KR20060114954A

KR20060114954A - 펙틴 유도체 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20060114954A
Application number: KR1020050037188A
Authority: KR
Inventors: 이현규
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2005-05-03
Filing date: 2005-05-03
Publication date: 2006-11-08
Also published as: KR100656877B1

Abstract

본 발명은 펙틴 유도체 및 이의 용도에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 펙틴을 구성하는 다당 중 피라노스(pyranose) 고리구조의 C-6 위치에 일정 치환기를 부여함으로써 펙틴 유도체의 용해도 및 점도특성 등의 물성과 항응고 활성, 항균활성, 담즙산 결합능 및 안지오텐신 전환 효소 저해능 등의 생리활성을 증강시키며, 상기한 치환기의 종류 및 치환도를 일정 범위로 조절하여 제조된 펙틴 유도체를 식품 및 의약학적인 용도로 다양하게 적용할 수 있도록 한 효과가 있다.

펙틴, 유도체, 치환기

Description

펙틴 유도체 및 이의 용도{Pectin derivatives and use for them}

도 1은 펙틴의 탈메틸화(demethylation) 경로를 간단하게 나타낸 그림이다.

도 2는 펙틴의 아미드화(amidation) 경로를 간단하게 나타낸 그림이다.

도 3은 펙틴의 황산염화(sulfation) 경로를 간단하게 나타낸 그림이다.

도 4는 펙틴의 아민화(amination) 경로를 간단하게 나타낸 그림이다.

도 5는 펙틴 및 펙틴 유도체의 적외선(IR) 분광분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 6은 펙틴 및 펙틴 유도체의 ¹H-NMR(핵자기 공명) 분광분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 7은 펙틴 및 펙틴 유도체의 ¹³C-NMR(핵자기 공명) 분광분석 결과를 나타낸 그래프이다.

도 8은 펙틴 및 펙틴 유도체의 점도 특성(flow curve) 결과를 나타낸 그래프이다.

도 9는 펙틴 및 펙틴 유도체의 안지오텐신 전환효소(ACE) 저해활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 10은 펙틴 및 펙틴 유도체의 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 항균활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 11은 펙틴 및 펙틴 유도체의 비브리오 피셔리(V. fischeri)에 대한 항균활성 측정 결과를 나타낸 그래프이다.

도 12는 황산염화 펙틴(SFP)과 헤파린의 응고시간(prothrombin time) 결과를 나타낸 그래프이다.

펙틴은 과채류의 1차 세포벽과 중엽에서 존재하는 다당류로서 과채류와 그 가공식품의 조직감 및 레올로지에 영향을 미치고 상업적으로는 주스 가공 부산물인 감귤류 껍질이나 사과박을 고온의 산(acid) 용액으로 처리하여 추출, 분리, 정제하여 점증제, 겔화제, 안정제 등의 기능성을 가진 수용성 하이드로콜로이드로서 잼, 젤리, 요구르트 증의 각종 가공식품에 광범위하게 사용되고 있으며 최근에는 지방대체제로도 개발된 바 있다(Hwang, 1995).

영양학적으로도 펙틴은 많은 생리활성이 알려져 있는데 물에 녹으면서 인체내의 소화효소에 의해 분해되지 않는 수용성 식이섬유로 작용하여 혈중 콜레스테롤을 저하시키고 당뇨병 환자의 당 불내증(glucose intolerance)를 감소시킨다 (Tinker et al., 1994). 그리고, 펙틴을 알칼리 처리 및 강산에 의해 가수분해한 변성 시트러스 펙틴(modified citrus pectin)은 B16-F1 흑색종(melanoma) 세포의 폐 집락화(lung colonization)를 90 % 이상 감소시키고(Platt & Raz, 1992), 전립선암의 전이 저해제로 개발될 가능성이 높다는 발표가 있었다(Pienta et al., 1995). 최근 한약재를 포함한 많은 식물에서 추출된 펙틴에서 면역 항진 작용, 항응고 작용, 항궤양 작용 및 혈당 저하 작용 등 많은 생리 활성이 보고됨에 따라 펙틴의 응용범위가 더욱 확대되어 가고 있다(Shin, 1999).

