KR20060121186A

KR20060121186A - 암 치료에 있어서 시라메신의 용도

Info

Publication number: KR20060121186A
Application number: KR1020067011665A
Authority: KR
Inventors: 크리스티안 톰센; 마르셀 레이스트; 마리아 오텔라; 마리 스탐페 안데르센
Original assignee: 하. 룬트벡 아크티에 셀스카브
Priority date: 2003-12-19
Filing date: 2004-12-17
Publication date: 2006-11-28
Also published as: ZA200604185B; CN1893947A; IL175774A0; US20090203721A1; IS8391A; US20060178389A1; UA87292C2; AR047051A1

Abstract

본 발명은 암 치료에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 암 치료를 위해 시라메신을 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명은 추가로 암으로부터 고통받는 환자에게 시라메신을 투여하는 것을 포함하는 치료 방법을 제공한다.

시라메신

Description

암 치료에 있어서 시라메신의 용도 {USE OF SIRAMESINE IN THE TREATMENT OF CANCER}

본 발명은 암 치료에 유용한 약제의 제조를 위한 시라메신 (Siramesine) 의 용도에 관한 것이다.

종양 세포는 종종 전형적인 캐스페이즈 (caspase)-매개 세포자멸사와 같은 전형적인 치료 양식에 대한 내성을 획득하였다. 그러나, 암 치료를 위한 신규 효율적인 약물에 대한 채워지지 않은 요구가 여전히 크게 남아 있다.

시그마 2 수용체가 많은 상이한 유형의 암을 나타내는 세포에서 상향조절되어 있으며 (Bem 등 1991, Cancer Res. 51, 6558 ; Vilner 등 1995, Cancer Res. 55, 408), 더욱이 시그마2 수용체 리간드가 종양 세포에서 세포 증식을 억제하고 세포자멸사를 유도할 수 있다는 것이 알려져 있다 (Brent & Pang, 1995, Eur. J. Pharmacol. 278, 151 ; Crawford & Bowen, 2002, Cancer Res. 62, 313). 추가로, 시그마 2 리간드가 항신생물성 약물의 활성을 증가시킬 수 있다고 나타나 있다 (Crawford & Bowen, 2002, Cancer Res. 62, 313).

국제 특허 공개 번호 WO 92/22554 는 일련의 시그마 수용체 리간드가 정신적 및 신경학적 장애의 범위의 치료에 유용한 것으로 생각된다고 기술하고 있다. 상기 화합물의 구조 활성 관계는 추가로 [Perregaard, J. 등, J. Med . Chem ., 1995, 38, 11, p. 1998 - 2008] 에 의해 연구되어 있다.

수많은 기타 화합물 중에서, WO 92/22554 는 화합물 1'-[4-[1-(4-플루오로페닐)-1H-인돌-3-일]-1-부틸]-스피로[이소벤조푸란-1(3H)-4'-피페리딘] (시라메신) 을 개시하고 있으며, 그의 신규 용도가 본 발명의 주제이다.

본 출원인은 이제 놀랍게도, 시라메신이 대조 시그마2 리간드보다 항-발암성 활성이 현저히 더욱 강력하다는 것을 발견하였다.

본 발명에 따르면, 암 치료용 약제가 제공된다.

시그마2 수용체 리간드는 상이한 기원의 암 세포의 세포자멸사를 유도하는 것으로 알려져 있다. 본 출원인은 이제 놀랍게도, 단독으로 사용된 경우 본 발명의 시라메신은 할로페리돌과 같은 시그마2 활성 대조 화합물보다 암세포의 세포자멸사를 유도하는데 있어 더욱 강력하다는 것을 발견하였다. 더욱이, 본 출원인은 에토포시드, 독소루비신, 스타우로스포린, 빈크리스틴 및 타목시펜과 같은 공지된 화학치료 화합물과 병용하는 경우 시라메신의 현저한 상승 효과를 관찰하였다. 따라서, 본 발명은 시라메신이 암 치료를 위한 약학적 조성물의 제조에 사용될 수 있으며, 상기 조성물은 기타 화학치료 암 약물과 병용해서, 및/또는 방사선치료와 병용해서 사용될 수 있다는 것을 입증한다. 시라메신 및 항암 화학치료 약물을 병용하는 경우, 약물은 동시에 또는 연속해서 투여될 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명은 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을, 활성 성분의 동시 투여에 적당한 상기와 같은 약학적 조성물의 제조를 위해 상승적 유효 투여량으로 화학치료 약물과 함께 사용하는 것에 관한 것이다. 특히, 상기 약학적 조성물은 동일한 단위 투여 형태 내에, 예를 들어 동일한 정제 또는 캡슐 내에 활성 성분을 함유할 수 있다. 상기 단위 투여 형태는 단위 투여 형태의 별도의 부분 내에 또는 균질한 혼합물로서 활성 성분을 함유할 수 있다.

