KR20060115435A - 예덕나무 추출물 및 코엔자임 ｑ―１０을 유효성분으로함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 화장료 조성물은 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 동시에 함유함으로써 상기 유효성분에 의한 피부 탄력 증진 효과 및 피부 주름 개선 효과가 상승적으로 증가하여 피부 노화 방지에 유용하게 사용될 수 있다.

예덕나무, 코엔자임 Q-10, 노화 방지, 화장료

Description

예덕나무 추출물 및 코엔자임 Ｑ―１０을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물{Cosmetic Composition for Inhibition of Skin Aging Comprising the Extract of Mallotus japonicus and Coenzyme Q-10 As Active Ingredient}

본 발명은 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 피부 노화 방지 효과가 뛰어난 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10의 혼합물을 포함하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부의 노화는 크게 내인적 노화 (Intrinsic aging)와 광노화 (Photo aging)로 대별된다 (Cosmetics ＆ Toiletories, 111:31-37(1996)). 내인적 노화는 임상학적으로 피부의 두께가 얇아지고, 탄력이 떨어지며 혈관이 감소하며 얕은 주름이 생기는 특징이 있다. 광노화는 임상학적으로 탄력이 감소하고, 피부결이 거칠어지며, 깊은 주름이 생기며 색소가 침착되는 특징이 있다 (Arch Dermatol., 130:87-95(1994)).

자외선에 장기간 반복 노출되는 피부는 그렇지 않은 부위에 비해 노화가 앞당겨진다는 사실은 오래전부터 인식되어 왔다. 일반적으로 피부가 햇빛에 과다 노출되면 피부 진피층의 세포간 성분 (extracellular matrix)의 변성과 양적 감소를 수반하게 된다. 섬유아세포에서 생성되는 콜라겐과 엘라스틴 섬유는 피부 진피층에서 피부의 기계적 견고성, 조직의 결합력 및 탄력성 등에 관여한다 (Journal of the american academy of dermatology, 21:610-613(1989)). 이러한 세포간 성분들은 광노화에 의해 생합성이 감소하거나 변형이 지속적으로 축적되어 주름생성, 탄력 손실, 피부 건조 및 색소침착과 같은 전형적인 노화의 징후를 통해 외부로 나타나게 된다 (Clinics in geriatric medicine, 17(4):617-630(2001)).

한편, 광노화의 한 메커니즘으로 자유 라디칼 (free radical) 이론이 주목을 받고 있다. 이 이론은 1950년대 중반 하만 (D. Harman)에 의해 최초로 주장되어, 현재 여러 분야에서 연구가 진행중이다. 자유 라디칼은 세포내 구성물질을 손상시키고 생체막의 인지질을 산화시키며, 피부의 염증반응을 일으켜 피부 노화를 촉진시킨다 (Clinics in dermatology, 14:227-234(1996)).

따라서, 피부의 광노화를 억제하기 위한 일환으로 항산화 효과를 지니는 물질을 적용하고, 주름 생성과 연관이 있는 진피 세포간 성분들의 생성 및 분해를 정상 수준으로 유지시켜 주는데 사용할 수 있는 물질의 개발이 요구되고 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문이 참조되고 그 인용은 괄호 내에 표시되어 있다. 인용된 논문의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준과 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

이에, 본 발명자들은 피부 노화를 예방 및 치료하는데 있어 우수한 효과가 있는 화장료의 개발에 주목하였으며, 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함께 피부에 적용한 결과 상기 각 성분에 의한 노화 방지 효과가 상승적으로 증가함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명 및 청구범위에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물을 제공한다.

예덕나무 (Mallotus japonicus)는 일명 야오동 (野梧桐) 또는 적아백 (赤芽柏)이라 불리는 낙엽 소교목으로 우리나라 남부의 산기슭 및 산골짜기에 자란다. 키는 10 m 되는 것도 있으나 대개 관목 모양이다. 일반적으로 예덕나무의 나무껍질이 위궤양이나 위염, 간 기능 개선 보조제로 사용되고 있다.

본 발명에 있어서, 예덕나무 추출물은 예덕나무의 다양한 기관 또는 부분 (예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 과실 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미하고, 바람직하게는 줄기, 가지, 껍질 또는 뿌리, 보다 바람직하게는 가지, 껍질 또는 뿌리, 가장 바람직하게는 껍질 (즉, 수피)로부터 얻은 추출물을 의미한다.

본 발명의 예덕나무 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있다.

본 발명의 조성물의 유효성분인 예덕나무 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3 부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것이 바람직하며, 보다 바람직하게는 에틸 알코올이며, 보다 더 바람직하게는 70% 에틸 알코올이다. 상기 추출 용매의 적합한 양은 예덕나무 건조 중량의 1-20 배이며, 보다 바람직하 게는 1-10배이다.