펙틴의 구조는 갈락투론산(galacturonic acid)의 α-1,4결합하고 중간 중간에 람노즈(rhamnose)가 주기적으로 연결되어 주 골격을 이루며, 우론산(uronic acid)의 카르복시기(carboxyl)가 메틸 에스테르(methyl ester)를 이루고 있어, 상기 에스테르화 정도에 따라 LMP(DE 50% 이하), HMP(DE 50% 이상)으로 나뉜다.

HMP의 겔 형성에는 카르복시기 제거를 위한 산(pH 2.0 ∼ 3.5)과 수분, 펙틴과 수소결합하기 위한 당의 첨가(Bx > 60 ∼ 65 %)가 필요하다. 반면에 LMP은 pH는 1 ∼ 7 그 이상도 가능하고(pH는 텍스쳐에 영향 미침), Ca⁺⁺의 첨가의 의한 자 유 카르복시기와의 이온결합에 의해서 겔이 형성된다(Hwang & Chun, 1996).

펙틴의 DE는 인위적으로 낮추지 않으면 60 ∼ 90 %의 분포를 보이는데, HMP는 중성 근처의 pH 5 ∼ 6과 상온에서만 안정하고, 온도와 pH가 증가할수록 점도와 겔의 강도가 빠르게 감소하는 반면, LMP의 물성은 상온에서 더 긴 시간동안 안정하며 고온에서도 형태를 유지하는 등의 장점을 나타내기 때문에, 일반적으로 상기 HMP을 산, 효소, 알칼리 등으로 처리하여 LMP를 제조하여 사용한다.

ADP도 Ca⁺⁺의 첨가만으로 겔을 형성하지만, 그 물성에 있어서 pH 3 이하에서 LMP는 겔 강도가 감소하는데 비해 ADP는 겔 강도가 강화되는 등(Lootens et al., 2003)의 다른 물성을 보인다.

황산화 유도체들은 항 AIDS 활성, 항혈액 응고 활성, 암세포 전이 억제, 면역 활성 등 많은 생리활성이 보고 되어 있다. 현재 혈액의 항응고제로 가장 널리 사용되고 있는 헤파린은 항응고 활성은 우수하나, 가격이 비싸고 동물성 추출물이기 때문에 과민 반응이나 장기간 사용에 따른 출혈 등 부작용이 있어 키토산, 커드란, 덱스트란 등 천연 다당류를 황산염화(sulfation)시켜서 유사 헤파린을 제조하고 항응고 활성을 시험하는 연구가 이루어져왔다. 그리고, 황산염화 아세틸 키토산(sulfated N-acetyl chitosan, 3,6-O-disulfate)이 자발적인 전이성 고형암인 BL6, B16 흑색종(melanoma) 세포를 이식한 쥐에 대해 양 의존적(20 ∼ 100 mg/kg)으로 폐암전이를 억제했으며, 황산염화 덱스트란(sulfated dextran)은 전이를 막는 능력이 있어 AIDS와 패혈증과 전립선암의 치료제로 쓰이고 있다.

아민화(Amination)는 키토산에 적용되어 중금속 흡착능이 향상되었고 양이온을 높여 항콜레스테롤 활성을 증진 시키며, 귀리와 보리의 β-글루칸에 적용 되어 담즙산 결합능(bile acid binding capacity), ACE 활성 저해능 및 항균 활성이 있음이 보고 되었다.

식품으로의 안정성 면에서는 이미 ADP와 LMP는 식품첨가물로 광범위하게 사용되고 있으며 아미드기를 치환한 ADP가 유해하지 않다면 ANP도 큰 유해함이 없을 것이라 예상되며, 황산염화 다당은 식품으로서보다 의료적 목적으로 사용 되고 있다.

이에 본 발명의 발명자들은 다당의 일종인 펙틴의 구조변화에 따른 물성 및 생리활성을 연구한 결과, 펙틴 유도체가 그 치환기에 따라 고유의 생리활성이 보다 증강됨을 알게되어 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 생리활성이 증강되어 식품 및 의약학적인 용도로 적용가능한 펙틴 유도체와 이의 용도를 제공하는데 그 목적이 있다.

본 발명은 다음 화학식 1로 표시되는 피라노스(pyranose) 고리구조를 포함하는 펙틴 유도체를 특징으로 한다.

