstract

하기 화학식 (I)로 표시되는 화합물들이 개시된다: 이러한 화합물들을 제조하는 방법으로서, 상기 방법은 디아실디케토피페라진을 첫 번째 알데히드와 반응시켜 중간체 화합물을 제조하는 단계; 및 상기 중간체 화합물을 두 번째 알데히드와 반응시켜 상기 일반적인 구조를 갖는 상기 부류의 화합물들을 제조하는 단계를 포함하는데, 상기 첫 번째 알데히드 및 두 번째 알데히드는 옥사졸카르복스알데히드, 이미다졸카르복스알데히드, 벤즈알데히드, 이미다졸카르복스알데히드 유도체, 및 벤즈알데히드 유도체로 구성된 군에서 선택되고, 이로써 상기 화합물을 형성하며, 상기 화학식에서 R1, R1', R1", R2, R3, R4, R5 및 R6, X1과 X2, Y, Z, Z1, Z2, Z3 및 Z4는 첨부되는 설명과 일치하는 방식으로 각각 정의된다. 또한, 혈관 증식을 치료하기 위한 조성물 및 방법이 개시된다.
Figure 112006063575231-PCT00103
데하이드로페닐아히스틴, 혈관 붕괴, 혈관 증식 억제, 면역 및 비면역 염증, 류마티스 관절염, 당뇨성 망막증, 황반변성, 홍채혈관신생