본 발명의 예덕나무 추출물은 다음의 단계를 포함하는 과정에 의해 제조된다: (a) 예덕나무에 1-10배의 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3 부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 첨가하는 단계; (b) 단계 (a)의 용매 첨가된 예덕나무를 10-40℃에서 1-15일간 방치하여 추출하는 단계; 및 (c) 상기 단계 (b)에서 추출한 성분을 여과 및 건조하는 단계.

본 발명의 구체적인 일 실시예에 따르면, 상술한 추출 과정은 다음과 같이 실시된다: 우선, 원료가 되는 예덕나무를 세척, 건조 및 작은 조각으로 파쇄한 다음 70% 에틸 알코올을 예덕나무 건조중량의 10배 부피비로 첨가하여 냉각 콘덴서가 장치된 추출기에 넣는다. 이어, 15-35℃에서 5일간 방치하여 숙성시킨 후 이를 여과하고 감압증발기로 건조하여 예덕나무 추출물을 얻는다.

한편, 본 발명의 예덕나무 추출물은 상술한 추출법에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획도 본 발명의 예덕나무 추출물에 포함된다고 해석된다.

본 발명의 예덕나무 추출물은 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 예덕나무 추출물의 함량은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.0001-10 중량%, 바람직하게는 0.001-5 중량%, 더욱 바람직하게는 0.01-1 중량%이다. 이때 예덕나무 추출물의 총 중량이 0.0001% 미만일 때에는 그 효과가 나타나기 어렵고, 10% 이상일 때에는 피부에 자극을 유발할 가능성이 높으며, 제형의 안정화에도 큰 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물의 또 다른 유효성분인 코엔자임 (coenzyme) Q-10은 모든 세포에서 생합성되지만, 그 양이 매우 적은 특징이 있으며, 정상적인 경우 인체에서는 충분한 양이 생성 및 소모되지만, 나이가 들거나, 과도한 육체적 노동, 각종 스트레스, 면역체계의 교란 및 미토콘드리아의 질병 등의 요인에 의해 체내에서 부족현상이 일어나게 된다. 그러나 매우 우수한 항산화 효과, 광노화 예방, 주름 억제, 각질 턴오버 증가, 레티노인산의 대체효과 및 라디칼 소거 효과를 나타내고, 세포막의 동력학을 조절해주는 작용이 있다. 즉, 코엔자임 Q-10을 피부에 적용함으로써 피부세포의 보호와 활성화의 효과를 동시에 부여해주는 효과를 가져올 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 사용 가능한 코엔자임 Q-10은 화학적으로 합성된 것으로서, 본 발명의 바람직한 실시예에서는 시그마-알드리치사의 코엔자임(Cat No. C9538)를 사용하나, 반드시 상기 제조사에서 제조된 것에만 국한되는 것은 아니다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 코엔자임 Q-10은 화장료 조성물 총 중량에 대해 0.01-1.0 중량%, 바람직하게는 0.1-0.5 중량%로 포함된다. 이때 코엔자임 Q-10의 총 중량이 0.01% 미만일 때에는 그 효과가 나타나기 어렵고, 1.0% 이상일 때에는 피부에 자극을 유발할 가능성이 높으며, 제형의 안정화에도 큰 영향을 미칠 수 있다.

본 발명의 조성물 및 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효 성분으로서 상기 베르게닌 이외에 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함한다.

본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 본 발명의 조성물이 화장료 조성물로 사용될 때에는 유연 화장수 (스킨), 수렴 화장수, 영양 화장수 (밀크로션), 영양 크림, 맛사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소 결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 실시예에 따르면, 예덕나무 추출물은 엘라스테이즈 활성 억제 효과, 콜라겐 및 엘라스틴 합성 효과, MMP-1 생성 억제 효과 및 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성이 우수하며, 코엔자임 Q-10은 자유라디칼 소거 활성을 통한 항산화 효과 및 세포성장 촉진 효과를 갖는다.

또한, 상기 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물은 피부 노화에 의한 피부 주름 개선 효과 및 피부 탄력 증진 효과를 나타내어 피부 노화 방지에 효과적이며, 상기 유효성분 각각에 의한 피부 노화 방지 효과보다 상승적인 효과를 나타낸다.

또한, 상기와 같은 유리한 효과를 나타내는 본 발명의 화장료 조성물은 피부자극이 없으며 장기 보존 안정성도 뛰어나 화장품 원료로서 매우 유용하다.