상기 화학식 1에서, R은 황산염기, 아미드기, 아민기이고, R₁은 수소 또는 황산염기이다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 펙틴을 구성하는 다당 중 피라노스(pyranose) 고리구조의 C-6 위치에 일정 치환기를 부여함으로써 펙틴 유도체의 물리적 물성과 생리활성을 증강시키며, 상기한 치환기의 종류 및 치환도를 일정 범위로 조절하여 제조된 펙틴 유도체를 식품 및 의약학적인 용도로 다양하게 적용하고자 함에 그 특징이 있다.

본 발명에서는 펙틴을 구성하는 다당 중 피라노스(pyranose) 고리구조의 C-6 위치에 아미드기, 황산염기 및 아민기를 각각 일정 치환정도로 도입하였다.

본 발명의 펙틴 유도체 중 아미드화 펙틴은 아미드기 치환도가 10 ∼ 30% 범위인 것을 사용할 경우 보다 바람직한 생리 활성 효과를 나타내게 된다.

또한, 본 발명의 펙틴 유도체 중 황산염화 펙틴은 황산염기 치환도가 10 ∼ 20% 범위인 것을 사용하는 경우 보다 바람직한 생리 활성 효과를 나타내게 된다.

또한, 본 발명의 펙틴 유도체 중 아민화 펙틴은 아민기 치환도가 20 ∼ 40% 범위인 것을 사용하는 경우 보다 바람직한 생리 활성 효과를 나타내게 된다.

상기와 같이 펙틴 유도체 중 특히 황산염화 펙틴(SFP)은 점도가 감소되고, 항응고 활성과 항균활성이 우수하여, 이를 항응고제로서 적용가능함을 확인하였다. 또한, 아민화 펙틴은 점도가 감소되고, 담즙산 결합능, ACE 활성 저해능 및 항균활성이 우수하여, 이를 콜레스테롤 저하시키는 용도로 적용 가능함을 확인하였다. 상기한 각 펙틴 유도체의 치환도가 각 하한가 미만의 범위일 경우 생리 활성의 발현 정도가 미약하며, 상기 범위를 초과하는 치환도를 얻기는 실제 무리가 있다.

상기와 같은 결과를 종합해 볼 때, 본 발명의 펙틴 유도체는 식품산업 뿐만 아니라 의약학 분야에도 다양한 적용 가능성을 가지고 있음을 확인할 수 있으며, 특히 항콜레스테롤 제제, 항고혈압제제 및 면역증강제로서의 응용 가능성이 높음을 알 수 있다.

본 발명의 펙틴 유도체는 임상 투여시에 경구 또는 비경구로 투여, 예를 들어 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소 적용할 수 있으며, 일반적인 의약품 및 건강식품의 형태로 사용될 수 있다.

경구 투여용 제형, 예를 들면 정제, 트로키제(troches), 로렌지(lozenge), 수용성 또는 유성현탁액, 조제분말 또는 과립, 에멀젼, 하드 또는 소프트 캡슐, 시럽 또는 엘릭실제(elixirs)로 제제화된다. 정제 및 캡슐 등의 제형으로 제제하기 위해 락토오스, 사카로오스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아밀로펙틴, 셀룰로오스 또는 젤라틴과 같은 결합제; 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제; 옥수수 전분 또는 고구마 전분과 같은 붕괴제; 스테아린산 마그네슘, 스테아린산 칼슘, 스테아릴푸마르산 나트륨 또는 폴리에틸렌글리콜 왁스와 같은 윤활유가 함유된다. 캡슐제형의 경우는 상기에서 언급한 물질 이외에도 지방유와 같은 액체 담체를 함유한다.

또한, 본 발명의 펙틴 유도체는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여는 피하주사, 정맥주사, 근육 내 주사 또는 흉부 내 주사 주입방식에 의한다. 비경구 투여용 제형으로 제제화하기 위해서는 펙틴 유도체를 안정제 또는 완충제와 함께 물에서 혼합하여 용액 또는 현탁액으로 제조하고 이를 앰플 또는 바이알의 단위 투여형으로 제제한다.