Description

데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체, 및 이들의 합성방법{Dehydrophenylahistins and Analogs Thereof and the Synthesis of Dehydrophenylahistins and Analogs Thereof}
관련 출원
본 출원은 2003년 8월 1일에 출원된 미국 특허출원 제 10/632,531 호의 일부계속출원 (continuation-in-part)이고, 2004년 2월 4일에 출원된 미국 가출원 (provisional application) 제 60/542,073 호 및 2004년 11월 1일에 출원된 미국 가출원 제 60/624,262 호에 대해 우선권을 주장하고, 이들 모든 출원은 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체, 및 이들의 합성방법를 발명의 명칭으로 하고; 이들 각각은 전체로 참조로써 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 화학 및 의료 분야의 화합물 및 그의 합성적 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 암 치료 및 진균 감염의 치료에 유용한 화합물 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
단일의 보편적인 세포 메카니즘은 진핵 세포 주기 과정의 조절을 통제하는 것으로 생각된다. 예를 들어 문헌[Hartwell, L.H. et al., Science(1989), 246:629-34]을 참조. 또한, 세포 주기의 조절 메카니즘에 이상이 발생하는 경우 암이나 면역 질환이 일어날 수 있는 것으로 알려져 있다. 따라서, 알려진 바와 같이, 세포 주기를 조절하는 물질 중에는 항종양제 및 면역 억제제가 있을 수 있다. 따라서, 진핵 세포 주기 억제제를 생산하기 위한 새로운 방법은 항종양 및 면역 증진 화합물로서 요구되고, 화학요법제, 항종양제로서 인간 암의 치료에 유용해야 한다. 예를 들어, 문헌[Roberge, M. et al., Cancer Res.(1994), 54, 6115-21]을 참조.
진균, 특히 병원성 진균 및 관련된 감염은 점점 더 임상적으로 도전되고 있다. 기존의 항진균제들은 제한된 효능과 독성을 가지며, 현재 이용할 수 있거나 개발 중인 약물에 내성인 병원성 진균의 균주가 발생하고/하거나 발견되고 있다. 예를 들어, 인간에 병원성인 진균은 다른 것들 중에서도 칸디다 스페시즈, 예를 들어 씨 알비칸스, 씨 트로피칼리스, 씨 케파이르, 씨 크루세이 및 씨 갈브라타; 아스퍼질러스 스페시즈, 예를 들어 에이 푸미가투스 및 에이 플라부스; 크립토코커스 네오포르만스; 블라스토마이세스 스페시즈, 예를 들어 블라스토마이세스 더마티티디스; 뉴모사이스티스 카리니; 콕시디오이데스 이미티스; 바시디오볼루스 라나룸; 코니디오볼루스 스페시즈; 히스토플라스마 캅술라툼; 리조푸스 스페시즈, 예를 들어 알 오리자에 및 알 마크로스포루스; 커닝하멜라 스페시즈; 리조무코르 스페시즈; 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스; 슈달레케리아 보이디; 리노스포리디움 시베 리; 및 스포로트릭스 첸키를 포함한다(Kwon-Chung, K.J. & Bennett, J.E. 1992 Medical Mycology, Lea and Febiger, Malvern, PA).
최근에, 트리프로스타틴 A 및 B (프롤린과 이소프레닐화된 트립토판 잔기로 이루어진 디케토피페라진임), 및 5 개의 다른 구조적으로 관련된 디케토피페라진들이 M 기에서 세포 주기 진행을 억제하고(Cui, C. et al., 1996 J Antibiotics 49:527-33; Cui, C. et al., 1996 J Antibiotics 49:534-40), 이들 화합물은 또한 미세관 조립체에 영향을 미치는 것으로 보고되었다(Usui, T. et al., 1998 Biochem J 333:543-48; Kondon, M. et al., 1998 J Antibiotics 51:801-04). 게다가, 천연 및 합성 화합물들이 2 개의 50 kDa 서브유닛(α- 및 β- 튜불린으로 이루어진 거대분자이고 미세관의 주성분인 콜히친 결합 부위 (CLC-부위)에 결합함으로써 유사 분열을 억제하고, 따라서 진핵 세포 주기를 억제하는 것으로 보고되었다. 예를 들어, 문헌 [Iwasaki, S., 1993 Med Res Rev 13:183-198; Hamel, E. 1996 Med Res Rev 16:207-31; Weisenberg, R.C. et al., 1969 Biochemistry 7:4466-79] 참조. 미세관은 몇 가지 필수적인 세포 기능, 예를 들어 축삭 운반, 세포 이동성 및 세포 형태의 결정에 관여하는 것으로 생각된다. 따라서, 미세관 기능의 억제제는 광범위한 생물 활성을 가질 수 있으며 의약 및 농약 용도로 적용가능하다. 또한, 콜히친(CLC)-부위 리간드, 예를 들어 CLC, 스테가나신(Kupchan, S.M. et al., 1973 J Am Chem Soc 95:1335-36 참조), 포도필로톡신(Sackett, D.L., 1993 Pharmacol Ther 59:163-228 참조) 및 콤브레 타스타틴(Pettit, G.R. et al., 1995 J Med Chem 38:166-67 참조)이 진핵 세포 주기 억제제로서 가치있는 것으로 증명될 수 있고, 따라서 화학요법제로서 유용할 수 있다.
디케토피페라진-형 대사산물이 미코톡신으로서 (Horak R.M. et al., 1981 JCS Chem Comm 1265-67; Ali M. et al., 1898 Toxicology Letters 48:235-41 참조) 또는 2 차 대사산물로서 (Smedsgaard J. et al., 1996 J Microbiol Meth 25:5-17 참조) 다양한 진균으로부터 단리되었지만, 디케토피페라진-형 대사산물 또는 이들의 유도체의 특정한 구조, 및 특히 생체 내에서 이들의 항종양 활성에 대해서는 거의 공지되지 않았다. 이들 화합물은 미코톡신으로서 단리되었을 뿐만 아니고, 디케토피페라진-형 대사산물의 한 유형인 페닐아히스틴의 화학 합성이 개시되었다(Hayashi et al. in J. Org. Chem. (2000) 65, 8402 쪽). 당해 분야에서, 한가지 상기와 같은 디케토피페라진-형 대사산물 유도체인 데하이드로페닐아히스틴이 모 페닐아히스틴의 효소에 의한 탈수소화에 의해 제조되었다. 암 발병률이 상승하고 있는 가운데, 동물 세포 특이적인 증식 억제 활성 및 높은 항종양 활성과 선택성을 가지는 실질적으로 정제된 디케토피페라진-형 대사산물-유도체의 부류를 화학적으로 제조해야 할 특별한 필요성이 존재한다. 따라서, 실질적으로 정제되고 구조 및 생물학적으로 특성화된 디케토피페라진-형 대사산물-유도체를 합성적으로 제조하는 효율적인 방법이 특히 필요하다.
또한, PCT 공보 WO/0153290(2001년 7월 26일)는 페닐아히스틴 또는 특정한 페닐아히스틴 동족체를 스트렙토마이세스 알부루스로부터 수득된 데하이드로게나제에 노출시켜 데하이드로페닐아히스틴을 제조하는 비합성적 제조 방법을 개시한다.
발명의 요약
하기 화학식 I의 구조를 가지는 부류의 화합물들, 및 이들의 합성적 제조 방법을 개시한다:
Figure 112006063575231-PCT00001
개시된 화합물은 화학식 I의 구조를 가진다:
R1, R4 및 R6은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
R1' 및 R1"는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
R2, R3 및 R5는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C12 알킬, 불포화된 C1-C12 알케닐, 아실, 사이클로알킬, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로 및 치환된 니트로기, 설포닐 및 치환된 설포닐기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고;
X1 및 X2는 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 각각은 상기에 정의된 바와 같은 R5 기로 치환되거나 치환되지 않고;
Y는 질소 원자, R5로 치환된 질소 원자, 산소 원자, 황 원자, 산화된 황 원자, 메틸렌기 및 치환된 메틸렌기로 구성된 군에서 선택되고;
n은 0, 1 또는 2의 정수이고;
n이 0이 아닌 경우 각각 별개의 n에 대해 Z, 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4 는 탄소 원자, 황 원자, 질소 원자 또는 산소 원자에서 각각 독립적으로 선택되고;
점선 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있으나;
단 특정 화합물에서, R1, R1', R2, R3, R4 및 R5 가 각각 수소 원자인 경우 X1 및 X2이 각각 산소 원자이고 R6이 3,3-디메틸부틸-1-엔이거나 수소 원자라는 것은 사실이 아니다.
상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
디아실디케토피페라진을 첫 번째 알데히드와 반응시켜 중간체 화합물을 제조하고;
상기 중간체 화합물을 두 번째 알데히드와 반응시켜 상기 일반적인 구조를 갖는 상기 부류의 화합물들을 제조하며,
상기 첫 번째 알데히드 및 두 번째 알데히드는 옥사졸카르복스알데히드, 이미다졸카르복스알데히드, 벤즈알데히드, 이미다졸카르복스알데히드 유도체, 및 벤즈알데히드 유도체로 구성된 군에서 선택되고, 화학식 I의 구조를 가지는 화합물을 형성한다:
R1, R4 및 R6은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
R1' 및 R1"는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
R2, R3 및 R5는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C12 알킬, 불포화된 C1-C12 알케닐, 아실, 사이클로알킬, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로 및 치환된 니트로기, 설포닐 및 치환된 설포닐기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고;
X1 및 X2는 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 각각은 상기에 정의된 바와 같은 R5 기로 치환되거나 치환되지 않고;
Y는 질소 원자, R5로 치환된 질소 원자, 산소 원자, 황 원자, 산화된 황 원자, 메틸렌기 및 치환된 메틸렌기로 구성된 군에서 선택되고;
n은 0, 1 또는 2의 정수이고;
n이 0이 아닌 경우 각각 별개의 n에 대해 Z, 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4 는 탄소 원자, 황 원자, 질소 원자 또는 산소 원자에서 각각 독립적으로 선택되고;
점선 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다.
상기 화합물 및 방법의 바람직한 실시태양에서, 이미다졸카르복스알데히드는 5-(1,1-디메틸-2-에틸)이미다졸-4-카르복스알데히드이고, 벤즈알데히드는 단일 메톡시 군을 포함한다. 본 명세서에 개시된 화합물의 추가적인 바람직한 실시태양은 t-부틸기, 디메톡시기, 클로로-기 및 메틸티오펜기를 갖는 화합물 및 상기와 같은 화합물의 제조 방법뿐만 아니라, 표 2, 3 및 4에 개시된 화합물 및 상기와 같은 화합물의 제조 방법을 포함한다.
또한, 종양 조직의 치료, 또는 암 또는 병원성 진균에 의한 감염의 예방을 위한 방법 및 물질을 개시한다. 이러한 방법 및 물질은 포유동물 대상자, 보다 특히 인간의 치료에 특히 적합하며, 상기 대상자에게 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 투여하는 것을 포함한다. 상기 방법은 상기 대상자에게 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체의 항종양제 유효량 또는 항진균 유효량을 포함하는 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
구체적인 실시태양은 동물의 병태를 치료하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 혈관 증식을 감소시키는데 효과적인 용량으로 또는 혈관 밀도를 감소시키는데 효과적인 용량으로 본 명세서에 기재된 바와 같은 화합물을 동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다. 예시적인 병태들은 암과 같은 종양 뿐만 아니라, 혈관 생성에 의존하거나 관련이 있는 병태, 예를 들어 면역 및 비면역 염증, 류마티스 관절염, 만성 관절성 류마티즘, 건선, 당뇨성 망막증, 신생혈관 녹내장, 미숙아 망막증, 황반변성, 각막 이식 거부, 후수정체 섬유증식증, 홍채혈관신생, 동맥경화 프라그에서 모세혈관 증식, 골다공증 등을 포함한다. 몇가지 실시태양에서 질병은 암이 아니다.
다른 실시태양은 동물의 혈관 붕괴 (vascular collapse)를 유도하는 방법들에 관한 것이다. 이 방법들은 예를 들어, 본 명세서에 기재된 화학식 I의 화합물의 치료적으로 효과적인 용량으로 상기 동물을 치료하는 것을 포함할 수 있다. 상기 화합물의 치료적으로 효과적인 용량은 혈관에 튜불린 (tubulin) 탈중합을 야기할 수 있다.
바람직하게 동물은 인간일 수 있다. 바람직하게 질병은 종양, 당뇨성 망막증, 연령 관련 황반변성 등일 수 있다. 몇가지 면에서, 질병은 암이 아닐 수 있거나, 암은 상기 방법 및 사용에서 특정적으로 배제될 수 있다. 바람직하게, 화합물은 KPU-02이다.
더 다른 실시태양은 약제학적으로 허용가능한 운반체와 함께 본 명세서 기재된 화합물의 약제학적으로 효과적인 용량을 포함하는, 혈관 증식를 치료하거나 예방하기 위한 약제학적 조성물에 관한 것이다. 혈관 증식은 예를 들어, 암, 연령 관련 황반변성 및 당뇨성 망막증 같은 질병의 증상일 수 있다.
몇가지 실시태양은 비종양 조직 혈관에 대해 종양 혈관을 선택적으로 표적화하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법들은 본 명세서에 기재된 화학식 I의 구조를 가지는 화합물을 동물, 바람직하게는 인간에게 투여하는 단계를 포함할 수 있다. 비종양 조직은 예를 들어 피부, 근육, 뇌, 신장, 심장, 비장, 소화관 (gut) 등과 같은 것일 수 있다. 종양 혈관은 예를 들어 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 및 90%로 비종양 조직 혈관에 대해 선택적으로 표적화될 수 있다.
다른 실시태양은 비종양 조직 혈관에 대해 종양 혈관을 선택적으로 표적화하는 방법에 관한 것이고, 이 방법은 비종양 조직 혈관에 대해 종양 혈관을 선택적으로 표적화하는 작용제를 동물에 투여하는 것을 포함할 수 있다.
다른 실시태양은 증가된 혈관과 관련되거나 혈관에 의존하는 병태의 치료를 위한 의약의 제조에 화학식 I의 구조를 가지는 화합물의 사용에 관한 것이다. 몇가지 면에서, 병태는 암일 수 있으나, 다른 면에서, 특정 형태의 암이나 모든 암이 특정적으로 배제된다. 병태는 혈관과 관련되거나 혈관에 의존하는 과혈관 생성과 관련되는 다른 것일 수 있다. 실시예는 면역 및 비면역 염증, 류마티스 관절염, 만성 관절성 류마티즘, 건선, 당뇨성 망막증, 신생혈관 녹내장, 미숙아 망막증, 황반변성, 각막 이식 거부, 후수정체 섬유증식증, 홍체혈관증식 (rubeosis), 동맥경화 프라그에서 모세혈관 증식, 골다공증 등을 포함한다.
명세서에 포함되고 명세서의 일부를 형성하는 첨부하는 도면들은 단지 본 발명의 바람직한 실시태양을 예시한다. 명세서의 다른 부분들과 함께, 도면은 당업자에게 발명의 몇가지 화합물을 제조하는 바람직한 방법을 설명하기 위해 제공되는 것으로 의도된다.
도 1은 디아실디케토피페라진 1을 이미다졸카르복스알데히드 2와 반응시켜 중간체 화합물 3을 수득하고 이를 벤즈알데히드 4와 반응시켜 데하이드로페닐아히스틴을 제조함으로써 데하이드로페닐아히스틴의 제조를 위한 반응 도식을 예시한다.
도 2는 합성 조 데하이드로페닐아히스틴의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 3은 디아실디케토피페라진 1을 벤즈알데히드 4와 반응시켜 중간체 화합물 17을 수득하고 이를 이미다졸카르복스알데히드 15와 반응시켜 데하이드로페닐아히스틴을 제조함으로써 데하이드로페닐아히스틴의 제조를 위한 반응 도식을 예시한다.
도 4는 경로 A 및 경로 B로부터 제조된 합성 조 tBu-데하이드로페닐아히스틴의 HPLC 프로파일을 나타낸다.
도 5는 강력한 세포독성 활성을 위한 데하이드로PLH의 2 가지 변경 전략을 예시한다.
도 6은 페닐 잔기에서 데하이드로PLH의 추정적인 활성 형태를 나타낸다.
도 7은 페닐아히스틴의 시토크롬 P450 대사를 나타낸다.
도 8은 tBu-데하이드로PLH의 Z-E 이동을 예시한다.
도 9는 아실-E-tBu-데하이드로PLH의 합성 및 전구약물 이미지를 나타낸다.
도 10은 3-Z-벤질리덴-6-[5"-(1,1-디메틸알릴)-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌]-피페라진-2,5-디온의 온도 구배를 나타낸다.
도 11은 3-Z-벤질리덴-6-(5"-3 급-부틸-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌)-피페라진-2,5-디온의 온도 구배를 나타낸다.
도 12는 콜히친 및 탁솔과 비교하여, FITC-덱스트란에 대한 HuVEC 단층 투과성에 대한 KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴의 효과를 나타낸다.
도 13은 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 측정된 종양 성장에 대한 단독 및 CPT-11과 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다.
도 14는 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 각각의 마우스 부검시 절 제한 종양 중량에 대한 단독 및 CPT-11과 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다.
도 15는 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 측정된 종양 성장에 대한 단독 및 CPT-11과 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다.
도 16은 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 각각의 마우스 부검시 절제한 종양 중량에 대한 단독 및 CPT-11과 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다.
도 17은 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 측정된 종양 성장에 대한 단독 및 CPT-11과 조합으로 A. KPU-2, B. KPU-35 및 C. t-부틸-페닐아히스틴의 효과를 나타낸다.
도 18은 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 각각의 마우스의 부검시 절제된 종양 중량에 대한 단독 및 CPT-11과 조합으로 A. KPU-2, B. KPU-35 및 C. t-부틸-페닐아히스틴의 효과를 나타낸다.
도 19는 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 종양 성장에 대한 단독 및 CPT-11과 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다: 3 개의 연구에 대한 비교.
도 20은 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 최종 종양 중량에 대한 단독 및 CPT-11과 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다: 3 개의 연구에 대한 비교.
도 21은 DU-145 인간 전립선 종양 이종이식 모델에서 측정된 종양 성장에 대한 단독 및 탁소테르와 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다.
도 22는 DU-145 인간 전립선 종양 이종이식 모델의 생존 기간 동안 수행된 관찰을 근거로 추측된 종양 성장에 대한 단독 및 탁소테르와 조합으로 A. KPU-2, B. KPU-35 및 C. t-부틸-페닐아히스틴의 효과를 나타낸다.
도 23은 DU-145 인간 전립선 종양 이종이식 모델에서 부검시 각각의 절제된 종양 중량에 대한 단독 및 탁소테르와 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다.
도 24는 DU-145 인간 전립선 종양 이종이식 모델에서 부검시 각각의 절제된 종양 중량에 대한 단독 및 탁소테르와 조합으로 KPU-35의 효과를 나타낸다.
도 25는 MCF-7 인간 유방 종양 이종이식 모델에서 단독 및 탁소테르와 조합으로 A. KPU-2, B. KPU-35 및 C. t-부틸-페닐아히스틴의 효과를 나타낸다.
도 26은 A549 인간 폐 종양 이종이식 모델에서 측정된 종양 성장에 대한 단독 및 탁소테르와 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다.
도 27은 A549 인간 폐 종양 이종이식 모델에서 부검시 절제된 종양 중량에 대한 단독 및 탁소테르와 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다.
도 28은 쥐 유방의 지방 패드 이식된 MDA-231 인간 유방 종양 모델에서 측정된 종양 중량에 대한 단독 및 파클리탁셀과 조합으로 KPU-2의 효과를 나타낸다.
도 29는 쥐 흑색종 B16 F10 전이성 종양 모델에서 단독 및 파클리탁셀과 조합으로 A. KPU-2, B. KPU-35 및 C. t-부틸-페닐아히스틴의 효과를 나타낸다.
도 30은 도 30의 등쪽 피부 소실 (dorsal skinfold chamber)의 종양 혈관에 대한 KPU-35 및 KPU-02의 효과를 나타낸다.
도 31은 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 측정된 종양 중량에 대한 CPT-11과 조합으로 KPU-02의 효과를 나타낸다.
도 32은 HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 절제된 종양 중량에 대한 CPT-11과 조합으로 KPU-02의 효과를 나타낸다.
도 33은 KPU-02 및 KPU-35에 의해 유도된 HuVEC 세포에서 신속한 튜불린 탈중합을 나타낸다.
도 34는 HuVEC 세포에서 단층 투과성에 대한 KPU-02의 효과를 나타낸다.
도 35는 125I-IAP 기술을 사용하는 P22 래트 육종 모델에서 종양 혈류에 대한 KPU-02의 효과를 나타낸다.
도 36은 다른 조직에서 1 및 24 시간 후-투여로 혈류에 대한 KPU-02 15 mg/kg IP (% 운반체 조절로 표현)의 효과를 나타낸다.
도 37은 P22 래트 육종 모델에서 KPU-02 7.5 및 15.0 mg/kg IP에 의해 유도된 종양 괴사를 나타낸다.
도 38은 HT-29 세포에서 다양한 tBu-데하이드로-PLH 유도체의 활성을 나타낸다.
도 39는 tBu-데하이드로-PLH 유도체의 3D QSAR (CoMFA) 분석을 나타낸다.
도 40은 tBu-데하이드로-PLH 유도체의 X선 결정분석을 나타낸다.
도 41은 콜히친과 비교하여 다양한 페닐아히스틴 유도체의 생물학적 활성을 나타낸다.
도 42는 tBu-데하이드로-PLH (KPU-2) 및 KPU-35에 의한 HeLa 세포의 세포 주기 진행에 대한 효과를 나타낸다.
도 43은 파클리탁셀과 비교할 때, 약물-민감성 및 약물-저항성 종양 세포 라인에 대한 데하이드로-PLH 및 tBu-데하이드로-PLH (KPU-2)의 효과를 나타낸다.
도 44A는 DMSO 약물 운반체 (◇), 1.25μM (□), 2.5μM (―) 및 5μM (○) KPU-02의 존재 하에서 미세관 단백질 중합의 탁도 스펙트럼을 나타낸다.
도 44B는 DMSO 약물 운반체 (◇), 1.25μM (□), 2.5μM (―) 및 5μM (○) CA4의 존재 하에서 미세관 단백질 중합의 탁도 스펙트럼을 나타낸다.
도 44C는 DMSO 약물 운반체 (◇), 1.25μM (□), 2.5μM (―) 및 5μM (○) CLC의 존재 하에서 미세관 단백질 중합의 탁도 스펙트럼을 나타낸다.
도 45는 KPU-02 (○), CA4 (□) 및 콜히친 (◇) 농도 범위의 존재 또는 부재 하에서 MT의 억제를 나타낸다.
도 46A는 KPU-02의 존재 하에서 정상 상태에서 시험관 내에서 평균 미세관 길이의 빈도 히스토그램를 나타낸다.
도 46B는 CA4의 존재 하에서 정상 상태에서 시험관 내에서 평균 미세관 길이의 빈도 히스토그램를 나타낸다.
도 46C는 CLC의 존재 하에서 정상 상태에서 시험관 내에서 평균 미세관 길이의 빈도 히스토그램를 나타낸다.
도 47A는 KPU-02의 존재 하에서 정상 상태에서 시험관 내에서 형성된 고 MAP 미세관 (MAP-rich microtubules)의 전자 현미경 사진을 나타낸다.
도 47B는 CA4의 존재 하에서 정상 상태에서 시험관 내에서 형성된 고 MAP 미세관의 전자 현미경 사진을 나타낸다.
도 47C는 CLC의 존재 하에서 정상 상태에서 시험관 내에서 형성된 고 MAP 미세관의 전자 현미경 사진을 나타낸다.
도 48은 KPU-02, CA4 및 콜히친의 존재 하에서 정상 상태에서 MT 길이 감소 의 그래프 요약을 나타낸다.
도 49A는 증가하는 KPU-02의 존재 하에서 튜불린의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다.
도 49B는 KPU-02에 대한 튜불린의 Kd를 얻기 위해서 487 nm에서 형광 방출 최대에 대한 피트 (fit)를 나타낸다. 삽입은 잔류를 나타낸다.
도 49C는 결합 데이터의 이중 역변환을 나타낸다.
도 50은 부재 (◇)하에서, 또는 10 μM KPU-02 (○) 또는 10 μM CA4 (□)의 존재 하에서 [3H]CLC의 다양한 농도로 튜불린에 결합하는 콜히친의 길항적 억제 분석의 그래프 결과를 나타낸다.
도 51은 KPU-02 (○), CA4 (□) 및 콜히친 (◇)의 존재 하에서 배양된 MCF7 세포에서 KPU-02, CA4 및 CLC에 의한 유사분열 진행 억제에 대한 log[화합물] 반응 곡선을 나타낸다.
도 52는 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다. a-d: 대조군에서 튜불린 - (a) 대조군에서 튜불린, (b) KPU-02, (c) CA4 및 (d) CLC 처리된 세포들; e-h: 대조군에서 DNA - (e) 대조군에서 DNA, (f) KPU-02, (g) CA4 및 (h) CLC 처리된 세포들.
도 53A는 KPU-02로 처리된 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 53B는 CA4로 처리된 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 53C는 CLC로 처리된 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 54A는 KPU-02로 처리된 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 54B는 CA4로 처리된 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다.
도 54C는 CLC로 처리된 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다.
몇가지 도면에서, 화합물은 선택적인 표시를 사용하여 정의된다. 이들 선택적인 표지를 전환하는 완전한 차트는 하기와 같다:
Figure 112006063575231-PCT00002
Figure 112006063575231-PCT00003
Figure 112006063575231-PCT00004
바람직한 실시예의 상세한 설명
본 명세서에 언급된 미국 특허를 포함하는 본 명세서 인용된 각각의 참고 문헌은 법으로 허용가능한 완전한 범위까지 본 명세서에 전체적으로 참조로 포함되는 것으로 간주된다. 전체가 2003년 8월 1일에 출원되고 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체, 및 이들의 합성방법을 발명의 명칭으로 하는 미국 특허 출원 제 10/632,531 호 및 PCT 출원 PCTUS03/24232은 전체로 참조로 본 명세서에 포함된다.
데하이드로페닐아히스틴 및 데하이드로페닐아히스틴 동족체를 포함하는 신규 화합물을 포한하여, 화합물의 합성적 제조 방법을 제공하고, 약제학적으로 허용가능한 세포 주기 억제제, 항종양제 및 항진균제를 상대적으로 고수율로 제조하기 위한 방법을 제공하며, 여기에서 상기 화합물 및/또는 그의 동족체는 상기 세포 주기 억제제, 종양 억제제 및 항진균제에서 활성 성분 중에 있다. 본 발명의 다른 목적은 현재 이용할 수 있는, 비합성적 방법에 의해 수득할 수 없는 신규 화합물을 제공하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적은 신규의 항종양제 화합물의 부류의 일원의 종양-성장 억제 유효량을 투여하는 단계를 포함하는, 암, 특히 인간 암을 치료하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명은 또한 대상자에게 신규 항진균 화합물 부류의 일원의 항진균 유효량을 투여, 예를 들어 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 의도하는 항진균 효과를 제공하는 용량 및 방식으로 투여하는 것을 포함하는, 상기 대상자에서 병원성 진균을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다. 이러한 목적들이 본 명세서에서 개시된 상기 화합물, 및 상기 화합물을 제조하고 사용하는 방법에 대한 바람직한 실시태양에서 충족되지만, 반드시 본 발명의 모든 실시태양들에는 충족되는 것은 아니다.
본 발명은 또한 하기 화학식 I의 화합물, 및 상기 화합물 부류의 제조 방법을 개시한다:
Figure 112006063575231-PCT00005
상기 식에서,
R1, R4 및 R6은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
R1' 및 R1"는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
R, R1' 및 R1"는 서로 공유 결합되거나 또는 서로 공유 결합되지 않고;
R2, R3 및 R5는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C12 알킬, 불포화된 C1- C12 알케닐, 아실, 사이클로알킬, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로 및 치환된 니트로기, 설포닐 및 치환된 설포닐기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고;
X1 및 X2는 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 각각은 상기에 정의된 바와 같은 R5 기로 치환되거나 치환되지 않고;
Y는 질소 원자, R5로 치환된 질소 원자, 산소 원자, 황 원자, 산화된 황 원자, 메틸렌기 및 치환된 메틸렌기로 구성된 군에서 선택되고;
n은 0, 1 또는 2의 정수이고;
n이 0이 아닌 경우 각각 별개의 n에 대해 Z, 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4 는 탄소 원자, 황 원자, 질소 원자 또는 산소 원자에서 각각 독립적으로 선택되고;
점선 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다.
상기 방법은 하기의 단계를 포함한다:
디아실디케토피페라진을 첫 번째 알데히드와 반응시켜 중간체 화합물을 제조하고;
상기 중간체 화합물을 두 번째 알데히드와 반응시켜 상기 일반적인 구조를 갖는 상기 부류의 화합물들을 제조하며,
상기 첫 번째 알데히드 및 두 번째 알데히드는 옥사졸카르복스알데히드, 이미다졸카르복스알데히드, 벤즈알데히드, 이미다졸카르복스알데히드 유도체, 및 벤 즈알데히드 유도체로 구성된 군에서 선택되고, 화학식 I의 구조를 가지는 화합물을 형성한다:
R1, R4 및 R6은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
R1' 및 R1"는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원 자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
R2, R3 및 R5는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C12 알킬, 불포화된 C1-C12 알케닐, 아실, 사이클로알킬, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로 및 치환된 니트로기, 설포닐 및 치환된 설포닐기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고;
X1 및 X2는 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 각각은 상기에 정의된 바와 같은 R5 기로 치환되거나 치환되지 않고;
Y는 질소 원자, R5로 치환된 질소 원자, 산소 원자, 황 원자, 산화된 황 원자, 메틸렌기 및 치환된 메틸렌기로 구성된 군에서 선택되고;
n이 0이 아닌 경우 각각 별개의 n에 대해 Z, 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4 는 탄소 원자, 황 원자, 질소 원자 또는 산소 원자에서 각각 독립적으로 선택되고;
점선 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있다.
또한, 화학식 I 및 II의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염 및 전구약물 에스테르를 제공하고 본 명세서에 개시된 방법에 의해 상기와 같은 화합물을 합성하는 방법을 제공한다.
"전구 약물 에스테르"란 용어는, 특히 본 명세서에 개시된 방법에 의해 합성된 화학식 I의 화합물의 전구 약물 에스테르를 지칭할 때, 예를 들어, 혈액 또는 조직 내에서의 가수분해에 의해 생체 내에서 신속하게 전환되어 상기 화합물을 생성시키는 상기 화합물의 화학적 유도체를 지칭한다. "전구 약물 에스테르"란 용어는 생리학적 조건 하에서 가수분해되는 몇가지 에스테르 형성 군들 중 임의의 군의 첨가에 의해 형성되는 본 명세서에 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 전구 약물 에스테르 군의 예는 피보일옥시메틸, 아세톡시메틸, 프탈리딜, 인다닐 및 메톡시메틸뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 상기와 같은 군들, 예를 들어 (5-R-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)메틸 기를 포함한다. 전구 약물 에스테르 군의 다른 예들을 예를 들어 문헌[T. Higuchi and V. Stella, in "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14, A.C.S. Symposium Series,
American Chemical Society(1975); 및 "Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application", edited by E.B. Roche, Pergamon Press: New York, 14-21(1987)]에서 찾을 수 있다(카르복실기를 함유하는 화합물에 대한 전구약물로서 유용한 에스테르들의 예를 제공한다).
본 명세서에 사용된 바와 같이, "전구 약물 에스테르"란 용어는 또한 예를 들어, 혈액 중에 가수분해에 의해 생체 내에서 신속하게 전환되어 상기 화합물을 생성시키는 화합물의 화학적 유도체를 지칭한다. "전구 약물 에스테르"란 용어는 생리학적 조건 하에서 가수분해되는 몇가지 에스테르 형성 군들 중 임의의 군의 첨가에 의해 형성되는 본 명세서에 개시된 화합물의 유도체를 지칭한다. 전구 약물 에스테르 군의 예는 피보일옥시메틸, 아세톡시메틸, 프탈리딜, 인다닐 및 메톡시메틸뿐만 아니라 당해 분야에 공지된 다른 상기와 같은 군들, 예를 들어 (5-R-2-옥소-1,3-디옥솔렌-4-일)메틸기를 포함한다. 전구 약물 에스테르 군의 다른 예들을 예를 들어 문헌[T. Higuchi and V. Stella, in "Pro-drugs as Novel Delivery Systems", Vol. 14, A.C.S. Symposium Series, American Chemical Society(1975); and "Bioreversible Carriers in Drug Design: Theory and Application", edited by E.B. Roche, Pergamon Press: New York, 14-21(1987)]에서 찾을 수 있다(카르복실 군을 함유하는 화합물에 대한 전구약물로서 유용한 에스테르들의 예를 제공한다).
"약제학적으로 허용가능한 염"이란 용어는, 특히 본 명세서에 개시된 방법에 의해 합성된 화학식 I 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭할 때, 화합물의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭하며, 바람직하게는 화합물의 산 부가염을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예는 알칼리 금속 염(나트륨 또는 칼륨), 알칼리성 토금속 염(칼슘 또는 마그네슘), 또는 암모니아 또는 약제학적으로 허용가능한 유기 아민으로부터 유도된 암모늄 염, 예를 들어 C1-C7 알킬아민, 사이클로헥실아민, 트리에탄올아민, 에틸렌디아민 또는 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄이다. 상기 방법에 의해 합성되는 염기성 아민 화합물에 대해서, 약제학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예는 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 산, 예를 들어 할로겐화 수소산, 황산, 인산 또는 지방족 또는 방향족 카르복실산 또는 설폰산, 예를 들어 아세트산, 숙신산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 니코틴산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산 또는 나프탈렌설폰산의 산부가염이다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "약제학적으로 허용가능한 염"이란 용어는 또한 화합물의 임의의 약제학적으로 허용가능한 염을 지칭하며, 바람직하게는 화합물의 산 부가염을 지칭한다. 약제학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예는 알칼리 금속 염(나트륨 또는 칼륨), 알칼리성 토 금속 염(칼슘 또는 마그네슘), 또는 암모니아 또는 약제학적으로 허용가능한 유기 아민으로부터 유도된 암모늄 염, 예를 들어 C1-C7 알킬아민, 사이클로헥실아민, 트리에탄올아민, 에틸렌디아민 또는 트리스-(하이드록시메틸)-아미노메탄이다. 염기성 아민 화합물에 대해서, 약제학적으로 허용가능한 염의 바람직한 예는 약제학적으로 허용가능한 무기 또는 유기 산, 예를 들어 할로겐화 수소산, 황산, 인산 또는 지방족 또는 방향족 카르복실산 또는 설폰산, 예를 들어 아세트산, 숙신산, 락트산, 말산, 타르타르산, 시트르산, 아스코르브산, 니코틴산, 메탄설폰산, p-톨루엔설폰산 또는 나프탈렌설폰산의 산 부가염이다.
본 명세서에 개시된 바람직한 약제학적 조성물은 본 명세서에 개시된 방법에 의해 합성된 화학식 I의 화합물의 약제학적으로 허용가능한 염 및 전구약물 에스테르를 포함한다. 따라서, 약제학적 제형의 제조가 염 형태로 약제학적 부형제들과 유효 성분의 긴밀한 혼합을 포함한다면, 비 염기성, 즉 산성이거나 중성인 약제학 적 부형제를 사용하는 것이 바람직하다.
본 명세서에 개시된 화합물의 제조 방법의 바람직한 실시태양에서, 상대적으로 단단한 평면 의사(pseudo) 3-환 구조가 형성될 수 있다. 상기와 같은 상대적으로 단단한 평면 의사 3-환 구조를 안정화시키기 위해서 R3을 수소로 선택하는 것이 바람직할 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물 및 방법의 다른 바람직한 실시태양에서, n은 0 또는 1이고, 보다 바람직하게는 1 이고, Z2, Z3 및 Z4는 산소 원자, 질소 원자 및 탄소 원자에서 각각 독립적으로 선택되고, 보다 바람직하게는 Z2, Z3 및 Z4 중 적어도 하나 이상이 탄소 원자이며, 가장 바람직하게는 Z2, Z3 및 Z4 중 적어도 2 개 이상이 탄소 원자이다. 모든 Z들이 동시에 탄소 원자일 수도 있다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 더욱 다른 바람직한 실시태양은 하기 화학식 Ia 및 Ib의 구조를 갖는 화합물을 포함한다:
Figure 112006063575231-PCT00006
상기 식들에서 다양한 기들은 본 명세서에 정의된 바와 같다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "할로겐 원자"란 용어는 원소 주기율표 7 족 의 방사-안정성 원자들 중 임의의 원자, 예를 들어 불소, 염소, 브롬 또는 요오드, 바람직하게는 불소 및 요오드를 의미한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "알킬"이란 용어는 임의의 비 분지 또는 분지된, 치환 또는 비 치환된, 포화된 탄화수소, 바람직하게는 C1-C6 비 분지된, 포화된, 비 치환된 탄화수소, 가장 바람직하게는 메틸, 에틸, 이소부틸 및 3 급-부틸을 의미한다. 상기 치환된, 포화된 탄화수소 중에서, C1-C6 일- 및 이- 및 과-할로겐 치환된 포화된 탄화수소 및 아미노 치환된 탄화수소가 바람직하며, 퍼플루오로메틸, 퍼클로로메틸, 퍼플루오로-3 급-부틸 및 퍼클로로-3 급-부틸이 가장 바람직하다. "치환된" 이란 용어는 관련 기술에서 다수의 최신 특허들에서 발견되는 바와 같이, 그의 통상적인 의미를 갖는다. 예를 들어 미국 특허 제 6,583,143; 6,509,331; 6,506,787; 6,500,825; 5,922,683; 5,886,210; 5,874,443; 및 6,350,759 호를 참조. 구체적으로, 치환의 정의는 미국 특허 제 6,583,143 호에 제공된 것만큼 광범위하며, 상기 특허는 상기 용어 치환을 알킬, 아릴, 아릴알킬, 헤테로아릴, 헤테로아릴알킬, 헤테로사이클 및 헤테로사이클알킬과 같은 임의의 군으로서 정의하고, 여기서 적어도 하나 이상의 수소 원자가 치환기에 의해 치환된다. "치환된"이란 용어는 또한 미국 특허 제 6,509,331 호에 제공된 정의만큼 광범위하며, 상기 특허는 "치환된 알킬"이란 용어를 상기가 바람직하게는 알콕시, 치환된 알콕시, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아실, 아실아미노, 아실옥시, 아미노, 치환된 아미노, 아미노아실, 아미노아 실옥시, 옥시아실아미노, 시아노, 할로겐, 하이드록실, 카르복실, 카르복실알킬, 케토, 티오케토, 티올, 티오알콕시, 치환된 티오알콕시, 아릴, 아릴옥시, 헤테로아릴, 헤테로아릴옥시, 헤테로사이클릭, 헤테로사이클로옥시, 하이드록시아미노, 알콕시아미노, 니트로, -SO-알킬, -SO-치환된 알킬, -SO-아릴, -SO-헤테로아릴, -SO2-알킬, -SO2-치환된 알킬, -SO2 -아릴 및 -SO2-헤테로아릴로 이루어진 군에서 선택된 1 내지 5 개의 치환기, 바람직하게는 1 내지 3 개의 치환기를 갖는, 1 내지 10개의 탄소 원자의 알킬기를 지칭하는 것으로 정의한다. 다른 상기 열거된 특허들은 또한 당업자들에 의해 잘 이해되는 "치환된"이란 용어에 대한 표준 정의를 제공한다. "사이클로알킬"이란 용어는 바람직하게는 고리를 포함하는 5 내지 12 개의 원자를 갖는, 임의의 비-방향족 탄화수소 고리를 지칭한다. "아실"이란 용어는 옥소산으로부터 유도된 알킬 또는 아릴기를 지칭하며, 아세틸기가 바람직하다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "알케닐"이란 용어는 임의의 비 분지 또는 분지된, 치환 또는 비 치환된, 다중 불포화된 탄화수소를 포함한 불포화된 탄화수소를 의미하며, C1-C6 비 분지된, 일- 및 이-불포화된, 비 치환된 탄화수소가 바람직하고, 일-불포화된, 이-할로겐 치환된 탄화수소가 가장 바람직하다. 화학식 I의 화합물의 R1 및 R4 위치에서, z-이소프레닐 잔기가 특히 바람직하다. "사이클로알케닐"이란 용어는 바람직하게는 고리를 포함하는 5 내지 12 개의 원자를 갖는 임의의 비-방향족 탄화수소 고리를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "아릴", "치환된 아릴", "헤테로아릴" 및 " 치환된 헤테로아릴"이란 용어는 바람직하게는 고리를 포함하는 5, 6 또는 7 개의 원자, 가장 바람직하게는 6 개의 원자를 갖는 방향족 탄화수소 고리를 지칭한다. "헤테로아릴" 및 "치환된 헤테로아릴"은 적어도 하나 이상의 헤테로원자, 예를 들어 산소, 황 또는 질소 원자가 적어도 하나 이상의 탄소 원자와 함께 고리 중에 존재하는 방향족 탄화수소 고리를 지칭한다.
"알콕시"란 용어는 임의의 비분지 또는 분지된, 치환 또는 비 치환된, 포화 또는 불포화된 에테르를 지칭하며, C1-C6 비분지된, 포화된, 비 치환된 에테르가 바람직하고, 메톡시가 바람직하며, 또한 디메틸, 디에틸, 메틸-이소부틸 및 메틸-3 급-부틸 에테르가 또한 바람직하다. "사이클로알콕시"란 용어는 바람직하게는 고리를 포함하는 5 내지 12 개의 원자를 갖는 임의의 비-방향족 탄화수소 고리를 지칭한다.
본 명세서에 사용된 바와 같이, "정제된", "실질적으로 정제된" 및 "단리된"이란 용어는 천연 상태에서 통상적으로 회합되는 다른 비유사한 화합물이 존재하지 않는 화합물을 지칭하며, 따라서 본 발명의 화합물은 주어진 샘플의 중량을 기준으로 최소한 0.5%, 1%, 5%, 10% 또는 20%, 가장 바람직하게는 50% 또는 75%의 질량을 포함한다.
화학식 I의 화합물을 당해 분야에 공지되어 있고 이용가능한 시약으로부터 화학적으로 합성하거나 제조할 수 있다. 예를 들어 문헌[Loughlin et al., 2000 Bioorg Med Chem Lett 10:91 또는 Brocchini et al. WO 95/21832]에 디아실디케토 피페라진 (디아세틸디케토피페라진)의 변경이 개시되어 있다. 상기 디아실디케토피페라진 (디아세틸디케토피페라진)을 예를 들어 저렴한 2,5-피페라진디온 (TCI 목록 번호 G0100, 25 g)을 나트륨 아세테이트 및 나트륨 무수물에 의해 디아세틸화시킴으로써 제조할 수 있다. 상기 활성화된 데케토피페라진의 디아세틸 구조를 Boc(t-부톡시카르보닐), Z(벤조일옥시카르보닐)과 같은 카르바메이트를 포함하도록 다른 아실기로 치환시킬 수 있다.
이미다졸카르복스알데히드를 예를 들어 하기 나타낸 바와 같이 문헌[Hayashi et al., 2000 J Organic Chem 65: 8402]에 개시된 과정에 따라 제조할 수 있다:
Figure 112006063575231-PCT00007
본 명세서에 개시된 합성 방법을 바람직하게 산소 제거된 환경 및 DMF에서 염기로서 탄산 세슘의 존재 하에서 수행할 수 있다. 예를 들어 문헌[Watanabe et al., 18th International Congress of Heterocyclic Chemistry in Yokohama, Japan(30 July 2001), Abstract, 225쪽]에 보고된 바와 같이, 탄산 세슘으로 처리하는 동안 불활성 환경이 디케토피페라진 고리의 활성화된 α-탄소 원자의 가능한 산화를 억제한다(하기 참조).
Figure 112006063575231-PCT00008
상기 합성 방법의 다른 실시태양들은 화학식 I의 화합물의 합성에 사용되거나 또는 그렇지 않으면 관여되는 화합물에 대한 변경을 포함한다. 상기와 같은 유도체는 페닐 고리에 대한 변경, 다른 방향족 고리 시스템의 도입, 상기 방향족 고리의 위치, 이미다졸 고리 시스템에 대한 변경 및/또는 상기 이미다졸 고리 상의 5-위치에 대한 추가의 변경을 포함할 수 있다. 상기와 같은 변경들의 예가 예를 들어 실시예 4에 논의된다. 상기와 같은 변경의 결과는 페닐 고리의 증가된 질소 함량 및/또는 화합물 용해도를 증가시킬 수 있는 화합물을 포함한다. 다른 변경은 공지된 튜불린 억제제의 유도체를 포함할 수 있으며, 이에 의해 상기 튜불린 억제제의 활성을 모방할 수 있다. 다른 변경은 본 명세서에 개시된 방법에 사용되는 이미다졸카르복스알데히드의 제조에 관여하는 β-케토에스테르의 합성을 단순화할 수 있다.
약제학적 조성물
본 발명은 또한 보관 및 후속 투여를 위해 제조된 약제학적으로 허용가능한 운반체를 포함하는 약제학적 조성물에서, 선택적으로 바람직하게 본 명세서에 개시된 방법에 의해 제조된 본 명세서에 개시된 화합물을 포함하며, 상기 조성물은 약제학적으로 허용가능한 운반체 또는 희석제 중에 약제학적으로 유효한 용량의 상기 개시된 생성물을 갖는다. 치료학적 용도를 위한 허용가능한 운반체 또는 희석제는 약제학적 분야에 널리 공지되어 있으며, 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co., A.R. Gennaro edit. 1985]에 개시되어 있다. 보존제, 안정화제, 염료 및 심지어 풍미제가 상기 약제학적 조성물에 제공될 수 있다. 예를 들어, 벤조산 나트륨, 아스코르브산 및 p-하이드록시벤조산의 에스테르가 보존제로서 첨가될 수 있다. 또한, 항산화제 및 현탁제를 사용할 수도 있다.
데하이드로페닐아히스틴 또는 데하이드로페닐아히스틴 동족체 조성물을 제형화하여 경구 투여용 정제, 캡슐, 또는 엘릭시르; 직장 투여용 좌약; 주사용 투여를 위한 멸균 용액, 현탁액; 경피 투여용 패치; 및 피하 침착제 등으로서 사용할 수 있다. 주사용을 액체 용액 또는 현탁액으로서, 주사 또는 주입 전 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태로서, 또는 유화액으로서 통상적인 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 예를 들어 물, 염수, 덱스트로즈, 만니톨, 락토오즈, 레시틴, 알부민, 글루탐산 나트륨, 시스테인 하이드로클로라이드, 인간 혈청 알부민 등이다. 추가적으로, 경우에 따라 주사용 약제학적 조성물은 소량의 무독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제, pH 완충제 등을 함유할 수 있다. 경우에 따라, 흡수 촉진제(예를 들어 리포솜)를 사용할 수도 있다.
비 경구 투여용 약제학적 제형은 수용성 형태의 활성 화합물의 수용액을 포함한다. 추가적으로, 상기 활성 화합물의 현탁액을 적당한 유질 주입 현탁액으로서 제조할 수 있다. 적합한 친유성 용매 또는 운반체는 지방 오일, 예를 들어 호마유, 또는 다른 유기 오일, 예를 들어 대두 오일, 자몽 오일 또는 아몬드 오일, 또는 합 성 지방산 에스테르, 예를 들어 에틸올리에이트 또는 트리글리세라이드, 또는 리포솜을 포함한다. 수성 주입 현탁액은 상기 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로즈, 솔비톨 또는 덱스트란을 함유할 수 있다. 선택적으로, 상기 현탁액은 또한 적합한 안정화제, 또는 화합물의 용해도를 증가시켜 매우 농축된 용액의 제조를 허용하는 작용제를 함유할 수 있다.
활성 화합물들을 고체 부형제와 함께 배합하고, 선택적으로 결과 혼합물을 분쇄하고, 과립 혼합물을 가공하고, 그 후에 경우에 따라 적합한 보조제를 가하여 정제 또는 당의정 코어를 수득함으로써 경구용 약제학적 제제를 수득할 수 있다. 적합한 부형제는 특히 충전제, 예를 들어 당, 예를 들어 락토오즈, 슈크로즈, 만니톨 또는 솔비톨; 셀룰로즈 제제, 예를 들어 옥수수 전분, 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 트라가칸트 검, 메틸 셀룰로즈, 하이드록시프로필메틸-셀룰로즈, 나트륨 카르복시메틸셀룰로즈, 및/또는 폴리비닐피롤리돈(PVP)이다. 경우에 따라, 붕해제, 예를 들어 가교결합된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산 또는 그의 염, 예를 들어 나트륨 알기네이트를 첨가할 수 있다. 적합하게 코팅된 당의정 코어를 제공한다. 이를 위해서, 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화 티탄, 랙커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 선택적으로 함유할 수 있는 농축된 당 용액을 사용할 수 있다. 활성 화합물 용량을 확인하거나 또는 상기 화합물 용량들의 상이한 조합을 특성화하기 위해서 염료 또는 안료를 상기 정제나 당의정에 첨가할 수도 있다. 이를 위해서 아라비아 검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜 및/또는 이산화 티탄, 랙커 용액, 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 선택적으로 함유할 수 있는 농축된 당 용액을 사용할 수 있다. 활성 화합물 용량을 확인하거나 또는 상기 화합물 용량들의 상이한 조합을 특성화하기 위해서 염료 또는 안료를 상기 정제나 당의정에 첨가할 수도 있다. 상기와 같은 제형들을 당해 분야에 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다(예를 들어, 미국 특허 제 5,733,888 (주사용 조성물); 5,726,181(불충분하게 수용성인 화합물); 5,707,641(치료학적으로 활성인 단백질 또는 펩티드); 5,667,809(친유성 작용제); 5,576,012(가용성 중합체성 작용제); 5,707,615(항바이러스성 제형); 5,683,676(미립자 약제); 5,654,286(국소 제형); 5,688,529(경구 현탁액); 5,445,829(연장된 방출 제형); 5,653,987(액체 제형); 5,641,515(조절된 방출 제형); 및 5,601,845 호(장구 제형)를 참조).