따라서, 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 포함하는 본 발명의 화장료 조성물은, 피부 노화 방지용 화장료 조성물, 피부 주름 개선용 화장료 조성물 및 피부 탄력 증진용 화장료 조성물로 표시될 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 예덕나무 추출물의 제조

예덕나무 (Bioland, 한국)의 수피를 정제수로 세척한 후 건조하고 작은 조각으로 파쇄한 뒤, 여기에 건조 중량의 10배의 70% 에틸 알코올을 가하였다. 15℃에서 5일간 추출한 후 300 메쉬 여과포로 여과하고, 다시 와트만 5번 여과지로 여과한 후, 회전 감압증발기로 건조하였다. 건조된 예덕나무 추출 파우더를 50% 1,3-부틸렌글리콜에 용해하여 사용하였다.

실시예 2 : 예덕나무 추출물의 엘라스테이즈 활성 억제 효과

상기 실시예 1에서 제조한 예덕나무 추출물에 대하여 엘라스테이즈 (elastase) 활성 억제 효과를 측정하였다.

96-웰 플레이트에 완충용액 (Tris 용액, pH 8.0) 60 ㎕, 기질액 (Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide)(시그마-알드리치) 20 ㎕, 25, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 농도의 예덕나무 추출물 각각 100 ㎕ 및 효소액 (Porcine Pancreatic Elastase)(시그마-알드리치) 20 ㎕를 첨가하여 25℃에서 15분간 반응시켰다. 반응 후 410 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조군은 예덕나무 추출물 대신에 증류수를 사용하여 같은 방법으로 반응을 시키고 흡광도를 측정하였다. 엘라스테이즈 억제율은 하기의 수학식으로 구하였으며, 그 결과를 표 1에 나타내었다.

예덕나무 추출물의 엘라스테이즈 활성 억제 효과

시험농도(㎍/㎖)	엘라스테이즈 억제율(%)
25	22.1
50	59.4
100	75.7
200	75.8

상기 표 1의 결과에서 확인할 수 있는 바와 같이 예덕나무 추출물은 처리농도 의존적으로 엘라스테이즈 억제율이 증가하므로, 엘라스테이즈 억제 효과가 우수함을 알 수 있었다.

실시예 3 : 예덕나무 추출물의 콜라겐 합성 효과

실시예 1에서 제조한 예덕나무 추출물을 이용하여 사람에서 유래한 정상 섬유아세포에 대한 제 1형 콜라겐의 합성 촉진 효과를 측정하였다.

사람의 정상 섬유아세포 (fibroblast)를 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM (Sigma Co., Ltd. 미국)이 들어 있는 48-웰 마이크로 플레이트에 1 ×10⁵ 세포/웰의 농도로 접종시키고, 5% 농도(CO₂)의 CO₂ 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 상기 사람의 정상 섬유아세포는 병원에서 신생아의 포경 수술 후 채취한 피부조직을 분리하여 사용하였다. 예덕나무 추출물을 25, 50, 100 및 200 ㎍/㎖의 농도로 각각 포함하며 혈청이 들어있지 않은 DMEM을 만들어 상기 섬유아세포 배양 배지를 이 배지로 교체하여 36시간 동안 섬유아세포를 배양한 후 세포배양액을 채취하였다.

타카라사 (Takara Shuzo Co., Ltd. 일본국)의 콜라겐 단백질 측정키트를 사용하여, 채취한 세포배양액에서 생성된 프로콜라겐 타입 I C-펩타이드의 양을 측정함으로써, 제1형 콜라겐의 생성 촉진 정도를 확인하였다. 먼저 1차 콜라겐 항체가 균일하게 도포 된 96-웰 마이크로 플레이트에 채취된 세포배양액을 넣고 37℃에서 3시간 동안 항원-항체 반응이 일어나도록 하였다. 웰 내의 세포배양액을 제거하고 PBS 완충용액으로 4회 세척하였다. 각 웰에 발색 유발 물질을 넣고 상온에서 15분간 반응시킨 후, 1 N 황산용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 분광광도계로 파장 450 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 표준용액을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 상기의 방법으로 얻은 흡광도를 표준곡선에 대입하여 각 시료가 첨가된 세포배양액의 콜라겐 생성량을 산출하였다. 콜라겐 합성 촉진율은 하기의 수학식으로 구하였으며, 그 결과를 표 2에 나타내었다.

상기 수학식에서, A는 시료 첨가 배양액의 콜라겐 생성량이며, B는 시료를 첨가하지 않은 배양액의 콜라겐 생성량이다.

예덕나무 추출물의 콜라겐 합성 효과

시험농도(㎍/㎖)	콜라겐 합성 촉진율(%)
25	15.7
50	43.6
100	71.1
200	71.4

상기 표 2에서 보는 바와 같이, 예덕나무 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 피부 진피 세포인 섬유아세포로부터의 콜라겐 합성량이 증가하는 것을 확인 할 수 있었다. 따라서, 본 발명의 예덕나무 추출물은 콜라겐 합성을 촉진한다.

실시예 4 : 예덕나무 추출물의 엘라스틴 합성 효과

실시예 1에서 제조한 예덕나무 추출물을 이용하여 사람에서 유래한 정상 섬유아세포에 대한 엘라스틴 합성 효과를 측정하였다.