또다른 구현예에서, 본 발명은 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을, 활성 성분의 연속 투여에 적당한 상기와 같은 약학적 조성물 또는 키트의 제조를 위해 상승적 유효 투여량으로 화학치료 약물과 함께 사용하는 것에 관한 것이다. 특히, 상기 약학적 조성물은 활성 성분의 어느 하나를 함유하는 분리된 단위 투여 형태 내에 분리된 정제 또는 캡슐과 같은 활성 성분을 함유할 수 있다. 상기 분리된 단위 투여 형태는 블리스터 팩 (blister pack) 과 같은 동일한 용기 또는 패키지 내에 함유될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 키트는 활성 성분의 각각을 분리된 단위 투여 형태 내에서 함유하는 약학적 조성물을 의미한다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "상승적 유효 투여량" 은 그의 병용 사용이 상승 효과, 바람직하게는 최대 수득가능한 상승 효과를 제공하는 시라메신 및 화학치료제의 투여량을 의미한다.

본 발명의 약학적 조성물 또는 키트는 상기 기술된 바와 같이, 활성 성분의 동시 투여 또는 활성 성분의 연속 투여에 적합할 수 있다.

더욱 구체적으로는, 본 발명은 암 치료용 약제의 제조를 위한, 하기 화학식을 갖는 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 신규 용도에 관한 것이다 :

.

더욱이, 본 발명은 약학적 허용량의 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 암 치료를 필요로 하는 개인에게 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.

추가의 측면에서, 본 발명은 화학치료제로 치료받은 또는 치료받고 있는 개인에게 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 화합물 1'-[4-[1-(4-플루오로페닐)-1H-인돌-3-일]-1-부틸]-스피로[이소벤조-푸란-1(3H),4'-피페리딘] (시라메신) 은 상기 화합물의 기재로서 또는 그의 약학적으로 허용가능한 산 부가염으로서 또는 상기 염의 무수물 또는 수화물로서 사용될 수 있다. 본 발명에 사용되는 상기 화합물의 염은 비-독성 유기 또는 무기산으로 형성된 염이다. 상기 유기염의 예는 말레산, 푸마르산, 벤조산, 아스코르브산, 숙신산, 옥살산, 비스-메틸렌살리실산, 메탄술폰산, 에탄디술폰산, 아세트산, 프로피온산, 타르타르산, 살리실산, 시트르산, 글루콘산, 락트산, 말산, 만델산, 신남산, 시트라콘산, 아스파르트산, 스테아르산, 팔미트산, 이타콘산, 글리콜산, p-아미노-벤조산, 글루탐산, 벤젠 술폰산 및 테오필린 아세트산뿐만 아니라, 8-브로모-테오필린과 같은 8-할로테오필린과의 염이다. 상기 무기염의 예는 염산, 브롬화수소산, 황산, 술팜산, 인산 및 질산과의 염이다. 바람직하게는 상기 화합물은 푸마레이트 또는 염산염으로서 사용된다.

1'-[4-[1-(4-플루오로페닐)-1H-인돌-3-일]-1-부틸]-스피로[이소벤조-푸란-1(3H),4'-피페리딘] 의 푸마레이트는 [Perregaard, J. 등, J. Med . Chem ., 1995, 38, 11, 1998 - 2008] (화합물 14f) 에서 기술된 바와 같이 제조될 수 있고, 염기 및 기타 약학적으로 허용가능한 염은 표준 과정에 의해 그로부터 수득될 수 있다.

따라서, 본 발명에 따른 산 부가염은 1'-[4-[1-(4-플루오로페닐)-1H-인돌-3-일]-1-부틸]-스피로[이소벤조-푸란-1(3H),4'-피페리딘] 을 불활성 용매 중에서 산으로 처리하고, 이어서 공지된 방법에 의한 침전, 단리 및 임의로 재-결정화 및 필요하다면 습식 또는 건식 밀링 또는 또다른 편리한 방법에 의한 결정질 생성물의 미분화, 또는 용매-에멀젼화 방법으로부터의 입자의 제조에 의해 수득될 수 있다.

염의 침전은 바람직하게는 불활성 용매 예를 들어, 알콜 (예를 들어, 에탄올, 2-프로판올 및 n-프로판올) 과 같은 불활성 극성 용매 중에서 수행된다.

본 발명에 따르면, 1'-[4-[1-(4-플루오로페닐)-1H-인돌-3-일]-1-부틸]-스피로[이소벤조푸란-1(3H),4'-피페리딘] 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염은 경구 또는 비경구와 같은 임의의 적합한 경로로 투여될 수 있고, 정제, 캡슐, 분말, 시럽 또는 주사용액 또는 주사 분산액의 형태와 같은 상기 투여에 적합한 임의의 형태로 제공될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 목적에 따르면, 본 발명의 화합물은 고형 약학적 독립체, 적합하게는 정제 또는 캡슐의 형태로 투여되거나, 또는 주사 현탁액, 용액 또는 분산액의 형태로 투여된다.