또한, 상기 유효성분의 투여 용량은 일반적으로 성인 환자 체중 1 kg 당 1 ∼ 50 mg/일이고, 바람직하기로는 5 ∼ 20 mg/일이며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간 간격으로 1 ∼ 수회, 바람직하기로는 하루 2 ∼ 3 회 분할 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 펙틴 유도체를 유효성분으로 하는 건강보조제를 포함한다. 상기 건강보조제는 펙틴 유도체를 음료, 차류, 향신료, 껌, 과자류 등의 식품소재에 첨가하거나, 캡슐화, 분말화, 현탁액 등으로 제조한 식품으로, 이를 섭취할 경우 건강상 특정한 효과를 가져오는 것을 의미하나, 일반 약품과는 달리 식품을 원료로 하여 약품의 장기복용시 발생할 수 있는 부작용 등이 없는 장점이 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의거하여 구체적으로 설명하겠는바, 다음 실시예에 의하여 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

제조예 : 재료 및 방법

본 실험에 사용한 펙틴(HMP)은 시트러스 껍질(citrus peel)에서 추출되었고 에스테르화도(DE) 70 %인 펙틴이다[Genu pectin type JMJ, Jupiter International Co.(Korea)]. 유도체 치환에 사용한 시약은 암모니아수(NH₄OH 28 %; Nakarai Chemicals Co. Ltd., Kyoto, Japan), 포름아미드(HCONH₂, Kanto Chemicals, Tokyo), ClSO₃H(chlorosulfuric acid; Kanto Chemicals, Tokyo), NH₄OAc(ammonium acetate , Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)와 NaBH₃CN(sodium cyanoborohydride, Sigma Chemical Co., St. Louis, USA)를 사용했으며 그 외 시약은 일등급 시약을 사용하였다.

실시예 1 : 펙틴 유도체의 제조

1. 탈메틸화 펙틴(Demethylated pectin)의 제조

HMP의 탈메틸화는 펙틴을 1N HCl 포함한 60 % 이소프로판올에 넣고 30 ℃에서 7 일간 반응시킨 후 60 % 이소프로판올로 세척, 여과 후 60 ℃에서 건조시켜 탈메틸화 펙틴(DMP)을 얻었다[El-Nawawi & Heikal(1995)의 방법에 의함]. 탈메틸화(Demethylation)는 메틸에스테르기가 카르복시기로 치환되는 것으로 경로는 첨부도면 도 1에 나타내었다.

2. 아미드화 펙틴(Amidated pectin)의 제조

냉 에탄올 (24 mL)에 HMP(4.0 g)을 넣고 16 mL의 수성(aqueous) NH₄OH와 2시간 동안 교반 하면서 반응시켰다. 반응이 끝나면 과량의 아민을 제거하기 위해 클로로포름으로 세척한 후 0.1 M HCl을 포함하는 증류수와 에탄올(1:1(v/v)) 혼합물과 반응시켰다. 상기 반응물을 40 % 에탄올로 여러 번 세척한 후 80 % 에탄올과 교반한 후 여과하고 60 ℃에서 건조시켜 아미드화 펙틴(ADP)을 얻었다[Lockwood (1976)의 방법에 의함]. 아미드화는 메틸에스테르기가 아미드기로 치환되는 것으로 그 경로를 첨부도면 도 2에 나타내었다.

3. 황산염화 펙틴(Sulfated pectin)의 제조

HMP 1.5 g을 포름아미드 15 mL와 ClSO₃H 10 mL의 혼합액에 넣고 4시간 동안 80 ∼ 90 ℃ 에서 교반시키며 반응시켰다. 반응을 끝낸 후 프로필렌옥사이드 50 mL을 첨가해서 침전물을 생성시키고 침전물은 증류수에 녹인 후 3N-NaOH로 pH 10.0 ∼ 11.0으로 조정할 후 24 시간 동안 투석(Mw < 10,000)한 후 동결건조 하여 황산연화 펙틴(SFP)을 얻었다[Huang등(2003)의 방법에 의함]. 황산염화 펙틴의 구조 변화 경로를 첨부도면 도 3에 나타내었다.