사람의 정상 섬유아세포 (fibroblast)를 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM (Sigma Co., Ltd. 미국)이 들어 있는 48-웰 마이크로 플레이트에 1 ×10⁵ 세포/웰 농도로 접종시키고, 5% 농도(CO₂)의 CO₂ 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 상기 사람의 정상 섬유아세포는 병원에서 신생아의 포경 수술 후 채취한 피부조직을 분리하여 사용하였다. 예덕나무 추출물을 25, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 농도로 포함하는 혈청이 들어있지 않은 DMEM 배지를 만들고, 상기 섬유아세포 배양 배지를 이 배지로 교체하여 48시간 동안 섬유아세포를 배양한 후 세포배양액을 채취하였다.

바이오컬러사 (Biocolor Ltd. 아일랜드국)의 엘라스틴 단백질 측정 키트를 사용하여, 채취한 세포배양액에서 생성된 엘라스틴의 양을 측정함으로써 엘라스틴 촉진 정도를 확인하였다. 침전용액을 채취된 세포배양액에 넣고 잘 섞어 0℃에서 12시간동안 반응이 일어나도록 하였다. 10,000 ×g에서 10분 동안 원심분리하여 침전물을 얻어내었다. 이 침전물에 90% 암모늄 설페이트 용액을 첨가하고 파스틴 (Fastin) 염색 용액을 첨가하여 1시간동안 반응이 일어나도록 하였다. 10,000 × g에서 10분 동안 원심분리하여 상등액을 제거하였다. 파스틴 해리 용액을 첨가하고 분광 광도계로 파장 513 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 엘라스틴 표준용액을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 상기의 방법으로 얻은 흡광도를 표준곡선에 대입하여 각 시료가 첨가된 세포배양액의 엘라스틴 생성량을 산출하였다. 엘라스틴 합성 촉진율은 하기의 수학식으로 구하였다.

상기 수학식에서, A는 시료 첨가 배양액의 엘라스틴 생성량이며, B는 시료를 첨가하지 않은 배양액의 엘라스틴 생성량이다.

예덕나무 추출물의 엘라스틴 생합성 촉진 효과

시험농도(㎍/㎖)	엘라스틴 합성 촉진율(%)
25	18.9
50	26.3
100	45.8
200	67.5

상기 표 3에서 보는 바와 같이, 예덕나무 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 피부 진피 세포인 섬유아세포로부터 엘라스틴 합성 촉진율이 증가하였다. 따라서, 본 발명의 예덕나무 추출물은 엘라스틴의 생합성을 효과적으로 촉진시킴을 알 수 있다.

실시예 5 : 예덕나무 추출물의 MMP-1 생성 억제 효과

실시예 1에서 제조한 예덕나무 추출물의 사람에서 유래한 정상 섬유아세포에 대한 MMP-1 (Matrix metalloproteinase-1) 생합성 억제 효과를 측정하였다. MMP-1은 콜라겐 및 엘라스틴을 분해하는 효소로 알려져 있다.

사람의 정상 섬유아세포 (fibroblast)를 10%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM (Sigma Co., Ltd. 미국)이 들어 있는 48-웰 마이크로 플레이트에 1 ×10⁵ 세포/웰 농도로 접종시키고, 5% 농도(CO₂)의 CO₂ 배양기에서 37℃로 24시간 동안 배양하였다. 상기 사람의 정상 섬유아세포는 병원에서 신생아의 포경 수술 후 채취한 피부조직을 분리하여 사용하였다. 12.5, 25 및 50 ㎍/㎖ 농도의 예덕나무 추출물을 첨가한 혈청이 들어있지 않은 DMEM을 만들고, 상기 섬유아세포 배양 배지를 이 배지로 교체하여 48시간 동안 섬유아세포를 배양한 후 세포배양액을 채취하였다.

케미콘사 (Chemicon international, Inc. 미국)의 MMP-1 단백질 측정키트를 사용하여, 채취한 세포배양액에서 생성된 MMP-1의 양을 측정함으로써 MMP-1 생성 촉진 정도를 확인하였다. 먼저 1차 콜라겐 항체가 균일하게 도포 된 96-웰 마이크로 플레이트에 채취된 세포배양액을 넣고 상온에서 2시간동안 항원-항체 반응이 일어나도록 하였다. 웰 내의 세포배양액을 제거하고 PBS 완충용액으로 4회 세척하였다. 각 웰에 효소 표지 항체 용액을 넣고 상온에서 60분간 반응시킨후 웰 내의 반응액을 제거하고 PBS 완충용액으로 4회 세척하였다. 발색 유발 물질을 넣고 상온에서 30분간 반응시킨 후, 1 N 황산용액을 첨가하여 반응을 중지시켰다. 분광광도계로 파장 450 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 표준용액을 이용하여 표준곡선을 작성하고, 상기의 방법으로 얻은 흡광도를 표준곡선에 대입하여 각 시료가 첨가된 세포배양액의 MMP-1 생성량을 산출하였다. MMP-1 합성 억제율은 하기의 수학식으로 구하였다.