고형 약학적 제제의 제조 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다. 즉, 정제는 활성 성분을 통상의 아쥬반트 및/또는 희석제와 혼합하고, 이어서 통상의 정제 기계 (tabletting machine) 내에서 상기 혼합물을 압축하여 제조될 수 있다. 아쥬반트 또는 희석제의 예는 하기를 포함한다 : 옥수수 전분, 락토스, 탈쿰, 마그네슘 스테아레이트, 젤라틴, 락토스, 검 등. 또한, 착색제, 아로마, 방부제 등과 같은 임의의 기타 아쥬반트 또는 첨가제는, 그것들이 활성 성분과 융화된다면 사용될 수 있다.

본원에 사용된 바와 같은, 용어 "조성물" 은 특정 성분을 특정량으로 포함하는 생성물뿐만 아니라, 특정 성분의 특정량을 직접 또는 간적적으로 병용하여 생기는 임의의 생성물을 포함하고자 하는 것이다.

활성 성분을 함유하는 약학적 조성물은 경구 용도에 적합한 형태, 예를 들어 정제, 트로키(troche), 마름모꼴 정제 (lozenge), 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀젼, 경성 또는 연성 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르 (elixir) 로서 있을 수 있다. 경구 용도의 조성물은 약학적 조성물의 제조를 위해 당업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조될 수 있으며, 상기 조성물은 감미제, 방향제, 착색제 및 방부제로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 작용제를 함유하여, 약학적으로 아취가 있고 비위에 맞는 제제를 제공할 수 있다. 정제는, 활성 성분을 정제의 제조에 적합한 비-독성의 약학적으로 허용가능한 부형제와의 혼합물로 함유한다. 상기 부형제는 예를 들어, 칼슘 카르보네이트, 나트륨 카르보네이트, 락토스, 칼슘 포스페이트 또는 나트륨 포스페이트와 같은 불활성 희석제 ; 예를 들어 미세결정질 셀룰로스, 나트륨 크로스카멜로스, 옥수수 전분, 또는 알긴산과 같은 과립화제 및 붕괴제 ; 전분, 젤라틴, 폴리비닐-피롤리돈 또는 아카시아와 같은 결합제 ; 및 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크와 같은 윤활제일 수 있다.

본 발명의 조성물은 포유류, 바람직하게는 인간의 암 치료에 사용될 수 있다.

본 발명의 용도를 위한 시라메신 또는 그의 염은 활성 성분 (유리 형태로서 계산됨) 을 약 0.01 ㎍/kg/일 내지 100 mg/kg/일, 바람직하게는 0.01 ㎍/kg/일 내지 30mg/kg/일 체중, 가장 바람직하게는 0.5 mg/일/kg 내지 7.0 mg/일/kg 체중의 양으로 함유하는 정제 또는 캡슐과 같은 단위 투여 형태에서 경구로 가장 편리하게 투여된다.

증가된 효과를 수득하기 위해, 또는 기타 화합물의 표준 이하의 투여량을 사용하여 부작용을 최소화하기 위해, 시라메신을 기타 화합물과 병용하는 경우, 시라메신 및/또는 기타 화합물의 표준 이하의 투여량이 치료에 사용될 수 있다. 환자 특이적 투여량의 계산은 당업자에게 일상적인 일이다.

본 발명에서 제공되는 약학적 조성물 및 방법은 특히 피부암, 유방암, 뇌암, 자궁경부암, 고환암 등과 같은 고형 종양을 포함한 암의 치료에 유용한 것으로 여겨진다. 더욱 특히, 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법에 의해 치료될 수 있는 암은 하기를 포함하나, 이에 제한되지 않는다 : 심장 : 육종 (혈관육종, 섬유육종, 횡문근육종, 지방육종), 점액종, 횡문근종, 섬유종, 지방종 및 기형종 ; 폐 : 기관지 암 (편평세포, 미분화 소세포, 미분화 대세포, 선암), 폐포 (세기관지) 암, 기관지 선종, 육종, 림프종, 연골 과오종, 중피종 ; 위장관 : 식도 (편평세포암, 선암, 평활근육종, 림프종), 위 (암, 림프종, 평활근육종), 췌장 (관선암종, 인슐린종, 글루카곤종, 가스트린종, 유암종, VIP 종), 소장 (선암, 림프종, 유암종, 카포시 육종, 평활근종, 혈관종, 지방종, 신경섬유종, 섬유종), 대장 (선암, 관상선종, 융모선종, 과오종, 평활근종) ; 비뇨생식기 경로 : 신장 (선암, 윌름 종양 [신모세포종] , 림프종, 백혈병), 방광 및 자궁 (편평세포암, 전이세포암, 선암), 전립선 (선암, 육종), 고환 (정상피종, 기형종, 배아 암종, 기형암종, 융모암, 육종, 간질 세포암종, 섬유종, 섬유선종, 유선종, 지방종) ; 간 : 간암 (간세포암종), 담관암종, 간모세포종, 혈관육종, 간세포선종, 혈관종 ; 뼈 : 골원성 육종 (골성육종), 섬유육종, 악성 섬유성 조직구종, 연골육종, 에빙 육종, 악성 림프종 (세망세포 육종), 다발성 골수종, 악성 거대세포종 척삭종, 골성척삭종 (osteochronfroma, (하악과두 과형성증 (osteocartilaginous exostoses)), 양성 연골종, 연골모세포종, 연골점액섬유종, 유골 골종 및 거대 세포종 ; 신경계 : 두개골 (골종, 혈관종, 육아종, 황색종, 변형성 골염), 뇌막 (뇌수막종, 뇌수막육종, 신경교종증), 뇌 (성상교종, 수모세포종, 신경교종, 뇌실질막세포종, 배아종 [송과체종], 다형성 교모세포종, 핍지교종, 신경초종, 망막모세포종, 선천성 종양), 척수 신경섬유종, 뇌수막종, 신경교종, 육종) ; 부인과 : 자궁 (자궁내막암), 경부 (자궁경부암, 예비-종양 자궁경부 이형성), 난소 (난소암 [장액성 낭선종, 점액성 낭선종, 미분류 암종] , 과립층-난포막 세포종, 세르톨리-라이디그 (Sertoli-Leydig) 세포종, 배세포종, 악성 기형종), 외음부 (편평세포암종, 상피내암, 선암, 섬유육종, 흑색종), 질 (투명세포암종, 편평세포암종, 포도상 육종 (배아 횡문근육종), 난관 (암종) ; 혈액 : 혈액 (골수성 백혈병 [급성 및 만성], 급성 림프모구성 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 골수증식성 질환, 다발성 골수종, 골수이형성 증후군), 호지킨 질환, 비-호지킨 림프종 [악성 림프종] ; 피부 : 악성 흑색종, 기저세포암종, 편평세포암종, 카포시 육종, 기태 이형성 모반 (moles dysplastic nevi), 지방종, 혈관종, 피부섬유종, 해족증, 건선 ; 및 부신 : 신경모세포종.