안 내, 비 내, 및 귀 내 전달을 포함하는 용도로 약제학적 분야에 널리 공지된 다양한 약제학적 조성물들을 또한 본 명세서에 개시한다. 약제학적 제형은 수용성 형태의 상기 활성 화합물들의 수성 안 용액, 예를 들어 점안제, 또는 겔란 검(Shedden et al., 2001 Clin Ther 23(3):440-50) 또는 하이드로겔(Mayer et al., 1996 Ophthalmologica 210:101-3); 안 연고; 안 현탁액, 예를 들어 미세입자, 액체 운반체 매질 중에 현탁되는 약물 함유 중합체성 소립자(Joshi, A., 1994 J Ocul Pharmacol 10:29-45), 지용성 제형(Alm et al., 1989 Prog Clin Biol Res 312:447-58), 및 미소구(Mordenti, 1999 Toxicol Sci 52:101-6); 및 안구 삽입물을 포함한다. 상기와 같은 적합한 약제학적 제형들은 종종, 바람직하게는 안정성과 안락을 위해 멸균되고, 등장성이고, 완충되도록 제형화된다. 약제학적 조성물은 또한 종종 정상적인 섬모 운동의 유지를 확인하기 위해 여러 면에서 코 분비물을 모방하기 위해 제조되는 점적제 및 스프레이를 포함한다. 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing, 18th Edition]에 개시되고 당업자들에게 널리 공지된 바와 같이, 적합한 제형은 종종 바람직하게는 등장성으로, 5.5 내지 6.5의 pH를 유지하도록 가볍게 완충되며, 종종 바람직하게는 항균성 보존제 및 적합한 약물 안정화제를 포함한다. 귀 내 전달을 위한 약제학적 제형은 귀에 국소 적용하기 위한 현탁액 및 연고를 포함한다. 상기와 같은 귀 제형에 통상적인 용매는 글리세린 및 물을 포함한다.
화학식 I의 화합물은 세포 주기 억제제, 종양 성장 억제 화합물 또는 진균 성장 억제 화합물로서 사용될 때, 경구 또는 비 경구 경로에 의해 투여될 수 있다. 경구로 투여되는 경우, 상기 화합물을 캡슐, 정제, 과립, 스프레이, 시럽 또는 다른 상기와 같은 형태로 투여할 수 있다. 비 경구로 투여되는 경우, 상기 화합물은 수성 현탁액, 유성 제제 등으로서 또는 점적 주입, 좌약, 고약, 연고 등으로서 투여될 수 있으며, 주사 또는 주입을 통해, 피하, 복강 내, 정맥 내, 근육 내 등으로 투여될 수 있다. 유사하게, 상기 화합물을 종양과 최적으로 접촉되게 하기 위해 당업자들에 의해 적합하다고 생각되는 바와 같이 상기를 국소, 직장 또는 질을 통해 투여하여 상기 종양의 성장을 억제시킬 수 있다. 또한 종양 절제 전 또는 후에 종양 부위에의 국소 투여를 조절된 방출 제형, 데포 제형 및 주입 펌프 전달로서 고려한다.
투여 방법
본 발명은 또한 개시된 화학 화합물 및 개시된 약제학적 조성물의 제조 방법 및 투여 방법을 포함한다. 상기와 같이 개시된 방법은 다른 것들 중에서도 (a) 경구 경로를 통한 투여 (상기 투여는 캡슐, 정제, 과립, 스프레이, 시럽 또는 다른 상기와 같은 형태를 포함한다); (b) 비 경구 경로를 통한 투여 (상기 투여는 수성 현탁액, 유성 제제 등으로서 또는 점적 주입, 좌약, 고약, 연고 등으로서의 투여를 포함한다); 주사 또는 주입을 통해, 피하, 복강 내, 정맥 내, 근육 내, 경피 내 등으로 투여뿐만 아니라; 및 살아있는 조직과 화합물을 접촉시키기 위해 당업자들이 적합하다고 생각하는 바와 같이 (c) 국소 투여, (d) 직장 투여; 또는 (e) 질을 통한 투여; 및 (f) 조절된 방출 제형, 데포 제형 및 주입 펌프 전달을 통한 투여를 포함한다. 상기와 같은 투여 방식에 대한 추가의 예 및 투여 방식에 대한 추가의 개시로서, 상기 개시된 화학 화합물 및 약제학적 조성물의 다양한 투여 방식, 예를 들어 안 내, 비 내 및 귀 내 경로를 통한 투여 방식을 본 명세서에 개시한다.
용량으로 요구되는 데하이드로페닐아히스틴 또는 데하이드로페닐아히스틴 동족체 조성물의 약제학적으로 유효한 용량은 투여 경로, 인간을 포함한 치료되는 동물의 유형, 및 고려 중인 특정 동물의 신체적 특징에 의존한다. 상기 용량을 목적하는 효과를 성취하기 위해 맞출 수 있지만, 이는 체중, 식이요법, 동반되는 약물 치료, 및 의학 분야의 숙련가들이 인식하는 다른 인자와 같은 요인에 의존할 것이다.
상기 방법의 실시에서, 생성물 또는 조성물을 단독으로 또는 서로 조합으로, 또는 다른 치료제 또는 진단제와 조합으로 사용할 수 있다. 예를 들어,본 명세서에 개시된 바와 같이 본 명세서에 개시된 화합물은 다른 활성 물질, 특히 다른 화학요법제, 예를 들어 생물제제 및 특정한 화학요법제 CPT-11, 탁소텐(도카탁셀) 및 파클리탁셀과 조합으로 사용될 때 암 치료에 효과적이다. 본 명세서에 개시된 화합물은 또한 다른 활성 물질, 예를 들어 항혈관제, 혈관형성 억제제, 예를 들어 에르뷰이툭스 (Erbuitux)(임클론/브리스톨-마이어스(Imclone/bristol-Myers)) 및 이레사 (아스트라제네카(AstraZeneca)), 다른 VEGF 억제제 및 생물 제제, 보다 구체적으로 적어도 하나 이상의 항-VEGF 항체, 특히 VEGF 수용체에 대한 단일 클론 항체, 예를 들어 DC101, 래트 단일 클론 항체 (마우스 VEGF 수용체 2(flk-1)를 차단한다)와 조합으로 사용될 때 암 치료에 효과적이다. 상기와 같은 조합을 생체 내에서, 통상적으로는 포유동물에서, 바람직하게는 인간에서, 또는 시험관 내에서 사용할 수 있다. 이들을 생체 내에서 사용하는 경우, 개시된 화합물을 단독으로 또는 다른 화학요법제 또는 다른 생물 제제 산물과 조합으로 포유동물에게 다양한 투여 형태를 사용하여 다양한 방식으로, 예를 들어 비 경구로, 정맥 내로, 주입 또는 주사를 통해, 피하로, 근육 내로, 결장으로, 직장으로, 질로, 코로, 복강 내로 투여할 수 있다. 상기와 같은 방법을 또한 생체 내에서 화학 활성을 시험하는데 적용시킬 수도 있다.
당업자들에게 쉽게 자명해지는 바와 같이, 투여되는 유용한 생체 내 용량 및 특정 투여 방식은 연령, 체중 및 처치되는 포유동물 종, 사용되는 특정 화합물, 및 상기 화합물이 사용되는 특정한 용도에 따라 변할 것이다. 목적하는 결과를 성취하는데 필요한 용량 수준인 유효 용량 수준의 결정은 통상적인 약물학적 방법을 사용 하여 당업자에 의해 수행될 수 있다. 전형적으로, 생성물의 인간 임상 적용을 보다 적은 용량 수준에서 개시하여, 상기 용량 수준을 목적하는 효과가 성취될 때까지 증가시킨다. 선택적으로, 허용가능한 시험관 내 연구를 이용하여, 확립된 약물학적 방법을 사용하는 본 발명의 방법에 의해 정의된 조성물의 유용한 용량 및 투여 경로를 확립시킬 수 있다.
비 인간 동물 연구에서, 가능성 있는 생성물의 적용을 보다 높은 용량 수준에서 개시하여, 목적하는 효과가 더 이상 성취되지 않거나 또는 부작용이 사라질 때까지 용량을 감소시킨다. 상기 용량의 범위는 목적하는 영향 및 치료 징후에 따라 광범위할 수 있다. 전형적으로, 용량은 약 10 ㎍/체중 ㎏ 내지 100 ㎎/체중 ㎏, 바람직하게는 약 100 ㎍/체중 ㎏ 내지 10 ㎎/체중 ㎏일 수 있다. 선택적으로, 용량은 당업자들에 의해 이해되는 바와 같이, 환자의 표면적을 기준으로 하며 이를 근거로 계산될 수 있다. 투여는 3 일마다, 이틀마다, 매일, 하루에 2 회, 또는 하루에 3 회 경구로 수행될 수 있다.
정확한 제형, 투여 경로 및 용량을 환자의 조건에 비추어 의사 개인이 선택할 수 있다. 예를 들어 문헌[Fingl et al., in The Pharmacological Basis of Therapeutics, 1975]을 참조. 주치의는 독성이나 기관 기능 장애로 인하여 투여를 종료, 중단 또는 조절하는 방법 및 시기를 알 것임을 유념해야 한다. 반대로, 주치의는 임상 반응이 적합하지 않은 경우 (독성 제외) 치료를 보다 높은 수준으로 조절해야 할 것을 알 것이다. 관심 질환의 관리에서 투여되는 용량의 규모는 치료되는 병태의 중증도 및 투여 경로에 따라 다양할 것이다. 상기 병태의 중증도는 예를 들어 부분적으로 표준 예후 평가 방법에 의해 평가될 수 있다. 또한, 용량 및 추정 상 용량 빈도가 또한 환자 개인의 연령, 체중 및 반응에 따라 다양할 것이다. 상기 논의된 것에 필적하는 프로그램을 수의학적 약제에 사용할 수 있다.
치료되는 특정 병태에 따라, 상기와 같은 작용제를 제형화하고 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 다양한 제형화 및 투여 기법을 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990)]에서 찾을 수 있다. 적합한 투여 경로는 경구, 직장, 경피, 질, 점막통과 또는 장 투여; 비 경구 전달, 예를 들어 근육 내, 피하, 척추 내 주사뿐만 아니라, 주입을 통해 포막 내, 직접적인 심실 내, 정맥 내, 복강 내, 비 내 또는 안내 주입을 포함할 수 있다.
주사 또는 주입을 위해, 상기 작용제를 수용액, 예를 들어 생리학적으로 적합한 완충액, 예를 들어 행크 용액(Hanks' solution), 링거 액, 또는 생리 염수 완충액 중에서 제형화할 수 있다. 상기와 같은 점막 내 투여를 위해, 투과시킬 차단층에 적합한 침투제를 제형에 사용한다. 상기와 같은 침투제는 당해 분야에 일반적으로 공지되어 있다. 본 발명의 실시를 위해 본 명세서에 개시된 화합물을 전신 투여에 적합한 용량으로 제형화하기 위해서 약제학적으로 허용가능한 운반체를 사용하는 것은 본 발명의 범위 내에 있다. 운반체 및 적합한 제조 실시를 적합하게 선택하여, 본 명세서에 개시된 조성물, 특히 용액으로서 제형화된 조성물을 비 경구적으로, 예를 들어 정맥 내 주사 또는 주입에 의해 투여할 수 있다. 상기 화합물을 당해 분야에 널리 공지된 약제학적으로 허용가능한 운반체를 사용하여 경구 투여에 적합한 용량으로 쉽게 제형화할 수 있다. 상기와 같은 운반체는 상기 화합물을 치료할 환자가 경구 섭취할 수 있도록 정제, 환제, 캡슐, 액체, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁액 등으로서 제형화될 수 있게 한다.
세포 내로 투여하게 되어 있는 작용제를 당업자에게 널리 공지된 기법을 사용하여 투여할 수 있다. 예를 들어, 상기와 같은 작용제를 리포솜으로 캡슐화하고, 이어서 상술한 바와 같이 투여할 수 있다. 리포솜 형성 시에 수용액 중에 존재하는 모든 분자는 수성 내부로 포함된다. 상기 리포솜 내용물은 외부의 미세 환경으로부터 보호되며, 리포솜이 세포막과 융합되기 때문에 세포질 내로 효율적으로 전달된다. 추가적으로, 그의 소수성에 기인하여, 작은 유기 분자들이 세포 내로 직접 투여될 수 있다.
유효량의 결정은, 특히 본 명세서에 제공된 상세한 내용에 비추어, 당업자들의 능력 내에 있다. 활성 성분들에 추가하여, 상기 약제학적 조성물은 활성 화합물이 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공되는 것을 촉진시키는 부형제 및 보조제를 포함하는 적합한 약제학적으로 허용가능한 운반체를 함유할 수 있다. 경구 투여용으로 제형화된 제제는 정제, 당의정, 캡슐 또는 용액의 형태일 수 있다. 상기 약제학적 조성물을 공지된 방법으로, 예를 들어 통상적인 혼합, 용해, 과립화, 당의정 제조, 부양, 유화, 캡슐화, 포집 또는 동결 건조 방법들을 사용하여 제조할 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물을 공지된 방법을 사용하여 효능 및 독성에 대해 평가할 수 있다. 예를 들어, 특정 화합물, 또는 몇가지 화학 잔기들을 공유하는 상 기 화합물의 서브셋의 독성을 세포 라인, 예를 들어 포유동물, 및 바람직하게는 인간, 세포 라인에 대한 시험관 내 독성을 측정함으로써 확립시킬 수 있다. 상기와 같은 연구의 결과는 종종 동물, 예를 들어 포유동물, 또는 보다 구체적으로 인간에서 독성을 예견한다. 선택적으로, 동물 모델, 예를 들어 마우스, 래트, 토끼 또는 원숭이에 대한 특정 화합물의 독성을 공지된 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 특정 화합물의 효능을 몇가지 기술의 인식된 방법, 예를 들어 시험관 내 방법, 동물 모델, 또는 인간 임상 시험을 사용하여 확립시킬 수 있다. 기술 인식된 시험관 내 모델은 거의 모든 부류의 증상, 예를 들어 본 명세서에 개시된 화합물에 의해 약화되는 증상, 예를 들어 암, 심혈관 질환 및 다양한 진균 감염에 대해 존재한다. 유사하게, 허용 가능한 동물 모델을 사용하여 상기와 같은 증상의 치료를 위한 화학물질의 효능을 확립시킬 수 있다. 효능을 측정할 모델을 선택할 때, 숙련가는 적합한 모델, 용량, 및 투여 경로, 및 섭생을 선택하기 위해 기술적 상황을 지침으로 할 수 있다. 물론, 인간 임상 시험도 또한 인간에서의 화합물의 효능을 측정하기 위해 사용될 수 있다.
항암제, 또는 종양 성장 억제 화합물로서 사용될 때 본 명세서에 개시된 화합물을 경구 또는 비 경구 경로로 투여할 수 있다. 경구로 투여하는 경우 상기를 캡슐, 정제, 과립, 스프레이, 시럽 또는 다른 상기와 같은 형태로 투여할 수 있다. 비 경구로 투여하는 경우, 상기 화합물을 수성 현탁액, 유성 제제 등으로서 또는 점적 주입, 좌약, 고약, 연고 등으로서 투여할 수 있으며, 주사 또는 주입을 통해, 피하, 복강 내, 정맥 내, 근육 내, 피하 내 등으로 투여할 수 있다. 유사하게, 상 기 화합물을 종양과 최적으로 접촉되게 하기 위해 당업자들에 의해 적합하다고 생각되는 바와 같이, 상기 화합물을 국소, 직장 또는 질을 통해 투여하여 상기 종양의 성장을 억제시킬 수 있다. 종양 또는 다른 질병 증상 부위에 국소 투여가 또한 종양 절제 전 또는 후에, 또는 상기 질병 증상의 기술 인식된 치료의 일부로서 고려된다. 조절된 방출 제형, 데포 제형 및 주입 펌프 전달이 유사하게 고려된다.
항암제 또는 항종양제로서 사용되는 경우 인간 환자에게 약 0.0007 ㎎/일 내지 약 7,000 ㎎/일의 활성 성분, 보다 바람직하게는 약 0.07 ㎎/일 내지 약 70 ㎎/일의 유효 성분의 용량을, 바람직하게는 하루에 한 번, 또는 덜 바람직하게는 하루에 2 회 내지 약 10 회 경구 또는 비 경구 투여할 수 있다. 선택적으로 또한 바람직하게, 상기 화합물을 예를 들어 정맥 내 점적 주입에 의해 연속적으로, 지정된 용량으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 체중이 70 ㎏인 환자의 경우, 활성 항종양제 성분의 바람직한 1 일 용량은 약 0.0007 ㎎/㎏/일 내지 약 35 ㎎/㎏/일, 예를 들어 1.0 ㎎/㎏/일 및 0.5 ㎎/㎏/일, 보다 바람직하게는 0.007 ㎎/㎏/일 내지 약 0.050 ㎎/㎏/일, 예를 들어 0.035 ㎎/㎏/일일 것이다. 그럼에도 불구하고, 당업자들에 의해 이해되는 바와 같이, 몇가지 상황에서 상기 항종양 화합물을 과잉 또는 심지어 훨씬 과잉의 용량으로, 상기 지정된, 진행되거나 치명적인 종양을 효율적이고 공격적으로 치료하는데 바람직한 용량 범위의 용량으로 투여하는 것이 필요할 수 있다.
항진균제로서 사용될 때, 특정 진균 병원균의 치료 또는 예방에 유효한 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체의 바람직한 양은 부분적으로 진균의 특징 및 감염 정도에 부분적으로 의존하고 표준적인 임상 기법에 의해 결정될 수 있다. 시험관 내 또는 생체 내 분석은 최적 용량 범위를 확인하는 것을 돕기 위해 선택적으로 사용할 수 있다. 유효 용량을 시험관 내 분석 또는 바람직하게는 동물 모델로부터 유도된 용량-반응 곡선으로부터 외삽법으로 추정할 수 있다. 정확한 용량 수준을 주치의나 다른 건강 관리 제공자가 결정해야 하며, 상기 수준은 잘 알려진 인자들, 예를 들어 투여 경로, 및 개인의 연령, 체중, 성별 및 일반적인 건강; 감염 성질, 중증도 및 임상 단계; 동반되는 요법의 사용 여부에 의존한다.
데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체의 유효 용량은 전형적으로는 단일 또는 수회 용량으로 투여 시, 하루에 포유동물 체중을 기준으로 약 0.01 내지 약 50 ㎎/㎏, 바람직하게 약 0.1 내지 10 ㎎/㎏의 범위일 것이다. 일반적으로, 상기 화합물을 상기와 같은 치료가 필요한 환자에게 환자 당 약 1 내지 약 2000 ㎎의 1 일 용량 범위로 투여할 수 있다.
본 명세서에 개시된 화합물을 포함하는 용량을 종양 성장 억제 화합물로서 제형화하기 위해서, 공지된 표면 활성제, 부형제, 평활제, 현탁제, 및 약제학적으로 허용가능한 필름 형성 물질 및 코팅 보조제 등을 사용할 수 있다. 바람직하게 알콜, 에스테르, 황산화된 지방족 알콜 등을 표면 활성제로서; 슈크로스, 글루코스, 락토오스, 전분, 결정화된 셀룰로즈, 만니톨, 경 무수 실리케이트, 마그네슘 알루미네이트, 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트, 합성 알루미늄실리케이트, 탄산 칼슘, 나트륨 산 카보네이트, 인산 수소 칼슘, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로즈 등을 부형제로서; 마그네슘 스테아레이트, 활석, 경화유 등을 평활제로서; 코코넛 오일, 올리브 오일, 호마유, 땅콩 오일, 대두 오일을 현탁제 또는 윤활제로서; 셀룰로즈 또는 당과 같은 탄수화물의 유도체로서 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트, 또는 폴리비닐의 유도체로서 메틸아세테이트-메타크릴레이트 공중합체를 현탁제로서; 및 가소화제, 예를 들어 에스테르 프탈레이트 등을 현탁제로서 사용할 수 있다. 상기 바람직한 성분에 추가하여, 감미제, 향료, 착색제, 보존제 등을 바람직하게는 화합물을 경구 투여하는 경우 상기 화합물의 투여 제형에 첨가할 수도 있다.
약제학적 조성물 중의 본 명세서에 개시된 화합물은 또한 약제학적으로 허용 가능한 운반체를 또한 포함할 수 있다. 상기와 같은 조성물을 보관 또는 후속 투여를 위해 제조할 수 있다. 치료학적 용도로 허용 가능한 운반체 또는 희석제는 약제학적 분야에 널리 공지되어 있으며 예를 들어 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co.(A.R. Gennaro edit. 1985)]에 개시되어 있다. 예를 들어, 상기와 같은 조성물을 제형화하고 경구 투여를 위해 정제, 캡슐 또는 용액으로서; 직장 또는 질 투여를 위해 좌약으로서; 주사용의 투여를 위해 멸균 용액 또는 현탁액으로서 사용할 수 있다. 주사용을 액체 용액 또는 현탁액, 주사 또는 주입 전에 액체 중의 용액 또는 현탁액에 적합한 고체 형태, 또는 유화액으로서 통상적인 형태로 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 염수, 덱스트로즈, 만니톨, 락토오즈, 레시틴, 알부민, 나트륨 글루타메이트, 시스테인 하이드로클로라이드 등을 포함하지만, 이들에 제한되지 않는다. 또한, 경우에 따라, 상기 주사 가능한 약제학적 조성물은 소량의 무독성 보조 물질, 예를 들어 습윤제, pH 완충제 등을 함유할 수 있다. 경우에 따라, 흡수 촉진 제제(예를 들어 리포솜)를 사용할 수 있다.
용량으로 필요한 조성물의 약제학적으로 유효한 용량은 투여 경로, 치료하려는 동물의 유형 및 고려 중인 특정 동물의 신체 특징에 의존할 것이다. 상기 용량을 목적하는 효과를 성취하기 위해 맞출 수 있지만, 이는 체중, 식이요법, 동반되는 약물 치료, 및 의학 분야의 숙련가들이 인식하는 다른 인자들에 의존할 것이다.
상술한 바와 같이 상기 생성물 또는 조성물을 단독으로 또는 서로 조합으로, 또는 다른 치료제 또는 진단제와 조합으로 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 개시된 화합물 생성물을 단독으로 또는 암 치료를 위한 다른 화학요법제 또는 생물 제제, 예를 들어 항체와 조합으로, 또는 진균 감염의 치료를 위한 다른 항감염제와 조합으로 사용할 수 있다. 이들 생성물 또는 조성물을 생체 내 또는 시험관 내에서 사용할 수 있다. 유용한 용량 및 가장 유용한 투여 방식은 연령, 체중 및 치료되는 동물, 사용되는 특정 화합물, 및 상기 조성물 또는 조성물들을 사용하는 특정한 용도에 의존할 것이다. 특정 질환의 관리 또는 치료에서 용량의 크기는 치료하려는 증상의 중증도 및 투여 경로에 따라 변할 것이며, 질환 증상 및 그의 중증도에 따라, 상기 조성물을 제형화하고 전신 또는 국소 투여할 수 있다. 다양한 제형화 및 투여 기법을 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th Ed., Mack Publishing Co., Easton, PA(1990)]에서 찾을 수 있다.
바람직하게는 본 명세서에 개시된 방법에 따라 합성적으로 제조된 화학식 I의 화합물을 세포 주기 억제제, 종양 성장 억제제 또는 항진균 화합물로서 제형화하기 위해서, 공지된 표면 활성제, 부형제, 평활제, 현탁제, 및 약제학적으로 허용가능한 필름 형성 물질 및 코팅 보조제 등을 사용할 수 있다. 바람직하게는 알콜, 에스테르, 황산화된 지방족 알콜 등을 표면 활성제로서; 슈크로스, 글루코스, 락토오스, 전분, 결정화된 셀룰로즈, 만니톨, 경 무수 실리케이트, 마그네슘 알루미네이트, 마그네슘 메타실리케이트 알루미네이트, 합성 알루미늄 실리케이트, 탄산 칼슘, 나트륨 산 카보네이트, 인산 수소 칼슘, 칼슘 카르복시메틸 셀룰로즈 등을 부형제로서; 마그네슘 스테아레이트, 활석, 경화유 등을 평활제로서; 코코넛 오일, 올리브 오일, 호마유, 땅콩 오일, 대두 오일을 현탁제 또는 윤활제로서; 셀룰로즈 또는 당과 같은 탄수화물의 유도체로서 셀룰로즈 아세테이트 프탈레이트, 또는 폴리비닐의 유도체로서 메틸아세테이트-메타크릴레이트 공중합체를 현탁제로서; 및 가소화제, 예를 들어 에스테르 프탈레이트 등을 현탁제로서 사용할 수 있다. 상기 바람직한 성분들에 추가하여, 감미제, 향료, 착색제, 보존제 등을 특히 화합물을 경구 투여하는 경우 상기 방법에 의해 제조된 상기 화합물의 투여 제형에 첨가할 수도 있다.
상기 방법에 의해 제조될 수 있는 세포 주기 억제제, 항종양제 및 항진균제를 인간 환자에게 약 0.001 ㎎/㎏/일 내지 약 10,000 ㎎/㎏/일의 유효 성분의 용량으로, 보다 바람직하게는 약 0.1 ㎎/㎏/일 내지 약 100 ㎎/㎏/일의 유효 성분의 용량으로, 바람직하게 주기 기준으로 3 일에 한 번, 이틀에 한 번, 하루에 한 번, 하루에 두 번, 또는 덜 바람직하게는 하루에 2 회 내지 약 10 회 경구 또는 비 경구 투여할 수 있다. 선택적으로 또한 바람직하게, 상기 방법으로 생성된 상기 화합물을 예를 들어 정맥 내 점적 주입에 의해 연속적으로, 지정된 양으로 투여하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 체중이 70 ㎏인 환자의 경우, 활성 항종양 성분의 바람 직한 1 일 용량은 약 0.07 ㎎/일 내지 약 700 g/일, 보다 바람직하게는 7 ㎎/일 내지 약 7 g/일일 것이다. 그럼에도 불구하고, 당업자들에 의해 이해되는 바와 같이, 몇가지 상황에서 상기 방법으로 생성된 상기 항종양 화합물을 과잉 또는 심지어 훨씬 과잉의 용량으로, 상기 지정된, 특별히 진행되거나 치명적인 종양을 효율적이고 공격적으로 치료하는데 바람직한 용량 범위의 용량으로 투여하는 것이 필요할 수도 있다.
생화학 시험 시약으로서 상기 방법에 의해 제조된 세포 주기 억제제를 사용하는 경우에, 본 발명의 방법에 의해 제조된 화합물은 유기 용매 또는 함수 유기 용매에 용해되고 임의의 다양한 배양 세포 시스템에 직접 적용될 때, 세포 주기의 진행을 억제한다. 유용한 유기 용매는 예를 들어 메탄올, 메틸설폭사이드 등을 포함한다. 상기 제형은 예를 들어 분말, 과립 또는 다른 고체 억제제, 또는 유기 용매 또는 함수 유기 용매를 사용하여 제조된 액체 억제제일 수 있다. 세포 주기 억제제로서 사용하기 위한 본 발명의 방법에 의해 제조된 화합물의 바람직한 농도는 일반적으로 약 1 내지 약 100 ㎍/㎖의 범위이지만, 가장 적합한 사용량은 당업자에 의해 인식되는 바와 같이 배양된 세포 시스템의 유형 및 사용 목적에 따라 다양하다. 또한, 몇가지 적용에서, 상기 범위 밖의 용량을 사용하는 것이 당업자에게 필요하거나 바람직할 수도 있다.
약제학적 예견으로부터, 일부 실시태양은 상기 대상자에서 진균 감염및/또는 병원성 진균을 예방 또는 치료하는 방법을 제공하고, 대상자에게 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 포함하는 조성물을 투여, 예를 들어 데하이드로페닐아 히스틴 또는 그의 동족체를 목적하는 항진균 효과를 제공하는 용량 및 방식으로 투여하는 것을 포함한다.
다른 실시태양은 상기에 나타내거나 하기에 언급하는 것들과 같은 병원성 진균에 의한 환자의 감염을 치료 또는 예방하는 것을 포함한다.
또 다른 실시태양은 하나 이상의 다른 항진균제, 특히 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체 이외의 작용제, 예를 들어 암포테리신 B 또는 그의 동족체 또는 이들의 유도체(14(s)-하이드록시암포테리신 B 메틸 에스테르, 1-아미노-4-메틸피페라진을 갖는 암포테리신 B의 하이드라지드 및 다른 유도체 포함) 또는 다른 폴리엔 마크로리드 항생제, 예를 들어 나이스타틴, 칸디시딘, 피마리신 및 나타마이신; 플루시토신; 그리세오풀빈; 에치노칸딘스 또는 아우레오바시딘스, 예를 들어 천연 및 반 합성 동족체; 디하이드로벤조[a]나프타센퀴논; 뉴클레오시드 펩티드 항진균제, 예를 들어 폴리옥신 및 니코마이신; 알릴아민, 예를 들어 나프티핀 및 다른 스쿠알렌 에폭시다제 억제제; 및 아졸, 이미다졸 및 트리아졸, 예를 들어 클로트리마졸, 미코나졸, 케토코나졸, 에코나졸, 부토코나졸, 옥시코나졸, 테르코나졸, 이트라코나졸 또는 플루코나졸 등에 내성인 병원성 진균에 의한 환자 감염의 치료 또는 예방에 관한 것이다. 추가의 통상적인 항진균제 또는 개발중인 신규 작용제에 대해서, 예를 들어 문헌[Turner and Rodriguez, 1996 Current Pharmaceutical Design, 2:209-224]을 참조. 또 다른 실시태양은 환자가 하나 이상의 다른 항진균제에 대해 알러지성이거나, 그렇지 않으면 내성이거나 또는 비 반응성인 경우, 또는 다른 항진균제의 사용이 달리 금기를 나타내는 경우 병원성 진균에 의한 환자 감염의 치료 또는 예방을 포함한다. 상기 다른 항진균제는 다른 것들 중에서 상기 및 본 명세서의 다른 부분에 개시된 항진균제들을 포함한다.
상기 치료 또는 예방 방법에서, 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 대상자에게 항진균 유효량으로 투여한다.
다른 실시태양은 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 하나 이상의 다른 항진균제, 예를 들어 임의의 앞서 언급한 작용제 또는 앞서 언급한 유형의 작용제의 투여와 함께(예를 들어 바람직하게는 지성 또는 리포솜 제형 중의 암포테리신 B; 아졸 또는 트리아졸, 예를 들어 플루코나졸; 아우레오바시딘; 디하이드로벤조[a]나프타센퀴논; 또는 에키노카르딘에 의한 치료와 조합으로)뿐만 아니라 상이한 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체와 함께 투여함으로써 환자의 병원성 진균에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 것에 관한 것이다.
데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 다른 항진균제의 투여 전, 후 또는 상기와 동시에 투여할 수 있다. 몇가지 실시태양에서, 조합 치료는 단독으로 사용되는 경우 사용되는 용량에 비해 항진균 성분 하나 또는 둘 모두의 감소된 용량의 사용을 허용할 것이다.
더욱 다른 실시태양은 병원성 진균에 의한 감염의 치료 또는 예방을 위해 대상자에게 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 투여하는 것에 관한 것이며, 이때 상기 대상자는 예를 들어 유전 질환, 당뇨병 또는 HIV 또는 다른 감염과 같은 질환, 암 또는 다른 질환에 대한 화학요법제 또는 방사선 치료, 또는 약물-또는 달리 조직이나 기관 이식 또는 자가면역 질환의 치료와 관련하여 유발된 면역억제의 결과로서 면역 억제되거나 면역 손상되어 있다. 상기 환자가 예를 들어 조직 또는 기관 이식과 관련하여 면역억제제로 치료받는 중이거나 또는 치료받을 것이라면, 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 면역 억제제(들)와 함께 동시에 투여하여 병원성 진균 감염을 치료 또는 예방할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 항균성 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 하나 이상의 항-HIV 치료제(예를 들어 HIV 프로테아제 억제제, 역 전사 억제제 또는 항바이러스제를 포함)와 함께 투여함으로써 HIV로 감염되거나 감염이 의심되는 환자에서 병원성 진균에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 것이다. 상기 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 상기 항-HIV 작용제(들)의 투여 전, 후 또는 투여와 동시에 투여할 수 있다.
본 발명의 또 다른 태양은 항진균성 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 하나 이상의 다른 항생제 화합물, 특히 하나 이상의 항균제와 함께, 바람직하게는 세균 감염의 치료 또는 예방에 유효한 용량 및 섭생으로 투여함으로써 환자에서 병원성 진균에 의한 감염을 치료 또는 예방하는 것이다. 다시, 상기 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 상기 다른 작용제(들)의 투여 전, 후 또는 투여와 동시에 투여할 수 있다.
상기에 개시된 방법에 의해 치료되거나 예방될 수 있는 병원성 진균 감염은 다른 것들에 비해 침습성 폐 아스퍼질러스증을 포함한 아스퍼질러스증; 심하거나 급속한 진행성 감염 및 중추 신경계에서의 블라스토마이세스증을 포함한 블라스토마이세스증; 예를 들어 신장 결석, 요로 폐쇄, 신장 이식 또는 불량하게 조절된 당 뇨병 환자에서 요로의 역행성 칸디다증을 포함한 칸디다증; 다른 화학요법에 잘 반응하지 않는 만성 질환을 포함한 콕시디오이도마이세스증; 크립토코커스증; 히스토폴라스모스증; 예를 들어 머리얼굴 뮤코마이세스증 및 폐 뮤코마이세스증을 포함한 뮤코마이세스증; 파라콕시디오이도마이세스증; 및 스포로트리코스증을 포함한다. 예를 들어 상기 언급한 바와 같이 진균이 하나 이상의 다른 항진균 치료제에 내성이거나 또는 하나 이상의 다른 항진균 치료제의 사용이 금기를 나타내는 경우 항진균 용량의 하나 이상의 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 포함하는 조성물의 투여가 포유동물 대상자에서 병원성 진균 감염을 치료 또는 예방하는데 특히 유용할 수 있음을 유념해야 한다.
적어도 하나 이상의 항진균성 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 함유하는 항진균성 약제학적 조성물이 또한 개시된 방법의 실시에 사용하기 위해 제공된다. 상기 약제학적 조성물을 특히 항진균 용도와 관련된 설명이나 정보를 포함하는 적합한 패키지 삽입물과 함께 포장할 수 있다. 하나 이상의 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 제 2의 항진균제와 함께 함유하는 약제학적 조성물을 또한 제공한다.
진균 감염의 치료 방법
본 명세서에 개시된 몇가지 실시태양들은 병원성 진균 감염, 예를 들어 침습성 폐 아스퍼질러스증을 포함한 아스퍼질러스증; 심하거나 급속한 진행성 감염 및 중추 신경계에서의 블라스토마이세스증을 포함한 블라스토마이세스증; 예를 들어 신장 결석, 요로 폐쇄, 신장 이식 또는 불량하게 조절된 당뇨병 환자에서 요로의 역행성 칸디다증을 포함한 칸디다증; 다른 화학요법에 잘 반응하지 않는 만성 질환을 포함한 콕시디오이도마이세스증; 크립토코커스증; 히스토폴라스모스증; 예를 들어 머리얼굴 뮤코마이세스증 및 폐 뮤코마이세스증을 포함한 뮤코마이세스증; 파라콕시디오이도마이세스증; 및 스포로트리코스증의 치료 또는 예방 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상술한 바와 같은 적어도 하나 이상의 항진균성 하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 진균 감염이 치료 또는 예방되도록 인간 대상자에게 투여하는 것을 포함한다. 몇가지 실시태양에서, 상기 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 하나 이상의 비-데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체 항진균제, 예를 들어 앞서 언급한 것들과 같은 암포테리신 B, 또는 이미다졸 또는 트리아졸제와 함께 투여할 수 있다.
병원성 진균 감염은 예를 들어 다른 미생물들 중에서도 칸디다, 트리코파이톤, 미크로스포룸 또는 에피데리노파이톤 종에 의해 야기된 국소적인 것이거나, 또는 예를 들어 칸디다 알비칸스(예를 들어 질염 및 질 칸디다증)에 의해 야기된 점막성인 것일 수 있다. 상기 감염은 예를 들어 칸디다 알비칸스, 크립토코커스 네오포르만스, 아스퍼질러스 푸미가투스, 콕시디오데스, 파라콕시시오데스, 히스토플라스마 또는 블라스토마이세스 스페시즈에 의해 야기된 전신적인 것일 수 있다. 상기 감염은 또한 진균종, 크로모블라스토마이세스증, 크립토코커스 뇌막염 또는 파이코마이세스증을 포함할 수 있다.
추가의 실시태양은 칸디다 스페시즈, 예를 들어 씨 알비칸스, 씨 트로피칼리 스, 씨 케파이르, 씨 크루세이 및 씨 갈브라타; 아스퍼질러스 스페시즈, 예를 들어 에이 푸미가투스 및 에이 플라부스; 크립토코커스 네오포르만스; 블라스토마이세스 스페시즈, 예를 들어 블라스토마이세스 더마티티디스; 뉴모사이스티스 카리니; 콕시디오이데스 이미티스; 바시디오볼루스 라나룸; 코니디오볼루스 스페시즈; 히스토플라스마 캅술라툼; 리조푸스 스페시즈, 예를 들어 알 오리자에 및 알 미크로스포루스; 커닝하멜라 스페시즈; 리조니우코르 스페시즈; 파라콕시디오이데스 브라실리엔시스; 슈달레케리아 보이디; 리노스포리디움 시베리; 및 스포로트릭스 첸키로 이루어진 군에서 선택된 병원성 진균 감염을 치료 또는 예방하기 위한 방법에 관한 것이다. 다시, 상기 방법은 비-면역 억제성 항진균성 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 상기의 투여가 필요한 환자에게 상기 진균 감염이 부적합한 면역 억제 효과를 유도하지 않으면서 치료되거나 예방되도록 투여하는 것을 포함할 수 있다.
추가의 실시태양은 다른 항진균 요법에 내성인 병원성 진균 감염, 예를 들어 본 명세서의 다른 부분에서 언급한 하나 이상의 항진균제, 예를 들어 암포테리신 B, 플루사이토신, 이미다졸 또는 트리아졸 중 하나(예를 들어 플루코나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸 및 앞서 언급한 다른 예들을 포함)에 내성인 병원성 진균 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 환자에게 하나 이상의 항진균성 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 상기 대상자에서 또 다른 항진균 요법에 내성인 진균 감염이 치료되거나 예방되도록 하는 용량 및 투여 섭생으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
추가의 실시태양은 또 다른 항진균 요법에 대해 알러지성이거나, 달리 내성이거나 또는 비 반응성인 경우, 또는 다른 항진균제[본 명세서의 다른 부분에서 언급한 하나 이상의 항진균제, 예를 들어 암포테리신 B, 플루사이토신, 이미다졸 또는 트리아졸 중 하나(예를 들어 플루코나졸, 케토코나졸, 이트라코나졸 및 앞서 언급한 다른 예들을 포함한다)를 포함한다]의 사용이 달리 금기를 나타내는 환자에서, 병원성 진균 감염을 치료 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 상기와 같은 환자에게 하나 이상의 항진균성 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 진균 감염이 치료되거나 예방되도록 하는 용량으로 투여하는 것을 포함할 수 있다.
패키징된 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체
몇가지 실시태양은 패키징된 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체, 바람직하게는 패키징된 비 면역 억제성 항진균성 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체에 관한 것으로, 상기 용어는 상술한 바와 같이 적어도 하나 이상의 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를, 인간 대상자 내에서 부적합한 면역 억제 효과를 일으키지 않으면서 상기 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체(들)를 항진균제로서 투여하기 위한 설명서와 함께 패키징하여 포함하는 것을 의미한다. 일부 실시태양에서, 상기 비 면역 억제성 항진균성 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체는 상술한 화합물들의 바람직한 서브셋들 중 하나의 일원이다. 상기 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 단독으로 설명서와 함께 패키징하거나, 또 는 또 다른 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체, 라파마이신 또는 또 다른 성분 또는 첨가제, 예를 들어 약제학적 조성물의 성분들 중 하나 이상과 함께 패키징할 수 있다. 상기 패키지는 상기 약제학적 조성물의 성분들 중 하나 이상으로 충전된 하나 이상의 용기를 함유할 수 있다. 선택적으로 상기와 같은 용기(들)와 관련하여, 약제학적 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 당국에 의해 규정된 형태의 고시가 있을 수 있으며, 상기 고시는 상기 당국에 의한 인간 투여용 제조, 사용 또는 판매의 승인을 반영한다.
하기의 비제한적인 실시예는 몇가지 바람직한 실시태양들을 사용하여 바람직한 방법을 개시하고자 한다. 사용된 특정 방법의 세부 사항 및 수득된 정확한 화학 조성물에서의 변화는 당업자들에 의해 확실히 이해될 것이다.
실시예 1
A. 데하이드로페닐아히스틴의 합성
데하이드로페닐아히스틴을 도 1에 나타낸 바와 같이, 하기의 기본적인 반응식에 따라 축합에 의해 합성하였다.
Figure 112006063575231-PCT00009
N,N'-디아세틸-2,5-피페라진디온
아세트산 무수물(Ac2O) 100 ㎖ 중의 포괄적인 2,5-피페라진디온 1[2,5-피페라진디온(Aldrich G640-6), 25.0 g, 0.218 몰] 25.0 g을 아세트산 나트륨(NaOAc)(17.96 g, 0.0218 몰)과 혼합한다. 상기 혼합물을 Ar 환경 하에서 이중 코일로 된 응축기를 사용하여 110 ℃에서 8시간 동안 가열한다. Ac2O를 증발에 의해 제거한 후에, 잔사를 AcOEt에 용해시키고, 10% 시트르산, 10% NaHCO3 및 포화된 NaCl(각각 3 회)로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고 진공하에서 농축시켰다. 잔사를 에테르로 연마하여 고체를 형성시킨다. 상기 고체를 에테르-헥산과 함께 EtOAc로부터 재결정시켜 26.4 g(61%)의 N,N'-디아세틸-2,5-피페라진디온 1을 수득한다.
1-아세틸-3-{(Z)-1-[5-(1,1-디메틸-2-프로페닐)-1H-4-이미다졸릴]메틸리덴}]-2,5-피페라진디온 2
DMF(2 ㎖) 중의 5-(1,1-디메틸-2-프로페닐)이미다졸-4-카르복스알데히드(100 ㎎, 0.609 mmol) 용액에 화합물 1(241 ㎎, 1.22 mmol)을 가하고 상기 용액을 단 시간 내에 반복해서 배기시켜 산소를 제거하고 Ar로 플러싱시킨 다음 Cs2CO3(198 ㎎, 0.609 mmol)을 가하고 상기 배기-플러싱 공정을 다시 반복한다. 생성 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반한다. 용매를 증발에 의해 제거한 후에, 잔사를 EtOAc와 10% Na2CO3의 혼합물에 용해시키고 유기 상을 10% Na2CO3 로 다시 및 포화된 NaCl로 3 회 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시킨다. 잔류 오일을 용출제로서 CHCl3-MeOH(100:0 내지 50:1)를 사용하여 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피로 정제시켜 60 ㎎(33%)의 담황색 고체 2를 수득한다.
데하이드로페닐아히스틴
DMF(0.8 ㎖) 중의 2(30 ㎎, 0.099 mmol) 용액에 벤즈알데히드(51 ㎕, 0.496 mmol, 5 당량)를 가하고 상기 용액을 단시간 내에 반복해서 배기시켜 산소를 제거하고 Ar로 플러싱시킨 다음 Cs2CO3(53 ㎎, 0.149 mmol, 1.5 당량)을 가하고 상기 배기-플러싱 공정을 다시 반복한다. 생성 혼합물을 80 ℃에서 2.5 시간 동안 가열한다(온도를 서서히 증가시켜야 한다. 신속한 가열은 벤질리덴 잔기에서 E-이성체의 생성을 증가시킨다). 용매를 증발에 의해 제거한 후에, 잔사를 EtOAc에 용해시키고 물로 2 회 및 포화된 NaCl로 3 회 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시켰다. CHCl3-MeOH(10:1)를 사용하여 TLC 상에서, 365 ㎚ UV에서 밝은 녹-황색 발광을 갖는 반점을 관찰할 수 있다. 상기 조 생성물의 순도는 HPLC 분석으로부터 75% 이상이다. 생성 잔사를 90% 수성 MeOH에 용해시키고 역상 HPLC 컬럼 (YMC-Pack, ODS-AM, 20 x 250 ㎜)에 적용시키고 16 분에 걸쳐 12 ㎖/분의 유속으로 수 중 70% 내지 74% MeOH의 선형 구배를 사용하여 용출시키고, 목적하는 분획을 수 거하고 증발에 의해 농축시켜 황색 데하이드로페닐아히스틴 19.7 ㎎(60%)을 수득한다. 상기 합성 조 데하이드로페닐아히스틴의 HPLC 프로파일을 도 2에 나타낸다.
데하이드로페닐아히스틴의 정제에서, 도 4에 나타낸 바와 같이, 주요 피크는 데하이드로페닐아히스틴의 목적하는 Z-형 화합물이다. E-이성체의 형성이 소량 성분(약 10%)으로서 관찰되고, 이는 Z-이성체보다 더 극성 피크로서 용출된다. 다른 작은 피크들로서, 데하이드로페닐아히스틴의 디메틸알릴 부분이 환원된 Z- 및 E-화합물이 또한 관찰된다. 이러한 환원된 화합물의 형성은 불순물이 감소된 알데히드 2에 기인하며, 이는 DIBAL-H에 의한 환원 도중 생성되고 후속 공정에서 분리되지 않는다.
상기 소량 화합물들을 예비 HPLC 정제에 의해 제거할 수 있으며, 벤질리덴 부분에서 Z-배위를 갖는 데하이드로페닐아히스틴을 95% 이상의 순도로 60% 수율(2 단계에서 20% 수율)로 수득한다. 디케토피페라진 고리의 이미다졸 부위에서 E-배위를 갖는 화합물은 상기 HPLC 차트에서 관찰되지 않으며, 도 1의 화합물 1 내지 3으로부터의 첫 번째 반응이 Z-선택성임을 암시한다.
B. 화학적 특성:
상기 데하이드로페닐아히스틴 화합물은 담황색 고체이다. 그의 구조를 표준 NMR 분석에 의해 확인한다.
실시예 2
tBu-데하이드로페닐아히스틴 유도체의 합성 및 물리적 특성
데하이드로페닐아히스틴의 구조 유도체를 하기 반응식에 따라 합성하여 tBu-데하이드로페닐아히스틴을 수득한다. 경로 A(도 1 참조)에 의한 합성은 몇가지 관점에서 실시예 1에서와 같이 합성된 데하이드로페닐아히스틴의 합성과 유사하다.
Figure 112006063575231-PCT00010
경로 A:
N,N'-디아세틸-2,5-피페라지딘디온 1을 실시예 1에서와 같이 제조하였다.
1) 1-아세틸-3- {(Z)-1-[5-3 급-부틸-1H-4-이미다졸릴]메틸리덴}]-2,5-피페라진디온(16)
Figure 112006063575231-PCT00011
DMF(30 ㎖) 중의 5-3 급-부틸이미다졸-4-카르복스알데히드 15(3.02 g, 19.8 mmol) 용액에 화합물 1(5.89 g, 29.72 mmol)을 가하고 상기 용액을 단 시간 내에 반복해서 배기시켜 산소를 제거하고 Ar로 플러싱시킨 다음 Cs2CO3(9.7 g, 29.72 mmol)을 가하고 상기 배기-플러싱 공정을 다시 반복한다. 생성 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반한다. 용매를 증발에 의해 제거한 후에, 잔사를 EtOAc와 10% Na2CO3의 혼합물에 용해시키고 유기 상을 10% Na2CO3로 다시 및 포화된 NaCl로 3 회 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시킨다. 잔류 오일을 용출제로서 CHCl3-MeOH(100:0 내지 50:1)를 사용하여 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 1.90 g(33%)의 담황색 고체 16을 수득한다. 1H NMR(270 MHz, CDCl3) δ 12.14 (d, br-s, 1H), 9.22(br-s, 1H), 7.57(s, 1H), 7.18(s, 1H), 4.47(s, 2H), 2.65(s, 3H), 1.47(s, 9H).
2) t-Bu-데하이드로페닐아히스틴
Figure 112006063575231-PCT00012
DMF(1.0 ㎖) 중의 1-아세틸-3- {(Z)-1-[5-3 급-부틸-1H-4-이미다졸릴]메틸리덴}]-2,5-피페라진디온(16)(11 ㎎, 0.038 mmol) 용액에 벤즈알데히드(19 μL, 0.19 mmol, 5 당량)를 가하고 상기 용액을 단 시간 내에 반복해서 배기시켜 산소를 제거하고 Ar로 플러싱시킨 다음 Cs2CO3(43 ㎎, 0.132 mmol, 3.5 당량)을 가하고 상기 배 기-플러싱 공정을 다시 반복한다. 생성 혼합물을 80 ℃에서 2.5 시간 동안 가열한다. 용매를 증발에 의해 제거한 후에, 잔사를 EtOAc에 용해시키고 물로 2 회 및 포화된 NaCl로 3 회 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시킨다. 생성 잔사를 90% 수성 MeOH에 용해시키고 역상 HPLC 컬럼(YMC-Pack, ODS-AM, 20 x 250 ㎜)에 적용시키고 16분에 걸쳐 12 ㎖/분의 유속으로 수 중 70% 내지 74% MeOH의 선형 구배를 사용하여 용출시키고, 목적하는 분획을 수거하고 증발에 의해 농축시켜 황색 3급-부틸-데하이드로페닐아히스틴 6.4 ㎎(50%)을 수득한다. 1H NMR(270 MHz, CDCl3) δ 12.34 br-s, 1H), 9.18 br-s, 1H), 8.09(s, 1H), 7.59(s, 1H), 7.31-7.49(m, 5H), 7.01s, 2H), 1.46(s, 9H).
tBu-데하이드로페닐아히스틴을 제조하기 위한 데하이드로페닐아히스틴 반응은 실시예 1과 동일하다.
회수된 tBu-데하이드로페닐아히스틴의 전체 수율은 16.5%이다.
경로 B
N,N'-디아세틸-2,5-피페라지딘디온 1을 실시예 1에서와 같이 제조한다.
1) 1-아세틸-3-[(Z)-벤질리덴1]-2,5-피페라진디온(17)
Figure 112006063575231-PCT00013
DMF(5 ㎖) 중의 벤즈알데히드 4(0.54 g, 5.05 mmol) 용액에 화합물 1(2.0 g, 10.1 mmol)을 가하고 상기 용액을 단시간 내에 반복해서 배기시켜 산소를 제거하고 Ar로 플러싱시킨 다음 Cs2CO3(1.65 g, 5.05 mmol)을 가하고 상기 배기-플러싱 공정을 다시 반복한다. 생성 혼합물을 실온에서 3.5 시간 동안 교반한다. 용매를 증발에 의해 제거한 후에, 잔사를 EtOAc와 10% Na2CO3의 혼합물에 용해시키고 유기 상을 10% Na2CO3로 다시 및 포화된 NaCl로 3 회 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시킨다. 잔류 고체를 MeOH-에테르로부터 재결정시켜 회색 고체 17을 수득한다; 수율 1.95 g(79%).
2) t-Bu-데하이드로페닐아히스틴
Figure 112006063575231-PCT00014
DMF(1.0 ㎖) 중의 1-아세틸-3-[(Z)-벤질리덴1]-2,5-피페라진디온(17)(48 ㎎, 0.197 mmol) 용액에 5-3 급-부틸이미다졸-4-카르복스알데히드 15(30 ㎎, 0.197 mmol)를 가하고 상기 용액을 단 시간 내에 반복해서 배기시켜 산소를 제거하고 Ar로 플러싱시킨 다음 Cs2CO3(96 ㎎, 0.296 mmol)을 가하고 상기 배기-플러싱 공정을 다시 반복한다. 생성 혼합물을 80 ℃에서 14 시간 동안 가열한다. 용매를 증발에 의해 제거한 후에, 잔사를 EtOAc에 용해시키고 물로 2 회 및 포화된 NaCl로 3 회 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시킨다. 생성 잔사를 90% 수 성 MeOH에 용해시키고 역상 HPLC 컬럼(YMC-Pack, ODS-AM, 20 x 250 ㎜)에 적용시키고 16 분에 걸쳐 12 ㎖/분의 유속으로 수 중 70% 내지 74% MeOH의 선형 구배를 사용하여 용출시키고, 목적하는 분획을 수거하고 증발에 의해 농축시켜 황색 3 급-부틸-데하이드로페닐아히스틴 0.8 ㎎(1.2%)을 수득한다.
회수된 tBu-데하이드로페닐아히스틴의 전체 수율은 0.9%이다.
경로 A 및 경로 B로부터의 조 합성 tBu-데하이드로페닐아히스틴의 HPLC 프로파일을 도 4에 나타낸다.
2 개의 다른 tBu-데하이드로페닐아히스틴 유도체를 경로 A의 방법에 따라 합성한다. 추가의 tBu-데하이드로페닐아히스틴 유도체의 합성에서, 벤즈알데히드 화합물 4에 대한 변경을 수행한다.
도 4는 실시예 1의 합성된 데하이드로페닐아히스틴(도 2)과 경로 A에 의해 생성된 상기 예시된 tBu-데하이드로페닐아히스틴 화합물로부터의 HPLC 프로파일(컬럼: YMC-Pack ODS-AM(20 x 250 ㎜); 구배: 메탄올-물 시스템 중에서 20 분간 65% 내지 75%, 이어서 100% 메탄올 시스템에서 10 분간; 유속: 12 ㎖/분; O.D. 230 ㎚)의 유사성을 예시한다.
상기 알데히드의 도입 순서는 수율과 관련되며, 따라서 합성의 태양이다. 데하이드로페닐아히스틴의 동족체를 대조군 또는 모델로서 합성하고, 여기서 디메틸알릴기를 이미다졸 고리의 5번 위치에서 유사한 입체 장애를 갖는 3 급-부틸기로 변화시킨다.
"경로 A"를 사용한 상기 "3 급-부틸(tBu)-데하이드로페닐아히스틴"의 합성은 상기 나타낸 바와 같다: 특히, 알데히드의 도입 순서는 정확하게 데하이드로페닐아히스틴 합성에 따르며, 16.5%의 tBu-데하이드로페닐아히스틴 총 수율을 나타낸다. 상기 수율은 데하이드로페닐아히스틴의 것(20%)과 유사하다. "경로 B"를 사용하는 경우, 이 때 알데히드의 도입 순서는 하이드로페닐아히스틴 합성에 대한 경로 "A"의 것과 상반되고, 비록 첫 번째 벤즈알데히드 4의 도입에서 76%의 중간체 화합물 17의 수율이 제공되지만, 단지 미량의 목적하는 tBu-데하이드로PLH만이 총 수율 0.9%로 수득된다. 이러한 결과는 이미다졸 고리의 인접한 5번 위치 상에 4 급 탄소를 갖는 치환기가 있는 매우 부피가 큰 이미다졸-4-카르복스알데히드 15를 중간체 화합물 17에 도입시키는 것이 어려울 수 있음을 나타내며, 이는 알데히드의 도입 순서가 본 명세서에 개시된 합성을 사용하여 고 수율의 데하이드로페닐아히스틴 또는 데하이드로페닐아히스틴의 동족체를 수득하는데 중요한 태양인 것을 시사한다.
최종적인 조 생성물의 HPLC 분석으로부터, 도 4에 나타낸 바와 같이, 매우 높은 함량의 tBu-데하이드로페닐아히스틴 및 소량의 부산물 형성이 경로 A(좌측)의 조 샘플에서 관찰된다. 그러나, 상대적으로 보다 적은 양의 목적하는 tBu-데하이드로페닐아히스틴 및 몇가지 다른 부산물들이 경로 B(우측)를 사용하여 수득된 샘플에서 관찰된다.
실시예 3
선택적으로 보다 큰 규모의 데하이드로페닐아히스틴 및 동족체의 합성
3-Z- 벤질리덴 -6-[5"-(1,1- 디메틸알릴 )-1H- 이미다졸 -4"-Z- 일메틸렌 ]-피페라진 -2,5-디온[데하이드로페닐아히스틴](1)의 합성
Figure 112006063575231-PCT00015
시약:
a) LDA, CH3CHO; b) Tos-Cl, 피리딘; c) DBU; d) NaOH; e) C2Cl2O 2 ; f) KOOCCH2COOEt, BuLi; g) SO2Cl2; h) H2NCHO, H2O; i) LiAlH4; j) MnO2; k) 1,4-디아세틸-피페라진-2,5-디온, Cs2CO3; l) 벤즈알데히드, Cs2CO3
3-하이드록시-2,2-디메틸-부티르산 메틸 에스테르
Figure 112006063575231-PCT00016
헵탄/THF/에틸벤젠(2 M, 196 ㎖, 0.39 몰) 중의 LDA 용액을 아르곤 하에 -60 ℃에서 THF(270 ㎖) 중의 메틸 이소부티레이트(45 ㎖, 0.39 몰) 용액에 첨가하고 생성 혼합물을 30 분간 교반한다. -60 ℃로 예냉시킨, THF(45 ㎖) 중의 아세트알데히드(27 ㎖, 0.48 몰) 용액을 서서히 첨가하고 생성 용액을 추가로 30 분간 교반한다. 포화된 염화 암모늄(50 ㎖)을 첨가하고 상기 용액을 실온으로 가온시킨다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 추출하고, 추출물을 HCl(2 M), 중탄산 나트륨, 이어서 염수로 세척한다. 유기 층을 황산 마그네슘 상에서 건조시키고, 여과하고, 이어서 증발시켜 투명한 오일(52.6 g)을 수득하였다. 증류(76-82 ℃/30 ㎜Hg)에 의해 순수한 3-하이드록시-2,2-디메틸-부티르산 메틸 에스테르(42.3 g, 74%)를 수득한다(Burk et al., J. Am. Chem. Soc., 117:4423-4424(1995)).
1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 1.15(d, J = 6.2 Hz, 3H); 1.17(s, 6H); 2.66(d, J = 6.2 Hz, 1H, -OH); 3.71(s, 3H, -OMe); 3.87(app 오중선, J = 6.4 Hz, 1H, H3).
2,2-디메틸-3-(톨루엔-4-설포닐옥시)-부티르산 메틸 에스테르
Figure 112006063575231-PCT00017