상기 수학식에서, A는 시료 첨가 배양액의 MMP-1 생성량이며, B는 시료를 첨가하지 않은 배양액의 MMP-1 생성량이다.

예덕나무 추출물의 MMP-1 생합성 억제 효과

시험농도(㎍/㎖)	MMP-1 합성 억제율(%)
12.5	29.1
25	32.5
50	45.5

상기 표 4에서 보는 바와 같이, 예덕나무 추출물의 첨가 농도가 증가함에 따라 피부 진피 세포인 섬유아세포로부터의 MMP-1 합성이 억제되었다. 따라서, 본 발명의 예덕나무 추출물은 MMP-1의 생합성을 감소시킴으로써 콜라겐 및 엘라스틴의 분해를 억제시킴을 확인 할 수 있었다.

실시예 6 : 예덕나무 추출물의 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성 시험

실시예 1에서 제조한 예덕나무 추출물을 이용하여 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 (superoxide dismutase, SODase) 활성을 측정하였다.

NBT (nitroblue tetrazolium) 용액 10 ㎕와 크산틴 (xanthine) 용액 40 ㎕를 96-웰 마이크로 플레이트에 넣었다. 크산틴 산화효소 (xanthine oxidase) 30 ㎕와 포스페이트 버퍼에 25, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 농도로 용해시킨 예덕나무 추출물 120 ㎕를 넣고 25℃에서 20분 동안 반응이 일어나도록 하였다. 분광 광도계로 파장 560 ㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성 촉진율은 하기의 수학식으로 구하였으며, 그 결과를 하기 표에 나타내었다.

상기 수학식에서, A는 시료 (예덕나무 추출물)를 첨가한 반응액의 흡광도이며, B는 시료를 첨가하지 않은 반응액의 흡광도이다.

예덕나무 추출물에 의한 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성 변화

시험농도 (㎍/㎖)	SODase 활성 촉진율(%)
25	24.7
50	56.2
100	79.4
200	84.1

상기 표 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 예덕나무 추출물은 농도 의존적으로 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성을 촉진시켰다.

실시예 7 : 코엔자임 Q-10의 항산화 효과 시험

코엔자임 Q-10의 항산화 효과를 확인하기 위해 자유라디칼 소거 활성을 측정하였다. 코엔자임 Q-10 (시그마-알드리치사, C9538)의 최종 농도가 1, 5 및 10 ㎍/㎖이 되도록 시험에 사용하였다.

자유 라디칼 소거 활성은 DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl)를 이용하여 측정하였다. DPPH는 시그마사 (시그마-알드리치사)에서 구입하여 사용하였다. 먼저 400 μM의 표준 DPPH 용액을 만들었다. 항산화능을 측정하고자 하는 시료에 에탄올을 가하여 각각 2, 10 및 20 ㎍/㎖ 농도의 시료를 만들었으며, 그런 다음 시료와 표준 DPPH 용액을 같은 비율로 첨가하여 잘 교반한 후 37℃에서 30분간 반응시키고 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 비교군으로써 예덕나무 추출물 대신 자유 라디칼 소거 활성을 가진다고 알려져 있는 비타민 E 아세테이트를 동일한 농도로 사용하였고, 대조군으로서 에탄올을 사용하였다.

자유라디칼 소거율은 하기의 수학식으로 구하였으며, 그 결과를 표 6에 나타내었다.

코엔자임 Q-10의 자유 라디칼 소거 효과

최종실험농도	자유 라디칼 소거율(%)
	비타민 E 아세테이트	코엔자임 Q-10
1 ㎍/㎖	26.4	54.2
5 ㎍/㎖	38.5	71.3
10 ㎍/㎖	54.0	89.6

상기 표 6에서 확인할 수 있는 바와 같이, 코엔자임 Q-10은 기존에 자유라디칼 소거제로 사용되는 항산화제인 비타민 E 아세테이트에 비해 동일 농도에서의 자유 라디칼 소거율이 훨씬 높아 항산화 효과가 월등히 우수한 것으로 나타났다.