따라서, 본원에 제공된 바와 같은 용어 "암성 세포" 는 상기 정의된 이상 (condition) 중 임의의 하나에 의해 시달리는 세포를 포함하고, 용어 "암" 은 상기 정의된 이상 중 임의의 하나를 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 상기 언급된 모든 이상은 단일 구현예로서 생각되고, 따라서 각각의 이상의 치료에 관한 조성물은, 용어 암이 사용되는 경우의 요구된 군에 포함되거나 또는 개별적으로 요구될 수 있다.

상기 암 징후 중 임의의 것이 시라메신, 약학적 조성물, 키트, 치료 방법의 사용과 관련하여 언급될 때마다, 그것은 개별적인 구현예인 것으로 생각된다. 따라서, 상기 특정화된 징후의 각각은 개별적으로 시라메신, 약학적 조성물, 키트, 치료 방법 및 치료에 유용한 화합물의 확인 방법의 상기 사용과 함께 요구될 수 있다.

실험 과정

세포 배양

쥐과동물 섬유육종 세포 WEHI-S, Wn902, Wn912, 및 WEHI-R4 각각은 정상 세포, 벡터 대조군 세포, Hsp70 과발현 세포, 및 hTNF 내성 세포이다. 테스트한 기타 세포 유형은 : 인간 유방암 세포 유형 MCF7-S1 및 MDA-MB-468, 및 비-종양원성 부동화된 유방 내피 세포 HBL100 을 포함한다. MCF7 casp3.1 과 -3.3 및 neo2 는 캐스페이즈3 및 벡터를 발현하는 단일 세포 클론이다. MCF7 pCEP, -Bcl2 WT, -Bcl2 NT, -Bcl2 Acta, 및 -Bcl2 Cb5 는 벡터, 야생형 Bcl2, 세포질 위치 Bcl2, 미토콘드리아 위치 Bcl2, 및 ER 위치 Bcl2 를 발현하는 단일 세포 클론이다 (Maria HØyer Hansen, Apoptosis Laboratory, Danish Cancer Society). 인간 신경모세포종 세포주 SK-N-MC 세포 (ATCC, USA). 또한, 인간 경부암종 세포주 HeLa (Dr. J. Lukas, Danish Cancer Society 가 친절하게도 제공하였음) 및 ME180 을 테스트하였다. HEK293-A, 전립선암 세포주 PC3, 및 비-종양원성 부동화 전립선 외피 세포주 PNT1A 또한 테스트하였다. 비-형질전환된 NIH3T3 쥐과동물 섬유아세포는, 친절하게도 C. Holmberg (University of Copenhagen, Denmark) 가 제공해 주었다. 섬유아세포를 기술된 바와 같이 pBabe-puro mock, -SV40LT, -v-Ha-ras, -c-src 로 형질도입시켰다 (Fehrenbacher 등, 2004). 10 % 가열-불활성화시킨 소 혈청 (Biological Industries, Beit Haemek, Israel), 0,1 mM 불필수 아미노산 (Invitrogen), 및 항생제가 보충된 DMEM (Invitrogen, Paisly, UK) 또는 6 % 가열-불활성화시킨 소 혈청 및 항생제가 보충된 RPMI-1640 (Invitrogen) 중에서 5% CO₂로 보습된 대기 중 37℃ 에서 세포를 증식시켰다. 세포를 반복해서 테스트하고, 획스트 (hoecsht) 염색 (H-33342, Molecular Probes, Eugene, OR) 에 의해 미코플라즈마에 대해 음성임을 발견하였다.