피리딘(100 ㎖) 중의 3-하이드록시-2,2-디메틸-부티르산 메틸 에스테르(52.0 g, 0.36 몰)의 냉각된(0 ℃) 용액에 p-톨루엔 설포닐 클로라이드(69.0 g, 0.36 몰)를 점차적으로 첨가한다. 상기 혼합물을 실온으로 가온시키고 60 시간 동안 교반한다. 반응물을 다시 얼음 중에서 냉각시키고 HCl(2 M)의 첨가에 의해 산성화시킨다. 생성 용액을 에틸 아세테이트로 추출하고, 추출물을 HCl, 이어서 염수로 세척하고, 건조시키고 증발시켜 정치 시 백색 침전물을 형성하는 오일을 수득한다. 상기 혼합물을 최소량의 에틸 아세테이트에 용해시키고 이어서 경유를 가하여 수거되고 보다 많은 경유로 세척된 백색 침전물을 수득한다. 여액을 부분적으로 증발시키고 두 번째 결정 수확물을 수거하고 상기 첫 번째 것에 첨가하여 2,2-디메틸-3-(톨루엔-4-설포닐옥시)-부티르산 메틸 에스테르(81.2 g, 76%)를 수득한다.
1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 1.12(s, 3H); 1.13(s, 3H); 1.24(d, J = 6.4 Hz, 3H); 2.45(s, 3H, -PhMe) 3.58(s, 3H, -OMe); 4.94(4 중선, J = 6.4 Hz, 1H, H3), 7.33(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.78(d, J = 8.0 Hz, 2H).
최종 여액을 증발시켜 추가적인 조 2,2-디메틸-3-(톨루엔-4-설포닐옥시)-부티르산 메틸 에스테르(19.0 g, 18%)를 수득한다.
2,2-디메틸-부트-3-에노산 메틸 에스테르
Figure 112006063575231-PCT00018
DBU(15 ㎖) 중의 2,2-디메틸-3-(톨루엔-4-설포닐옥시)-부티르산 메틸 에스테르(18.06 g, 0.06 몰) 용액을 140 내지 160 ℃에서 3.5 시간 동안 가열한다. 상기 혼합물을 실온으로 냉각시키고 이어서 에테르로 희석한다. 상기 혼합물을 HCl(1 M), 중탄산 나트륨, 이어서 염수로 세정한다. 에테르 층을 건조시키고 부분적으로 증발시켜 2,2-디메틸-부트-3-에노산 메틸 에스테르(10 g)의 농축 용액을 수득한다(Savu and Katzenellenbogen, J. Org. Chem. 46:239-250(1981)). 추가의 증발은 생성물의 휘발성(bp 102 ℃)으로 인해 피하여 진다(Tsaconas et al., Aust. J. Chem., 53:435-437(2000)).
1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 1.31(s, 6H); 3.68(s, 3H); 5.06(d, J = 17.1 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.11(d, J = 10.7 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.03(dd, J = 17.1, 10.7 Hz, 1H, -CH=CH2).
2,2-디메틸-부트-3-에노산
Figure 112006063575231-PCT00019
상기 2,2-디메틸-부트-3-에노산 메틸 에스테르(10 g)의 에테르 용액을 에탄올(25 ㎖)로 희석하고, 수산화 나트륨(4 M, 22 ㎖)을 첨가하고 상기 혼합물을 밤새 교반한다. 상기 용액을 부분적으로 증발시켜 에탄올을 제거하고 생성된 혼합물을 HCl(1 M, 100 ㎖)에 첨가한다. 생성물을 에틸 아세테이트로 추출하고 추출물을 건조시키고 증발시켜 2,2-디메틸-부트-3-에노산(6.01 g, 88% 2 단계)을 수득한다. (Hayashi et al., J. Org. Chem. 65:8402-8405(2000)).
1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 1.33(s, 6H); 5.11(d, J = 10.8 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.15(d, J = 17.2 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.05(dd, J = 17.2, 10.8 Hz, 1H, -CH=CH2).
모노에틸 수소 말로네이트(Wierenga and Skulnick, "Aliphatic and Aromatic β-keto Esters from Monoethyl Malonate: Ethyl 2-Butyrylacetate(모노에틸 말로네이트로부터 지방족 및 방향족 β-케토 에스테르: 에틸 2-부티릴아세테이트)," Organic Syntheses Collective Volume 7, 213).
Figure 112006063575231-PCT00020
에틸 칼륨 말로네이트(25.0 g, 0.15 몰)를 물(15.6 ㎖)에 현탁시키고 빙 욕에서 냉각시킨다. 농축된 HCl(12.5 ㎖)을 30 분에 걸쳐 적가하고, 이어서 상기 혼합물을 추가로 10 분간 교반시킨다. 침전물을 여과하고, 이어서 에테르로 2 회 세척한다. 여액을 분리시키고 수성 상을 에테르로 추출한다. 합한 에테르 용액을 건조(MgSO4)시키고 증발시켜 오일로서 모노에틸 수소 말로네이트(19.2 g, 99%)를 수득하고, 이를 진공 하에서 밤새(또는 1 시간 동안 50 ℃/1 ㎜) 건조시킨 후에 사용한다.
4,4-디메틸-3-옥소-헥스-5-에노산 에틸 에스테르
Figure 112006063575231-PCT00021
옥살릴 클로라이드(3.83 ㎖, 43.9 mmol)를 무수 디클로로메탄(25 ㎖) 중의 2,2-디메틸-부트-3-에노산(5.0 g, 43.9 mmol) 및 DMF(1 적)의 냉각된(0 ℃) 용액에 적가한다. 상기 혼합물을 0 ℃에서 1 시간 동안 교반하고, 이어서 실온에서 16 시간 동안 교반한다. 분별 증류(121 ℃/760 ㎜Hg)시켜 2,2-디메틸-부트-3-에노일 클로라이드(4.1 g, 71%)를 수득한다.
모노에틸 수소 말로네이트(7.2 g, 0.05 몰) 및 비피리딜(수 ㎎)을 THF(90 ㎖)에 용해시키고 상기 시스템을 질소로 플러싱시킨다. 상기 용액을 -70 ℃로 냉각시키고, 이어서 BuLi(헥산 중의 2.5 M, 37 ㎖, 0.09 몰)를 첨가한다. 단지 ∼10 ㎖ 의 BuLi를 가한 후에, 상기 용액은 분홍색으로 변하고 자기 교반을 위해서 추가의 THF(15 ㎖)가 필요하다. 냉각 욕을 제거하고 나머지 BuLi를 첨가하고, 온도가 -10 ℃에 도달하게 하고, 이때 상기 용액은 무색으로 변한다. 상기 혼합물을 다시 -60 ℃로 냉각시키고 THF(12 ㎖) 중의 2,2-디메틸-부트-3-에노일 클로라이드(4.1 g, 0.03 몰) 용액을 적가한다. 첨가를 완료한 후에, 상기 혼합물을 0 ℃로 가온시키고 3 시간 동안 교반하고, 이어서 0 ℃에서 에테르/1 M HCl의 1:1 혼합물(260 ㎖)에 첨가하고 추가로 1.5 시간 동안 교반한다. 유기 층을 제거하고, HCl(1 M), 중탄산 나트륨 용액, 염수로 세척하고, 이어서 건조시키고 증발시켜 4,4-디메틸-3-옥소-헥스-5-에노산 에틸 에스테르(5.6 g, 98%)를 수득한다
(Hayashi et al., J. Org. Chem., 65:8402-8405(2000)). 쿠겔로어(Kugelrohr) 오븐으로 증류시켜(160 ℃/1 ㎜Hg) 물질을 수득한다.
1H NMR(400 MHz, CDCl3) δ 1.26(s, 6H); 1.27(t, J = 6.9 Hz, 3H, -CH2CH3); 3.51(s, 2H); 4.18(q, J = 6.9 Hz, 2H, -CH2CH3); 5.20(d, J = 17.7 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.21(d, J = 9.6 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.89(dd, J = 17.7, 9.6 Hz, 1H, -CH=CH2).
2-클로로-4,4-디메틸-3-옥소-헥스-5-에노산 에틸 에스테르
Figure 112006063575231-PCT00022
염화 설푸릴(0.84 ㎖, 10.4 mmol)를 클로로포름(7 ㎖) 중의 4,4-디메틸-3-옥소-헥스-5-에노산 에틸 에스테르(1.83 g, 9.93 mmol)의 냉각된(0 ℃) 용액에 첨가한다. 생성 혼합물을 실온으로 가온시키고 30 분간 교반하고, 그 후에 상기를 2 시간 동안 가열 환류시킨다. 실온으로 냉각시킨 후에 반응 혼합물을 클로로포름으로 희석하고, 이어서 중탄산 나트륨, 물, 이어서 염수로 세척한다. 유기 상을 건조시키고 증발시켜 갈색 오일로서 2-클로로-4,4-디메틸-3-옥소-헥스-5-에노산 에틸 에스테르(2.01 g, 93%)를 수득한다(Hayashi et al., J. Org. Chem., 65:8402-8405(2000)).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.28(t, J = 7.0 Hz, 3H, -CH2CH3); 1.33(s, 3H); 1.34(s, 3H); 4.24(q, J = 7.0 Hz, 2H, -CH2CH3); 5.19(s, 1H; 5.28 (d, J=16.9 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.29 (d, J=10.9 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.96 (dd, J=16.9, 10.9 Hz, 1H, -CH=CH2).
LC/MS tR=8.45 (219.3 [M(Cl37)+H]+)min
상기 물질을 추가의 정제 없이 반응시킨다.
5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-카르복실산 에틸 에스테르
Figure 112006063575231-PCT00023
포름아미드(36.8 ㎖) 중의 2-클로로-4,4-디메틸-3-옥소-헥스-5-에노산 에틸 에스테르(19.4 g, 0.09 몰) 및 물(1.94 ㎖, 0.11 몰)의 현탁액을 간단히 진탕시키고, 이어서 15 x 18 ㎖ 바이알들에 분배한다. 상기 바이알들을 밀봉시키고 150 ℃로 5 시간 동안 가열한다. 실온으로 냉각시킨 후에, 상기 바이알의 내용물들을 합하고 클로로포름으로 철저히 추출하였다. 상기 추출물을 건조시키고 증발시켜 농축된 포름아미드 용액(14.7 g)을 수득한다. 상기를 클로로포름 중의 1% MeOH/1% Et3N으로 충전된 실리카 컬럼(7 ㎝ 직경, 11 ㎝ 높이)에 첨가한다. 상기 컬럼을 상기 혼합물 2 ℓ로 용출시킨 다음 클로로포름 중의 2% MeOH/1% Et3N 2 ℓ로 용출시켜 초기 분획 중에 5-(1,1-디메틸-알릴)-옥사졸-4-카르복실산 에틸 에스테르(1.23 g, 7%)로 의심이 가는 화합물을 수득한다.
HPLC(214nm) tR=8.68 (50.4%)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.40(t, J = 7.2 Hz, 3H, -CH2CH3); 1.54(s, 6H); 4.38(t, J = 7.2 Hz, 2H, -CH2CH3); 5.03(d, J=17.4 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.02 (d, J=10.4 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.26 (dd, J=17.4, 10.4 Hz, 1H, -CH=CH2); 7.83(s, 1H).
LCMS tR=8.00 (210.1 [M+H]+, 361.1[2M+H]+)min.
나중의 분획으로부터 목적하는 5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-카르복실산 에틸 에스테르(3.13 g, 17%)를 회수한다(Hayashi et al., J. Org. Chem., 65:8402-8405(2000)).
HPLC(214nm) tR=5.52 (96.0%)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.38(t, J = 7.0 Hz, 3H); 1.57(s, 6H); 4.35(q, J = 7.0 Hz, 2H); 5.04-5.14(m, 2H, -CH=CH2); 6.28 (dd, J=18.0 10.4 Hz, 1H, -CH=CH2); 7.52 (s, 1H).
LC/MS tR=5.30 (209.1 [M+H]+, 417.2[2M+H]+)min.
추가의 5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-카르복실산 에틸 에스테르를 또한 상기 컬럼으로부터 회수하고(3.59 g, 19%), 이는 보다 낮은 순도를 가지지만 추가의 반응에 여전히 충분하다.
클로로포름 중의 5% MeOH/1% Et3N을 사용하여 상기 컬럼으로부터 추가로 용출시킴으로써 유사한 반응(보다 작은 규모)으로부터 단리된 또 다른 부산물은 5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-카르복실산(0.27 g, 9%)인 것으로 의심이 가는 화합물이다.
HPLC(245nm) tR=5.14 (68.9%)min.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.45(s, 6H); 4.97(d, J = 10.6 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.01 (d, J=17.7 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.28 (dd, J=17.7, 10.6 Hz, 1H, -CH=CH2); 7.68(s, 1H).
LCMS tR = 4.72 (181.0 [M+H]+, 361.1[2M+H]+)min.
[5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-일]-메탄올
Figure 112006063575231-PCT00024
THF(60 ㎖) 중의 5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-카르복실산 에틸 에스테르(3.13 g, 15.0 mmol) 용액을 THF(40 ㎖) 중의 리튬 알루미늄 하이드라이드(95% 현탁액, 1.00 g, 25.0 mmol)의 현탁액에 적가하고 상기 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반한다. 물을 기체 발생이 중단될 때까지 첨가하고, 상기 혼합물을 10 분간 교반하고, 이어서 소결된 깔때기를 통해 여과시킨다. 침전물을 THF로 세척하고, 이어서 메탄올로 세척하고, 여액 및 세척물을 합하고, 증발시키고, 이어서 동결 건조시켜 [5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-일]-메탄올(2.56 g, 102%)을 수득한다. 추가의 반응 전에 잔류 수를 클로로포름과 공비 증류에 의해 제거한다(Hayashi et al., J. Org. Chem., 65:8402-8405(2000) 참조).
HPLC(240nm) tR = 3.94 (56.8%)min.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.43(s, 6H); 4.57(s, 2H); 5.01(d, J = 10.5 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.03 (d, J=17.7 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.10 (dd, J=17.7, 10.5 Hz, 1H, -CH=CH2); 7.46(s, 1H).
LC/MS tR = 3.77 (167.3 [M+H]+)min.
5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-카르브알데히드
Figure 112006063575231-PCT00025
이산화 망간(20 g, 0.23 몰)을 아세톤(300 ㎖) 중의 [5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-일]-메탄올(2.56 g, 0.02 몰) 용액에 첨가하고 생성 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 여과지를 통해 여과시키고 잔사를 아세톤으로 세정한다. 여액 및 세정물을 합하고 증발시켜 5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-카르브알데히드 (1.82 g, 51%)를 수득한다(Hayashi et al., J. Org. Chem., 65:8402-8405(2000)).
HPLC(240nm) tR = 4.08 (91.5%)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.56(s, 6H); 5.16(d, J = 10.6 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.19(d, J=17.3 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.22 (dd, J=17.3, 10.6 Hz, 1H, -CH=CH2); 7.75(s, 1H), 10.02(s, 1H, HCO).
LC/MS tR = 3.75 (165.2 [M+H]+)min.
1-아세틸-3-[5'-(1,1-디메틸-알릴)-1H-이미다졸-4'-Z-일메틸렌]-피페라진-2,5-디온
Figure 112006063575231-PCT00026
DMF(35 ㎖) 중의 5-(1,1-디메틸-알릴)-3H-이미다졸-4-카르브알데히드(1.78 g, 0.01 몰)의 용액에 1,4-디아세틸-피페라진-2,5-디온(8.59 g, 0.04 몰)을 첨가하고 혼합물을 배기시키고, 이어서 아르곤으로 플러싱시킨다. 상기 배기-플러싱 공정을 추가로 2 회 반복하고, 이어서 탄산 세슘(3.53 g, 0.01 몰)을 첨가한다. 상기 배기-플러싱 공정을 추가로 3 회 반복하고, 이어서 생성 혼합물을 45 ℃에서 5 시간 동안 가열한다. 반응 혼합물을 작은 부피가 남을 때까지 부분적으로 증발시키고(고 진공 하에서 가열) 생성 용액을 빙-수(50 ㎖)에 적가한다. 황색 침전물을 수거하고, 물로 세척하고, 이어서 동결건조시켜 1-아세틸-3-[5'-(1,1-디메틸-알릴)-1H-이미다졸-4'-일메틸렌]-피페라진-2,5-디온(1.18 g, 36%)을 수득한다(Hayashi, Personal Communication(2001)).
HPLC(214nm) tR = 6.01 (72.6%)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.53(s, 6H); 2.64(s, 3H); 4.47(s, 2H); 5.19(d, J = 17.3 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.23(d, J=10.7 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.06 (dd, J=17.3, 10.7 Hz, 1H, -CH=CH2); 7.16(s, 1H), 7.59(s, 1H), 9.47(bs, 1H); 12.11(bs, 1H)
[관찰된 ~2% 1,4-디아세틸-피페라진-2,5-디온 오염 δ 2.59 (s, 6H); 4.60 (s, 4H).]
LC/MS tR = 6.65 (303.3 [M+H]+, 605.5[2M+H]+)min. (다른 시스템이 사용되는 것에 주의).
3-Z-벤질리덴-6-[5"-(1,1-디메틸알릴)-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌]-피페라진-2,5-디온
Figure 112006063575231-PCT00027
DMF(70 ㎖) 중의 1-아세틸-3-[5'-(1,1-디메틸-알릴)-1H-이미다졸-4'-일메틸렌]-피페라진-2,5-디온(2.91 g, 9.62 mmol)의 용액에 벤즈알데히드(4.89 ㎖, 48.1 mmol)를 첨가하고 상기 용액을 배기시키고, 이어서 아르곤으로 플러싱시킨다. 상기 배기-플러싱 공정을 추가로 2 회 반복하고, 이어서 탄산 세슘(4.70 g, 14.4 mmol)을 첨가한다. 상기 배기-플러싱 공정을 추가로 3 회 반복하고, 이어서 생성 혼합물을 하기 나타낸 바와 같은 온도 구배 하에서 가열한다.
총 5 시간 후에, 반응물을 실온으로 냉각시키고 혼합물을 빙-냉수(500 ㎖)에 첨가한다. 침전물을 수거하고, 물(300 ㎖)로 세척하고, 이어서 동결 건조시켜 황색 고체(2.80 g)를 수득한다. 상기 물질을 클로로포름(250 ㎖)에 용해시키고, 여과지를 통해 여과하고 증발시켜 나머지 물을 공비 증류시킨다. 잔류 황색 침전물(2.70 g, HPLC(214 ㎚) tR = 7.26(93.6%)min)을 클로로포름(20 ㎖)에 부분적으로 용해시키고, 상기 현탁액을 5 분간 초음파 처리하고, 이어서 고체를 수거하고 공기 건조시켜 3-Z-벤질리덴-6-[5"-(1,1-디메틸알릴)-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌]-피페라진-2,5-디온(1.82 g, 54%)을 수득한다(Hayashi, Personal Communication(2001)). m.p. 239-240℃(분해).
HPLC(214nm) tR = 6.80 (1.92)min, 7.33(95.01%).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.53(s, 6H); 5.18(d, J = 17.6 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.21(d, J=11.0 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.06 (dd, J=17.6, 11.0 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.99(s, 1H, -C-C=CH); 7.00(s, 1H, -C-C=CH), 7.30-7.50(m, 5 x ArH); 7.60(s, H2"); 8.07(bs, NH); 9.31(bs, NH); 12.30(bs, NH).
LC/MS tR = 6.22 (349.3 [M+H]+, E 이성질체), 6.73 (349.5 [M+H]+, 697.4 [2M+H]+, Z 이성질체)min.
ESMS m/z 349.5 [M+H]+, 390.3 [M+CH4CN]+
상기 클로로포름 용액을 증발시켜 추가의 3-Z-벤질리덴-6-[5"-(1,1-디메틸알릴)-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌]-피페라진-2,5-디온(0.76 g, 29%)을 수득한다.
HPLC(214 ㎚) tR = 7.29(84.5%) min.
3-E-벤질리덴-6-[5"-(1,1-디메틸알릴)-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌]-피페라진-2,5-디온
Figure 112006063575231-PCT00028
상기와 같이 합성된 물질의 조 샘플을 예비 HPLC 정제시켜 기하 이성체 3-E-벤질리덴-6-[5"-(1,1-디메틸알릴)-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌]-피페라진-2,5-디온(1.7 ㎎)을 수득한다.
HPLC(214nm) tR = 6.75 (87.79)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.52(s, 6H); 5.19(d, J = 20.8 Hz, 1H, -CH=CH2); 5.22(d, J=14.0 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.05 (dd, J=18.0, 10.4 Hz, 1H, -CH=CH2); 6.33(s, 1H, -C-C=CH); 6.90-7.65(m, 7H).
ESMS m/z 349.5 [M+H]+, 390.4 [M+CH4CN]+
3-Z-벤질리덴-6-(5"-3 급-부틸-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌)피페라진-2,5-디온(2)의 합성
Figure 112006063575231-PCT00029
시약:
g) SO2Cl2; h) H2NCHO, H2O; i) LiAH4; j) MnO2; k) 1,4-디아세틸-피페라진- 2,5-디온, Cs2CO3; l) 벤즈알데히드, Cs2CO3
2-클로로-4,4-디메틸-3-옥소-펜타노산 에틸 에스테르
Figure 112006063575231-PCT00030
염화 설푸릴(14.0 ㎖, 0.17 몰)을 클로로포름(100 ㎖) 중의 에틸 피발로일아세테이트(27.17 g, 0.16 몰)의 냉각된(0 ℃) 용액에 첨가한다. 생성 혼합물을 실온으로 가온시키고 30 분간 혼합하고, 그 후에 상기를 2.5 시간 동안 가열 환류시킨다. 실온으로 냉각시킨 후에, 반응 혼합물을 클로로포름으로 희석하고, 이어서 중탄산 나트륨, 물, 이어서 염수로 세정한다.
유기 상을 건조시키고 증발시켜 투명한 오일로서 2-클로로-4,4-디메틸-3-옥소-펜타노산 에틸 에스테르(33.1 g, 102%)를 수득한다(Durant et al., "Aminoalkylimidazoles and Process for their Production(아미노알킬이미다졸 및 그의 제조 방법)." 특허 제 GB1341375(Great Britain, 1973)).
HPLC(214nm) tR = 8.80 (92.9%)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.27(s, 9H); 1.29(t, J = 7.2 Hz, 3H); 4.27(q, J=7.2 Hz, 2H); 5.22 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 13.8, 26.3, 45.1, 54.5, 62.9, 165.1, 203.6.
5-3 급-부틸-3H-이미다졸-4-카르복실산 에틸 에스테르
Figure 112006063575231-PCT00031
포름아미드(47.5 ㎖) 및 물(2.5 ㎖) 중의 2-클로로-4,4-디메틸-3-옥소-펜타노산 에틸 에스테르(25.0 g, 0.12 몰) 용액을 진탕시키고, 이어서 15 x 8 ㎖ 바이알들에 분배시킨다. 상기 바이알들을 밀봉시키고 이어서 150 ℃에서 3.5 시간 동안 가열한다. 상기 바이알들을 실온으로 냉각시키고, 이어서 물(20 ㎖)을 가하고 혼합물을 클로로포름으로 철저히 추출한다. 클로로포름을 제거하여 농축된 포름아미드 용액(22.2 g)을 수득하고 이를 클로로포름 중의 1% MeOH/1% Et3N으로 충전된 플래시 실리카 컬럼(6 ㎝ 직경, 12 ㎝ 높이)에 첨가한다. 상기 컬럼을 상기 혼합물 2.5 ℓ로 용출시킨 다음 클로로포름 중의 2% MeOH/1% Et3N 1 ℓ로 용출시켜 초기 분획 중에 5-3 급-부틸-옥사졸-4-카르복실산 에틸 에스테르(6.3 g, 26%)로 의심이 가는 생성물을 수득한다.
HPLC(214nm) tR = 8.77min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.41(t, J = 7.2 Hz, 3H); 1.43(s, 9H); 4.40 (q, J=7.2 Hz, 2H); 7.81 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 14.1, 28.8, 32.5, 61.3, 136.9, 149.9, 156.4, 158.3.
ESMS m/z 198.3 [M+H]+, 239.3 [M+CH4CN]+
LC/MS tR = 7.97 (198.1 [M+H]+)min.
나중의 분획으로부터 5-3 급-부틸-3H-이미다졸-4-카르복실산 에틸 에스테르(6.20 g, 26%)를 회수한다(Durant et al., "Aminoalkylimidazoles and Process for their production(아미노알킬이미다졸 및 그의 제조 방법)." 특허 제 GB1341375(Great Britain, 1973)).
HPLC(214nm) tR = 5.41(93.7%)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.38(t, J = 7.0 Hz, 3H); 1.47(s, 9H); 4.36 (q, J=7.2 Hz, 2H); 7.54 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3) δ 13.7, 28.8, 32.0, 59.8, 124.2, 133.3, 149.2, 162.6.
ESMS m/z 197.3 [M+H]+, 239.3 [M+CH4CN]+
1 ℓ의 5% MeOH/1% Et3N을 사용하여 상기 컬럼을 추가로 용출시켜 5-3급-부 틸-3H-이미다졸-4-카르복실산(0.50 g, 2%)인 것으로 의심이 가는 화합물을 수득한다.
HPLC(245nm) tR = 4.68(83.1%)min.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.36 (s, 9H); 7.69 (s, 1H).
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.37 (s, 9H); 7.74 (s, 1H).
1H NMR (400 MHz, CD3SO) δ 1.28 (s, 9H); 7.68 (s, 1H).
ESMS m/z 169.2 [M+H]+, 210.4 [M+CH4CN]+
(5-3 급-부틸-3H-이미다졸-4-일)-메탄올
Figure 112006063575231-PCT00032
THF(60 ㎖) 중의 5-3급-부틸-3-이미다졸-4-카르복실산 에틸 에스테르(3.30 g, 16.8 mmol) 용액을 THF(40 ㎖) 중의 리튬 알루미늄 하이드라이드(95% 현탁액, 0.89 g, 22.2 mmol)의 현탁액에 적가하고 상기 혼합물을 실온에서 3 시간 동안 교반한다. 물을 기체 발생이 중단될 때까지 첨가하고, 상기 혼합물을 10 분간 교반하고, 이어서 소결된 깔때기를 통해 여과시킨다. 침전물을 THF로 세척하고, 이어서 메탄올로 세척하고, 여액 및 세척물을 합하고, 증발시킨다. 잔사를 밤새 동결 건조 시켜 백색 고체로서 (5-3 급-부틸-3H-이미다졸-4-일)-메탄올(2.71 g, 105%)을 수득한다(Durant et al., "Aminoalkylimidazoles and Process for their Production(아미노알킬이미다졸 및 그의 제조 방법)." 특허 제 GB1341375(Great Britain, 1973)).
HPLC(240nm) tR = 3.70(67.4%)min.
1H NMR (400 MHz, CD3OD) δ 1.36(s, 9H); 4.62 (s, 2H), 7.43 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CD3OD) δ 31.1, 33.0, 57.9, 131.4, 133.9, 140.8.
LC/MS tR = 3.41(155.2 [M+H]+)min.
상기 물질을 추가의 정제 없이 사용한다.
5-3 급-부틸-3H-이미다졸-4-카르브알데히드
Figure 112006063575231-PCT00033
이산화 망간(30 g, 0.35 몰)을 아세톤(700 ㎖) 중의 (5-3급-부틸-3H-이미다졸-4-일)-메탄올(4.97 g, 0.03 몰)의 이종 용액에 첨가하고 생성 혼합물을 실온에서 4 시간 동안 교반한다. 상기 혼합물을 셀라이트(Celite) 패드를 통해 여과시키고 상기 패드를 아세톤으로 세척하였다. 여액 및 세척물을 합하고 증발시켰다. 상 기 잔사를 에테르로 연마하여 무색 고체로서 5-3 급-부틸-3H-이미다졸-4-카르브알데히드(2.50 g, 51%)를 수득한다(Hayashi, Personal Communication(2000)).
HPLC(240nm) tR = 3.71(89.3%)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.48(s, 9H); 7.67 (s, 1H), 10.06 (s, 1H).
LC/MS tR = 3.38(153.2 [M+H]+)min.
상기 연마로부터의 여액을 증발시켜 추가의 5-3 급-부틸-3H-이미다졸-4-카르브알데히드(1.88 g, 38%)를 수득한다.
1-아세틸-3-(5'-3 급-부틸-1H-이미다졸-4'-Z-일메틸렌)-피페라진-2,5-디온
Figure 112006063575231-PCT00034
DMF(50 ㎖) 중의 5-3 급-부틸-3H-이미다졸-4-카르브알데히드(2.50 g, 164.4 mmol)의 용액에 1,4-디아세틸-피페라진-2,5-디온(6.50 g, 32.8 mmol)을 첨가하고 상기 용액을 배기시키고, 이어서 아르곤으로 플러싱시킨다. 상기 배기-플러싱 공정을 추가로 2 회 반복하고, 이어서 탄산 세슘(5.35 g, 16.4 mmol)을 첨가한다. 상기 배기-플러싱 공정을 추가로 3 회 반복하고, 이어서 생성 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반한다. 반응 혼합물을 작은 부피가 남을 때까지 부분적으로 증발시키고(고 진공 하에서 가열) 생성 용액을 물(100 ㎖)에 적가한다. 황색 침전물을 수거하고, 이어서 동결 건조시켜 1-아세틸-3-(5'-3급-부틸-1H-이미다졸-4'-Z-일메틸렌)-피페라진-2,5-디온(2.24 g, 47%)을 수득한다(Hayashi, Personal Communication(2000)).
HPLC(214nm) tR = 5.54(94.4%)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.47(s, 9H); 2.65 (s, 3H), 4.47 (s, 2H); 7.19 (s, 1H); 7.57 (s, 1H), 9.26 (s, 1H), 12.14 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCl3+CD3OD) δ 27.3, 30.8, 32.1, 46.5, 110.0, 123.2, 131.4, 133.2, 141.7, 160.7, 162.8, 173.0.
LC/MS tR = 5.16(291.2 [M+H]+, 581.6 [2M+H]+min.
3-Z-벤질리덴-6-(5"-3 급-부틸-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌)-피페라진-2,5-디온
Figure 112006063575231-PCT00035
DMF(55 ㎖) 중의 1-아세틸-3-(5'-3급-부틸-1H-이미다졸-4'-Z-일메틸렌)-피페라진-2,5-디온(2.43 g, 8.37 mmol)의 용액에 벤즈알데히드(4.26 ㎖, 41.9 mmol)를 가하고 상기 용액을 배기시키고, 이어서 질소로 플러싱시킨다. 상기 배기-플러싱 공정을 추가로 2 회 반복하고, 이어서 탄산 세슘(4.09 g, 12.6 mmol)을 첨가한다. 상기 배기-플러싱 공정을 추가로 3 회 반복하고, 이어서 생성 혼합물을 하기에 나타낸 바와 같은 온도 구배 하에서 가열한다. 총 5 시간 후에, 반응물을 실온으로 냉각시키고 혼합물을 빙-냉수(400 ㎖)에 첨가한다. 침전물을 수거하고, 물로 세척하고, 이어서 동결 건조시켜 황색 고체(2.57 g, HPLC(214 ㎚) tR = 6.83(83.1%) min)를 수득한다. 상기 물질을 클로로포름(100 ㎖)에 용해시키고, 증발시켜 나머지 물을 공비 증류시키고, 그 결과 갈색 오일이 생성된다. 이를 클로로포름(20 ㎖)에 용해시키고 얼음 중에서 냉각시킨다. 90 분 후에 황색 침전물을 수거하고 공기 건조시켜 3-Z-벤질리덴-6-(5"-3급-부틸-1H-이미다졸-4"-Z-일메틸렌)-피페라진-2,5-디온(1.59 g, 56%)을 수득한다(Hayashi, Personal Communication(2000)).
HPLC(214nm) tR = 6.38(2.1%), 6.80 (95.2)min.
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.46(s, 9H); 7.01 (s, 1H, -C-C=CH); 7.03 (s, 1H, -C-C=CH); 7.30-7.50 (m, 5H, Ar); 7.60 (s, 1H); 8.09 (bs, NH); 9.51 (bs, NH), 12.40 (bs, NH).
LC/MS tR = 5.84(337.4 [M+H]+, E 이성체), 6.25 (337.4 [M+H]+, 673.4 [2M+H]+, Z 이성체)min.
ESMS m/z 337.3 [M+H]+, 378.1 [M+CH4CN]+
상기 클로로포름 용액을 증발시켜 추가의 3-Z-벤질리덴-6-(5"-3급-부틸-1H- 이미다졸-4"-Z-일메틸렌)-피페라진-2,5-디온(0.82 g, 29%)을 수득한다.
HPLC(214 ㎚) tR = 6.82(70.6%) min.
일반적인 실험
중탄산 나트륨은 5% 용액을 지칭한다.
유기 용매를 달리 언급하지 않는 한 황산 나트륨 상에서 건조시킨다.
분석 조건
NMR 조건
1H NMR(400 MHz) 분석을 배리안 이노바 유니티(Varian Inova Unity) 400 MHz NMR 기계 상에서 수행한다. 샘플을 0.1% TMS(달리 특정되지 않으면)를 함유하는 중수소화된 클로로포름 중에서 실행시킨다. 화학적 이동(ppm)은 샘플 실행 CD3OD에 대해 3.30 ppm에서 TMS(0.00 ppm) 또는 CH3OH에 비교하여 참조한다. 커플링 상수를 헤르츠(Hz)로 나타낸다.
분석 HPLC 조건
시스템 6 조건:
RP-HPLC를 레이닌 마이크로소브(Rainin Microsorb)-MV C18(5 ㎛, 100 Å) 50 x 4.6 ㎜ 컬럼 상에서 수행한다.
완충제 A: 0.1% 수성 TFA
완충제 B: 90% 수성 MeCN 중의 0.1% TFA
구배: 11 분에 걸쳐 0 내지 100%의 완충제 B
유속: 1.5 ㎖/분
LCMS 조건
LCMS를 퍼킨-엘머(Perkin-Elmer) Sciex API-100 장치 상에서 실행시킨다.
LC 조건:
역상 HPLC 분석
컬럼: 모니터 5 ㎛ C18 50 x 4.6 ㎜
용매 A: 수 중의 0.1% TFA
용매 B: 90% 수성 MeCN 중의 0.085% TFA
구배: 11.0 분에 걸쳐 0 내지 100% B
유속: 1.5 ㎖/분
파장: 214 ㎚
MS 조건:
이온 공급원: 이온스프레이
검출: 이온 카운팅
질량 분광계로의 유속: 컬럼으로부터 분리 후에 300 ㎕/분(1.5 ㎖/분).
ESMS 조건
ESMS를 전자스프레이 유입구를 사용하여 퍼킨 엘머/Sciex-API III LC/MS/MS 상에서 수행한다.
용매: 60% 수성 MeCN 중의 0.1% AcOH
유속: 25 ㎕/분
이온스프레이: 5000 V
오리피스 플레이트: 55 V
획득 시간: 2.30 min
스캔 범위: 100 - 1000 amu/z
스캔 단계 사이즈: 0.2 amu/z
예비 RP-HPLC 정제 조건
역상 HPLC 정제를 하기 조건을 사용하여 워터스(Waters) XterraMS 컬럼(19 x 50 ㎜, 5 ㎛, C18)을 갖는 네뷸라(Nebula)를 사용하여 수행한다:
용매 A: 0.1% 수성 TFA
용매 B: 90% 수성 MeCN 중의 0.1% TFA
구배: 4 분에 걸쳐 5 내지 95%
유속: 20 ㎖/분
파장: 214 ㎚
약어는 하기와 같다: br s; 넓은 단일선; BuLi: n-부틸 리튬; d: 이중선; DBU: 1,8-디아자비사이클로[5.4.0]운데크-7-엔; ESMS: 전자스프레이 질량 분광측정; HCl: 염산; HPLC: 고 성능 액체 크로마토그래피; LCMS: 액체 크로마토그래피 질량 분광측정; LD: 리튬 디이소프로필아미드; M+: 분자 이온; m: 다중선; MeCN: 아세토니트릴; M: 질량 분광측정; MW: 분자량; NMR: 핵 자기 공명; q: 사중선; s: 단일선; 삼중선; tR: 체류 시간; TFA: 트리플루오로아세트산; THF: 테트라하이드로푸란
데하이드로페닐아히스틴의 상세한 합성 과정
Figure 112006063575231-PCT00036
1-아세틸-3-{(Z)-1-[5-(1,1-디메틸-2-프로페닐)-1H-4-이미다졸릴]메틸리덴}]-2,5-피페라진디온(2)
Figure 112006063575231-PCT00037
DMF(2 ㎖) 중의 5-(1,1-디메틸-2-프로페닐)이미다졸-4-카르복스알데히드(100 ㎎, 0.609 mmol) 용액에 화합물 1(241 ㎎, 1.22 mmol)을 첨가하고 상기 용액을 단 시간 내에 반복적으로 배기시켜 산소를 제거하고 Ar로 플러싱시킨 다음, Cs2CO3(198 ㎎, 0.609 mmol)를 첨가하고 배기 플러싱 공정을 다시 반복한다. 산소의 제거는 디케토피페라진 고리의 6 번 위치에서 알파-탄소의 산화를 감소시키는 것으로 여겨지기 때문에 상기와 같은 제거는 바람직하다. 생성 혼합물을 실온에서 5 시간 동안 교반한다. 용매를 증발에 의해 제거한 후에, 잔사를 EtOAc와 10% Na2CO3의 혼합물에 용해시키고 유기 상을 10% Na2CO3으로 다시 및 포화된 NaCl로 3 회 세척하고, Na2CO3 상에서 건조시키고 진공 하에서 농축시킨다. 잔류 오일을 용출제로서 CHCl3-MeOH(100:0 내지 50:1)를 사용하여 실리카 상에서 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제시켜 60 ㎎(33%)의 담황색 고체 2를 수득한다.
데하이드로페닐아히스틴
DMF(0.8 ㎖) 중의 2(30 ㎎, 0.099 mmol) 용액에 벤즈알데히드(51 ㎕, 0.496 mmol, 5 당량)를 첨가하고 상기 용액을 단시간 내에 반복해서 배기시켜 산소를 제거하고 Ar로 플러싱시킨 다음 Cs2CO3(53 ㎎, 0.149 mmol, 1.5 당량)을 가하고 상기 배기-플러싱 공정을 다시 반복하였다. 생성 혼합물을 80 ℃에서 2.5 시간 동안 가열한다(온도를 서서히 증가시켜야 한다. 신속한 가열은 벤질리덴 잔기에서 E-이성체의 생성을 증가시킨다). 용매를 증발에 의해 제거한 후에, 잔사를 EtOAc에 용해시키고 물로 2 회 및 포화된 NaCl로 3 회 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 진공 하에서 농축시킨다. CHCl3-MeOH(10:1)를 사용하여 TLC 상에서, 365 ㎚ UV에서 밝은 녹-황색 발광을 갖는 반점을 관찰할 수 있다. 상기 조 생성물의 순도는 HPLC 분석으로부터 75% 이상이다. 생성 잔사를 90% 수성 MeOH에 용해시키고 역상 HPLC 컬럼(YMC-Pack, ODS-AM, 20 x 250 ㎜)에 적용시키고 16 분에 걸쳐 12 ㎖/분의 유속으로 수 중 70% 내지 74% MeOH의 선형 구배를 사용하여 용출시키고, 목적하는 분획을 수거하고 증발에 의해 농축시켜, 비록 수율이 각 단계에 대해 최적은 아니지만, 황색 데하이드로페닐아히스틴 19.7 ㎎(60%)을 수득한다.
실시예 4
데하이드로페닐아히스틴 및 데하이드로페닐아히스틴 동족체의 생물학적 특성
A. 생물학적 평가
합성된 tBu-데하이드로페닐아히스틴 및 데하이드로페닐아히스틴의 생물학적 특성을 HT29 인간 결장 세포 및 PC-3 전립선 선암종 세포 모두에서 평가한다.
인간 결장직장 선암종인 HT-29(ATCC HTB-38)를 맥코이(McCoy)의 완전 배지(L-글루타민이 있는 맥코이의 5A 배지 및 10% FBS, 1 mM Na 피루베이트, 1X NEAA, 2 mM L-글루타민, 및 각각 100 IU/㎖ 및 100 μg/㎖의 Pen/Strep이 보충된 25 mM HEPES)에서 유지시킨다. 인간 전립선 선압종인 PC-3(ATCC CRL-1435)을 F12K 완전 배지(10% FBS; 2 mM 글루타민; 1% HEPES; 및 각각 100 IU/㎖ 및 100 μg/㎖의 Pen/Strep이 보충된 F12K 배지)에서 유지시킨다. 세포 라인을 95% 가습 배양기 중에서 37 ℃, 5% CO2에서 배양한다.
종양 세포독성 분석을 위해서, HT-29 또는 PC-3 세포를 90 ㎕ 완전 배지 중의 5,000 세포/웰에서 코닝(Corning) 3904 어두운 벽으로 된, 깨끗한 바닥의 조직 배양 플레이트로 시딩하고 상기 플레이트를 밤새 배양시켜 세포를 확립시키고 로그 증식기를 시작시킨다. 데하이드로페닐아히스틴 및 tBu-데하이드로페닐아히스틴의 20 mM 저장액을 100% DMSO 중에서 제조하고 -20 ℃에서 보관한다. 상기 두 화합물의 10 배 농축된 일련의 희석물들을 적합한 배양 배지에서 20 x 10-5 M 내지 20 x 10-10 M 범위의 최종 농도로 제조한다. 상기 10 배의 일련의 희석물의 10 ㎕분량을 상기 시험 웰에 3 회 중복하여 가하고 상기 플레이트를 48 시간 동안 상기 배양기에 다시 넣는다. DMSO의 최종 농도는 모든 샘플에서 0.25%이다.
48 시간의 약물 노출에 이어서 Mg2+, Ca2+ 비 함유 PBS 중의 0.2 ㎎/㎖ 레사주린(시그마-알드리치 케미칼 컴퍼니 (Sigma-Aldrich Chemical Co.)로부터 수득) 10 ㎕를 각 웰에 첨가하고 상기 플레이트를 3 내지 4 시간 동안 배양기에 다시 넣었다. 상기 플레이트를 회수하여 레사주린 형광을 융합(Fusion) 형광계(패카드 인스트루먼츠(Packard Instruments))에서 530 ㎚ 여기 및 590 ㎚ 방출 필터를 사용하여 측정한다. 세포가 없는 레사주린 염료를 사용하여 배경을 측정하고, 이를 모든 실험 웰에 대한 데이터에서 제한다. 상기 데이터를 프리즘(Prism) 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어(GraphPad Software))를 사용하여 분석한다. 상기 데이터를 배지만으로(100% 세포 생장) 처리한 세포의 평균에 대해 표준화하고 EC50 값을 표준 S 자 용량 반응 곡선 정합 알고리즘을 사용하여 측정한다.
하기 표 1에 나타낸 바와 같이, tBu-데하이드로페닐아히스틴은 데하이드로페닐아히스틴에 비해 약 4 배 더 큰 세포독성 활성을 나타낸다.
표 1. 데하이드로페닐아히스틴과 유도체의 세포독성 효과
Figure 112006063575231-PCT00038
HT-29, PC-3 및 P-388 세포의 추가적인 데이터를 위해 도면 41을 참조.
B. 데하이드로페닐아히스틴 유도체의 구조 및 활성 연구
페닐아히스틴, 데하이드로페닐아히스틴, 및 데하이드로페닐아히스틴의 다양한 유도체들의 세포독성 효과를 P388 쥐 백혈병 세포, HT-29 인간 결장 세포 및 PC-3 전립선 선암종 세포에서 검사한다.
상기 설명한 바와 같이, 인간 결장직장 선암종인 HT-29를 맥코이의 완전 배지(L-글루타민이 있는 맥코이의 5A 배지 및 10% FBS, 1 mM Na 피루베이트, 1X NEAA, 2 mM L-글루타민, 및 각각 100 IU/㎖ 및 100 μg/㎖의 Pen/Strep이 보충된 25 mM HEPES)에서 유지시킨다. 인간 전립선 선암종인 PC-3을 F12K 완전 배지(10% FBS; 2 mM 글루타민; 1% HEPES; 및 각각 100 IU/㎖ 및 100 μg/㎖의 Pen/Strep이 보충된 F12K 배지)에서 유지시킨다. 세포 라인을 95% 가습 배양기 중에서 37 ℃, 5% CO2에서 배양한다.
종양 세포독성 분석을 위해서, HT-29 또는 PC-3 세포를 90 ㎕ 완전 배지 중의 5,000 세포/웰에서 코닝 3904 어두운 벽으로 된, 깨끗한 바닥의 조직 배양 플레이트로 시딩하고 상기 플레이트를 밤새 배양시켜 세포를 확립시키고 로그 증식기를 시작시킨다. 데하이드로페닐아히스틴 및 tBu-데하이드로페닐아히스틴의 20 mM 저장액을 100% DMSO 중에서 제조하고 - 20 ℃에서 보관한다. 상기 두 화합물의 10 배 농축된 일련의 희석물들을 적합한 배양 배지에서 2.0 x 10-5 M 내지 2.0 x 10-10 M 범위의 최종 농도로 제조한다. 상기 10 배의 일련의 희석물의 10 ㎕분량을 상기 시험 웰에 3 회 중복하여 첨가하고 상기 플레이트를 48 시간 동안 상기 배양기에 다시 넣는다. DMSO의 최종 농도는 모든 샘플에서 0.25%이다.
48 시간의 약물 노출에 이어서 Mg2+, Ca2+ 비 함유 PBS 중의 0.2 ㎎/㎖ 레사주린(시그마-알드리치 케미칼 컴퍼니로부터 수득) 10 ㎕를 각 웰에 가하고 상기 플레이트를 3 내지 4 시간 동안 배양기에 다시 넣는다. 상기 플레이트를 회수하여 레사주린 형광을 융합 형광계(패카드 인스트루먼츠)에서 530 ㎚ 여기 및 590 ㎚ 방출 필터를 사용하여 측정한다. 세포가 없는 레사주린 염료를 사용하여 배경을 측정하고, 이를 모든 실험 웰에 대한 데이터에서 제한다. 상기 데이터를 프리즘 소프트웨어(그래프패드 소프트웨어)를 사용하여 분석한다. 상기 데이터를 배지만으로(100% 세포 생장) 처리한 세포의 평균에 대해 표준화하고 EC50 값을 표준 S 자 용량 반응 곡선 정합 알고리즘을 사용하여 측정한다.
페닐아히스틴, 데하이드로페닐아히스틴 및 데하이드로페닐아히스틴 유도체의 EC50 및 IC50 값을 하기 표 2에 요약한다.
표 2. 페닐아히스틴 또는 데하이드로페닐아히스틴 및 데하이드로페닐아히스 틴 유도체의 SAR 연구
Figure 112006063575231-PCT00039
페닐 고리에 대한 변경은 세포독성 활성의 현저한 효과를 가진다. tBu-데하이드로페닐아히스틴(#6)의 활성에 비해, 메타-위치에서 메톡시기의 활성(KPU-9)은 P388 세포에서 다른 유도체들 보다 20.8±3.3 nM의 IC50을 가지는 가장 큰 활성을 나타낸다. 상기 KPU-9 유도체는 또한 HT-29 세포에서 세포독성을 나타낸다(EC50 31 nM). 데하이드로페닐아히스틴, tBU-데하이드로페닐아히스틴(KPU-2) 및 KPU-9 유도체는 모두 P388 세포에서 세포독성을 나타낸다.
C. 추가의 데하이드로페닐아히스틴 유도체의 구조 및 활성 연구
페닐아히스틴, 데하이드로페닐아히스틴 및 데하이드로페닐아히스틴의 다양한 추가적인 유도체들의 세포독성 연구를 상술한 방법을 사용하여 HT-29 인간 결장 세포 및 PC-3 전립선 선암종 세포에서 검사한다.
표 3. 페닐아히스틴 , 데하이드로페닐아히스틴 및 추가적인 데하이드로페닐아히스틴 유도체의 SAR 연구
Figure 112006063575231-PCT00040
Figure 112006063575231-PCT00041
Figure 112006063575231-PCT00042
Figure 112006063575231-PCT00043
Figure 112006063575231-PCT00044
세포 생존력의 표지로서 레사주린 형광을 사용하여, 상기 실시예에서 상기에 기재된 바와 같이 추가적인 세포독성 분석을 수행한다. 결과를 하기 표 3.1에 나타낸다.
표 3.1. 페닐아히스틴 , 데하이드로페닐아히스틴 및 추가적인 데하이드로페닐아히스틴 유도체의 연구
Figure 112006063575231-PCT00045
Figure 112006063575231-PCT00046
Figure 112006063575231-PCT00047
Figure 112006063575231-PCT00048
Figure 112006063575231-PCT00049
Figure 112006063575231-PCT00050
Figure 112006063575231-PCT00051
Figure 112006063575231-PCT00052
Figure 112006063575231-PCT00053
실시예 5
다른 데하이드로페닐아히스틴 동족체
A. 데하이드로페닐아히스틴 유도체의 합성을 위한 변경
데하이드로페닐아히스틴의 다른 유도체들을 상기 기법을 단독으로 사용하거나 또는 다른 널리 공지된 유기 합성 기법과 함께 사용하여 합성한다.
상기 합성 방법에 관여하는 디아실디케토피페라진 및 첫 번째 및 두 번째 알데히드에 대한 변경은 제조할 목적하는 유도체에 따라 다양하다.
하기 유도체를 합성한다:
A) 페닐 고리를 변경시키고/시키거나 다른 방향족 고리 시스템을 도입,
B) 상기 방향족 고리의 위치를 변경,
C) 상기 이미다졸 방향족 고리 시스템을 변경, 및/또는
D) 상기 이미다졸 고리 상의 5-번 위치를 변경.
하기 도면은 데하이드로페닐아히스틴의 유도체들을 제조하기 위해서 변경시킨 데하이드로페닐아히스틴 화합물의 부분들을 나타낸다. 비 제한적인 변경 예들을 개시하며, 이들 예는 이러한 내용을 근거로 당업자들에게 이해될 것이다.
Figure 112006063575231-PCT00054
A. 1) 공지된 항-튜불린 화합물의 구조를 기초로 하는 페닐 고리의 변경
알킬, 할로겐, 알콕시, 아세틸, 설폰아미드, 아미노, 하이드록실, 니트로 등
Figure 112006063575231-PCT00055
2) 다른 방향족 고리 시스템의 도입
Figure 112006063575231-PCT00056
B. 방향족 고리의 위치
Figure 112006063575231-PCT00057
C. 다른 고리 시스템으로의 변화
Figure 112006063575231-PCT00058
D. 이미다졸 고리 상의 5번 위치의 추가 변경
Figure 112006063575231-PCT00059
상기 데하이드로페닐아히스틴 화합물에 대한 상기 변경을 확장하여, 상기 화합물의 유도체들은 페닐 고리에서 하기의 치환체들을 포함할 수 있다: (A): -CF3, -SO2NH2(-SO2NR1R2), -SO3H, -CONH2(-CONR1R2), -COOH, 등. 다른 고리 시스템 (C)은 또한 하기를 포함할 수 있다:
Figure 112006063575231-PCT00060
B. 합성된 데하이드로페닐아히스틴 유도체들의 예
합성된 데하이드로페닐아히스틴 유도체들에 대한 추가의 예들을 표 4에 개시한다.
표 4. 데하이드로페닐아히스틴의 추가 합성된 유도체들
Figure 112006063575231-PCT00061
Figure 112006063575231-PCT00062
Figure 112006063575231-PCT00063
Figure 112006063575231-PCT00064
Figure 112006063575231-PCT00065
Figure 112006063575231-PCT00066
Figure 112006063575231-PCT00067
Figure 112006063575231-PCT00068
Figure 112006063575231-PCT00069
C. 데하이드로페닐아히스틴 유도체들에 대한 평가
상술한 유도체들에 대한 평가를 실시예 3에 개시된 방법에 따라 평가한다. 상기 유도체들에 대한 추가적인 평가를 특정한 활성들, 예를 들어 세포 증식에 대한 억제 효과, 특정 세포 메카니즘(즉, 미세관 기능)에 대한 효과, 세포 주기 진행에 대한 효과를 측정하는 것으로 연장하여, 암 세포 라인에 대한 시험관 내 항종양 활성 등을 평가한다. 일부 평가 방법 프로토콜을 하기에 나타낸다.
1) 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체의 세포 증식 억제 효과
96-웰 미세적정 플레이트의 각 웰에, 10% 소 태아 혈청을 인간 폐 암으로부터 유도된 A-549 세포에 대해 항종양 효과를 갖는 EMEM 배양 배지(니쑤이 세이야쿠 컴퍼니 (Nissui Seiyaku Co., Ltd.))에 가하여 수득된 배양 배지 중에 105 세포/㎖로 제조된 인간 폐 암으로부터 유도된 A-549 세포 100 ㎕를 넣는다. 상기 목록으로 나타낸 예들에 의해 수득된 유도체의 메탄올 용액을 최상층 열의 웰에 가하고, 견본들을 반-로그 희석법에 의해 희석하여 가하고, 상기 플레이트를 37 ℃에서 48 시간 동안 이산화탄소 기체 배양기에서 배양한다. 결과를 MTT 시약 3-(4,5-디메틸-2-티아졸)-2,5-디페닐-2H-테트라 브로마이드)(1 ㎎/㎖ㅇPBS)을 갖는 다수의 10 ㎕에 가한 다음, 37 ℃에서 6 시간 동안 이산화 탄소 기체 배양기에서 배양한다. 배양 배지를 버리고 상기 세포 중에 생성된 결정을 디메틸설폭사이드 100 ㎕/웰에 용해시킨다. 이어서 595 ㎚ 광의 흡수를 미세 플레이트 판독기로 측정한다. 처리되지 않은 세포의 광 흡수를 공지된 농도의 견본으로 처리된 세포의 것과 비교함으로써, 세포 증식을 50% 억제하는 견본 농도(IC50)를 계산한다.