실시예 8 : 코엔자임 Q-10의 세포 증식 촉진 효과

섬유아세포는 마우스 유래 NIH/3T3 (ATCC CRL 1658) 세포주를 구입하여 사용하였다. 포도당 4.5 g/ℓ, 10% 혈청 및 1% 항생제가 함유된 DMEM에 섬유아세포를 2 × 10³ 세포/웰 농도로 접종하여 75 ㎠ T-플라스크에서 37℃에서 배양하였다. 5% CO₂ 조건하에서 24시간 동안 배양한 후, 0.02% EDTA가 함유된 0.05% 트립신 (Trypsin)을 처리하여 세포를 분리한 후 96 웰-플라스크에 접종하여 6시간 동안 배양하였다. 코엔자임 Q-10을 완충용액에 녹인 후 25, 50, 100 및 200 ㎍/㎖ 농도가 되도록 MEM에 희석시켜 상기 배양된 섬유아세포에 처리하여 37℃에서 4일간 배양하였다. 배양한 후 배지를 수득하여 570 nm에서 흡광도를 측정하여 세포 증식 정도를 비교하였다.

코엔자임 Q-10에 의한 세포 증식 효과

최종실험농도	흡광도 (570nm)
0 ㎍/㎖	0.853
25 ㎍/㎖	0.915
50 ㎍/㎖	1.240
100 ㎍/㎖	1.568
200 ㎍/㎖	1.572

상기 표 7에서 확인할 수 있는 바와 같이, 코엔자임 Q-10은 처리 농도 의존적으로 세포의 증식을 촉진하는 것으로 나타났다.

상기 실험예를 통해 예덕나무 추출물의 엘라스테이즈 활성 억제 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과, 엘라스틴 합성 촉진 효과를 갖고, 코엔자임 Q-10의 MMP-1의 생합성 억제 효과, 슈퍼옥사이드 디스뮤테이즈 활성 촉진 효과, 항산화 효과 및 세포성장 촉진 효과가 우수함을 확인하였다. 이에, 피부 노화의 예방과 치료에 우수한 효과가 기대되는 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 동시에 함유하는 여러 가용화제형과 유화제형의 화장료를 조성하여 제시한다. 그러나 본 발명의 조성물이 하기 제형예들에 제한되는 것은 아니다.

제형예 1: 유연화장수 (스킨로션)

하기 표의 조성으로 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 유연화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
예덕나무 추출물	1.0
코엔자임 Q-10	0.5
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
PEG 1500	1.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
소듐 히아루로네이트	5.0
에탄올	10.0
옥틱도데세스-16	0.2
폴리솔베이트 20	0.2
향	0.02
유니사이드-유 13	0.01
그린 #13	0.001
증류수	잔량
합계	100

제형예 2: 수렴화장수

하기 표의 조성으로 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 수렴화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
예덕나무 추출물	1.0
코엔자임 Q-10	0.5
글리세린	2.0
1,3-부틸렌글리콜	2.0
알란토인	0.2
DL-판테놀	0.2
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
소듐 히아루로네이트	3.0
에탄올	15.0
폴리솔베이트 20	0.3
위치하겔 추출물	2.0
구연산	미량
향	0.02
유니사이드-유 13	0.01
그린 #13	0.001
증류수	잔량
합계	100

제형예 3: 영양화장수

하기 표의 조성으로 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 영양화장수를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
예덕나무 추출물	1.0
코엔자임 Q-10	1.0
글리세릴 스테아레이트 SE	1.5
세테아릴알콜	1.5
라놀린	1.5
폴리솔베이트 60	1.3
솔비탄스테아레이트	0.5
경화식물유	1.0
광물유	5.0
스쿠알란	3.0
트리옥타노인	2.0
디메치콘	0.8
초산 토코페롤	0.5
카르복시비닐 폴리머	0.12
글리세린	5.0
1,3-부틸렌글리콜	3.0
소듐히아루로네이트	5.0
트리에탄올아민	0.12
향	0.01
유니사이드-유 13	0.02
그린 #3	0.003
증류수	잔량
합계	100

제형예 4: 영양크림

하기 표의 조성으로 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 영양크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
예덕나무 추출물	1.0
코엔자임 Q-10	1.0
친유형 모노스테아린산글리세린	2.0
세테아릴알콜	2.2
스테아린산	1.5
밀납	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
경화식물유	1.0
스쿠알란	3.0
광물유	5.0
트리옥타노인	5.0
디메치콘	1.0
소듐마그네슘실리케이트	0.1
글리세린	5.0
베타인	3.0
트리에탄올아민	1.0
소듐히아루로네이트	4.0
향	0.01
유니사이드-유13	0.02
그린 #3	0.003
증류수	잔량
합계	100

제형예 5: 맛사지 크림

하기 표의 조성으로 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 맛사지 크림을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
예덕나무 추출물	1.0
코엔자임 Q-10	0.5
친유형 모노스테아린산 글리세린	1.5
세테아릴알콜	1.5
스테아린산	1.0
폴리솔베이트 60	1.5
솔비탄스테아레이트	0.6
이소스테아릴 이소스테레이트	5.0
스쿠알란	5.0
광물유	35.0
디메치콘	0.5
히드록시에틸셀룰로오스	0.12
글리세린	6.0
트리에탄올아민	0.7
향	0.01
유니사이드-유13	0.02
그린 #3	0.003
증류수	잔량
합계	100