세포막 또는 조직막에의 [ ³ H] 시라메신의 결합

상기 기술된 바와 같은 세포주로부터 제조된 조직 또는 설치류 또는 인간으로부터의 조직 상에 시라메신-민감성 결합 부위가 있는지를 [SØby, K. 등, Neuropharmacol., 2002, 43, 95 - 100] 에서 이미 기술된 [³H]Lu 28-179 (시라메신) 결합 어세이를 사용하여 알아보았다. 간단하게는, 세포를 기술된 바와 같이 배양하고, 세포 긁개를 사용하여 포스페이트 완충 식염수 중에서 수합하고, 원심분리 (1000 × g, 10 분) 하였다. 생성 펠렛을 [SØby 등, 2002] 에서 기술된 바와 같은 [³H]Lu 28-179 결합 어세이에 사용하였다.

세포자멸사 자극

하기 세포자멸사 자극을 테스트하였다 : 시라메신 (Lu-28-179), 시라메신 유 사체 : 28131M, 28134M, 29288O, 32160F, 32124C, 및 32168F, 및 할로페리돌 (H. Lundbeck A/S, Copenhagen, Denmark), 인간 TNF-α (Strathmann Biotech Gmbh, Germany), 타프시가르긴 (thapsigargin), 에토포시드, 독소루비신, 스타우로스포린, 빈크리스틴, 타목시펜 (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), 콘카나마이신A (Alexis Biochemicals, San Diego, CA).

약물학적 억제제 및 약물

하기 프로테아제 억제제를 사용하였다 : zVAD-fmk, DEVD-fmk (Bachem Bubendorf, Switzerland), DEVD-CHO (Neosystems, Strasbourg, France), LEHD-CHO, zFA-fmk (Enzyme System Products, Livermore, CA), CA-074-Me (Peptides International, Louisville, KY), APC11138 (Celera Applied Biosystems, Foster City, USA), Pepstatin A, PD150606, 및 칼파인 억제제 I (CI) (Calbiochem, La Jolla, CA), TPCK (Boehringer Mannheim), 페파블록 (pefabloc) (AEBSF) (Roche Diagnostics, DK).

하기 항산화제를 사용하였다 : 부틸화된 히드록시아니솔 (BHA), α-토코페롤, γ-토코페롤, 글루타티온 에틸 에스테르 (GSH), N-아세틸-시스테인 (NAC) (SIGMA-Aldrich, St Louis, MO). 세포를 약물 처리 1 시간 전에 억제제 및 항산화제로 예비-배양하였다.

또한, 하기 약물의 시라메신 세포독성에 대한 효과를 테스트하였다 : 시그마2-수용체 안타고니스트 BD1047 (Tocris) 및 AC927 (W. Bowen, Brown University, USA 의 선물), 3-메틸-아데닌, 액티노마이신D, 사이클로헥사미드 및 콜레스테롤.

세포 사멸의 검출

세포 생존성

세포 생존성을 MTT 환원 어세이를 사용하여 측정하였다. 테트라졸륨염 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라나트륨브로마이드 (MTT, SIGMA-Aldrich) 의 푸른-색 포르마잔 생성물로의 전환을 Versamax 마이크로플레이트 판독기 (Molecular Devices) 를 사용하여 570 nm 에서의 흡수에 의해 분광광도적으로 수행하였다. 생존율을 미처리된 세포 또는 억제제-처리된 세포의 % 로서 결정하였다. 세포를 200 ㎕ 배지를 함유한 96-웰 플레이트에 심고, 다음 날 약물로 처리하였다. 세포 생존성에 대한 효과를 약물 첨가 후 24 - 60 시간 째에 100 ㎕ 배지를 제거하고 25 ㎕ MTT 용액 (멸균 여과된 PBS 중 1 mg/㎖)을 첨가하여 평가하였다. 37℃, 암실에서 3 시간 인큐베이션시킨 후, 세포를 100 ㎕ 용해화 완충액 (50 % 디메틸포름아미드 용액 중 20 % SDS) 을 사용하여 침투시키고, 다음 날 분광 광도계 상에서 분석하였다.

세포 사멸 및 세포독성

세포 사멸 및 세포독성을 락테이트 디하이드로게나제 (LDH) 방출 어세이 (Roche, Mannheim, Germany) 를 사용하여 평가하였다. 세포질 LDH 를 배양 배지 내로 방출하는 원형질막의 파열은 세포독성 또는 세포 파쇄의 측정 수단이다. 락테이트의 피루베이트로의 산화 및 NAD⁺ 의 NADH + H⁺ 로의 환원을 초래하는 LDH 의 효소 활성을 테트라졸륨염 (황색) 의 포르마잔염 (적색) 으로의 전환에 의해 분 광광도적으로 측정하였다. 세포를 심고, MTT 어세이를 위해 기술된 바와 같이 처리하였다. 분석 시, 50 ㎕ 배지를 제거하고, 50 ㎕ 반응 완충액과 혼합하였다. 잔존 배지를 제거하고, 세포를 1 % Triton X-100 으로 37℃ 에서 20 분 동안 파쇄하였다. LDH 함량을 세포 파쇄물 중에서 측정하고, % LDH 방출 범위 또한 계산하였다 :