2) 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체의 세포 주기 억제 활성
세포 균주 A431은 인간 폐암으로부터 유도된다. 10% 소 태아 혈청 및 1% MEM 비필수 아미노산 용액(시그마 M2025)을 함유하는 EMEM 배양 배지를 사용하여 5% 이산화탄소 기체 및 수증기로 포화된 배양기 중에서 37 ℃에서 A431 세포를 배양한다. 상기 방법에 의해 수득된 데하이드로페닐아히스틴의 정제된 견본을 로그 증식 기의 세포에 첨가하고 상기 세포 주기의 진행을 유식 세포계 및 현미경 관찰에 의해 분석한다.
HeLa 세포의 세포 주기 진행에 대한 효과를 도 42에 나타낸다.
실시예 6
합성된 데하이드로페닐아히스틴(데하이드로PLH) 유도체의 구조-활성 관계
1) 유도체 합성에 대한 개요
본 명세서에 개시된 데하이드로PLH 유도체의, 전부는 아니지만, 다수는 페닐 고리에 하나, 둘 또는 세 개의 변경을 포함한다 (하기 도 5). 상기 유도체들을 상술한 방법에 의해 합성한다. 표 5에 나타낸 바와 같이, 몇가지 화합물들은 데하이드로PLH 및 tBu-데하이드로PLH보다 더 효능 있는 세포독성 활성을 나타낸다. 3 nM의 EC50 값을 나타내는 가장 효능 있는 화합물은 KPU-90이다. 이 값은 데하이드로PLH 및 tBu-데하이드로PLH의 값보다 각각 16 배 및 4 배 더 크다. 이들 유도체는 페닐 고리의 o- 또는 m-위치에서 할로겐 원자, 예를 들어 불소 및 염소 원자 또는 메틸, 비닐 또는 메톡시기로 일-치환을 가진다. 나프탈렌, 티오펜 및 푸란 고리와 같은 헤테로아릴 구조에 치환체를 갖는 유도체들이 또한 효능 있는 활성을 나타낸다. KPU-35, 42, 69, 80 및 81은 또한 tBu-데하이드로PLH보다 더 큰 활성을 나타내었다.
표 5. 효능 있는 합성 데하이드로PLH 유도체
Figure 112006063575231-PCT00070
Figure 112006063575231-PCT00071
Figure 112006063575231-PCT00072
2) 페닐 고리에 메톡시기의 도입
콜히친은 β-튜불린 상의 동일한 결합 부위를 PLH로서 인식한다. 콜히친은 그의 A 및 B 고리 상에 4 개의 특징적인 메톡시기를 가진다. 단일 또는 다수 개의 메톡시기를 가진 일련의 치환을 수행하고 세포독성 활성의 결과를 표 6에 나타낸다.
표 6. HT-29 세포의 증식에 대한 메톡시기 치환의 효과
Figure 112006063575231-PCT00073
Figure 112006063575231-PCT00074
결과는 상기 m- 또는 o-위치에서의 치환이 HT-29 세포에 대한 세포독성 활성을 증가시키는 것을 입증한다. KPU-9 및 16은 높은 활성을 나타낸다. 3 중 치환을 갖는 메톡시 유도체(KPU-11, 17 및 45)가 또한 활성을 나타낸다. KPU-24의 구조를 MASS 분석에 의해 정한다.
3) 전자-회수기에 의한 변경
페닐 고리에 대한 보다 확장된 구조-활성 관계를 연구하기 위해서 일련의 상이한 작용기들을 도입시키고, 여기에는 전자-회수기 및 전자-공여기가 모두 포함된다. HT-29 세포에 대한 세포독성의 결과를 각각 표 7 및 8에 나타낸다.
상기 o- 또는 m-위치의 치환은 활성을 효과적으로 증가시킨다. 이러한 결과는 메톡시기의 경우와 잘 일치한다.
표 7. HT-29 세포의 증식에 대한 전자- 회수기의 효과
Figure 112006063575231-PCT00075
Figure 112006063575231-PCT00076
Figure 112006063575231-PCT00077
표 8. HT-29 세포의 증식에 대한 전자- 공여기의 효과
Figure 112006063575231-PCT00078
Figure 112006063575231-PCT00079
Figure 112006063575231-PCT00080
본 개시는 임의의 특정한 과학 이론에 종속되거나 제한되지 않는다. 그럼에도 불구하고, 당업자는 본 명세서에 제공된 결과들을, 입체 장애에 적게 작용하는 비교적 보다 작은 작용기가 보다 효능 있는 활성을 유도하는데 바람직하고 에톡시기(메톡시기에 비해) 또는 Br 원자(Cl 원자에 비해)와 같은 약간 큰 기들은 예를 들어 튜불린 결합 부위와의 상호작용에 불리한 입체 장애 작용을 할 수 있다는 것을 암시하는 것으로 해석할 수 있음을 인식한다. 더욱이, 이들 치환체의 전기적 성질은 상기 활성에 영향을 미치지 않기 때문에, 상기는 상기 비교적 작은 치환체들이 β-튜불린의 결합 부위와 직접 상호 작용하는 것이 아니라 상기 결합에 적합한 데하이드로PLH의 배위를 제한함을 암시한다. 그렇지 않으면, 또 다른 가능한 가설로서, 수소 공여체로서 수소 결합을 형성할 수 있는 친수성 하이드록실기의 도입은 상기 활성을 극적으로 감소시키기 때문에, 상기 소수성 성질은 β-튜불린 상의 o- 또는 m-위치의 결합 부위에서 보다 중요한 인자일 수 있다.
표 9에 나타낸 바와 같이, 상기 o-위치에서 세포독성 활성에 대한 치환체들의 효과를 표 10에 나타낸 바와 같이, m-위치의 경우에서와 같이 정렬시킬 수 있다. tBu-데하이드로PLH보다 더 큰 활성을 나타낸 유효 작용기들을 갖는 화합물들을 또한 추가로 변경시킬 수 있다. 가시광선 조사 하에서 Z에서 E로의 입체 화학의 이동이 관찰되기 때문에, 공액된 이중 결합에서 전자 밀도를 감소시키는 치환체들은 상기 광선에 의한 Z에서 E로의 이동의 감소에 기여하여 보다 물리화학적으로 안정한 구조를 초래한다. 온도가 또한 상기 이동에 영향을 미칠 수 있다.
상기 고리의 두 부분에서의 변경은 효능이 있을 뿐만 아니라 생물학적으로 안정한 화합물을 개발하는데 바람직할 수 있다. 상기 페닐아히스틴의 페닐 고리는 시토크롬 P-450에 의해 산화된다. 따라서 상기 페닐 고리의 전자 밀도를 감소시키는 이중 변경은 P-450의 산화를 피하는데 유효할 수 있다. 따라서, 상기 작은 전자 회수기, 예를 들어 불소 원자와, 상기 활성을 증가시킬 수 있는 원소, 예를 들어 -OMe, -Me, -Cl, -F 및 Br의 결합은 보다 효능 있고 생물학적으로 안정한 약물 화합물을 초래할 수 있다.
표 9. o-위치에서 변경에 대한 요약
Figure 112006063575231-PCT00081
Figure 112006063575231-PCT00082
표 10. m-위치에서 변경에 대한 요약
Figure 112006063575231-PCT00083
Figure 112006063575231-PCT00084
Figure 112006063575231-PCT00085
4) 페닐 고리의 아릴-헤테로사이클로의 치환
페닐 고리를 또한 헤테로아릴기에 의해 치환시킬 수 있다. 세포독성 활성에 관한 상기와 같은 치환의 결과를 표 11에 나타낸다. 아릴 질소 원자는 디케토피페라진 고리의 NH 기와 수소 결합을 형성할 수 있고 피리딘과 디케토피페라진 고리 사이의 분자의 배위를 평면상에 있는 구조로 제한할 수 있기 때문에, 데하이드로PLH의 활성 배위는 디케토피페라진 고리의 아미드 수소 원자와 페닐 고리의 o-수소 원자 사이의 입체 반발에 의해 형성된 특정 수준의 2 면각을 필요로 할 것이다(도 6).
표 11. HT-29 세포의 증식에 대한 헤테로아릴 고리로 치환의 효과
Figure 112006063575231-PCT00086
Figure 112006063575231-PCT00087
Figure 112006063575231-PCT00088
페닐 고리의 보다 작은 푸란 또는 티오펜 고리에 의한 치환, 예를 들어 KPU-29 또는 -42는 활성을 나타낸다. 상기 페닐 고리를 상기 강력한 활성을 유지시키면서 다른 방향족 구조로 변화시킬 수 있다.
5) 페닐아히스틴의 대사
최근의 연구에서, (±)-페닐아히스틴을 래트 간 마이크로솜 또는 인간 간 P450으로 처리한다. 인간의 경우, 적어도 7 개 이상의 대사산물을 검출하고, 이들 중 2 개, 즉 P1 및 P3이 회수된 대사산물의 60% 이상을 차지하는 주요 대사산물이다.
tBu-데하이드로PLH에는 엑소-올레핀 구조가 존재하지 않기 때문에, 본 발명의 합성된 유도체들은 P1 및 P4 같은 산화를 갖지 않는다. 그러나, P3 및 P5와 같은 산화는 간 대사 중에 형성된다. 상기와 같은 대사를 방지하는 다양한 유도체들이 페닐 고리에서 P450 산화를 피하는데 유효하다. 상기 이미다졸 고리를 또한 변경시켜 상기 바람직하지 못한 산화를 피할 수 있다.
6) 데하이드로PLH의 물리화학적 안정성
물리화학적 안정성은 데하이드로PLH의 바람직하지 못한 문제들 중 하나이다. 페닐아히스틴에서, 벤질 부분에 추가의 올레핀 구조가 존재하지 않기 때문에, 상기와 같은 문제는 없다. 그러나, 데하이드로PLH에서는 상기 벤질리덴 잔기가, 추정상 가시 광선에 의해 쉽게 활성화될 수 있으며, 이중 결합의 보다 긴 연결의 존재로 인해 Z에서 E로의 이동이 빈번히 발생한다. 이러한 이동은 심지어 통상적인 실내 광 하에서도 발생한다. 세포독성 분석에서, 비록 이동은 데하이드로PLH의 경우에 추정 상 1:1 비로 평형을 유지하지만, 상기 화합물들 중 일부는 배양 중 E-형으로 이동한다. 이러한 이동은 조절될 수 있다. Z에서 E로의 이동은 또한 동일한 유형의 튜불린 억제제인 콤브레타스타틴 A4에서도 알려져 있으며, 이러한 문제를 개선시키기 위한 몇몇 연구들이 보고되어 있다.
7) 전구약물 합성
E-형을 또한 데하이드로PLH 또는 본 명세서에 개시된 동족체들을 포함한, 그의 동족체들 중 하나 이상의 전구약물로서 사용할 수 있다. 항-튜불린 약물의 바람직하지 못한 성질들 중 하나는, 비록 상기 약물이 분자 표적 요법 중 하나에 속하기는 하지만, 종양과 완전한 조직 사이의 낮은 선택성을 포함한다. 이는 바람직하지 못한 부작용을 일으킨다. 그러나, 상기 화합물이 단지 종양 조직에만 선택적으로 작용하는 경우 항-미세관 약물의 부정적인 부작용들을 감소시킬 수 있다. 데하이드로PLH(Z-형)를 가시 광선 조사에 의해 그의 E-이성체로부터 생성시킬 수 있기 때문에, 상기 E-형을 투여하고 오직 종양 조직에만 광 조사를 수행하면, 상기 종양만이 광-생성된 Z-형에 의해 손상되어 완전한 조직에 대한 부작용이 감소된다.
상기 E-형을 부피가 크지만 생분해성인 아실기의 첨가에 의해 화학적으로 보호할 수 있고, 이는 전구약물로서 디케토피페라진 고리에 도입된다. 상기 아실 군은 체 내에서 프로테아제에 의해 절단될 수 있다. 따라서, 상기 아실화된 E-화합물 을 투여 전에 유지시키고, 이어서 투여 후에 상기 화합물은 진정한 E-형으로 변화되어 국소적인 광 조사에 의해 생물활성인 Z-형태로 이동할 수 있다.
tBu-데하이드로PLH의 이러한 아실-E-형의 합성 반응식을 도 9에 요약한다.
실시예 7
합성된 데하이드로페닐아히스틴의 약제학적 제형
1) 점적 주입, 주사, 주입 등에 의해 정맥 내로 투여되는 제형
5 g의 분말 글루코스를 함유하는 바이알들에 각각 상기 방법에 의해 합성된 화합물 10 ㎎을 무균적으로 첨가하고 밀봉시킨다. 질소, 헬륨 또는 다른 불활성 기체를 충전시킨 후에, 상기 바이알들을 냉각된 암실에서 보관한다. 사용 전에, 상기 내용물을 에탄올에 용해시키고 0.85% 생리 식염수 100 ㎖에 가한다. 생성 용액을 당업자에 의해 적합한 것으로 간주되는 바와 같이, 정맥 내로, 점적 주입에 의해, 또는 피하 또는 복강 내 주사를 통해 약 10 ㎖/일 내지 약 1000 ㎖/일로, 암성 종양이 있다고 진단된 인간에게 상기와 같은 종양의 성장을 억제하는 방법으로서 투여한다.
2) 경구 등으로 투여되는 제형
상기 방법에 의해 합성된 화합물 1 g, 락토오즈 98 g 및 하이드록시프로필 셀룰로즈 1 g을 철저히 혼합하여 수득한 혼합물을 임의의 통상적인 방법에 의해 과립으로 제조한다. 상기 과립을 철저히 건조시키고 체질하여 병으로 또는 가열 밀봉 에 의해 패키징하기에 적합한 과립 제제를 수득한다. 생성된 과립 제제를 증상에 따라, 인간의 암성 종양 치료 분야의 통상적인 숙련가에 의해 적합한 것으로 간주되는 바와 같이, 약 100 ㎖/일 내지 약 1000 ㎖/일로 경구 투여한다.
3) 국소적으로 투여되는 제형
유효량의 화합물을 개인에게 투여하는 것을 또한 상기 개인의 피부의 병에 걸린 영역에 직접 상기 화합물(들)을 투여함으로써 국소적으로 수행할 수 있다. 이를 위해서, 투여되거나 적용되는 화합물은 약리학적으로 허용가능한 국소 운반체, 예를 들어 겔, 연고, 로션 또는 크림, 예를 들어 비 제한적으로 물, 글리세롤, 알콜, 프로필렌 글리콜, 지방 알콜, 트리글리세라이드, 지방산 에스테르 또는 광물성 오일과 같은 운반체를 포함하는 조성물의 형태 중에 있다. 다른 국소 운반체는 액체 석유, 이소프로필 팔미테이트, 폴리에틸렌 글리콜, 에탄올(95%), 수 중 폴리옥시에틸렌 모노라우레이트(5%) 또는 수 중 나트륨 라우릴 설페이트(5%)를 포함한다. 다른 물질들, 예를 들어 항산화제, 보습제, 점도 안정제 및 유사한 작용제들을 필요에 따라 첨가할 수도 있다. 피부 침투 촉진제, 예를 들어 아존(Azone)을 또한 포함할 수 있다. 또한, 몇 가지 예에서, 상기 화합물을 피부 위, 피부 중 또는 피부 아래에 놓이는 장치와 함께 배치할 수도 있는 것이 예상된다. 상기와 같은 장치는 패치, 이식편, 및 상기 화합물을 수동 또는 능동 방출 메카니즘에 의해 피부로 방출시키는 주사를 포함한다.
실시예 8
KPU-2, KPU-35 및 t-부틸 페닐아히스틴의 시험관 내 약물학
KPU-2, KPU-35 및 t-부틸 페닐아히스틴을 사용하여 수행된 상기 시험관 내 효능 연구는 A) 6 개의 종양 세포 라인의 패널, B) 다중약물-내성 종양 세포에 대한 연구 및 C) 작용 메카니즘을 결정하기 위한 연구를 포함한다.
A) 6 개의 종양 세포 라인의 패널에서 KPU-2, KPU-35 및 t-부틸 페닐아히스틴의 연구
하기의 세포 라인(괄호 안에 출처를 표기)를 사용한다: HT29(인간 결장 종양; ATCC; HTB-38), PC3(인간 전립선 종양;, ATCC; CRL-1435), MDA-MB-231(인간 유방 종양; ATCC; HTB-26), NCI-H292(인간 비 소(non small) 세포 폐 종양; ATCC; CRL-1848), OVCAR-3(인간 난소 종양; ATCC; HTB-161), B16-F10(쥐 흑색종; ATCC; CRL-6475) 및 CCD-27sk(정상적인 인간 섬유아세포; ATCC; CRL-1475). 세포들을 각각의 배양 배지에서 합류점 이하의 밀도로 유지시킨다.
세포독성 분석을 세포 생존력의 지표로서 레사주린 형광을 사용하여 실시예 4에 상술한 바와 같이 수행한다.
개시된 화합물은 다양한 상이하고 독특한 종양 세포 라인들에 대한 유효 작용제들이다. 구체적으로, 예를 들어 KPU-2 및 KPU-35는 유효성(저 나노몰 범위에서 활성임) 및 효능(최대의 세포독성 효과에 대해서 가장 반응성임) 모두에 있어서 HT-29 종양 세포 라인에 가장 효과적이고; t-부틸-페닐아히스틴은, 비록 가장 큰 효능은 HT-29 세포 라인에 대해 나타내지만, PC-3 종양 세포 라인에 대해 가장 큰 유효성을 나타내고; KPU-2 및 KPU-35는 일반적으로 t-부틸-페닐아히스틴보다 10 내지 40 배 더 큰 유효성을 보인 반면, 효능은 상이한 종양 세포 라인들에서 상기 3 개의 모든 화합물들에 대해 유사하고; HT-29, PC-3, MDA-MB-231 및 NCI-H292 종양 세포 라인은 모두 NPI 화합물에 대해 유사하게 반응한 반면, B16-F10은 감수성이 다소 적은 것으로 나타난다. t-부틸-페닐아히스틴은 정상적인 섬유아세포와 종양 세포 라인 사이에 현저한 차이를 나타내고, 이때 비율 범위는 OVCAR-3 세포 라인을 제외하고 >20->100이다.
표 12. 종양 패널 스크린에서 KPU -2, KPU -35 및 t-부틸 페닐아히스틴의 활성
Figure 112006063575231-PCT00089
B) 약물 내성 세포 라인에 대한 연구
임상 종양학에서 화학요법제의 사용에 있어서 주요 도전 중 하나는 종양 세포에 의한 약물 효과에 대한 내성의 발달이다. 내성의 발달에 대해 다수의 메카니즘들이 존재하는데, 이들은 각각은 화학요법 약물에 대해 상이한 효과를 가질 것이다. 이러한 메카니즘은 ATP-의존성 유출 펌프, 예를 들어 MDR1에 의해 암호화된 P-당단백질 또는 MRP1에 의해 암호화된 다중약물-내성 관련된 단백질 1의 증가된 발현을 포함한다. 감소된 약물 흡수, 약물 표적의 변경, 약물-유도된 DNA 손상의 보수 증가, 세포사멸 경로의 변경 및 시토크롬 P450 효소의 활성화가 암 세포가 항암 약물에 내성으로 되는 메카니즘의 다른 예들이다. 선택된 화합물들을 2 개의 상이한 내성 메카니즘, 즉 상기 P-당단백질의 과 발현 및 변경된 토포이소머라제(topoisomerase) II 활성을 나타내는 3 개의 상이한 세포 라인에서 연구한다.
1) 인간 자궁 육종 종양 세포 라인 쌍: MES-SA(탁솔 감수성) 및 MES-SA/DX5(탁솔 내성)
상기 세포 라인은 상승된 mdr-1 mRNA 및 P-당단백질(압출 펌프 메카니즘)을 발현한다. 사이클로스포린-A(CsA)에 의한 전처리는 P-당단백질을 차단하며 내성이 상승된 P-당단백질에 기인하는 화합물들에 대한 내성 세포 라인에서 활성을 회복시킨다.
표 13으로부터 알 수 있는 바와 같이, KPU-2 및 KPU-35는 감수성 라인에서와 같이 내성 세포 라인에서도 동일한 유효성을 가지며, t-부틸-페닐아히스틴의 유효 성은 단지 약간 감소된다. 사이클로스포린 A(CsA) 전 처리는 상기 선택된 화합물들의 유효성을 변경시키지 않는다. 대조적으로, 탁솔은 MES-SA DX5 내성 세포 라인에서 실제로 불활성인 반면, 상기 화합물은 감수성 세포 라인에서 매우 효능이 있다. CsA 처리는 MES-SA/DX5 세포 주의 탁솔에 대한 감수성을 복원시킨다. MES-SA/DX5 세포 라인은 또한 에토포시드(60 배), 독소루비신(34 배) 및 미토잔트론(20 배)에 대해 감소된 감수성을 나타낸다.
이러한 데이터는 KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴의 효과가 상기 세포 라인에서 탁솔-관련 내성 메카니즘(p-당단백질)에 민감하지 않으며, 탁솔로부터의 교차 내성이 상기 모델에서 이들 선택된 화합물들에 대해 발생하지 않는다는 것을 나타낸다.
표 13. MES -SA 탁솔 감수성 및 MES -SA/ DX5 탁솔 내성 인간 자궁 육종 종양 세포 라인에 대한 KPU-2, KPU-35, t-부틸-페닐아히스틴 및 탁솔의 활성
Figure 112006063575231-PCT00090
도 43에 나타낸 추가적인 데이터를 참조.
2) 인간 급성 전골수구(promyelocytic) 백혈병 세포 라인 쌍: HL-60(미토잔트론-감수성) 및 HL-60/MX-2(미토잔트론-내성)
상기 세포 라인은 P-당단백질의 과 발현 없이 변경된 토포이소머라제 II 촉매 활성을 갖는 비 전형적인 약물 내성을 갖는 것으로 간주된다.
표 14에서 알 수 있는 바와 같이, 이들 결과는 선택된 신규 화합물의 유효성이 감수성 및 내성 HL-60 세포 라인에서 매우 유사함을 가리킨다. 대조적으로 미토잔트론은 내성 HL-60/MX-2 세포 라인에서 24 배의 인자까지 효능을 상실한다.
따라서, KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴은 상기 세포 라인에서 미토잔트론과 동일한 내성 메카니즘에 민감하지 않으며 상기 모델에서 이들 선택된 신규 화합물에 대한 미토잔트론으로부터의 교차 내성이 존재하지 않는다.
표 14. HL -60 인간 급성 전골수구 백혈병 종양 감수성 및 내성 세포 라인 쌍에서 KPU-2, KPU-35, t-부틸-페닐아히스틴 및 미토잔트론의 활성
Figure 112006063575231-PCT00091
3) 인간 유방 암 세포 라인 쌍: MCF-7(탁솔 감수성) 및 MCF-7/ADR(탁솔 내성)
본 연구는 탁솔과 비교된 KPU-2를 포함한다. KPU-2는 상기 세포 라인 쌍의 감수성 및 내성 일원 모두에서 유사한 유효성을 나타낸다. 대조적으로, 탁솔은 상기 내성 세포 라인에서 실제로 불활성인 반면 상기 감수성 세포 라인에서는 낮은 나노몰 유효성이 존재한다(표 15).
이러한 연구는 탁솔 내성이 KPU-2로 전달되지 않는 상이한 인간 종양 세포 라인에서 확인된다.
표 15. MCF -7 인간 유방 암 감수성 및 내성 세포 라인 쌍에서 KPU -2 및 탁솔의 활성
Figure 112006063575231-PCT00092
C) 작용 메카니즘에 대한 연구
1) 미세관 기능에 대한 작용
인간 제대(umbilical) 정맥 내피 세포(캄브렉스(Cambrex)로부터 HuVEC)를, α-튜불린을 염색함으로써 튜불린에 대한, 콜히친 및 탁솔과 비교된, KPU-2 및 t-부틸-페닐아히스틴의 영향을 평가하기 위해서 본 연구에 사용한다.
KPU-2, t-부틸-페닐아히스틴 또는 콜히친(모두 2 μM)에 대한 30 분의 노출 이 HuVEC 세포에서 DMSO 대조군 및 세포막 수포 발생(세포사멸의 분명한 표시)에서 관찰된 것과 대조적으로 완전한 미세관 구조의 결여에 의해 지시된 바와 같이, 미세관 탈 중합을 유도한 반면, 탁솔은 이러한 조건 하에서 미세관 탈 중합을 유도하지 않는다. 콜히친은 공지된 미세관 탈 중합제인 반면, 탁솔은 튜불린 안정화제이다. CCD-27sk 세포를 KPU-2 또는 콜히친에 노출시킬 때, 유사한 결과를 수득한다.
2) 세포사멸의 유도
세포사멸 및 그의 조절장애는 종양학에서 중요한 역할을 하며; 종양 세포에서 프로그램화된 세포사멸 주기의 선택적인 유도가 다수의 화학요법 약물 발견 프로그램의 목표이다. 이러한 세포사멸의 유도는 특징적인 세포막 수포발생, DNA 단편화, 세포사멸 억제 인자 Bcl-2의 과인산화, 카스파제 연속단계의 활성화 및 폴리(ADP 리보스) 폴리머라제(PARP)의 절단을 포함한 상이한 방법들에 의해 입증될 수 있다.
세포사멸 세포사의 특징적인 신호는 세포막 수포발생, 핵의 파괴, 세포 수축 및 축합, 및 괴사성 세포사와 매우 구별되는 최종적인 세포사를 포함한다. KPU-2는 인간 전립선 종양 세포에서 초기 단계의 세포사멸과 관련된 전형적인 형태적 변화를 유도한다. 유사한 발견은 KPU-2에 의한 HuVEC 세포의 치료에서 또한 분명하다.
3) DNA 단편화
세포사멸의 말기 단계 특징은 겔 전기영동에 의해 가시화될 수 있는 독특한 사다리 패턴을 초래하는 뉴클레오솜간 DNA 절단이다. 이러한 접근방법을 사용하여, 할이미드 및 데하이드로페닐아히스틴(KPU-1)과 비교된, 주르캣(JurKat) 세포(인간 T 세포 백혈병 라인)에서 DNA 사다리화에 대한 KPU-2의 효과를 연구한다. KPU-2는 1 nM 농도에서 DNA 사다리화를 유도한 반면 할이미드 및 KPU-1은 유효성이 훨씬 적다.
4) 카스파제 연속단계의 활성화
카스파제-3, -8 및 -9를 포함한 카스파제 연속단계의 여러 효소들이 세포사멸 중에 활성화된다. 카스파제-3의 활성을 KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴으로 처리한 주르캣 세포에서 모니터한다.
결과는 카스파제-3이 할이미드와 유사한 방식으로 3 개 화합물 모두의 처리에 의해 용량-의존적인 방식으로 활성화되었음을 가리킨다. 상기 카스파제-3 활성화는 주르캣 세포 주에서 세포독성에 대한 IC50에 관한 유사한 농도 범위에 걸쳐 발생하였다(표 16).
표 16. 주르캣 세포에서 KPU -2, KPU -3 및 t-부틸- 페닐아히스틴의 세포독성
Figure 112006063575231-PCT00093
5) 주르캣 세포에서 폴리(ADP-리보tm)폴리머라제(PARP)의 절단
주르캣 세포에서 세포사멸을 유도하는 이들 화합물의 능력을 평가하기 위해서, 폴리(ADP-리보오즈)폴리머라제(PARP)의 절단을 모니터한다. PARP는 카스파제-3의 주요한 세포 내 표적들 중 하나인 116 kDa 핵 단백질이다. PARP의 절단은 안정한 89 kDa 생성물을 생성시키며, 상기 공정은 웨스턴 블럿팅에 의해 쉽게 모니터할 수 있다. 카스파제에 의한 PARP의 절단은 세포사멸의 보증 중 하나이며, 그 자체가 상기 공정에 대한 탁월한 표지를 제공한다. KPU-2는 100 nM에서 상기 세포를 상기 화합물에 노출시킨 지 10 시간에 주르캣 세포에서 PARP의 절단을 유도한다. KPU-2는 할이미드나 KPU-1보다 더 활성이 있는 것으로 나타난다.
6) HuVEC 세포에서 향상된 혈관 침투성
미소관을 탈 중합시키는 화합물(예를 들어 콤브레타스타틴 A-4-포스페이트, ZD6126)은 생체 내 종양에서 혈관 붕괴를 유도하는 것으로 나타내어진다. 이러한 혈관 붕괴는 처음에 전해질 및 바로 후에 큰 분자들에 대한 혈관 세포 침투성의 신속한 유도가 선행된다. 형광-표지된 덱스트란에 대한 HuVEC 세포의 향상된 침투성을 혈관 붕괴에 대한 대리 분석으로 사용한다.
KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴은 모두 콜히친과 유사한 정도로 현저한 HuVEC 단층 침투성을 신속하게(1 시간 이내에) 유도한다. 미소관 안정화제인 탁솔은 상기 분석에서 불활성이다(도 12).
7) 광범위한 키나제 스크린의 프로파일
KPU-2를 60 개의 상이한 키나제들의 패널에서 10 μM의 농도로 초기에 스크린하고; ATP 농도는 10 μM이다. 4 개의 키나제가 1 차 스크린에서 50% 이상까지 억제되고 2 차 스크린에서 측정된 IC50을 표 17에 나타낸다. 상기 IC50 값들은 모두 낮은 마이크로몰 범위에 있으며, 이는 상기 키나제들의 억제가 종양 세포 세포독성의 경우 관찰된 낮은 나노몰 활성들과 관련이 없음을 가리킨다.
표 17. 선택된 키나제에 대한 KPU -2의 활성
Figure 112006063575231-PCT00094
실시예 9
생체 내 약물학
KPU-2에 대한 예비 연구를 마우스에서 MX-1(유방) 및 HT-29(결장) 이종이식 모델 및 P-388 쥐 백혈병 종양 모델을 사용하여 수행한다. 시험관 내 종양 패널에서 활성을 기초로 선택된 다른 종양 모델들은 DU-145(전립선), MCF-7(유방) 및 A549(폐) 세포 라인이다. 인간 췌장 종양(MiaPaCa-2)을 또한 포함시킨다. 신규 화합물들을 단일요법으로서 및 임상적으로 사용된 화학요법제와 조합으로 연구한다. 선택된 신규 화합물들의 용량을 급성 허용성 시험(최대로 허용되는 용량, MTD)으로 부터 측정하고, 필요하다면 각 연구 중에 조절한다. 상기 임상적으로 사용된 화학요법제의 용량을 병력 연구를 근거로 선택한다.
KPU-2는 이들 5 개의 종양 모델에서 연구된 첫 번째 화합물이다. 상기 연구로부터의 처음 결과에 따라, 3 개 화합물 모두를 HT-29 인간 결장 종양, DU-145 인간 전립선 및 MCF-7 인간 유방 종양 이종이식 모델에서 비교한다.
상기 모델들은 모두 피하 이종이식 기법을 사용하며 피하 혈관에 대한 확대된(또는 명백한) 항종양 활성을 생성하는 화합물의 선택적인 효과에 잠재적으로 종속한다. 이러한 가능성을 회피하기 위해서, 2 개의 다른 종양 모델을 상기 조사에 포함시킨다. 이들 중 하나는 B16-F10 마우스 흑색종 종양 세포의 정맥 내 주입에 따른 폐 전이의 관찰이다. 다른 모델은 마우스 유방 지방 패드에서 MDA-231 인간 유방 종양 세포의 이식이다. 상기 후자의 모델은 이종이식 모델이지만, 피하 혈관은 역할을 하지 않는다.
방법
1) 이종이식 모델
사용된 동물은 (예외는 각각의 연구에 나타난다) 5 내지 6 주 된(∼20 g, Harlan) 암컷 누드 마우스(nu/nu)이고; 군 크기는 달리 나타내지 않는 한 군 당 9 내지 10 마리의 마우스이다.
종양 이식에 사용된 세포 라인은 HT-29 인간 결장 종양; MCF-7 인간 유방 종양; A549 인간 비 소 세포 폐 종양; MiaPaCa-2 인간 췌장 종양; DU-145 인간 전립 선 종양이다.
선택된 신규 화합물들을 단일요법으로서 복강 내(i.p.) 경로를 통해 상기 개별적인 연구에 대해 지시된 용량으로 투여하고; 조합 연구의 경우 선택된 참조 화학요법제를 상기 화합물보다 15 내지 30 분 전에 주입한다.
이들 연구에 사용된 운반체는 선택된 신규 화합물들에 대해서 12.5% DMSO, 5% 크레마포어(Cremaphor) 및 82.5% 땅콩 오일; 탁소테르에 대해서(1:3) 폴리소르베이트 80:13 에탄올; 파클리탁셀에 대해서 (1:1) 크레마포어:에탄올; CPT-11에 대해서 용액의 각 ㎖은 20 ㎎의 이리노테칸 하이드로클로라이드, 45 ㎎의 소르비톨 NF 분말 및 0.9 ㎎의 락트산을 함유하고, pH를 NaOH 또는 HCl로 7.4로 조절한다. 염수 희석을 사용하여 참조 화합물에 대해 사용되는 주입 농도를 성취한다.
HT-29 인간 결장 종양 모델
동물들에게 누드 마우스 숙주에서 피하 성장하는 종양으로부터 수확한 HT-29 종양 단편들을 투관침에 의해 피하(s.c.)로 이식한다. 상기 종양 크기가 5 ㎜x 5 ㎜에 도달하면(약 10 내지 17 일), 동물들을 처리 및 대조 군으로 매치한다. 마우스의 중량을 매주 2 회 측정하고 종양을 제 1 일에 시작하여 매주 2 회 캘리퍼스(Calipers)를 사용하여 측정한다. 종양 측정치를 식 (W2 x L)/2를 사용하여 전환시켜 종양 중량 ㎎을 평가한다. 대조 군의 평가된 종양 중량이 평균 1000 ㎎에 도달할 때 상기 마우스의 체중을 측정하고, 도살하여 종양을 제거한다. 상기 종양의 중량을 측정하고 군 당 평균 종양 중량을 계산하여 종양 성장 억제(TGI)를 각 군에 대해 측정한다(100% - 평균 처리된 종양 중량 변화/평균 대조군 종양 중량 변화 x 100).
상기 모델에서 개별적인 연구에 대해 달리 나타내지 않는다면, 선택된 신규 화합물들을 15 일간 매 3 일마다(1, 4, 8, 11 및 15 일(q3dx5)) 복강 내로 주입하고; CPT-11을 제 1, 8 및 15 일째(qwx3)에 복강 내로 투여한다.
MCF-7 인간 유방 종양 모델
암컷 누드 마우스(∼20 g)에 MCF-7 종양 단편(누드 마우스 숙주의 피하 종양으로부터 수확)을 피하 이식하기 전 24 시간째에 21-일 방출 에스트로겐(0.25 ㎎) 펠릿을 피하 이식한다. 이어서 상기 연구를 표준 화학요법제로서 탁소테르를 사용하여 HT-29 모델에 대해 개시한 바와 같이 진행한다.
상기 모델에서 개별적인 연구에 대해 달리 나타내지 않는 한, 신규 화합물을 제 1 내지 5 일 째에 매일(qdx5) 복강 내 경로를 통해 주입하고; 탁소테르를 제 1, 3 및 5 일째에(qodx3) 정맥 내로 투여하였다.
A549 인간 폐 종양 모델
동물들에 누드 마우스 숙주에서 피하 성장하는 종양으로부터 수확한 A549 종양 단편을 투관침에 의해 피하로 이식하였다. 상기 종양 크기가 5 ㎜x 5 ㎜에 도달하면(약 10 내지 17 일), 동물들을 처리 및 대조 군으로 매치한다. 상기 연구의 나 머지를 표준 화학요법제로서 탁소테르 및 CPT-11를 사용하여 HT-29 모델에 대해 개시한 바와 같이 진행한다.
상기 모델에서 개별적인 연구에 대해 달리 나타내지 않는 한, 상기 시험된 화합물을 CPT-11 조합의 경우 q3dx5 용량 스케줄로 또는 탁소테르 조합의 경우 qdx5 용량 섭생으로 복강 내 경로를 통해 투여하고; CPT-11을 qwx3 스케줄로 복강 내 경로를 통해 투여하고; 탁소테르를 qodx3 용량 섭생으로 정맥 내로 투여한다.
MiaPaCa-2 인간 췌장 종양 모델
동물들에 누드 마우스 숙주에서 피하 성장하는 종양으로부터 수확한 MiaPaCa-2 종양 단편을 투관침에 의해 피하로 이식하였다. 상기 종양 크기가 5 ㎜x 5 ㎜에 도달하면(약 10 내지 17 일), 동물들을 처리 및 대조 군으로 매치한다. 상기 연구의 나머지를 표준 화학요법제로서 젬시타빈을 사용하여 HT-29 모델에 대해 개시한 바와 같이 진행시킨다.
상기 모델에서 개별적인 연구에 대해 달리 나타내지 않는 한, 시험 화합물을 제 1, 4, 7, 10 및 15 일(q3dx5) 째에 복강내 경로를 통해 매 3 일마다 투여하고; 젬시타빈을 제 1, 4, 7 및 10 일(q3dx4) 째에 복강 내 경로를 통해 투여한다.
DU-145 인간 전립선 종양 모델
수컷 마우스에게 누드 수컷 마우스 숙주에서 피하 성장하는 종양으로부터 수확한 DU-145 종양 단편을 투관침에 의해 피하로 이식한다. 상기 종양 크기가 5 ㎜x 5 ㎜에 도달하면(약 13 내지 17 일), 동물들을 처리 및 대조 군으로 매치한다. 상기 연구의 나머지를 표준 화학요법제로서 탁소테르를 사용하여 HT-29 모델에 대해 개시한 바와 같이 진행시킨다.
상기 모델에서 개별적인 연구에 대해 달리 나타내지 않는 한, 시험 화합물을 제 1, 3, 5, 8 및 11 일(q3dx5) 째에 복강 내 경로를 통해 투여하고; 탁소테르를 제 1, 3 및 5 일(q2dx3) 째에 정맥 내로 투여한다.
2) 비 피하 이식 종양 모델
사용된 동물은 5 내지 6 주 된(∼20 g, Harlan) 암컷 누드 마우스(nu/nu)(MDA-231 연구) 또는 B6D2F1(B16-F10 연구)였으며; 군 크기는 달리 나타내지 않는 한 군 당 10 마리의 마우스이다.
사용된 세포 라인은 MDA-MB-231 인간 유방 종양 및 B16-F10 쥐 흑색종 세포이다.
NPI 화합물을 단일요법으로서 복강 내 경로를 통해 상기 개별적인 연구에 대해 지시된 용량으로 투여하고; 조합 연구의 경우 선택된 참조 화학요법제를 NPI 화합물보다 15 내지 30 분 전에 주입한다.
MDA-231 인간 유방 종양
암컷 누드 마우스에 유방 지방 패드에 시험관 내 세포 배양물로부터 수확한 2 x 106 MDA-231 세포를 주입한다. 상기 종양 크기가 5 ㎜x 5 ㎜에 도달하면(약 14 내지 28 일), 동물들을 처리 및 대조 군으로 매치한다. 이어서 상기 연구를 표준 화학요법제로서 파클리탁셀을 사용하여 HT-29 모델에 대해 개시한 바와 같이 진행시킨다.
상기 모델에서 개별적인 연구에 대해 달리 나타내지 않는 한, 시험 화합물을 제 1, 4, 8, 11 및 15 일(q3dx5) 째에 복강 내 경로를 통해 투여하고; 파클리탁셀을 제 1 내지 5 일(qdx5) 째에 복강 내 경로를 통해 투여한다.
B16-F10 전이성 쥐 흑색종 모델
마우스에게 정맥 내 경로에 의해 제 0 일 째에 B16-F10 세포(B16-F10 세포의 시험관 내 세포 배양물로부터 준비)를 제공한다. 제 1 일째에, 마우스를 처리 및 대조 군으로 랜덤하게 분류하고 처리를 개시한다. 마우스의 체중을 제 1 일에 시작하여 매주 2 회 측정한다. 모든 마우스를 제 16 일 째에 도살고, 폐를 회수하고, 중량을 측정하고, 표면 콜로니들의 수를 계산한다. 결과를 처리된 마우스의 평균 콜로니/대조군 마우스의 평균 콜로니(T/C) x 100%로서 표현하였다. 전이 성장 억제(MGI)가 100%로부터 상기 수를 감한 것이다. 파클리탁셀이 본 연구에 사용된 표준 화학요법제이다.
상기 모델에서 개별적인 연구에 대해 달리 나타내지 않는 한, 시험 화합물을 제 1 내지 5 일 째에(qdx5) 복강 내 경로를 통해 투여하고; 파클리탁셀을 제 1 내 지 5 일 째에(qdx5) 정맥 내로 투여한다.
적합할 때(n ≥ 3), 결과를 평균 ± SEM으로 나타낸다. 여러 군에 대한 연구의 통계 분석을 달리 나타내지 않는 한 뉴만-큘스(Neuman-Keuls) 후 시험과 함께 ANOVA를 사용하여 수행한다. 또한 상기 화합물 또는 약물, 또는 이들의 조합이 종양 성장을 감소시킬 것이라는 가정을 기초로 1-테일드 t-시험을 사용한다.
결과
HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서의 연구
1. HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 KPU-2 +/- CPT-11의 생체 내 평가
상기 연구는 HT-29 모델에서 단독 및 관련 화학요법제인 CPT-11과 조합으로 KPU-2에 대한 용량 강도 및 투여 섭생의 변화를 평가한다.
KPU-2를 5 일간 매일(qdx5) 복강 내로 7.5 ㎎/㎏, 5 일간 bid 복강 내로 3.75 ㎎/㎏, 10 일간매 이틀마다(qodx5) 복강내로 7.5 ㎎/㎏ 및 15 일간 매 3 일마다(q3dx5) 복강내로 7.5 ㎎/㎏의 용량으로 투여한다. 15일간 매 3일마다(q3dx5) 복강내로 7.5 mg/kg의 용량으로 CTP-11의 NPI-2358과 조합은 어느 한 화합물의 단독 보다 현저하게 더 큰 효과를 초래하고, 이는 연구 기간 동안 지속된다(도 13). 상기 연구의 살아있는 동안의 이러한 관찰은 오직 상기 조합 군만이 대조군보다 통계학적으로 현저하게 보다 낮은 종양 중량을 나타낸다는 부검 시의 평균 군 최종 종양 중량에 의해 입증된다. 또한 상기 조합 요법과 CPT-11 단일요법 군 사이의 평균 종양 중량 차이는 통계학적으로 현저하다(도 14). 상기 부검 시의 개별적인 최종 종양 중량을 검사하는 경우, 상기 조합 요법의 보다 큰 효과는 분명하다(도 14). 상기 조합요법의 TGI는 CPT-11 단독에 대한 38.9%에 비해 78%이다. 상기 조합 요법 군의 TGI는 양의 결과에 대한 58%의 NCI 기준을 초과한다.
2. KPU-2 +/- 표준 화학요법 대 5 개의 인간 종양 이종이식 모델에 대한 연구
상기 연구는 5 개의 상이한 부문으로 이루어지며, 이들 각각은 그 자신의 프로토콜, 타이밍, 투여 섭생 및 참조 화합물을 가진다. 각 부문은 특정한 종양 모델의 존재 내에서 고려될 것이다.
상기 연구의 HT-29 부문의 목적은 상기 개시된 연구에 사용된 것과 비교된 바와 같이, HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 약간 더 높은 KPU-2의 용량(10 ㎎/㎏ ip q3dx5)을 조사하는 것이고, 이때 KPU-2(7.5 ㎎/㎏ ip q3dx5) 및 CPT-11(100 ㎎/㎏ ip qwx3) 사이에 현저한 상승작용이 관찰된다.
도 15에서 관찰할 수 있는 바와 같이, 상기 모델에서 KPU-2와 CPT-11의 조합은 종양 성장의 억제에서 현저한 상승작용을 초래하고, 상기 종양 성장은 상기 조합 요법 군에서 치료 제 29 일까지 거의 완전히 억제된다. 상기 조합 요법은 효능을 유지시키고, 상기 군에 대해 평가된 종양 성장은 어느 한 단일요법 군에 대한 것보다 현저하게 더 낮다. 따라서, KPU-2와 CPT-11의 투여는 종양 성장을 억제하고 이는 유효한 항종양 치료이다.
상기 연구의 살아있는 부분의 관찰(평가된 종양 성장, 도 15)은 부검 시 절제된 종양 중량의 측정에 의해 지지된다(도16). 상기 조합 군의 종양 중량은, CPT-11 단독에 대한 종양 중량(p<0.05)에서처럼, 대조군보다 현저하게 더 적다(p<0.01).
개별적인 최종 종양 중량을 고려할 때(도 16), 상기 조합 군의 종양 크기는 일반적으로 다른 처리된 군 또는 대조 군의 경우보다 일반적으로 더 작다. 상기 조합 군의 TGI는 65.8%이고, 이는 NCI 기준에 따르면 양의 효과를 나타내는 반면, 단일요법은 TGI>58%의 NCI 기준에 도달하지 못한다.
3. HT-29 인간 결장 종양 이종이식 연구에서 KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴의 활성 연구
상기 연구의 결과를 도 17 및 표 18에 나타낸다. 상기 조합 요법 군들은 모두 신규 화합물과 CPT-11 사이에 현저한 상승작용을 나타낸다. 개별적인 종양 중량은 조합요법 처리의 유효성을 입증한다(도 18). 각각의 경우에 상기 조합 군의 TGI는 양의 효과에 대한 NCI 기준을 능가하는 반면, CPT-11 단일요법에 대한 TGI는 이 수준에 도달하지 못한다.
표 18. HT-29 인간 결장 종양 모델에서 수행된 연구에 대한 요약
Figure 112006063575231-PCT00095
4. HT-29 인간 결장 종양 이종이식 모델에서 CPT-11과 조합으로 KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴의 효과에 대한 요약
CPT-11과 조합 시, KPU-2는 표준 화학요법제인 CPT-11의 효과를 양의 효과에 대해 TGI ≥ 58%의 NCI 기준을 상당히 초과하는 수준으로 향상시킨다. 상기 3 개의 연구에서 생성된 이러한 결과는 살아있는 동안의 관찰(도 19)과 부검 시 절제된 종양의 중량(도 20) 모두에 대해 매우 필적할 만하다.
DU-145 인간 전립선 이종이식 모델에 대한 연구
2 개의 연구를 상기 모델을 사용하여 완성한다: 첫 번째 연구는 KPU-2를 단독으로 및 탁소테르와 조합으로 포함하고; 두 번째 연구는 KPU-2, KPU-35 및 t-부 틸-페닐아히스틴을 단독 및 탁소테르와 조합으로 비교한다.
1. DU-145 인간 전립선 종양 이종이식 모델에서 탁소테르와 조합으로 KPU-2의 효과
상기 연구의 살아있는 동안에 수득된 데이터로부터 알 수 있는 바와 같이(도 21), 상기 DU-145 인간 전립선 종양의 가장 유효한 치료는 KPU-2 + 탁소테르의 조합 요법이다. 상기 치료 효과는 상기 연구의 개시 시에 가장 현저하였으며 연구가 진행됨에 따라 감소하는 것으로 나타난다. 20 내지 27 일의 치료로부터, 상기 조합 요법은 NCI 기준(TGI ≥ 58%)을 초과하는 명백한 TGI를 제공하고, 상기 조합 요법의 평가된 종양 중량은 어느 한 단일요법의 경우보다 현저하게 더 적다.
2. DU-145 인간 전립선 이종이식 모델에서 단독 또는 탁소테르와 조합으로 KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴의 활성
상술한 연구에서 탁소테르와 조합으로 KPU-2로 수득된 데이터를 근거로, 단독으로 및 탁소테르와 조합으로 KPU-2 내지 KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴을 비교하는 두 번째 연구를 개시한다.
상기 연구의 살아있는 동안 수행된 관찰은 KPU-2 또는 KPU-35 어느 한 화합물과 탁소테르와의 조합이 탁소테르 단독의 경우보다 종양 성장에 대해 더 큰 감소를 가진다는 것을 나타낸다(도 22). 상기 종양 성장은 탁소테르와 조합으로 KPU-35에 의해 거의 완전히 차단된다.
부검 시 절제된 종양 중량은 상기 연구의 살아있는 동안 수행된 관찰을 입증하였다. KPU-2(도 23) 또는 KPU-35(도 24) 어느 하나와 탁소테르와의 조합은 종양 성장의 차단에서 탁소테르 단독보다는 현저하게 더 유효하다. KPU-35의 경우에, 10 마리의 마우스 중 3 마리는 종양 수축에 대한 증거를 나타낸다. 상기 종양 성장 억제 지수는 KPU-2의 경우 종양 성장의 현저한 억제(군 평균 = 74.1%) 및 KPU-35의 경우 거의 전적인 차단(군 평균 = 92.5%)을 나타낸다. 탁소테르는 단독으로 양의 효과에 대한 NCI 확립된 기준(TGA ≥ 58%)에 도달하지 못한다.
5. MCF-7 인간 유방 종양 이종이식 모델에 대한 연구
상기 연구는 MCF-7 인간 유방 종양 이종이식 모델에서 KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴의 효과를 비교한다. 상기 화합물들의 용량을 제 1, 2, 3, 4 및 7 일째에 투여하고; 탁소테르를 제 1, 3 및 7 일째에 투여한다.
상기 선택된 신규 화합물은 상기 모델에서 탁소테르와 조합으로 사용 시 통계학적으로 현저한 효과인 조기 개시를 나타내며, 평가된 종양 성장을 명백히 거의 완전히 차단시킨다(도 25). 상기 3 개의 화합물 중에서, KPU-2가 가장 유효한 것으로 나타나고, t-부틸-페닐아히스틴도 또한 탁소테르의 현저한 유효성을 나타낸다.
6. A549 인간 비 소 세포 폐 종양 이종이식 모델에 대한 연구
상기 연구 중의 살아있는 동안의 관찰(도 26)은 KPU-2(7.5 ㎎/㎏ ip, qdx5)를 탁소테르와 조합으로 사용한 결과 대조 군이나 어느 한 단일요법 군에 비해 현 저한 종양 성장 억제를 나타낸다. 이는 상기 조합 요법 군의 평균이 탁소테르 단독 또는 대조 군의 평균에 비해 현저하게 더 적기 때문에 부검 시 종양 중량에 의해 입증된다(도 27). 상기 조합요법 군 종양 중량은 저 종양 중량 집단을 형성하며, 이는 상기 효과의 일관성을 나타낸다.
종양 성장 지수를 계산하는 경우, 상기 조합 요법 군은 대조 군에 비해 양의 효과에 대한 NCI 기준(TGI ≥ 58%)의 초과로 74.4%의 TGI를 가진다. 탁소테르는 단독으로 26.1%의 TGI를 가졌다.
7. MDA-231 인간 유방 종양 정위성(orthotopic) 이종이식 모델에 대한 연구
상기 모델은 인간 종양 조직의, 천연 환경의 대용물인 마우스 유방 지방 패드로의 배치를 포함한다. 이와 같은 방식으로 피하 혈관 층에서 특정 작용에 기인한 긍정적인 영향의 가능성을 피한다. 이 연구는 KPU-2(7.5 ㎎/㎏ ip, q3dx5) 단독 및 파클리탁셀(16 ㎎/㎏ ip, qdx5)과 조합으로효과를 비교한다.
상기 연구 3 주 째에 조합 요법 군에서 매우 현저한 효과인 종양 성장의 현저한 억제가 있다. 이러한 효과는 탁소테르 단독의 경우보다 더 현저한 것으로 나타난다(도 28).
8. 쥐 흑색종 B16 F10 전이성 종양 모델에 대한 연구
상기 연구는 B16 F10 흑색종 세포를 마우스에 정맥 내 주입한 후 16 일 째에 폐 표면 상에 나타나는 전이의 수에 대한 KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴 단독 및 패클리탁셀과 조합으로의 효과를 시험한다. 상기 모델은 이종이식 모델은 아니지만; 종양 덩어리 내로의 고도의 혈관화를 수반하지 않는다.
상기 모델에서, 가장 효과적인 치료는 KPU-2 단독으로(도 29), 파클리탁셀의 경우보다 약 10% 적은 평균 전이 수(각각 41.6% 및 35.0%의 MGI)를 가진다. 상기 연구는 그 자체로 조합 요법이 단일요법보다 더 유효하다는 것을 확립시키지는 않지만, KPU-2, KPU-35 및 t-부틸-페닐아히스틴이 고도로 혈관화된 종양에서 가장 유효함을 가리킨다.
실시예 10
병원성 진균에 대한 활성에 대한 분석
데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체의 AF/IS 값을 측정하는데 사용하기 위해서, 상기 인용된 공지된 항진균 화합물에 대한, 병원성 진균에 대한 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체의 활성 비교를 예를 들어 문헌[Diagn Micro and Infect Diseases 21:129-133(1995)]에 개시된 NCCLS 배양액(broth) 대규모 희석 방법의 미세 적정 플레이트 적응에 의해 진균 미생물에 대해 직접 측정한다. 항진균 활성을 또한 진균 감염의 전체 동물 모델에서 측정할 수 있다. 예를 들어, 폐 뮤코마이코시스의 스테로이드-처리된 마우스 모델을 사용할 수 있다(Goldaill, L.Z. & Sugar, A.M. 1994 J Antimicrob Chemother 33:369-372). 예시에 의해, 상기와 같은 연구에서 다수의 동물들에게, 진균에 의한 감염의 시작 전, 감염 시 또는 감염 후에 각각 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체를 제공하지 않거나, 다 양한 용량의 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체(및/또는 하나 이상의 다른 항진균제와 조합으로) 또는 양성 대조군(예를 들어 암포테리신 B)을 제공한다. 동물들을 매 24 시간마다 한 번, 선택된 용량의 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체, 양성 대조군 또는 운반체만으로 처리할 수 있다. 처리를 예정된 일수 동안, 예를 들어 10 일 까지 계속한다. 동물들의 사망률을 매일 평가하면서, 상기 처리 기간 후 일정 시간 동안, 예를 들어 총 3 주 동안 동물들을 관찰한다. 모델은 다른 처리(예를 들어, 스테로이드로 처리)와 함께 또는 상기 처리 없이 감염되기 쉬운 인간 대상자를 모방하기 위해 구상된 전신, 폐, 질 및 다른 감염 모델을 포함할 수 있다.
추가로 예시하기 위해서, 생체 내 치료 효능(ED50, 예를 들어 데하이드로페닐아히스틴 또는 그의 동족체 ㎎/대상자 ㎏으로 표현)을 측정하기 위한 하나의 방법은 설치류 모델 시스템이다. 예를 들어, 마우스를 병원균의 50% 치사 용량의 약 10 배(106 씨 알비칸스 세포/마우스)의 정맥 내 감염에 의해서와 같이 진균 병원균으로 감염시킨다. 상기 진균 감염 직후에, 데하이드로페닐아히스틴 화합물을 상기 마우스에게 예정된 용량의 부피로 제공한다. ED50을 감염 후 제 20 일 째에 기록된 생존율로부터 반 데르 바르덴(Van der waerden)(Arch Exp Pathol Pharmakol 195:389-412, 1940)의 방법으로 계산한다. 일반적으로, 처리되지 않은 대조용 동물은 감염 후 7 내지 13 일 째에 죽는다.
또 다른 예시적인 실시태양에서, 28 ℃에서 48 시간 동안 사보우라우 드(Sabouraud) 덱스트로즈 아가(SDA) 슬랜트 상에서 생육시킨 씨 알비칸스 위스콘신(C43) 및 씨 트로피칼리스(C112)를 염수에 현탁시키고 분광광도계 상에서 550 ㎚에서 46% 투과율로 조절한다. 상기 접종물을 혈구계에 의해 추가로 조절하고 플레이트 카운트로 대략 1 또는 5 x 107 CFU/㎖임을 확인한다. CF-1 마우스를 꼬리 정맥으로 1 또는 5 x 106 CFU 주사로 감염시킨다. 항진균제를 감염 후 4 시간 째 및 그 후에 3 또는 4 일 이상 동안 매일 한번씩 에탄올:물(10:90) 중에서 정맥 내로 또는 피하로 투여한다. 생존율을 매일 모니터한다. ED50을 마우스의 50% 생존을 허용하는 용량으로서 정의할 수 있다.
실시예 11
유사분열억제 활성의 평가
벤즈이미다졸 및 그리세오풀빈은 진균 미세관에 결합할 수 있는 항튜불린 작용제이다. 이들 화합물은 일단 결합하면 감수성 미생물에서 세포 분열 및 세포 내 운반을 방해하고 세포사를 일으킨다. 상업적으로, 벤즈이미다졸은 수의학적 의약에서 진균제로서 사용되고 식물 질병 억제에 사용된다. 광범위한 진균 종들, 예를 들어 보트리티스 시네레아, 보베리아 바씨아나, 헬민토스포리움 솔라니, 사카로마이세스 세레비지아에 및 아스퍼질러스가 이들 분자에 민감하다. 그러나, 독성 우려
및 증가하는 약물 내성은 이들의 사용에 부정적인 영향을 미친다. 그리세오풀빈은 트리코파이톤 스페시즈, 마이코스포룸 스페시즈 및 에피더모파이톤 플로코 숨에 의해 야기된, 피부, 모발 및 손톱의 백선 감염을 치료하기 위해 임상적으로 사용된다. 그러나, 그의 항진균 범위는 상기 부류의 진균 미생물로 제한된다. 유전독성도 또한 현저한 부작용이다. 테르비나핀은 선택적인 제일선 치료제이나 보다 값이 비싸다. 더욱이, 최근 임상적인 내성이 트리코파이톤 루브룸(모든 피부병 감염의 주요 원인 인자이다)에서 관찰되었다.
칸디다 알비칸스에서, 세포가 미세관 억제제 노코다졸 및 클로로프로팜에 노출 시 미세관/미세섬유 형성에 영향을 받는다. 이러한 결과는 유효 유사분열 억제제로서 세포골격 억제제의 탐구를 더욱 가치있게 한다. 따라서, 본 명세서에 개시된 몇가지 화합물들을 유사분열 억제 활성에 대해 평가한다.
구체적으로, 개시된 화합물들을 상업적으로 이용 가능한 미세관 억제제뿐만 아니라 승인된 항진균제들과 나란히 평가한다. 본 연구에 사용된 시험 화합물 및 대조군: (-)-페닐아히스틴, KPU-1, KPU-2, KPU-11 및 KPU-17, KPU-35, t-부틸 페닐아히스틴, 콜히친(3 개의 칸디다 단리물에 대해 시험된 상업적인 미세관 억제제), 베노밀(3 개의 칸디다 단리물에 대해 시험된 상업적인 미세관 억제제), 그리세오풀빈(6 개의 더마토파이트 단리물에 대해 시험용 상업적인 미세관 억제제 및 항생제 대조군), 암포테리신 B(3 개의 칸디다 단리물에 대해 시험용 항생제 대조군), 이트라코나졸(2 개의 아스퍼질러스 단리물에 대해 시험용 항생제 대조군).
이들 화합물이 시험되는 미생물은 칸디다 알비칸스, 칸디다 글라브라타, 아스퍼질러스 푸미가투스, 트리코파이톤 루브룸, 트리코파이톤 멘타그로파이테스, 에피더모파이톤 플로코숨을 포함한다. 칸디다 글라브라타(하나의 단리물)를 제외하 고, 각각의 종들에 대해 2 개의 단리물을 시험한다.
항진균 감수성 시험을 문헌[the National Committee for Clinical Laboratory Standards, M38-A "Reference Method for Broth Dilution Antifungal Susceptibility Testing of Conidium-Forming Filamentous Fungi; Approved Standard."]에 개략된 방법에 따라 수행한다. 상기는 0.4 - 5 x 104의 접종물 크기로 글루타민이 존재하고, 비카보네이트는 존재하지 않는 RPMI-1640에서, 30 또는 35 ℃에서 48 시간 동안 배양시켜 시험하는 것을 포함한다. 최소 억제 농도(MIC)를 약물 비 함유 대조용 튜브에 비해 혼탁도를 80% 감소시키는 최저 농도로서 정의하였다. 약물 농도는 조사 화합물에 대해 0.03 내지 16 ㎍/㎖이고, 이트라코나졸 및 그리세오풀빈의 경우 0.015 내지 8 ㎍/㎖이다.
화합물이 표적 미생물의 성장을 방지하는 최소 억제 농도(MIC)를 NCCLS 프로토콜의 변경된 버전에 따라 평가한다. 최소 억제 농도(MIC)를 먼저 약물 비 함유 대조용 튜브에서 성장을 측정할 수 있는 처음 24 시간 간격에서 측정한다. 상기 정의된 MIC는 상기 성장 대조군에 비해 80%의 혼탁도 감소를 나타내는 최저 농도이다. 최소 치사 농도(MLC)는 상기 MIC 농도 및 상기 MIC 이상의 각 농도로부터 0.1 ㎕를 도말함으로써 측정한다. 상기 MLC는 99.95%의 사멸을 나타내는 5 개 이하 콜로니의 진균 성장을 나타내는 처음 농도를 지칭한다. MIC가 얻어진 경우, 최소 살진균 농도(MFC)를 측정하여 상기 화합물의 정진균/살진균 성질을 평가한다. 상기 과정은 약물 처리된 세포 샘플(MIC 및 그 이상에서 화합물을 함유하는 시험 웰로부 터 제거)을 상기 억제 농도 보다 현저하게 아래의 화합물 농도로 희석하고 이를 아가 플레이트에 침착시키는 것을 수반한다. 상기 화합물을 세포가 생장을 다시 시작할 수 있는 경우 정진균으로 기록하고 상기 화합물이 상기 미생물을 사멸시키기 때문에 재생장할 수 없는 경우 살진균으로 기록한다.
본 명세서에 개시된 화합물들은 2 개의 트리코파이톤 종들에 대해 유효한 것으로 나타난다. 티 루브룸은 인간 피부진균 감염의 주요 원인 인자이며, 임상 작용제의 개발에서 표적이 되는 주요 미생물 일 것이다.
화합물 KPU-2, KPU-11 및 KPU-17, KPU-35 & t-부틸페닐아히스틴은 피부진균 감염의 치료에 사용되는 현재의 표준 약제학적 작용제인 그리세오풀빈과 유효성에서 동일하거나 또는 일부의 경우 보다 유효하다.
화합물 (-)-페닐아히스틴 및 KPU-1은 티 루브룸에 대해 시험 시 다른 화합물들보다 현저하게 덜 유효하고 약하지만, 감수성 티 멘타그로파이테스 단리물에 대해서는 다른 것들에 보다 필적할만하다.
MFC를 측정할 수 있는 경우에, 그 결과는 이들 화합물이 사실상 정진균성인 것을 가리킨다(표 19 및 20 참조)
표 19. 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체의 항진균 활성
Figure 112006063575231-PCT00096
표 20. 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체의 항진균 활성
Figure 112006063575231-PCT00097
실시예 12
혈관 표적 활성의 평가