제형예 6: 에센스

하기 표의 조성으로 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 에센스를 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
예덕나무 추출물	1.0
코엔자임 Q-10	1.0
글리세린	10.0
베타인	5.0
PEG 1500	2.0
알란토인	0.1
DL-판테놀	0.3
EDTA-2Na	0.02
벤조페논-9	0.04
히드록시에틸 셀룰로오스	0.1
소듐 히아루로네이트	8.0
카르복시비닐폴리머	0.2
트리에탄올아민	0.18
옥틸도데칸올	0.3
옥틸도데세스-16	0.4
에탄올	6.0
향	0.02
유니사이드-유 13	0.01
그린 #3	0.001
증류수	잔량
합계	100

제형예 7: 팩

하기 표의 조성으로 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 팩을 통상의 방법에 따라 제조하였다.

성분	함량 (중량%)
예덕나무 추출물	1.0
코엔자임 Q-10	0.5
폴리비닐알콜	15.0
셀룰로오스 검	0.15
글리세린	3.0
PEG 1500	2.0
시이크데스트린	0.15
DL-판테놀	0.4
알란토인	0.1
글리시리진산 모노암모늄	0.3
니코틴아미드	0.5
에탄올	6.0
PEG 40 경화피마자유	0.3
향	미량
유니사이드-유13	0.02
그린 #3	0.003
증류수	잔량
합계	100

실시예 9 : 피부 주름 개선 효과 평가

본 발명의 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 화장료의 주름 개선 효과를 실제 사용 테스트를 통하여 평가하였다. 제형예 4의 영양크림을 실험예로 하였으며, 제형예 4에서 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 정제수로 대체한 대조예의 제형, 제형예 4에서 예덕나무 추출물을 정제수로 대체한 비교예 1의 제형, 그리고 제형예 4에서 코엔자임 Q-10을 정제수로 대체한 비교예 2의 제형을 제조하였다. 제조한 크림은 매일 아침 저녁 2회씩 세안 후 적당량 피검자의 눈가를 중심으로 2개월간 연속적으로 바르게 하였다. 80명의 37-52세의 여성을 무작위로 4개군으로 나누어 각각 대조예, 실험예, 비교예 1 및 비교예 2의 크림을 눈가에 바르게 하였다. 각 피검자의 노화에 의한 눈가 주름 생성의 예방 및 치료 효과는 육안 관찰을 통하여 평가하였다.

노화에 의한 주름 개선 효과

처리군	주름 개선 효과 우수	주름 개선 효과 적음	주름 개선 효과 없음	유효율(%)
대조예	0	6	14	15.0
실험예	13	5	2	77.5
비교예 1	3	4	13	25.0
비교예 2	4	5	11	32.5

상기 표 15의 결과에서 나타난 바와 같이, 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 동시에 함유한 제형은 각각을 함유한 제형에 비해 주름 개선 효과가 월등히 우수함을 알 수 있었다.

실시예 10 : 피부 탄력 증진 효과

본 발명의 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 화장료의 피부 탄력 증진 효과를 평가하였다. 제형예 4의 영양크림을 실험예로 하고, 제형예 4에서 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 정제수로 대체한 대조예의 제형, 제형예 4에서 예덕나무 추출물을 정제수로 대체한 비교예 1의 제형, 그리고 제형예 4에서 코엔자임 Q-10을 정제수로 대체한 비교예 2의 제형을 제조하였다. 제조한 크림은 매일 아침, 저녁 2회씩 세안 후 적당량 피검자의 눈가를 중심으로 2개월간 연속적으로 바르게 하였다. 80명의 37-52세의 여성을 무작위로 4개군으로 나누어 각각 대조예, 실험예, 비교예 1 및 비교예 2의 크림을 눈가에 바르게 하였다. 각 피검자의 광노화에 피부 탄력의 증감 정도는 피부 탄력 측정기 (cutometer(C+K, 독일))를 이용하여 측정하였으며, 그 결과를 표 16에 나타내었다.

피부 탄력의 변화

처리군	탄력 증감율(%, n=20)
대조예	(+)2.2
실험예	(+)28.5
비교예 1	(+)7.6
비교예 2	(+)10.4

상기 표 16의 결과에서 나타난 바와 같이 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 동시에 함유한 제형은 각각을 함유한 제형에 비해 피부 탄력 증진 효과가 월등히 우수함을 확인할 수 있었다.

실시예 11 : 피부 자극 시험

본 발명의 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 함유하는 화장료의 피부 자극을 평가하였다. 제형예 4의 영양크림을 실험예로 하고, 제형예 4에서 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 정제수로 대체한 대조예의 제형을 제조하였다.