세포독성 (% LDH 방출)= LDH_{배지 중}/ (LDH_{배지 중}+ LDH_파쇄물 _중) × 100 %

핵 축합

세포 사멸 양식을 약물-처리된 세포의 핵 축합의 유형에 의해 평가하고, 획스트 염색 (세포 침투가능한 획스트 33342, SIGMA-Aldrich) 에 의해 수행하였다. 비 세포 침투가능한 Sytox Green (Molecular Probes) 을 막 혼입 손실을 어세이하기 위해 사용하고, 획스트로 관찰된 핵 형태학적 변화와 비교하였다. 세포를 25 mg/㎖ 획스트의 10,000 × 희석액 및/또는 5 mM 시톡스 그린의 10,000 × 희석액으로 37℃ 에서 5 분 동안 인큐베이션시키고, 그 후, 핵 축합의 유형 및 가능한 공-염색 (co-stain) 을 인버티드 Olympus 현미경 IX-70 을 사용하여 분석하였다.

DNA 래더링 검출을 위한 젤 전기영동. 세포를 수합하고, 120 ㎕ 파쇄 완충액 (100 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl (pH 8.0), 25 mM EDTA, 0.5% SDS 및 100 ㎍/㎖ 단백질분해효소 K) 중에서 50℃ 에서 밤새 인큐베이션시켰다. 샘플을 6M NaCl 로 침전시키고, 4℃, 13,000 rpm 에서 5 분 동안 원심분리하였다. 이어서, 게놈 DNA 를 96% 에탄올 2.5 부피에 의해 상청액으로부터 침전시켰다. 4℃, 20,000 rpm 에서 10 분 동안 원심분리하고, 70 % 에탄올로 헹군 후, 펠렛을 10 mM Tris-HCl (pH 8.0) 및 1 ㎍/㎖ Rnase A 를 함유한 1 mM EDTA 에 용해시켰다. 샘플을 37℃ 에서 1.5 시간 동안 인큐베이션시키고, DNA 농도를 260 nm 에서의 흡수율 (A) 로부터 측정하였다. DNA (5 ㎍/레인) 를 1.5% 아가로스 겔 상에서 전기영동시키고, 에티듐 브로마이드 염색에 의해 시각화하였다.

캐스페이즈 및 카텝신 활성

세포질 시스테인 카텝신 효소 활성을 측정하기 위해, 24-웰 플레이트에 심어진 아포화된 (subconfluent) 세포를 얼음 상에서 20 ㎍/㎖ 디기토닌을 함유한 추출 완충액 (250 mM 수크로스, 20 mM HEPES, 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl₂, 1mM EDTA, 1 mM EGTA, 1mM 페파블록 ; pH 7.5) 으로 12 - 15 분 동안 처리하였다. 총 세포 시스테인 카텝신 효소 활성을 측정하기 위해, 세포를 얼음 상에서 200 ㎍/㎖ 디기토닌을 함유한 상기 추출 완충액으로 12 - 15 분 동안 처리하였다. 캐스페이즈 3/7-유형 활성의 분석을 위해, 아포화된 세포를 얼음 상에서 캐스페이즈 추출 완충액 (0.5 % Triton X-100, 25 mM HEPES, 5 mM MgCl₂, 1 mM EGTA, 1 mM 페파블록, pH 7.5) 으로 20 분 동안 처리하였다. 캐스페이즈 3/7-유형 활성 및 시스테인 카텝신 활성을 캐스페이즈 반응 완충액 (100 mM HEPES, 20 % 글리세롤, 0.5 mM EDTA, 0.1% CHAPS, 5 mM DTT, 1 mM 페파블록, pH 7.5) 중의 20 μM Ac-DEVD-AFC (Biomol) 의 1 부피 또는 카텝신 반응 완충액 (50 mM 나트륨 아세테이트, 4 mM EDTA, 8 mM DTT, 1 mM 페파블록, pH 6.0) 중의 20 μM zFR-AFC (Enzyme System Products) 의 1 부피 각각을 첨가함으로써 평가하였다. AFC (여기 400 nm, 방출 489 nm) 의 방출의 V_max 를 Spectramax Gemini 형광계 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 를 사용하여 30℃ 에서 20 분에 걸쳐 분석하였다.

리소좀 안정성 어세이 , 세포 배양

세포를, 산성 부분에 축적되는 이염성 형광 색소 아크리딘 오렌지 (AO, Molecular Probes) 및 리소모트로픽 약염기에 노출시켰다. 산성 리소좀에 고도로 농축된 경우, AO 는 적색 형광을 나타내나, 세포질에 재위치화하는 경우, 녹색 형광을 나타낸다. 리소좀 보전을 모니터링하기 위해, 아포화된 약물-처리된 세포를 0.1 - 0.5 ㎍/㎖ AO 에 37℃ 에서 3 시간 동안 노출시켰다. 세포를 인버티드 Olympus 현미경 IX-70 을 사용하여 평가하거나 또는 용기의 바닥층으로부터 탈착시켜 488 nm 의 방출 파장을 가진 아르곤 이온 레이저가 있는 FACSort (Becton Dickinson, San Jose, CA) 를 사용하는 유세포분석기에 의해 분석하고, CellQuest 소프트웨어를 사용하여 분석하였다.