종양 및 종양성 병태를 본 명세서에 개시된 화합물을 사용하여 치료할 수 있다. 혈관 표적 작용제 (VTAs)로 종양에 혈액 공급을 차단하는 것은 종양의 퇴화를 유도한다. 예를 들어, NPU-02 및 KPU-35를 포함하는 본 명세서에 개시된 화합물은 혈관 표적 작용제 (VTAs) 일 수 있다. 다수의 VTA는 미세관의 콜히친 결합 부위에 상호작용함으로써 그들의 혈관 효과를 나타낸다. 이 상호작용은 종양에서 정착된 혈관의 특징적이고 신속한 붕괴 및 차단을 유도해서 괴사를 초래하는 존재하는 혈관의 보전을 손상시킨다.
예를 들어, VTA에 30-60 분간의 노출은 혈관 붕괴를 야기할 수 있고, 종양의 중심부에 있는 무활동의 성숙한 혈관 내피세포가 아닌 미성숙의 증식하는 혈관 내피세포의 형태를 변화시키는 것을 포함한다. 혈관 세포에 대한 상기의 차별적인 효과는 정상 혈관에 대해 종양 혈관에서 증식하는 미성숙한 혈관 내피세포의 높은 퍼센트에 기인하여, 종양에 선택적인 효과에 대한 이론적 근거를 제공한다. VTA는 활성의 3 가지 중복되는 범위로 분류될 수 있다: (1) 강력한 혈관 및 세포독성 효과, (2) 약한 세포독성 효과와 함께 강력한 혈관 효과, 및 (3) 약한 혈과 효과와 함께 강력한 세포독성 효과.
KPU -02 및 KPU -35의 생체 내의 혈관 표적 활성
동물 모델은 종양에 의해 유도된 혈관신생을 억제하고, 확립된 종양 혈관을 표적으로 하고, 종양 성장을 억제하는 신규한 치료법을 연구하는데 필수적이다.
쥐 공통 유전자형 "의사-정위성 (pseudo-orthotopic)" 유방 암 모델이 상기 문제를 해결하기 위해 사용된다. 문헌 [Torres Filho et al., Microvascular Research (1995)49, 212-226]이 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다. "의사-정위성 환경"을 생성하기 위해서, 배 스킨플랩 소실 (dorsal skinflap chamber)의 커버슬립을 제거하고 공여 마우스의 유방 지방 패드의 작은 조각를 소실에 이식한다. 지방 패드편의 상에, 히스톤 (H2B)-그린 형광 단백질(GFP)가 형질도입된 N202 유방 종양 세포를 함유하는 종양 타원체를 적용한다. H2B-GFP를 형질도입된 세포의 사용은 종양 성장을 가시화하고 유사분열 및 세포사멸을 모니터한다.
형광 비디오 현미경은 의식있는 마우스에서 종양 미세순환의 상대적으로 비침투성인 연구를 가능하게 한다. 상기 모델은 종양 혈관, 종양 성장, 유사분열 및 아포토시스에 대한 화합물의 효과에 관한 데이터를 제공할 수 있고, 단독으로 또는 다른 치료법과 조합으로 화합물의 활성을 시험하는데 유용하다. 상기 모델을 이용하여, KPU-02 및 KPU-35는 중심부의 괴사를 초래하는 신속한 혈관 붕괴를 유도하고, 단일 정맥 투여 후 정착된 종양의 퇴화를 유도하는 것을 나타낸다.
종양 성장의 12일째, 5 mg/kg KPU-35의 2분 연속 주입, 10 mg/kg KPU-02의 5분 정맥 연속 주입 또는 운반체(10% 솔루톨(w/w) + 수 중에 2% DMSO)의 전량(bolus) 주사로 마우스를 처리한다. 13일째, 10 mg/kg KPU-02, KPU-35 또는 운반체를 5분 연속 주입한다. KPU-02 또는 KPU-35의 처치는 내성을 가진다. 마우스를 추가적인 2일 동안 관찰한다. 종양 부위, 혈류 속도 및 종양 내부 및 주변부의 혈 관 밀도를 가시화한다. 스틸사진 및 비디오 현미경을 사용하여 실시간 관찰을 다양한 시각에 기록한다.
상기 연구는 KPU-02 또는 KPU-35 중 하나로 단일 정맥 처치 후에 중심부 혈관의 신속한 붕괴를 입증한다. 주변부의 지방 패드 또는 피부의 혈관에 관찰된 효과 없이, 혈관 작용의 변화는 현저한 중심부 종양 괴사를 초래한다(도 30). 이들 관찰은 KPU-02 및 KPU-35의 선택성 및 특이성을 지지하고, 이들 각각은 정착된 종양 혈관을 붕괴시킬 수 있다.
인간 종양 이종이식에서 KPU-02의 생체 내 활성
KPU-02를 CPT-11(이리노테칸), 탁소테르 또는 파클리탁셀과 함께 투여할 때, 표지된 항종양 활성을 인간 직장 (HT-29), 유방 (MCF-7; MDA-MB231) 및 폐 (A549) 종양 이종이식 모델에서 확인한다(표 21). HT-29 모델에서 KPU-02의 효과는 확실하고, 세가지 연구에서 재현가능하고, 7.5 mg/kg은 통계적으로 2.5 mg/kg 보다 더 크다는 용량 의존 효과를 나타낸다(도 32, 33).
HuVEC 세포에서 KPU-02 및 KPU-03의 생체 내 활성
상기에 기재된 종양 혈관에서 KPU-02 및 KPU-35의 생체 내 효과는 HuVEC 세포에서 동일한 화합물의 생체 내 효과에 의해 지지된다. 인간 제대 정맥 상피 세포는 미성숙한 것으로 여겨지는 종양 내피세포의 우수한 시험관 모델로 간주된다. 종양 상피 세포는 혈관 벽 세포를 지지하는 것이 부족하고 종양 혈관의 보전에 대한 미세관 망사조직에 더욱 더 의존한다. 따라서, 미세관 망사조직 종양의 퇴화는 혈관 붕괴를 야기한다.
KPU-02는 HuVEC 세포에서 신속한 튜불린 탈중합을 유도한다.
인간 제대 정맥 상피 세포 (HuVECs; Cambrex CC2519A)는 EGM-2 (Cambrex) 배지에서 하부융합형(subconfluent) 밀도에서 유지된다. 세포를 5% CO2 및 95% 습윤 공기 중에 37 ℃ 배양기에서 배양한다. 튜불린 염색 분석을 위해, HuVEC 세포를 조직 배양 호완성 커버슬립 상에 EGM-2 중에 3x104 세포/ml의 밀도로 시딩한다(Fisher). 상기 플레이트를 2일 동안 배양기에 넣어둔다.
시험 화합물의 저장(20 mM) 용액을 100% DMSO에서 준비한다. 상기 화합물의 400배 농축 희석액을 100% DMSO 중에 준비한다. 희석액의 5μl 용적을 200 nM의 최종 농도를 나타내도록 각각의 웰에 첨가한다. DMSO의 최종 농도는 모든 샘플에서 0.25%이다. 플레이트를 30분 동안 배양기에 넣어둔다. HuVEC 세포를 200nM KPU-02 또는 KPU-35로 30분 동안 처리한다.
세포를 dPBS 중에 세정한 후에, 실온에서 10분 동안 10%(v/v) 중성 완충 포르말린으로 고정한다. 고정 후에, α-튜불린를 간접 면역형광으로 가시화한다. 구체적으로, 세포를 10분 동안 0.2%(v/v) 트리톤 X-100/dPBS 중에 투과성화한다. 세포를 습윤실로 커버슬립을 이동하기 전에 세정하고, 커버슬립을 항체 완충액 (2%(w/v) BSA/0.1%(v/v) Tween 20/dPBS) 중에 두시간 동안 차단한다. 커버슬립은 한 시간 동안 항체 완충액 중에 0.1μg/ml 마우스 α-튜불린 (분자 탐색자)의 50μl로 배양한 후, 세정하고, 암실에서 한 시간 동안 1μg/ml 염소 항-마우스 FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories)의 50μl로 배양한다. 최종적으로, 세포를 세정하고 10분 동안 2μg/ml DAPI (분자 탐색자)로 처리한 후, 물로 세정하고 벡터쉬일드(Vectashield) (Vector Labs) 봉입제(mounting media)로 봉입한다. 세포를 직립형 현미경(올림푸스 BX51) 상에서 60배 유적 대물렌즈를 사용하여 이미지화한다. 상기 이미지를 CCD 카메라 및 마그나파이어(Magnafire) 2.0 소프트웨어(올림푸스)를 사용하여 디지털화한다. 포스트 이미지 프로세싱를 포토샵 엘러먼트(Photoshop Elements) 2.0 (아도브) 및 마이크로소프트 파워포인트에서 수행한다.
도 33은 KPU-02 및 KPU-35가 HuVEc 세포에서 튜불린 탈중합을 신속하게 유도한다는 것을 나타낸다.
KPU-02는 HuVEC 세포에서 용량 의존성 단층 투과성을 유도한다.
인간 제대 정맥 상피 세포 (HuVECs; Cambrex CC2519A)는 EGM-2 (Cambrex) 배지 중에 하부융합형 밀도에서 유지된다. 세포를 5% CO2 및 95% 습윤 공기에서 37 ℃ 배양기에서 배양한다. 단층 투과성 분석을 위해, HuVEC 세포를 24-웰 플레이트에서 피브로텍틴-코팅된 3.0 μm 플루오로블록(Fluoroblok) 삽입체 (벡톤 디킨슨(Becton Dickinson)) 상에서 EGM-2 배지 중에 1x105 세포/ml로 시딩한다. 플레이트를 세포가 포화도에 도달할 수 있도록 4일 동안 배양기에 넣어둔다.
시험 화합물의 저장 용액 (20 mM)을 100% DMSO에서 준비한다. 상기 화합물의 10배 농축된 일련의 희석액를 EGM-2에서 준비한다. 일련의 희석액의 10 μl 용적을 2 μM 내지 2 nM 범위에 이르는 최종 농도를 나타내도록 이중으로 시험 삽입체에 첨가한다. DMSO의 최종 농도는 모든 샘플에서 0.25%이다. 상기 세포를 15분 동안 2 nM - 2 μM KPU-02로 처리한다.
dPBS (38.2 kDa; Sigma) 중에 FITC-덱스트란 (50 mg/ml)를 EGM-2 중에 2.5 배로 희석하고 FITC-덱스트란 10 μl를 각각의 삽입체에 첨가한다. FITC-덱스트란의 최종 농도는 1 mg/ml이다. 상기 플레이트를 배양기에 넣어두고 30분 후에 상기 24개의 웰 플레이트의 하부실의 형광을 λex=485 nm 및 λem=530 nm 필터를 가진 융합 형광계 (팩카드 바이오사이언스(Packard Bioscience))를 사용하여 판독한다.
도 34는 KPU-02가 용량 의존법으로 단층 투과성을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다. 도 34에 나타난 결과는 세가지 비의존성 실험의 평균 ± S.D.를 나타낸다.
125 I-IAP로 P22 래트 육종 모델에서의 혈류
종양 혈류를 P22 래트 육종을 가지는 래트에서 양적인 125I-요오도안티피린 (IAP) 기술을 사용하여 모델에서 분석한다. KPU-02 (15 mg/kg, IP)는 투여 1시간 후에 운반체의 23%에 대해 현저하고 선택적으로 종양 혈류를 감소시키고; 유지되는 혈류는 24시간 후에 현저하게 감소한다(59% 운반체). 반대로, 비종양 조직에서 혈류는 1시간 후에 훨씬 더 적은 정도로 영향을 받는다(도 35 참조).
24시간 후-용량 투여에서 혈류의 감소는 도 36에서 나타낸 바와 같이, 운반체에 비교하여 KPU-02에 대해 조직들 사이에 훨씬 더 다양하다. 종양에 대한 혈류가 가장 영향을 많이 받는다. 다른 조직은 혈류에서 작은 감소를 나타낸다. 골격 근육 혈류는 24시간 후-용량 투여에서 증가된 것으로 나타난다.
1 시간 후에 관찰되는 KPU-02의 효과는 동일한 기술을 사용한 CA4P에 대해 이전에 보고된 것보다 종양 혈류에 대해 더 오래 지속하고 더 선택적인 것으로 나타난다.
P22 래트 육종 모델로 한 실험에서, 도 37에 나타낸 바와 같이, KPU-02 7.5 및 15 mg/kg IP (투여용량 당 n=2)가 24시간 후-용량 투여로 용량 의존성 종양 괴사를 생성하고, 최고 용량은 종양에 대한 거의 대부분의 괴사를 초래한다. KPU-02로 처리된 래트에서 모든 종양은 괴사를 증명하는 반면, 운반체로 처리된 래트에서 종양은 그렇지 않다. 임상에 도입한 VTA(예를 들어, CA4P, ZD6126, AVE8062)는 IAP 방법(또는, 유사한 기술)을 사용하여 종양 혈액에 대한 유사한 질적인 효과를 나타내어, dce-MRI 기술을 사용하여 P22 래트 육종 종양 및 인간에서 감소된 혈류를 증명한다. 문헌 [Steven JP, Rosen M, Sun W, Gallagher M, Haller DG, Vaughn D, et al., "Phase I trial of the antivascular agent combretastatin A4 phosphate on a 5-day schedule to patients with cancer: magnetic resonance imaging evidence for altered tumor blood flow", J Clin Oncol 2003; 21(23):4428-38; Evelhoch JL, LoRusso PM, He Z, DelProposto Z, Polin L, Corbett TH, et al., "Magnetic resonance imaging measurements of the response of murine and human tumors to the vascular-targeting agent ZD6126," Clin Cancer Res 2004; 10(11):3650-7; 및 Gadgeel SM, LoRusso PM, Wozniak AJ, Wheeler C. "A dose-escalation study of the novel vascular-targeting agent, ZD 6126, in patient with solid tumors," Proc Am Soc Clin Oncol 2002;21: 요약서 438]를 참조; 이들 문헌 각각은 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다.
미세관 표적제로 조합 치료
VTA가 말초 부위에 대하여 종양의 중심 부위에 있는 혈관을 선택적으로 손상시킨다, 즉, 기능성을 회복시킨다는 사실의 발견은 이들 작용제를 화학요법제 (탁솔, 빈블라스틴 및 시스플라틴), 방사선 및 VEGF 및 EGF에 대항하여 작용하는 혈관신생 억제제와 조합하여 사용하는 것을 지지한다. 신규의 VTA는 이들 치료법를 대신하기 보다는 오히려 보충하고, 더 큰 항종양 활성을 제공해야 한다.
다른 병태의 치료
암에 추가하여, 다른 질병들을 본 명세서에 개시된 VTA를 사용하여 치료할 수 있다. 병태는 다른 종양, 망막증, 및 혈액공급, 바람직하게는 생존가능하고/하거나 증식가능하게 유지하기 위해서 신규의 혈관으로부터의 혈액 공급에 의존하는 다른 병태나 질환을 포함한다.
많은 병태들이 과도하거나 부적당한 혈관과 관련이 있다. 과도한 혈관과 관련이 있는 병태의 예들은 염증성 질환, 예를 들어 면역 및 비면역성 염증, 류마티 스 관절염, 만성 관절성 류마티즘 및 건선; 부적당하거나 부적기의 혈관 침투와 관련이 있는 질병, 예를 들어 당뇨성 망막증, 신생혈관 녹내장, 미숙아 망막증, 황반변성, 각막 이식 거부, 수정체후 섬유증식증, 홍채혈관신생, 동맥경화 프라그에서 모세혈관 증식 및 골다공증; 및 암 관련 질병, 예를 들어 고형암, 암전이, 혈액 유래 종양, 예를 들어 백혈병, 혈관섬유종, 카포시 육종, 악성 종양, 예를 들어 혈관종, 청신경초종, 신경섬유종, 트라코마 및 농성 육아종 뿐만 아니라, 종양 성장을 지지하는 혈관 생성을 요구하는 다른 암을 포함한다. 추가적인 혈관-의존성 질병의 예들은 예를 들어, 오슬러-웹버 신드롬(Osler-Webber Syndrome); 심근 혈관신생; 프라그(plaque) 혈관신생; 모세혈관 확장증; 혈우병 조인트(hemophiliac joint) 및 창상 육아 조직(wound granulation)을 포함한다. 게다가, 과도한 혈관은 또한 생물학적 및 기계적인 이식의 일부로 임상 문제와 관련이 있다 (조직/기관 이식, 스텐트 등). 상기 즉제의 화합물 및 조성물은 혈관을 표적화하기 위해서, 바람직하게는 비질병 조직 혈관에 대해 질병 혈관을 선택적으로 표적화하기 위해서 사용될 수 있고, 따라서 화합물 및 조성물은 상기 병태의 치료에 사용될 수 사용될 수 있다. 혈관신생이 역할을 하고, 상기 즉제의 화합물 및 조성물이 사용될 수 있는 다른 질병은 당업자에게 공지되어 있다.
망막증의 예들은 연령 관련 황반변성(ARMD), 당뇨성 망막증 등을 포함한다. 병리학적 혈관신생은 집합적으로 선진국에서 실명의 주요한 원인인 많은 망막증의 주요한 요인이다. 문헌 [Kahn andHiller Am J Ophthalmol (1974) 78, 58-67]은 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다. 예를 들어, 망막 및 디스크 혈관신생은 20년 이상 동안 당뇨성 망막증을 가진 환자의 30-50% 에게 발병한다. 문헌 [Yanko et al Retina (2003) 23, 518-522]은 전체적으로 참조로써 본 명세서에 포함된다. 게다가, 망막하 혈관신생은 황반변성을 가진 환자의 ~10%에게 심각한 합병증이다. 문헌 [Ferris et al Arch Ophthalmol (1984), 102, 1640-1642]은 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다.
콤브레타스타틴 A-4 (CA-4)와 같은 혈관 표적제를 비종양성 조직에서 신생혈관의 붕괴를 야기하는 것으로 나타낸다. 문헌 [Griggs et al Br J Cancer (2001) 84, 832-835]은 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다. 추가적으로, CA-4P는 증식성 망막증 동안 발병하는 망막의 혈관신생을 억제하는 것으로 나타난다. 문헌 [Griggs et al Am J Path (2002) 160, 1097-1103]는 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다. 최종적으로, CA-4P 포스페이트는 VEGF 유도된 망막의 혈관신생의 발달을 억제하고 맥락막의 혈관신생의 발달을 억제하고/하거나 부분적 억제를 야기하는 것이 입증된다. 문헌 [Nambu et al Invest Ophthalmology & Visual Sci (2003) 44, 3650-3655]은 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다. 본 명세서에 개시된 화합물을 망막증을 치료하기 위해서 사용할 수 있다. 예를 들어, 그리그(Griggs (2001 및 2002)) 및 남부(Nambu)의 방법을 망막증을 치료하기 위해 사용한다. 게다가, 본 명세서에 개시된 상기 화합물 및 조성물을 혈관 밀도 및/또는 혈관 증식을 감소시키기에 효과적인 용량으로 표적 부위에 상기의 망막증을 치료하기 위해 사용할 수 있다.
표 21. 인간 종양 이종이식 모델에서의 화학요법과 조합된 KPU-02의 효과
Figure 112006063575231-PCT00098
실시예 13
구조-활성 관계
tBu-데하이드로PLH의 페닐 고리 상에 다양한 변형으로부터 활성의 효과를 도 38의 데이터로 예시한다. 상대적으로 소수성이고 m- 또는 o- 위치에 더 작은 작용기를 가진 치환은 HT-29 세포에서 세포 독성의 활성을 증가시키거나 유지시키는 반면 p- 위치에 치환이 활성을 감소시킨 다는 것이 명백하다. 특정 이론에 종속되지는 않지만, 이 데이터는 튜불린에 의한 페닐 고리의 정확한 인식을 제시한다.
3D-QSAR (CoMFA) 분석 (도 39 참조)은 또한 m- 및 o- 위치에서 입체적으로 호의적인 영역의 존재를 지지하고 입체적으로 비호의적인 영역은 p- 위치에 존재한다. X-선 결정 분석 (도 40 참조)은 효능 있는 유도체의 배위가 DKP 및 이미다졸 고리에 의해 형성된 페닐 고리 및 의사-삼환계 코어(cor) 형판 사이에 일정량의 2면각을 요구한다는 것을 나타낸다. 따라서, 페닐 고리의 적당한 배위 제한을 가진 변형이 강력한 활성을 유도할 수 있다. 특정 이론에 종속되지는 않지만, 튜불린의 콜히친 결합 부위에서 PLH 유도체의 결합 모드는 콜히친 및 공지의 동족체의 것과 다를 수 있다.
실시예 14
미세관에서 시험관 내 활성
미세관 단백질 및 튜불린의 정제
미세관 단백질 (MTP)을 이전에 기재된 바와 같이 제조한다 (문헌 [Farrell KW and Wilson L. (1987) Tubulin-colchicine complexes differentially poison opposite microtubule ends. Biochemistry 23(16): 3741-8]은 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다). 70% 튜불린 및 30% 미세관-관련 단백질 (MAP)로 구성된 MTP 제조를 PEM100 (100 mM 1-4 피페라진디에탄설폰산 (Pipes), 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, pH 6.8) 및 1 mM GTP 중에 온 중합 및 냉 중합의 세번 순환으로 소 뇌 (bovine brain)로부터 분리한다. MTP를 액체 질소에서 적-결빙(drop-frozen)하고 - 70℃에서 사용시까지 저장한다. 튜불린을 포스포셀룰로오스 크로마토그래피 (PC-튜불린)로 미세관 단백질로부터 정제하고 PEM50 (50 mM Pipes, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, pH 6.8) 중에 저장한다. 단백질 농도를 상기 표준으로 소 혈청 알부민을 사용하여 브 래드포드 분석 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO)으로 측정한다(Bradford, 1976).
시험 작용제
KPU-02의 저장 용액을 DMSO 중에 20 mM의 농도로 제조한다. 콤브레타스타틴 A4 (CA4)의 저장 용액 (National Cancer Institute, Bethesda, MD)을 DMSO 중에 5 mM의 농도로 제조한다. 콜히친 (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) (CLC)을 수 중에서 3 mM의 농도로 제조한다. 모든 작용제를 호박 에펜도르프(Eppendorf) 튜브로 주변 광선으로부터 차단한다. 일련의 희석액을 DMSO 및/또는 PEM50 중에 목적하는 농도로 제조한다.
정상 상태 미세관 중합체 질량의 측정
MTP (2 mg/ml)를 1 mM GTP를 함유하는 PEM100 및 0.5% 최종의 DMSO 농도 중에 약물 농도 범위의 존재 하에서 미세관으로 중합한다. 샘플을 75 분 동안 37 ℃, 350 nm에서 확산하는 광선으로 모니터한다.
중합화 반응을 원심분리하고 상등액 중에 미세관 단백질 농도, 정상 상태에서 가용성 튜불린 및 고형분의 측정, 및 미세관 중합체의 측정을 중합의 억제를 계산하기 위해 사용한다. 배양 후에, 중합된 미세관을 원심분리 (150,000 x g, 45 분, 37 ℃)로 비중합화된 MTP로부터 분리하고 침전시킨다. 상등액을 제거하고 미세관 고형분을 탈이온화된 H2O (24 시간, 0 ℃)에서 탈중합하여,브래드포드 분석에 의 한 단백질을 측정한다.
퍼센트 억제를 두가지 방법으로 계산하고 두가지 방법으로부터 얻어진 값을 비교한다. 한가지 방법으로, 고형분에서 미세관 단백질의 비율, 비 약물에 대한 약물을 계산한다. 상등액에 대한 고형분에서 미세관 단백질의 다른 비율, 비 약물에 대한 약물을 계산한다. 상기의 수들은 근접하게 일치하고, 전자의 값은 적게 변화하고 실험적으로 덜 동요하므로 전자의 값을 사용한다.
미세관 평균 길이 분포
투과 전자 현미경을 시험할 작용제의 부재 또는 존재 하에서 미세관의 평균 길이 분포를 측정하기 위해 사용한다. 75 분 및 침전 전에, 중합체 질량 실험으로부터 10 μl 약수(aliquot)를 290 μl PEM100-완충 0.2% 글루타르알데하이드에 희석으로 고정한다. 고정된 샘플의 30 마이크로리터를 90초 동안 폼바 (formvar) 코팅된 150 ICG 그물 전저 현미경 격자 상에 정착시킨다. 과잉의 샘플을 와트만(Whatman) 여과지로 제거한다. 시토크롬 C (1 mg/ml)의 30 마이크로리터를 30 초 동안 적용하여 프로토필라멘트 분해능을 증진시키고 착색을 어렵게 한다. 우라닐 아세테이트 (1.5%)를 20초 동안 적용하고 과잉을 제거한다. 격자를 지올 (Jeol) 전자 현미경 -1200 EX11로 2000X 및 30,000X 배율에서 관찰한다. 제이스 (Zeiss) MOPIII를 미세관 길이 분포 및 샘플 당 최소한 100개의 미세관에 대한 평균 길이를 측정하기 위해 사용한다.
CLC 길항 분석
PC-튜불린 (0.2 mg/ml)을 1 mM GTP를 가진 PEM50, 1% DMSO, 실험할 작용제 10 μM 및 7-25 μM [3H] CLC 중에 120분 동안 37℃에서 배양한다. 상기에 기재된 바와 같이 (Wilson, 1970), DEAE-셀룰로오스 필터-결합 분석 후에 [3H] CLC 결합을 측정한다. 상기 방법은 DEAE-셀룰로오스로 주입된 여과지에 튜불린의 흡착에 의존한다. 와트만 DE81 여과지를 샘플 적용 전에 PEM50으로 미리 적신다. 전체 100 μl 반응 부피를 얼음 상에 파라필름 상에서, 여과지의 2.5 cm 디스크에 적용한다. 상기 종이 디스크를 PEM50의 5회 연속적인 50 ml 교환으로, 5 분/세척, 4℃에서 잠김으로 세척하여 모든 비결합된 콜히친을 제거한다. 흡착하는 튜불린-결합된 콜히친을 가진 상기 종이 디스크를 베크만 코울터 레디 단백질 (Beckman Coulter Ready Protein) 용액의 2 ml를 함유하는 신틸레이션(Scintillation) 바이알 중에서 직접 계산한다(Fullerton, CA). 모든 상기 디스크들을 함께 세정한다. 비결합 CLC의 상기 종이 디스크에 무시가능한 결합은 튜불린의 존재 또는 부재 중 하나 하에서 대조 군 중에 발생한다.
Ki 값을 마이크로소프트 엑셀에서 실험 데이터의 이중 역 플롯의 선형 회귀로 계산한다. 실험 조건에서 CLC에 대한 튜불린의 Km 값을 -1/Km에 동일한 x 절편으로 먼저 측정한다. Km app, 약물 존재 하에서 Km을 실험적으로 측정한다. Ki를 Km app=αKm 관계 및 길항적인 억제 α=Km(1+[I]/Ki)를 사용하여 측정한다.
형광 분광기
형광을 퍼킨-엘머 (Perkin-Elmer) LS50B 분광 형광계를 사용하여 측정한다. PC-튜불린 (0.2 mg/ml)를 0-30 μM KPU-02를 가진 PEM50, 2 mM GTP, 3% DMSO 중에 배양한다. 튜불린과 KPU-02의 상호작용을 395 nm의 여기 파장 및 487 nm의 방출 최대 파장으로, 4,4'-디아닐리노-1,1'-비나프틸-5,5'-디설폰산, 디포타슘 염 (비스-ANS; 분자 탐침자, Eugene, OR) 형광으로 측정한다. 여기 및 방출 대 통과는 10 nm이다. 본 실험을 두 번 수행한다.
비스-ANS 형광발색단은 단백질의 소수성 표면을 탐침하고 비스-ANS 형광 신호의 강도에 변화는 단백질의 용매 접근가능한 표면 영역 중에서 변화의 결과이다. 리간드 결합 상에서 튜불린-비스-ANS 상호작용을 변화시키는 몇가지 배위 변화가 있다면, 비스-ANS를 결합을 측정하기 위해 사용할 수 있다.
PC-튜불린 (0.2 mg/ml)를 20분 동안 25℃에서 0-30 μM KPU-02로 배양한다. 비스-ANS (25 μM)를 첨가하고, 샘플의 상대적인 형광 강도를 15분 동안 25℃에서 측정한다. 완충 블랭크(blank) 스펙트럼을 수집하고, 이는 비스-ANS와 함께 KPU-02는 실험적 파장의 범위에서 무시가능한 형광을 생산한다는 것을 나타낸다.
Kd를 시그마플롯 및 식 F=((-Fmax x L)/(Kd + L))+F0를 사용하는 마이크로소프트 엑셀에 실험 데이터를 적용함으로써 측정하고, 여기에서 F는 전체 리간드 농도 L의 존재 하에서 비스-ANS-튜불린의 형광 강도이고, Fmax는 완전히 리간드화된 튜불 린의 비스-ANS 형광 강도이고, F0는 약물의 부재 하에서 비스-ANS 형광이다. Fmax는 1/L에 대해 1/(F0-F)를 플롯하고 1/L=0으로 외삽하여 측정한다. KPU-02에 의해 차지된 결합 부위 B의 부분을 하기 관계를 사용하여 측정한다: B=(F0-F)/(F0-Fmax). 자유 리간드의 농도를 Lfree=L-B[C]로 측정하고, 여기에서 [C]는 튜불린 다이머(dimer) 당 단일 결합 부위를 가정할 때, 리간드-결합 부위의 몰 농도이다.
KPU -02에 의한 미세관 중합의 억제
KPU-02, CA4 및 CLC를 시험관 내의 세포-자유 시스템에서 고-MAP(MAP-rich) 튜불린 (MTP)(2 mg/ml)의 중합을 변경하는 능력에 대해 분석한다. 초기에, 중합의 억제를 포스포셀룰로오스-정제된, 미세관-관련된 비 단백질 튜불린를 사용해서 분석한다(데이터를 나타내지 않음). KPU-02는 튜불린과 함께 정제하는 MAP의 존재 하에서 회합된 MT에 비교하여 글리세롤 및 DMSO 시드와 회합되는 MT에 대한 더욱 강력한 억제제이다. 비록 안정화하는 MAP의 부재 하에서 미세관 중합체가 2시간의 기간 동안 정상 상태에 도달하지 못하지만, 이들 분석은 KPU-02가 정제된 튜불린과 직접적으로 상호작용하고 MAP를 통해서 일차 효과를 나타내지는 않는다는 것을 입증한다.
KPU-02 및 CA4는 확산하는 광선 (도 44) 및 침전 분석 (도 45)으로 측정된 바와 같이, CLC보다 더 강력하게 MT 중합을 억제한다. MTP (2 mg/ml)를 약물 농도 범위의 존재 하에서 미세관으로 중합화시키고 350 nm에서 확산하는 광선으로 모니 터한 바와 같이 정상 상태에 도달하게 한다. 도 41은 DMSO 약물 운반체 (◇), 1.25 μM (□), 2.5 μM (■) 및 5 μM (○) NPI-2358 (a), CA4 (b) 및 CLC (c)의 존재 하에서 미세관 단백질 중합의 탁도 스펙트럼을 나타낸다. KPU-02 및 CA4는 비교가능한 강도로 MT 중합을 억제한다. 도 45는 KPU-02 (○), CA4 (□), 및 콜히친 (◇) 농도 범위의 부재 또는 존재 하에서 미세관 중합의 억제를 나타낸다. 회합의 75분 후에 전체 중합체 질량을 침전으로 측정한다. 오차 막대는 세가지 실험으로부터 표준 편차 값이다. 중합화를 50% 억제하는 농도 (IC50)는 KPU-02에 대해 2.4±0.4 μM, CA4에 대해 2.2±0.3 μM 및 CLC에 대해 7.6±2.4 μM이다(표 22). (통계적 분석에 의해 얻어진 변수는 달리 언급하지 않는 한, 표준 편차 값으로 기록한다). 고-MAP 튜불린의 시험관 내 중합에 대한 IC50 에 대한 농도에서, KPU-02 및 CA4가 미세관 회합을 방지하기 위해 단백질을 격리한다는 것을 제시하면서, MTP는 집합 동태를 나타낸다.
표 22. 미세관 중합 억제 농도
화합물 중합체 질량 평균. IC50±sd(μM) n
KPU-02 2.4±0.4 4
CA4 2.2±0.3 3
CLC 7.6±2.4 3
도 44에 나타낸 바와 같이, 시험할 작용제의 세가지 모두는 1.25-5 μM에서 미세관 중합의 정도의 농도 의존성 억제를 나타낸다. 스펙트럼 가운데 주의할 두가지 중요한 차이가 있다. 첫째로, 시간에 대하 흡수의 초기 증가율은 약물 농도의 증가로 감소한다 (도 44A 및 44B). 스펙트럼은KPU-02 및 CA4의 존재 하에서 MT 형성에 대한 지체(lag) 기간이 존재한다는 것을 나타낸다. 가용성의 회합-가능한 튜불린 풀을 현저하고 신속하게 감소시키는 약물은 초기 중합율을 감소시킨다. 반대로, 초기 중합율은 CLC의 모든 농도에서 변화하지 않는다 (도 44C). 두 번째로, 시간과 함께 선형으로 증가하는 흡수값으로 나타낸 바와 같이, KPU-02 또는 CA4의 존재 하에서 MTP는 고 약물 농도 (5 μM 이상)에서 정상 상태에 도달하지 못한다 (도 44A 및 44B). 반대로, CLC의 존재 하에서 MTP는 고 약물 농도에서 정상 상태에 도달하지 않는다 (도 44C).
50% 중합을 억제하기 위해서 요구되는 약물 용량 (IC50)을 약물 농도의 증가와 원심분리에 의해 침전된 미세관 중합체의 감소 사이의 선형 관계의 분석으로부터 측정한다 (도 45). 도 45에서의 오차 막대는 적어도 세가지 이상의 각각의 실험으로부터 표준 편차 값을 나타낸다.
투과 전자 현미경으로 측정한 평균 미세관 길이의 감소
투과 전자 현미경을 정상 상태에서 형성된 중합체를 기재하고 확산하는 광선 스펙트럼으로부터 유도된 결론을 평가하기 위해서 작용제-미세관 중합 반응 상에서 수행한다. KPU-02, CA4 및 CLC 모두는 정상 상태에서 형성된 미세관의 길이를 감소시킨다. MT는 증가하는 약물 농도와 함께 점진적으로 더 짧아진다 (도 46, 47 및 48). 도 46는 (A) KPU-02, (B) CA4 및 (C) CLC의 존재 하에서 정상 상태에서 시험 관 내의 평균 미세관 길이의 빈도 히스토그램을 나타낸다. 제이스 MOPIII를 미세관 길이 분포 및 평균 길이를 측정하기 위해서 사용한다. 약물 농도 당 최소한 100 개의 미세관을 측정한다. 도 47은 시험 화합물의 부재 또는 존재 하에서 미세관를 기록하기 위해서 사용된 전자 현미경을 나타낸다. 75분에, 중합체 질량 실험으로부터의 샘플을 고정, 염색하고 2000배 배율에서 지올 전자 현미경-1200 EX11으로 관찰한다. 고-MAP 미세관의 대표적인 전자 마이크로그래프가 (A) KPU-02, (B) CA4 및 (C) CLC의 존재 하에서 정상 상태에서 시험관 내에서 형성된다. 규모 막대, 10 μM. 도 48은 KPU-02, CA4 및 콜히친의 존재 하에서 정상 상태에서 MT 길이 감소의 그래프 요약을 나타낸다. 검은색 막대, 1.25 μM, 및 음영 막대, 2.5 μM 약물. KPU-02 및 CA4의 존재 하에서, 탁도로 검출된 바와 같이 MTP가 회합 동태을 나타내고 MT가 관찰되지 않는 약물 농도까지, MT는 약물 농도가 증가할 때 점진적으로 더 짧아진다. 오차 막대는 최소 100 개의 미세관의 측정으로부터 표준 편차 값이다.
KPU-02, CA4 및 CLC는 MT 핵형성에 영향을 끼치지 않는다. 수많은 짧은 미세관은 KPU-02, CA4 및 CLC의 존재가 핵형성에 영향을 끼치지 않는다는 중합 반응 증거를 형성한다. 핵형성에 영향을 끼친다면, 수많은 짧은 미세관과 반대로 더 적고 더 긴 미세관이 대조군 샘플에 대해 약물 처리된 샘플에서 발견될 것이다.
KPU-02 및 CA4는 평균 MT 길이를 감소시키는데 비교적으로 효능이 있다. 전자 현미경으로 분석한 가장 적은 약물 농도, 1.25 μM에서, KPU-02 및 CA4은 약 70%로 평균 MT 길이를 감소시키고 40%로 CLC를 감소시킨다 (도 48). 시험관 내 미 세관 중합에 대한 IC50 이상 농도에서 미세관은 KPU-02 및 CA4에 대해 전자 현미경으로 관찰되지 않는다. 반대로, 미세관은 CLC 분석의 모든 농도에 대해 전자 현미경으로 관찰된다. IC50 이상 농도에서, KPU-2 및 CA4의 존재 하에서 미세관 단백질은 시간에 대해 광선 흡수의 선형 증가로 특징지워지는 회합 동태를 나타내는 반면(도 44A 및 44B), CLC의 존재 하에서, 광선을 확산시키는 중합체는 정상 상태에 도달한다 (도 44C). KPU-02 또는 CA4를 가진 MTP가 시간에 대해 350 nm에서 흡수를 증가시키는 관찰에도 불구하고, 약물-특이성 단백질 회합이 관찰되지 않는다.
형광 분광
튜불린 (0.2 mg/ml)을 PEM50 및 2 mM GTP 중에 25℃에서 20분 동안 KPU-02 농도의 범위로 배양한다. KPU-02는 농도-의존적 방법으로 비스-ANS 형광을 억제한다 (도 49A). 방출 최대에서 비스-ANS 형광 강도의 비선형 회귀 분석으로 측정된 바와 같이 KPU-02 및 튜불린에 대해, Kd=10±1.6 μM (표준 오차) (도 49B). 튜불린 다이머 당 KPU-02에 대한 단일 결합 부위를 가정하면서, 결합 데이터의 이중 역 플롯은 6.4 μM의 해리 상수를 산출한다. 비선형 및 선형 회귀 분석 방법으로 얻어진 두가지 다른 Kd 값은 충분히 근접하고 상기 값들은 거의 동등한 것으로 고려된다. 도 49A는 증가하는 KPU-02의 존재 하에서 튜불린의 형광 방출 스펙트럼을 나타낸다. 약물 결합은 비스-ANS 형광의 억제를 초래한다. 도 49B는 KPU-02에 대한 튜불린의 Kd, 10 μM, 표준 편차 1.6 μM를 얻기에 적합한 487 nm에서 형광 방출 최대 를 나타낸다. 나머지를 삽입한다. 도 49C는 1 몰 약물/몰 튜불린 다이머를 가정하는 결합 데이터의 이중 역 전환을 나타낸다.
CLC 결합의 길항적 억제
KPU-02 및 CA4는 튜불린에 결합하는 CLC를 길항적으로 억제한다. 도 50은 포스포셀룰로오스-정제된 튜불린 (0.2 mg/ml)을 10 μM KPU-02 (○) 또는 10 μM CA4 (□)의 존재 또는 부재 (◇) 하에서 [3H]CLC의 다양한 농도로 배양하는 억제 분석의 결과를 나타낸다. 튜불린-CLC Km은 11±4.4 μM이고, KPU-02 및 CA4의 억제 상수는 각각 3.2±1.7 μM 및 2.4±0.3 μM이다. 상수는 세가지 각각의 실험으로 계산한다. 콜히친-튜불린 결합 반응은 시간 및 온도 의존성이고 결합 해리 상수는 분석 조건에 따라서 Kd=0.1-1 μM이다(Wilson L and Meza I (1973). 콜히친의 작용 메카니즘. 성게 정자 꼬리 외부 이중 튜불린의 콜히친 결합 성질. 문헌 [Journal of Cell Biology 58(3):709-19]은 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다. 시험 조건 하에서, CLC에 대한 튜불린의 Km은 11±4.4 μM이다. Km은 CLC에 대한 튜불린의 전체 Kd로 고려될 수 있으나, CLC 결합의 시간-의존성 때문에, Km은 Kd에 대해 기록된 값 보다 더 크다. KPU-02 및 CA4에 대한 Ki는 각각 3.2±1.7 μM 및 2.4±0.3 μM이다. Ki는 50%로 CLC 결합을 억제하기 위해 요구되는 약물 용량으로 정의되고 튜불린에 결합되는 방사성 CLC의 용량에 기초한다. Ki는 CLC와 경쟁하는 약물 능력의 측정이고; 이것은 결합 친화력을 기록하는 방법 때문에 약물-튜불린 결합 해리의 직접적 측정이 아니다.
결과
분석된 CLC의 모든 농도에서, 고-MAP 튜불린은 정상 상태에 도달한다. 반대로, 더 높은 KPU-02 및 CA4 약물 농도에서, 고-MAP 튜불린은 정상 상태로 중합하지 않고, 미세관은 전자 현미경으로 관찰되지 않는다. KPU-02 및 CA4는 이용가능한 튜불린의 농도를 효과적으로 감소시킨다. 수용성 튜불린의 풀에서 상기 감소는 MT 임계 농도를 증가시키고 중합을 방해한다. 시험관 내 중합체 질량을 감소시키기 위해서 요구되는 KPU-02 및 CA4의 화학양론적 용량은 상기 농도 이상에서 정상 상태에 도달하지 않는다는 데이터와 연결되고, 수용성 튜불린이 결합되거나 중합으로부터 방해되는 격리 메카니즘에 의해 KPU-02 및 CA4가 행동한다는 것을 제안한다.
고-MAP 미세관이 시험 작용제의 존재 하에서 형성된다는 정상 상태에서 전자 현미경으로의 관찰은 KPU-02 및 CA4가 튜불린을 격리한다는 제시된 메카니즘과 일치한다. KPU-02, CA4 및 CLC의 존재 하에서 평균 미세관 길이의 농도-의존성 감소가 존재한다. KPU-02 및 CA4의 존재 하에서, 상기 약물이 연장에 이용 가능한 튜불린을 감소시킨다는 것을 지적하면서, 초기 중합 속도에서 약물 농도 의존성 감소가 존재한다. 초기 중합 속도에서 상기 감소는 튜불린과 느린 결합 때문에 CLC에서는 관찰되지 않는다. 게다가, 미세관은 중합에 대한 IC50 이상의 CLC 농도에서 형성되지만, 미세관은 중합화에 대한 IC50 이상의 KPU-02 및 CA4 농도에서 형성되지 않는다. 특정 이론에 종속되지 않지만, KPU-02 및 CA4에 결합된 수용성 튜불린의 농도는 튜불린 중합이 진행되기 위해 요구되는 임계 농도 하에 있어야 한다.
결합 연구는 튜불린이 CLC에 대해 가지는 것보다 KPU-02에 대해 더 낮은 친화도를 가지는 것을 나타낸다. KPU-02 및 CA4가 튜불린에 결합하는 CLC를 억제하는 것는 20분의 배양 기간 내에서 발생하고, 튜불린과 KPU-02 및 CA4의 결합이 CLC에 대한 것보다 상대적으로 더 신속하게 평형 상태에 도달한다는 것을 나타낸다.(데이터는 나타내어지지 않음). KPU-02는 CLC-결합 부위와 중복하는 부위에서 튜불린에 결합하는 CLC를 길항적으로 억제하고, 이것은 페닐아히스틴을 특징으로 하는 연구와 일치한다(할이미드) (문헌 [Kanoh K, Kohno S, Kataka J, Takahashi J 및 Uno I. (1990) (-)-Phenylahistin arrests cells in mitosis by inhibiting tubulin polymerization. the Journal of Antibiotics 52(2):134-141]은 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다). CA4, CLC의 구조적 동족체는 또한 CLC 결합을 길항적으로 억제한다. 특정 이론에 종속되지 않고, CLC와 튜불린 결합 부위를 공유함에도 불구하고, KPU-02 및 CA4는 튜불린과 상호작용하고 CLC와 구별되는 메카니즘으로 미세관을 억제하는 것 같다.
실시예 15
미세관의 생체 내 작용
세포 배양 연구
GFP-알파-튜불린(Clontech, Palo Alto, CA)으로 안정하게 감염된 MCF7 인간 유방 암 세포 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)를 5% CO2 중에 37℃에서 250ml 조직 배양 플라스크 또는 35mm 6-웰 플레이트 (배가 시간, 29 시간)에서 5% 소 태아 혈청, 0.1% 페니실린/스트렙토마이신 및 비필수 아미노산 (시그마)로 보충된 둘벡코(Dulbecco)의 변경된 이글(Eagle) 배지 중에서 배양한다. 세포를 KPU-02, CA4 또는 CLC로 배양하고, 원래의 배지를 시험 작용제 또는 DMSO 운반체의 요구되는 농도를 함유하는 배지의 동일한 부피로 교체함으로써, 실시예 14에서 기재된 바와 같이 제조하여, 배양을 20시간 동안 37℃에서 지속한다.
유사 분열 진행
주어진 약물 농도 (유사 분열 지표)에서 유사 분열 중인 세포의 분획을 유방암 세포 라인 MCF7에서 측정한다. 세포를 6-웰 플레이트에서 3 x 104 세포/ml의 밀도로 도말한다. 24시간 후에, 세포를 20시간 동안 농도 범위(1 nM 내지 1μM)에서 약물의 부재 또는 존재 하에서 배양한다. 배지를 회합하여 세포를 베르센(versene) (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1.5 mM KH2PO4, 8.1 mM Na2PO4, 및 0.5 mM EDTA)으로 세정, 트립신으로 분리하고, 배지로 환수하여, 부유하고 약하게 결합된 유사 분열 세포가 상기 분석에 포함되도록 한다. 세포를 PBS 중에 10% 포르말린으로 37℃에서 밤새 고정하고, 10분 동안 메탄올 중에 투과성화하고 4,6-디아미디노-페닐린돌(DAPI)로 염색하여 핵을 가시화한다. 염색된 세포를 벡터쉬일드(Vectashield) 봉입 배지 (Burlingame, CA) 중에 커버슬립 상에 도말하고 네일 폴리시로 슬라이드 상에 봉입한다. 형광 현미경을 사용하여 유사 분열 지표를 측정한다. 결과는 300 개의 세포를 각각의 농도에 대해 계산하는 4-7 실험의 평균 및 표준 편차이다. IC50는 20시간 후에 50%의 최대 유사 분열 축적을 실험적으로 유도하는 약물 농도이다.
면역 형광 현미경
세포를 폴리-L-리신 (50 μg/ml, 시그마) 처리된 커버슬립 상에 시딩하는 것을 제외하고, 세포를 유사 분열 진행을 위한 것으로 제조한다. 염색한 당일 날에, 세포를 PBS 중에 세정하고 37℃에서 밤새 10% 포르말린 중에 고정한다. 세포를 PBS 중에 세정하고, -20℃에서 메탄올 중에 투과성화하고, PBS로 수화한다. 커버슬립을 1 시간 동안 실온에서 PBS/BSA (1%) 중에 20% 정상 염소 혈청으로 처리한다. 세포를 실온에서 1시간 동안 PBS/BSA 중에 희석된 DM1A/DM1B, 항-알파- 및 베타-튜불린의 마우스 단일 클론 칵테일 중에 배양한 후, FITC-결합된 2차 항체 및 DAPI로 염색한다. 커버슬립을 프로롱 안티페이드(Prolong antifade) 배지를 사용하여 봉합한다(분자 탐침자, Eugene OR).
미세관 동태 분석을 위한 세포 제조
세포 도말을 증진시키기 위해 2시간 동안 폴리-L-리신 (50 μg/ml, 시그마)로 예비처리하고, 1시간 동안 37℃에서 라미닌 및 피브로넥틴 (10 μg/ml, 시그마)로 처리한 유리 커버슬립 상에 세포를 시딩하는 것을 제외하고, 세포를 유사 분열 진행을 위한 것으로 제조한다. 세포를 20시간 동안 약물 또는 DMSO로 배양하고, 혈청을 결핍시킨다. 분석 전에, 커버슬립을 기록 배지로 이동시킨다 (배양 배지는 25 mM HEPES로 완충된 중탄산 나트륨 및 페놀 레드가 부족하고 자당 3.5 g/L으로 보충된다). 광표백을 예방하기 위해서, 옥시라제(Oxyrase) (30 μl/ml, Oxyrase Inc., Mansfield, OH)를 기록 배지에 첨가한 후, 이중 커버슬립으로 둘러쌓인 소실 중에 세포를 즉시 봉합한다.
시간-경과 현미경 및 이미지 포착
미세관을 플랜 색수차 1.4 N.A. x 100 대물 렌즈를 가진 니콘 이클립스 (Nikon Eclipse) E800 형광 현미경을 사용하여 관찰한다. 상기 단(stage)을 피렉스(Pyrex) 상자 안에 넣어 강제된 공기 난방 시스템으로 36 ± 1℃로 유지시킨다. 각각의 세포의 30개 이미지를 메타모르프(Metamorph) 소프트웨어(Universal Imaging, Media, PA)로 조작되는 포토메트릭스 (Photometrics) CoolSNAP HQ 디지털 카메라(Tucson, AZ)를 사용하여 10 MHz에서 300 ms 노출 시간으로, 2개의 게인(gain), 및 2 x 2 빈닝(binning)으로 4-s 간격으로 얻는다.
미세관 동태의 분석
시간에 대한 미세관의 플러스 말단의 위치를 마이크로소프트 엑셀로 정보 전달하는 메타모르프 트랙 포인트(Metamorph Track Points) 적용을 사용하여 기록하고, 리얼 타임 측정(Real Time Measurement) 소프트웨어를 사용하여 분석한다. 각각의 미세관의 길이를 시간 함수로 그래프화한다. 각각의 성장 및 단축 속도를 선형 회기로 측정하다. 두 점 사이에 ≥ 0.5 μm 의 변화는 성장 및 단축의 현상이 일어난 것으로 고려되고, 두 점 사이에 < 0.5 μm의 변화는 감쇠된 동태기 및 정지기로 고려된다. 최소한 25개의 미세관을 각각의 조건에서 분석한다. 결과는 최소한 세 개의 각각의 실험의 평균 및 표준 편차이다.
각각의 미세관에 대해 시간에 기초한 종말 빈도를 미세관 당 종말의 수를 성장 및 감쇠에 소비된 시간으로 나누어 계산한다. 미세관 당 시간에 기초한 구조(rescue) 빈도는 미세관 당 구조의 전체 수를 단축에 소비된 시간으로 나누어 계산한다. 거리에 기초한 종말 및 구조 빈도를 전이 수를 각각 성장 또는 단축된 길이로 나누어 유사하게 계산한다. ≤ 2분 동안 볼 수 있는 미세관을 빈도 분석에 포함한다. 미세관 당 동태를 미세관의 전체 라이프 기간으로 나누어진 성장 및 단축된 길이로 계산한다. ≥ 0.3분 동안 볼 수 있는 미세관을 동태 분석에 포함한다.
전중기에 차단된 세포 주기 진행
세포가 유사 분열 중에 축적하는 KPU-02, CA4 및 CLC에 대한 농도 범위를 측정한다. 빈카(vinca) 알칼로이드 및 2-메톡시에스트라디올과 같은 MT 탈중합제 및 탁솔, 에포틸론(epothilone) B 및 디스코데르몰리드(discodermolide)와 같은 MT 안 정화제에 대한 연구에서, 중기에 세포의 30-40%인 것에 비교하여, 20시간 후에, 세포의 60-70%가 전중기에서 억제된다(문헌[Jordan MA (2002) Mechnism of action of antitumor drugs that interact with microtubules and tubulin. Current Medicinal Chemistry - Anti-Cancer Agents 2: 1-17]은 전체로 참조로 본 명세서에 인용된다). 50% 최대 유사 분열 차단에 필요한 약물 농도(IC50)를 1nM 및 1 μM 약물 사이에서 평가한다(도 51). 도 51은 KPU-02, CA4 및 CLC에 의한 유사 분열 진행 억제에 대한 log[약물] 반응 곡선을 나타낸다. MCF7 세포를 NPI-2358 (○), CA4 (□) 및 콜히친 (◇)의 존재 하에서 배양한다. 유사 분열 지표를 평가하기 위해서, MCF7 세포를 6-웰 플레이트 중에 3 x 104 세포/ml의 밀도로 도말한다. 24시간 후에, 세포를 20시간 동안 농도 범위 (1 nM 내지 1 μM)에서 약물의 부재 또는 존재 하에서 배양한다. 세포를 고정하고 DAPI로 염색하여 핵을 가시화한다. 형광 현미경을 사용하여 유사 분열 지표를 측정한다. 결과는 300개의 세포를 각각의 약물 농도에 대해 계산하는 3 또는 4 번의 실험의 평균 및 표준 편차이다. KPU-02에 대한 유사 분열 억제 IC50는 17.4 ± 1.2 nM, CA에 대해서는 5.4 ± 0.7 nM 및 CLC에 대해서는 23.8 ± 3.1 nM 이다(표 23).
표 23. 유사 분열 진행의 억제
화합물 유사 분열 억제 평균 IC50 ± sd (nM) n
KPU-02 17.4 ± 1.2 4
CA4 5.4 ± 0.7 3
CLC 23.8 ± 3.1 4
대부분의 MT-표적 작용제는 중기에서 후기로 전이에서 유사 분열을 억제한다. 중기에서 후기로 전이에서 유사 분열 억제는 MT 동태의 억제와 관련이 있다. 특정 이론에 종속하지 않고, MT 중합체의 고갈과 함께, 더 이른 전중기 억제는 저 농도에서 MT 동태를 안정화하는 다른 MT 탈중합화 약물, 예를 들어 빈블라스틴과 비교하여, KPU-02에 대해 구별되는 작용 메카니즘을 제시한다.
유사 분열 방추사 및 간기 배열 MT 의 탈중합
KPU-02, CA4 및 CLC를 MCF7 세포에서 효능 있는 미세관 탈중합화제인 것으로 관찰한다. 비록 유사 분열 방추사 미세관이 간기 배열 미세관보다 탈중합 및/또는 중합의 억제에 더 민감하지만, 양쪽의 미세관 개체군이 영향을 받는다 (도 52). 도 52는 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다. 간기 배열은 유사 분열 방추사 보다 KPU-02, CA4 및 CLC에 의한 탈중합에 상대적으로 더 안정하다. 세포를 유사 분열 진행을 위한 것으로 준비 및 접종하고, 20시간 동안 각각의 약물에 대한 유사 분열 억제 IC50으로 처리한다. 세포를 DM1A/DM1B, 항-알파- 및 베타-튜불린의 마우스 단일클론 칵테일 중에 배양한 후, FITC-결합된 이차 항체 및 DAPI로 염색한다. a-d, 대조군 (a), KPU-02 (b), CA4 (c) 및 CLC (d) 처리된 세포 중의 튜불린, 및 e-h, 대조군 (e), KPU-2 (f), CA4 (g) 및 CLC (h) 처리된 세포 중에 DNA . 얇은 화살은 유사 분열 방추사 중합체 및 유사 분열 염색체를 나타내고, 두꺼운 화살은 간기 배열 및 핵을 나타낸다.
유사 분열 억제에 대한 IC25에서, KPU-02는 방추사 형태를 극적으로 변경시킨다. 도 53A-C는 20시간 동안 KPU-02 (A), CA4 (B) 및 CLC (C)로 처리된 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다. 1-4, 대조군 (1), 유사 분열 억제에 대한 IC25의 농도 (2), 유사 분열 억제에 대한 IC50 (3), 및 유사 분열 억제에 대한 IC50 2배 (4) 중에 알파 및 베타 튜불린 ; 5-8, 인접하는 패널에 대한 DNA의 대응하는 이미지. KPU-02 또는 CA4d 대한 IC25에서 정상의 이극성 방추사는 존재하지 않는다 (도 53A 및 B). 화합물 처리된 세포는 비회합된 염색체를 가진 단극성 또는 이극성 방추사를 가진다. 반대로, 정상의 이극성 방추사는 CLC에 대한 IC25에서 지속한다 (도 53C). KPU-02에 대한 IC50에서, 유사 분열 세포의 75%는 튜불린의 성상체 및 포커스를 포함하고 잔존하는 세포는 검출가능한 유사 분열 중합체를 가지지 않는다. CLC의 존재 하에서, 세포들의 반은 회합되지 않은 염색체를 가진 이극성이고 잔존하는 반을 단극성이다. 유사 분열 억제에 대한 IC50의 두배 농도에서, KPU-02, CA4 또는 CLC로 처리된 유사 분열 세포 중에 검출가능한 MT 중합체는 거의 없다.
미세관 간기 배열은 시험된 화합물 전체에 대해 유사 분열 방추사보다 탈중합화에 더 저항적이다 (도 52). 그러나, 중합체의 질적인 감소는 모든 세가지 화합물에 대해 용량 의존적 방법으로 관찰된다 (도 54 A-C). 도 54A-C는 20시간 동안 KPU-02 (a), CA4 (b) 및 CLC (c)로 처리된 MCF7 세포의 면역형광 현미경 이미지를 나타낸다. 증가하는 약물 농도와 함께 간기 MT 탈중합. 1-4, 대조군(1), 유사 분열 억제에 대한 IC25의 농도 (2), 유사 분열 억제에 대한 IC50 (3) 및 유사 분열 억제에 대한 IC50 2 배 (4) 에서 알파 및 베타 튜불린; 5-8, 인접하는 패널에 대한 DNA의 대응하는 이미지. 예상가능하게, 고-MAP 튜불린을 시험관 내에 중합체 질량 분석에서 격리하는 것과 같이, 세포내 안정화하는 MAP의 존재에도 불구하고, 튜불린은 이들 간기 세포 중에 격리된다.
살아있는 MCF7 세포 중에 MT 동태 비안정성의 조정 또는 억제의 결핍
KPU-02 뿐만 아니라 CA4는 MCF7 세포에서 최대 유사분열 억제의 25% (표 24) 또는 50% (표 25)의 효과를 나타내는 농도에서 MT 동태 비안정성에 대해 측정가능한 효과를 가지지 않는다. 특정 이론에 종속되지 않고, 이들 데이터는 KPU-02의 항증식성 작용 메카니즘이 미세관 동태의 억제라기 보다는 차라리, MT 중합의 억제에 일차적으로 기인하는 것을 제시한다.
표 24. 유사 분열 억제에서 MT 동태 비안정성
Figure 112006063575231-PCT00099
표 25. 유사 분열 억제에서 MT 동태 비안정성
Figure 112006063575231-PCT00100
상기에 기재된 실시예들을 단지 발명의 이해를 돕기 위해서 나타낸다. 따라서, 당업자는 개시된 방법 및 화합물이 데하이드로페닐아히스틴의 다른 유도체를 포함하고 그렇지 않으면 제공할 수 있다고 평가한다.
당업자는 본 발명을 예를 들어 상기에 언급된 장점 및 결과 뿐만 아니라, 고유의 다른 것들을 얻기 위해서 잘 적응시킬 수 있다고 손쉽게 평가할 것이다. 본 명세서에 개시된 방법 및 과정들은 현재의 바람직한 실시태양의 표본들이고, 예시적이며, 본 발명의 범위의 제한으로 의도되지 않는다. 이들의 변화 및 다른 용도들은 본 발명의 의도 내에서 포함되어 당업자에게 발생할 것이다.
다양한 치환과 변경이 본 발명의 범위 및 의도로부터 이탈되지 않고 본 명세서에 개시된 발명에 대해 수행될 수 있음은 당업자들에게 쉽게 자명할 것이다.
상기 나타낸 바와 같이, 상기 명세서에 언급된 모든 특허 및 공보들은 본 발명이 속하는 분야의 숙련가들의 수준을 나타낸다. 모든 특허 및 공보들은 법이 허용하는 정도로 본 명세서에 참고로 인용되어 있으며, 따라서 각각의 개별적인 특허 및 공보가 참고로 인용되는 것으로 구체적이고 개별적으로 나타내어지는 것으로 다루어 질 수 있다.
본 명세서에 적합하게 예시적으로 개시된 본 발명을 본 명세서에서 구체적으로 개시하지 않은 임의의 요소 또는 요소들, 제한 또는 제한들의 부재 하에서 실행할 수 있다. 사용된 용어 및 표현들은 설명하기 위한 것이지 제한으로서 사용되는 것은 아니며, 상기와 같은 용어 및 표현의 사용에서 나타내어지고 개시된 특징들의 균등물 또는 그의 일부를 제외시킬 의도는 없다. 다양한 변경들이 본 발명의 범위 내에서 가능함을 알 것이다. 따라서, 본 발명을 바람직한 실시태양 및 임의의 특징에 의해 구체적으로 개시하지만, 본 명세서에 개시된 개념의 변경 및 변화를 당업자들이 복원할 수 있으며 상기와 같은 변경 및 변화를 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 간주하는 것으로 이해된다.