화장료의 피부 자극성을 시험하기 위해, 건강한 성인 남녀 20명을 대상으로 첩포 시험 (patch test)을 헤이즈 테스트 쳄버 (Haye's Test Chamber)를 이용하여 실시하였다. 시험부위를 70% 에탄올로 닦아내고 건조시킨 다음, 준비된 시험물질 15 ㎍ 또는 15 ㎕를 적하한 쳄버 (Finn chamber, 100 ×10, EPITEST, 핀란드국)를 시험 대상자의 전박 (forearm) 안쪽 부위에 밀폐 첩포하였다. 24시간 동안 첩포하고 첩포를 제거한 후 표시펜으로 시험 부위를 표시하였다. 각각 1시간 그리고 24시간 후 (첩포 제거 후 1시간, 24시간 후 = 첩포 부착 포함 24시간, 48시간)에 확대경 (8MC-150, DAZOR, 미합중국)을 이용하여 시험 부위를 관찰하여 홍반 및 부종 유무를 관찰하였다. 피부 반응은 국제접촉피부염연구회 (ICDRG: International Contact Dermatitis Research Group)의 규정(표 17)에 따라 판정하였으며, 하기 수학식에 의하여 평균 피부 반응도를 계산하고 그 결과를 표 18에 나타내었다.

피부 반응의 평가 기준 및 점수

기호	점수	평가기준
-	0	무반응, 정상 피부
±	0.5	희미한 또는 가벼운 홍반
+	1.0	경계가 뚜렷하나 약한 홍반, 부종 및 구진
++	2.0	뚜렷한 홍반, 구진 및 소수포
+++	3.0	심한 홍반 및 소포형성
++++	6.0	대수포 형성

시험 물질	24 시간	48 시간	평균 피부 반응도 (n=20)
	± + ++	± + ++
실시예	1 - -	1 - -	0.42
대조예	1 - -	1 - -	0.42

상기 표 18에 나타난 바와 같이, 본 발명에서 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 모두 함유하지 않은 대조예의 크림에서의 피부 반응도는 매우 낮아 크림의 기타 함유 성분에 의해서는 피부 자극을 유발하지 않음을 알 수 있었다. 또한 실시예의 결과에서 나타난 바와 같이 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 첨가하여도 피부 자극이 나타나지 않음을 알 수 있었다.

실시예 12 : 제형의 안정성 시험

제형예 4의 영양크림을 실험예로 하고, 제형예 4에서 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10을 정제수로 대체한 대조예의 제형을 제조하였다.

상기 제형들에 대하여 4℃, 45℃, 50℃ 및 4℃- 45℃ 사이클 (Cycle)의 항온조 및 실온에서 1주일, 1개월 및 6개월을 단위로 하여 장기 보전 안정성을 하기 표 19의 평가기준으로 평가하여 그 결과를 표 20에 나타냈다.

양호	O
불안정	X
분리	△

보전 조건		실시예	대조예
4℃	1주일	0	0
	1개월	0	0
	6개월	0	0
45℃	1주일	0	0
	1개월	0	0
	6개월	0	0
50℃	1주일	0	0
	1개월	0	0
	6개월	0	0
Cycle	1주일	0	0
	1개월	0	0
	6개월	0	0
실온	1주일	0	0
	1개월	0	0
	6개월	0	0

상기 표 20에 나타난 바와 같이, 활성 성분을 함유하지 않은 대조예의 제형에서 안정성이 양호 한 것으로 볼 때 제형의 기타 함유 성분에 의해서는 안정성에 문제가 없음을 알 수 있었고, 실시예의 제형에서도 장기 보관 안정성이 나타나므로 활성성분인 예덕나무 추출물과 코엔자임 Q-10의 첨가에 의해서도 안정성에 문제가 없음을 알 수 있었다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명은 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 화장료 조성물은 상기 유효성분의 혼합에 의해 피부탄력 증진 효과 및 피부주름 개선 효과가 상승적으로 증가하여 피부 노화 방지에 유용하게 사용될 수 있다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (7)

1. 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 노화 방지용 화장료 조성물.
2. 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 화장료 조성물.
3. 예덕나무 추출물 및 코엔자임 Q-10을 유효성분으로 함유하는 피부 탄력 증진용 화장료 조성물.
4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 예덕나무 추출물은 물, 탄소수 1-4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트 및 1,3 부틸렌 글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 용매를 사용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제 4 항에 있어서, 상기 예덕나무 추출물은 에틸 알코올을 사용하여 추출되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 화장료 조성물 총 중량에 대하여 상기 예덕나무 추출물은 0.0001-10.0 중량%, 상기 코엔자임 Q-10은 0.01-1.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
7. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 화장료는 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이로 구성된 군으로부터 선택되는 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.