리소좀 안정성 시험관 내 어세이

14 cm 플레이트에 심은 MCF-7 세포에 Fe-덱스트란을 9 시간 동안 로딩하고, 이어서 배양 배지 중에서 16 시간 동안 깨끗하게 하였다. 이어서, 세포를 PBS 중에서 세척하고, 용기 바닥층으로부터 탈착시켰다. 세포 펠렛을 SCA 완충액 (20 mM Hepes KOH, 10 mM KCl, 1.5 mM Mg₂Cl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 250 mM 수크로스, pH 7.5) 중에 재현탁시키고, 얼음 상에서 20 분 동안 평형화시켰다. 세포 펠렛을 Teflon 막자를 사용하여 150 - 200 스트로크에 의해 균질화시켰다. 750 g 에서 5 분 동안 원심분리한 후, 상청액을 단리하고, 원심분리 단계를 반복하였다. 잔여 상청액을 자기장 내에 함유된 칼럼에 옮겼다. 리소좀 분획을 2 회 세척하고, 칼럼으로부터 용출시켰다. 이어서, 리소좀 카텝신의 방출을 카텝신 활성 측정에 대해 기술된 바와 같이 블랙 코스타 96 웰 플레이트 내에서 25 ㎕ 리소좀 용액에서 측정하였다. 37℃ 에서 1.5 시간 동안 반응시킨 후, AFC 의 방출의 V_max 를 Spectramax Gemini 형광계 (Molecular Devices, Sunnyvale, CA) 를 사용하여 30℃ 에서 20 분에 걸쳐 분석하였다.

면역블롯 분석 및 면역형광

사용된 1 차 항체는 카텝신 B (Oncogene Research Products, Boston, MA), 카텝신 L (Transduction Laboratories, Lexington, KY), 사이토크롬 c (BD Pharmingen), 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 디하이드로게나제 (GAPDH, Biogenesis, Poole, UK), Hsp70 (2H9 ; Boris Margulis, St. Petersbrug, Russia 에서 친절하게도 제공해 주었음) 및 래빗 다클론 카텝신 D (DAKO corporation, CA), 및 AIF (세포자멸사 실험실, Danish Cancer Research) 에 대한 마우스 단일클론 항체를 포함하였다. 면역블롯 분석을 위해, 단백질을 6 - 12% SDS-PAGE 에 의해 분리하고, 니트로셀룰로스 막에 옮겼다. 1 차 항체를 RT 에서 1 시간 또는 4℃ 에서 밤새 인큐베이션시킨 후, 블롯을 2 차 호스래디쉬 (horseradish)-퍼록시다제-공액 염소 항-마우스 또는 -래빗 IgG 항체로 RT 에서 1 시간 동안 인큐베이 션시켰다. 연속한 단백질 검출을 ECL 또는 ECL 플러스 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, England) 를 사용하여 수행하였다.

카텝신, AIF, 및 cyt C 를 시각화하기 위해, 세포를 -20℃ 메탄올 중에서 25℃ 에서 10 분 동안 고정시키고 침투시켰다. 5% 염소 혈청 (PBS 중 1% BSA, 0.3% Triton X-100 중) 으로 20 분 동안 미리차단시킨 후, 세포를 지시된 바와 같은 1 차 항체 (PBS 중 0.25% BSA, 0.1% Triton X-100 중) 로 1.5 시간 동안 인큐베이션시켰다. 2 차 항체 Alexa Fluor-488 또는 -546-공액 항-마우스 IgG 또는 항-래트 IgG (Molecular Probes) 로 1 시간 동안 인큐베이션시킨 후, 세포를 PBS 중 0.05% Tween 20 으로 3 회 세척하고, ProLong Antifade Kit (Molecular Probes) 를 사용하여 마운팅하였다. LSM 510 소프트웨어가 있는 Zeiss Axiovert 100M 현미경을 사용하여 콘포칼 분석을 수행하였다.

생체 내 실험

WEHI-R4 세포 (5 × 10⁶) 를 면역성인 암컷 BALB/c 마우스의 등에 피하 이식하였다. 종양 이식하기 2 일 전에 시라메신 치료를 시작하였다. 마우스를 군 (5 - 9/군) 으로 분리하고, 200 ㎕ 1) 비히클 (0.9 % NaCl 용액 중 0.5 % 메틸셀룰로스), 2) 현탁액 (0.9 % NaCl 용액 중 0.5 % 메틸셀룰로스 15 중) 중 100 mg/kg/일 시라메신을 주 당 7 일 경구 투여하였다. 병용의 생체 내 연구를 위해, 50 mg/kg 시라메신을 30 mg/kg (하루에 한 번 투여됨) 이하의 에토포시드 (i.p.) 의 단일 투여량과 병용하여 7 일/주 투여하였다. 종양 부피를 칼리퍼를 사용하여 측정하였다. 종양 성장에 대한 약물의 효과를 14 - 21 일에 걸쳐 모니터링하고, 마우스를 죽였다.