Claims (41)

  1. 화합물이 혈관 붕괴를 유도하는, 하기 화학식 I의 구조를 가지는 화합물:
    [화학식 I]
    Figure 112006063575231-PCT00101
    [상기 식에서,
    R1, R4 및 R6은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
    R1' 및 R1"는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
    R, R1' 및 R1"는 서로 공유 결합되거나 또는 서로 공유 결합되지 않고;
    R2, R3 및 R5는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C12 알킬, 불포화된 C1-C12 알케닐, 아실, 사이클로알킬, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로 및 치환된 니트로기, 설포닐 및 치환된 설포닐기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고;
    X1 및 X2는 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 각각은 상기에 정의된 바와 같은 R5 기로 치환되거나 치환되지 않고;
    Y는 질소 원자, R5로 치환된 질소 원자, 산소 원자, 황 원자, 산화된 황 원자, 메틸렌기 및 치환된 메틸렌기로 구성된 군에서 선택되고;
    n은 0, 1 또는 2의 정수이고;
    n이 0이 아닌 경우 각각 별개의 n에 대해 Z, 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4 는 탄소 원자, 황 원자, 질소 원자 또는 산소 원자에서 각각 독립적으로 선택되고;
    점선 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있음].
  2. 제 1 항에 있어서, 첫 번째 알데히드가 이미다졸카르복스알데히드인 화합물.
  3. 제 1 항에 있어서, 두 번째 알데히드가 벤즈알데히드인 화합물.
  4. 제 1 항에 있어서, R2, R3, R5 및 R6이 각각 수소 원자인 화합물.
  5. 제 1 항에 있어서, X1 및 X2가 각각 산소 원자인 화합물.
  6. 제 1 항에 있어서, R4가 포화된 C1-C12 알킬인 화합물.
  7. 제 6 항에 있어서, 포화된 C1-C12 알킬이 3급 부틸기인 화합물.
  8. 제 1 항에 있어서, R1이 치환된 페닐을 포함하는 화합물.
  9. 제 8 항에 있어서, 치환된 페닐기가 메톡시벤젠인 화합물.
  10. 제 1 항에 있어서,첫 번째 알데히드가 벤즈알데히드인 화합물.
  11. 제 1 항에 있어서, 두 번째 알데히드가 이미다졸카르복스알데히드인 화합물.
  12. 제 1 항에 있어서, n이 0 또는 1인 화합물.
  13. 제 1 항에 있어서, n이 1인 화합물.
  14. 제 1 항에 있어서, n이 1이고, Z, Z1, Z2, Z3 및 Z4가 각각 탄소 원자인 화합물.
  15. 제 1 항의 화합물을 혈관 밀도를 감소시키는데 효과적인 용량으로 또는 혈관 증식을 감소시키는데 효과적인 용량으로 동물에 투여하는 것을 포함하는 동물의 병태를 치료하는 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 병태가 면역 및 비면역 염증, 류마티스 관절염, 만성 관절류마티즘, 건선, 당뇨성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 미숙아 망막증, 황반변성, 각막 이식 거부, 후수정체 섬유증식증, 홍채혈관신생, 동맥경화 프라그에서 모세혈관 증식 및 골다공증으로 구성된 군에서 선택되는 방법.
  17. 제 15 항에 있어서, 병태가 종양성 병태인 방법.
  18. 제 17 항에 있어서, 종양성 병태가 암인 방법.
  19. 제 15 항에 있어서, 병태가 암이 아닌 방법.
  20. 제 15 항 또는 제 16 항에 있어서, 병태가 망막증인 방법.
  21. 제 20 항에 있어서, 망막증이 당뇨성 망막증인 방법.
  22. 제 20 항에 있어서, 망막증이 연령 관련 황반변성인 방법.
  23. 제 15 항에 있어서, 동물이 인간인 방법.
  24. 제 15 항에 있어서, 화합물이 KPU-02인 방법.
  25. 제 15 항에 있어서, 병태가 과혈관화와 관련된 병태인 방법.
  26. 화합물의 치료학적으로 효과적인 용량은 혈관에서 튜불린 탈중합을 일으키고 화합물이 하기 화학식의 구조를 가지는 것으로, 화학식 I의 화합물의 치료학적으로 효과적인 용량으로 동물을 치료하는 것을 포함하는, 동물에서 혈관 붕괴를 유도하는 방법:
    [화학식 I]
    Figure 112006063575231-PCT00102
    [상기 식에서,
    R1, R4 및 R6은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1- C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
    R1' 및 R1"는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치 환된 페닐기에서 선택되고;
    R, R1' 및 R1"는 서로 공유 결합되거나 또는 서로 공유 결합되지 않고;
    R2, R3 및 R5는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C12 알킬, 불포화된 C1-C12 알케닐, 아실, 사이클로알킬, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로 및 치환된 니트로기, 설포닐 및 치환된 설포닐기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고;
    X1 및 X2는 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 각각은 상기에 정의된 바와 같은 R5 기로 치환되거나 치환되지 않고;
    Y는 질소 원자, R5로 치환된 질소 원자, 산소 원자, 황 원자, 산화된 황 원자, 메틸렌기 및 치환된 메틸렌기로 구성된 군에서 선택되고;
    n은 0, 1 또는 2의 정수이고;
    n이 0이 아닌 경우 각각 별개의 n에 대해 Z, 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4 는 탄소 원자, 황 원자, 질소 원자 또는 산소 원자에서 각각 독립적으로 선택되고;
    점선 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있음].
  27. 제 26 항에 있어서, 동물이 인간인 방법.
  28. 제 26 항에 있어서, 인간이 종양, 당뇨성 망막증 및 연령 관련 황반변성으로 구성되는 군에서 선택되는 질병을 가지는 방법.
  29. 제 26 항에 있어서, 질병이 암이 아닌 방법.
  30. 제 26 항에 있어서, 화합물이 KPU-02인 방법.
  31. 약제학적으로 허용가능한 운반체와 함께 제 1 항의 화합물의 약제학적으로 효과적인 용량을 포함하는 혈관 증식을 예방하거나 치료하기 위한 약제학적 조성물.
  32. 제 31 항에 있어서, 혈관 증식이 암, 연령 관련 황반변성 및 당뇨성 망막증에서 선택되는 질병의 증상인 조성물.
  33. 화학식 I의 구조를 가지는 화합물을 동물에 투여하는 것을 포함하는, 비종양 조직 혈관에 대해 종양 혈관을 선택적으로 표적화하는 방법:
    [상기 식에서,
    R1, R4 및 R6은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
    R1' 및 R1"는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
    R, R1' 및 R1"는 서로 공유 결합되거나 또는 서로 공유 결합되지 않고;
    R2, R3 및 R5는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C12 알킬, 불포화된 C1-C12 알케닐, 아실, 사이클로알킬, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로 및 치환된 니트로기, 설포닐 및 치환된 설포닐기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고;
    X1 및 X2는 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 각각은 상기에 정의된 바와 같은 R5 기로 치환되거나 치환되지 않고;
    Y는 질소 원자, R5로 치환된 질소 원자, 산소 원자, 황 원자, 산화된 황 원자, 메틸렌기 및 치환된 메틸렌기로 구성된 군에서 선택되고;
    n은 0, 1 또는 2의 정수이고;
    n이 0이 아닌 경우 각각 별개의 n에 대해 Z, 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4 는 탄소 원자, 황 원자, 질소 원자 또는 산소 원자에서 각각 독립적으로 선택되고;
    점선 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있음].
  34. 제 33 항에 있어서, 비종양 조직이 피부, 근육, 뇌, 신장, 심장, 비장 및 장관으로 구성되는 군에서 선택되는 방법.
  35. 제 33 항에 있어서, 종양 혈관이 약 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 및 90%로 비종양 조직 혈관에 대해 선택적으로 표적화되는 방법.
  36. 제 33 항에 있어서, 동물이 인간인 방법.
  37. 비종양 조직 혈관에 대해 종양 혈관을 선택적으로 표적화하는 작용제를 동물에 투여하는 것을 포함하는, 비종양 조직 혈관에 대해 종양 혈관을 선택적으로 표적화하는 방법.
  38. 혈관에 의존하거나 증가된 혈관과 관련된 질병의 치료을 위한 약물의 제조에서 화학식 I의 구조를 가지는 화합물의 용도:
    [상기 식에서,
    R1, R4 및 R6은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
    R1' 및 R1"는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기, 하이드록시, 카르복시, -CO-O-R7, 시아노, 알킬티오, 폴리할로겐화된 알킬을 포함하는 할로겐화된 알킬, 할로겐화된 카르보닐 및 카르보닐-CCO-R7로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고, 이때 R7은 수소 원 자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C24 알킬, 불포화된 C1-C24 알케닐, 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로, 아지도, 치환된 니트로, 페닐 및 치환된 페닐기에서 선택되고;
    R, R1' 및 R1"는 서로 공유 결합되거나 또는 서로 공유 결합되지 않고;
    R2, R3 및 R5는 수소 원자, 할로겐 원자 및 포화된 C1-C12 알킬, 불포화된 C1-C12 알케닐, 아실, 사이클로알킬, 알콕시, 사이클로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아미노, 치환된 아미노, 니트로 및 치환된 니트로기, 설포닐 및 치환된 설포닐기로 구성된 군에서 각각 독립적으로 선택되고;
    X1 및 X2는 산소 원자, 질소 원자 및 황 원자로 구성된 군에서 독립적으로 선택되고, 각각은 상기에 정의된 바와 같은 R5 기로 치환되거나 치환되지 않고;
    Y는 질소 원자, R5로 치환된 질소 원자, 산소 원자, 황 원자, 산화된 황 원자, 메틸렌기 및 치환된 메틸렌기로 구성된 군에서 선택되고;
    n은 0, 1 또는 2의 정수이고;
    n이 0이 아닌 경우 각각 별개의 n에 대해 Z, 및 Z1, Z2, Z3 및 Z4 는 탄소 원자, 황 원자, 질소 원자 또는 산소 원자에서 각각 독립적으로 선택되고;
    점선 결합은 단일 결합 또는 이중 결합일 수 있음].
  39. 제 38 항에 있어서, 병태가 암인 용도.
  40. 제 38 항에 있어서, 병태가 암이 아닌 용도.
  41. 제 38 항에 있어서, 병태가 면역 및 비면역 염증, 류마티스 관절염, 만성 관절류마티즘, 건선, 당뇨성 망막증, 신생혈관성 녹내장, 미숙아 망막증, 황반변성, 각막 이식 거부, 후수정체 섬유증식증, 홍채혈관신생, 동맥경화 프라그에서 모세혈관 증식 및 골다공증으로 구성된 군에서 선택되는 용도.
KR1020067017883A 2004-02-04 2005-02-04 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체, 및 이들의합성방법 KR101228104B1 (ko)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US54207304P 2004-02-04 2004-02-04
US60/542,073 2004-02-04
US62426204P 2004-11-01 2004-11-01
US60/624,262 2004-11-01
PCT/US2005/003636 WO2005077940A1 (en) 2004-02-04 2005-02-04 Dehydrophenylahistins and analogs thereof and the synthesis of dehydrophenylahistins and analogs thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20060124743A true KR20060124743A (ko) 2006-12-05
KR101228104B1 KR101228104B1 (ko) 2013-02-01