결과

투여량 의존성 방식으로, 시라메신은 전립선, 유방 및 경부 종양으로부터 기원된 세포주를 포함하여 다양한 기원의 배양된 종양 세포주에서, 프로그래밍된 세포 사멸을 효과적으로 유도하였다. 세포의 시라메신에 대한 민감성은 ras 또는 src 에 의한 발암성 형질전환 시 증가되었고, 이는 시라메신이 암 약물의 목적하는 능력을 가지고 있어서, 정상 세포에 대한 단지 제한된 효과와 함께 암 세포에 대해서는 그의 효과를 선택적으로 유도함을 가리킨다.

더욱이, WEHI-S 및 MCF7 세포에서 할로페리돌 및 펜타조신과 같은 대조 시그마 리간드에 대해 테스트된 경우, 시라메신은 할로페리돌 및 펜타조신보다 확실히 더욱 강력한 세포자멸사 유도체였다.

시라메신에 의해 유도되는 사멸의 양상은 사멸 과정 동안의 핵의 형태학적 변화, 약물학적 캐스페이즈 억제제에 의한 보호의 부재, 및 효과기 캐스페이즈 활성의 부재를 기반으로 한 캐스페이즈-독립성이다. 대신, 리소좀 카텝신의 시토졸 내로의 방출은 사멸 과정의 집행과 관련 있는 것으로 보인다. 이러한 발견은 정제된 리소좀으로부터의 카텝신의 시험관 내 방출뿐만 아니라, 리소좀 카텝신 B 및 L 의 면역조직화학 염색을 바탕으로 한 것이다. 또한, 카텝신의 약물학적 억제제를 사용하면, 시라메신에 의해 유도되는 사멸을 감소시킬 수 있다.

Bcl-2 의 엑토픽 발현에 의해 대부분의 다른 항암 약물에 대해 보호된 종양 세포는 시라메신에 의해 효과적으로 살해되었다.

일부 화학치료제가 p53-의존성 사멸 경로를 활성화시키는 반면, 시라메신은 p53 을 활성화시키지 않는다. 이는, p53-의존성 사멸 경로가 종종 암에서 손상되어 있기 때문에, 사멸 경로가 DNA 손상제 (예를 들어, 에토포시드) 에 의해 유도되는 것과는 확실히 상이함을 가리키며, 이는 시라메신에 대한 광범위한 암 징후 범위를 나타내는 데이타를 뒷받침하는 결과를 가리킨다. 이는 추가로 시라메신 유도된 종양 세포 사멸이 Bcl-2 에 의해 억제되지 않는다는 상기 언급된 관찰에 의해 지지된다.

중요하게는, 시라메신은 생체 내에서 충분히 내성이고, BALB/c 마우스에서의 동계 종양 이종 이식에 있어서 항-종양원성 효과를 나타내었다. 또한, 시라메신 및 에토포시드의 병용 효과를 시라메신 및 에토포시드 각각으로 단일-처리된 군과 비교하여 생체 내에서 관찰하였다. 더욱이, 시라메신은 WEHI-S 세포에서의 세포 사멸의 유도에 있어서 에토포시드, 독소루비신, 스타우로스포린, 빈크리스틴 및 타목시펜과 함께 상승 방식으로 작용하였다. 상기 결과는, 시라메신이 기타 대조 시그마 리간드와 비교해 특히 효과적이고, 단독으로 또는 암 치료를 위한 통상의 화학치료제와 병용하여 사용될 수 있는 신규 항암 약물임을 나타낸다.

Claims

암 치료에 사용되는 약학적 조성물의 제조를 위한 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
암 치료에서 화학치료제의 증진된 효과를 증대시키고/시키거나 또는 제공하기에 유용한 약학적 조성물의 제조를 위한 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
암 치료에서 화학치료제와 병용되는 약학적 조성물의 제조를 위한 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
암 치료에 사용되는, 또다른 화학치료제를 추가로 포함하는 약학적 조성물의 제조를 위한 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염의 용도.
제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 암이 폐암, 전립선암, 유방암, 신경교종, 신경모세포종, 흑색종, 백혈병, 골수암 또는 피부암으로부터 선택되는 용도.
제 2 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 화학치료 화합물이 에토포시 드, 독소루비신, 스타우로스포린, 빈크리스틴, 및 타목시펜, 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 용도.
제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암 치료가 방사선치료를 병용하는 용도.
제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 시라메신이 푸마레이트 또는 염산염으로서 사용되는 용도.
시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 화학치료제, 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염 및 화학치료제, 및 임의로 약학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 키트.
유효량의 시라메신 또는 그의 약학적으로 허용가능한 염을 환자에게 투여하 는 것을 포함하는 암 치료 방법.
제 12 항에 있어서, 암이 폐암, 전립선암, 유방암, 신경교종, 신경모세포종, 흑색종, 백혈병, 골수암 또는 피부암으로부터 선택되는 방법.