Family

ID=34864489

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020067017883A KR101228104B1 (ko) 2004-02-04 2005-02-04 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체, 및 이들의합성방법

Country Status (9)

Country Link
EP (1) EP1711487A1 (ko)
JP (1) JP2007520565A (ko)
KR (1) KR101228104B1 (ko)
AU (1) AU2005212399B2 (ko)
BR (1) BRPI0506655A (ko)
CA (1) CA2553630A1 (ko)
IL (1) IL176932A0 (ko)
NZ (1) NZ548659A (ko)
WO (1) WO2005077940A1 (ko)

Families Citing this family (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7919497B2 (en) 2002-08-02 2011-04-05 Nereus Pharmaceuticals, Inc. Analogs of dehydrophenylahistins and their therapeutic use
CN100540548C (zh) 2002-08-02 2009-09-16 尼瑞斯药品公司 脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物以及脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物的合成
US7935704B2 (en) 2003-08-01 2011-05-03 Nereus Pharmaceuticals, Inc. Dehydrophenylahistins and analogs thereof and the synthesis of dehydrophenylahistins and analogs thereof
WO2007035841A1 (en) * 2005-09-21 2007-03-29 Nereus Pharmaceuticals, Inc. Analogs of dehydrophenylahistins and their therapeutic use
US8129527B2 (en) 2006-11-03 2012-03-06 Nereus Pharmacuticals, Inc. Analogs of dehydrophenylahistins and their therapeutic use
MY185650A (en) * 2013-10-11 2021-05-27 Beyondspring Inc Cancer treatment with combinantion of plinabulin and taxane
MY193968A (en) * 2015-02-12 2022-11-03 Beyondspring Pharmaceuticals Inc Use of plinabulin in combination with immune checkpoint inhibitors
MX2017011375A (es) * 2015-03-06 2018-01-23 Beyondspring Pharmaceuticals Inc Método para tratar un tumor cerebral.
KR102626155B1 (ko) 2015-03-06 2024-01-17 비욘드스프링 파마수티컬스, 인코포레이티드. Ras 돌연변이와 관련된 암의 치료 방법
EP4011878A1 (en) 2015-07-13 2022-06-15 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Plinabulin compositions
CA3013467A1 (en) 2016-02-08 2017-08-17 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Compositions containing tucaresol or its analogs
KR20230018545A (ko) 2016-06-06 2023-02-07 비욘드스프링 파마수티컬스, 인코포레이티드. 호중구감소증을 줄이는 조성물 및 방법
WO2018028420A1 (zh) * 2016-08-12 2018-02-15 青岛海洋生物医药研究院股份有限公司 脱氢苯基阿夕斯丁类化合物的多晶型及其制备纯化方法和应用
JP2020503363A (ja) 2017-01-06 2020-01-30 ビヨンドスプリング ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド チューブリン結合化合物およびその治療的使用
KR20190109479A (ko) 2017-02-01 2019-09-25 비욘드스프링 파마수티컬스, 인코포레이티드. 호중구감소증의 감소 방법
CN110603037A (zh) * 2017-03-13 2019-12-20 大连万春布林医药有限公司 普那布林的组合物及其用途
JP7350015B2 (ja) 2018-01-24 2023-09-25 ビヨンドスプリング ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド プリナブリンの投与による血小板減少症を軽減するための組成物および方法
CN108524442B (zh) * 2018-06-05 2022-01-28 深圳海王医药科技研究院有限公司 一种抗肿瘤药物的注射剂及其制备方法
JP2018199726A (ja) * 2018-09-26 2018-12-20 ビヨンドスプリング インコーポレイテッド プリナブリン及びタキサンの組合せがん治療
CA3234699A1 (en) * 2021-10-07 2023-04-13 Beyondspring Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancers and tumors

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3318789A1 (de) * 1983-05-24 1984-11-29 Eduard Gerlach GmbH Chemische Fabrik, 4990 Lübbecke Deodorant
GB9402807D0 (en) * 1994-02-14 1994-04-06 Xenova Ltd Pharmaceutical compounds
US6069146A (en) * 1998-03-25 2000-05-30 The Regents Of The University Of California Halimide, a cytotoxic marine natural product, and derivatives thereof
US6358957B1 (en) * 1998-11-12 2002-03-19 Nereus Pharmaceuticals, Inc. Phenylahistin and the phenylahistin analogs, a new class of anti-tumor compounds
MXPA02006826A (es) * 2000-01-18 2004-04-05 Nereus Phamraceuticals Inc Un inhibidor de division celular y un metodo de produccion del mismo.
CZ301743B6 (cs) * 2000-05-09 2010-06-09 Angiorx Corporation Piperazindionové slouceniny a protinádorové využití
CN100540548C (zh) * 2002-08-02 2009-09-16 尼瑞斯药品公司 脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物以及脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物的合成

Also Published As

Publication number Publication date
KR101228104B1 (ko) 2013-02-01
IL176932A0 (en) 2006-12-10
AU2005212399B2 (en) 2011-09-22
WO2005077940A1 (en) 2005-08-25
AU2005212399A1 (en) 2005-08-25
BRPI0506655A (pt) 2007-05-08
EP1711487A1 (en) 2006-10-18
JP2007520565A (ja) 2007-07-26
NZ548659A (en) 2011-01-28
CA2553630A1 (en) 2005-08-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101228104B1 (ko) 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체, 및 이들의합성방법
KR101049100B1 (ko) 데하이드로페닐아히스틴 및 그의 동족체, 및 이들의 합성방법
US7935704B2 (en) Dehydrophenylahistins and analogs thereof and the synthesis of dehydrophenylahistins and analogs thereof
US8247552B2 (en) Analogs of dehydrophenylahistins and their therapeutic use
US8129527B2 (en) Analogs of dehydrophenylahistins and their therapeutic use
WO2007035841A9 (en) Analogs of dehydrophenylahistins and their therapeutic use
CN1934101B (zh) 脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物以及脱氢苯基阿夕斯丁及其类似物的合成
WO2011084962A1 (en) Analogs of dehydrophenylahistins
MXPA06008810A (en) Dehydrophenylahistins and analogs thereof and the synthesis of dehydrophenylahistins and analogs thereof

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E90F Notification of reason for final refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
FPAY Annual fee payment
GRNT Written decision to grant
FPAY Annual fee payment

Payment date: 20160104

Year of fee payment: 4

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20170102

Year of fee payment: 5

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20180103

Year of fee payment: 6

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20190103

Year of fee payment: 7

FPAY Annual fee payment

Payment date: 20200103

Year of fee payment: 8