4. 아민화 펙틴(Aminated pectin)의 제조

디메틸설폭사이드(DMSO) 40 mL에 HMP(1.0 g)을 넣고 파라포름알데히드(2.0 g)과 90 ℃에서 3시간 반응시킨 후 125 ℃에서 1시간, 마지막으로 135 ℃에서 1시 간 동안 반응시킨 용액을 실온으로 식힌 다음 암소에서 아세트산 무수물(acetic anhydride)과 20 시간 반응시켜 펙틴을 산화시켰다. 상기 산화된 펙틴을 메탄올로 침전시키고 원심분리한 침전물을 DMSO(100 mL)에 녹인 NH₄OAc(3.6 g)과 NaBH₃CN (2.2 g)와 7 일 동안 실온에서 반응시켰다. 상기 반응을 끝낸 용액을 4일 동안 투석(Mw < 10,000)한 후 동결건조하여 아민화 펙틴(ANP)을 얻었다[Yalpani(1985)의 방법에 의함]. 아민화 펙틴의 구조 변화 경로를 첨부도면 도 4에 나타내었다.

실험예 1 : 펙틴과 펙틴유도체의 구조 분석

1. 구성원소 분석을 위한 원소분석(Element Analysis)

원소분석으로 화합물의 N, C, H, S의 함량을 측정하여 유도체화에 의한 그 함량의 변화로 치환도(DS)를 계산할 수 있다.

이러한 DS는 SFP의 황(S) 함량과 ANP, ADP의 질소(N) 함량을 통해 각각의 갈락투론 단위(galacturonic unit)당 치환된 황산염기, 아미드기 및 아민기의 평균량을 의미한다. 원소분석은 EA(EA1110, CE Instrument, Italy)로 측정하였고 그 치환도는 다음 수학식 1에 의하여 얻었다. 각 펙틴 유도체화 펙틴의 원소분석 결과와 치환도의 결과는 다음 표 1에 나타내었다.

구분	N(%)	C(%)	H(%)	S(%)	치환도(%)
HMP	0.00	39.59	6.05	N.D.¹⁾	-
ADP	1.51	37.66	5.85	N.D.	18.17
SFP	2.26	28.04	4.22	2.68	14.91
ANP	2.59	37.13	5.80	N.D.	31.50
1) 검출되지 않음(not detected)

상기 표 1에 나타낸 바와 같이, SFP는 펙틴(HMP)에 존재하지 않는 S기가 2.68 % 측정되었고, HMP에서 N기가 0.00% 측정된 반면 ADP, ANP는 각각 1.51 %, 2.59 %로 나타나서 펙틴 유도체의 합성이 성공적으로 이루어진 것으로 생각된다.

2. 탈메틸화 펙틴(DMP)의 에스테르화 치환도(DE) 측정

적정에 의한 DMP(Demethylated pectin)의 DE(degree of esterification) 측정은 Limberg 등(2000)의 방법에 따라 HMP 0.25 g을 0.5 mL 에탄올로 적신 후 100 mL의 증류수에 녹이고, 0.1 N NaOH를 적가하여 pH가 9가 될 때까지의 부피(V₁)을 잰 다음 에스테르기(ester group)를 비누화(saponification) 시키기 위해 10 mL의 1 N NaOH을 넣고 실온에서 15 분간 방치하였다. 여기에 0.1 N HCl 10 mL를 넣고 침전물이 녹을 때까지 교반한 후 여기에 다시 0.1 N NaOH를 적가하여 pH 9가 될 때까지의 부피(V₂)를 잰 다음 수학식 2에 의하여 DE를 측정하였으며, DMP의 DE는 41.9 % 로 나타나, 상기한 탈메틸화에 의해 DE 70.0 %의 HMP가 LMP(Low methoxy pectin)으로 치환된 것을 확인할 수 있었다.

3. 치환기 확인을 위한 적외선 분광분석

IR 분광분석기는 유도체들의 치환기를 확인하기 위해 측정하였으며, 각 시료를 Br과 혼합한 후 마쇄하여 펠렛을 만든 후 FT-IR 분광분석기(MAGNa -IR 760 E.S.P)를 사용하여 측정하였으며, 그 결과는 첨부도면 도 5에 나타내었다.

AMD의 IR 분광분석결과는 1500 ∼ 1900 cm^-1의 카르복시 진동(carboxyl vabration)이 중요하며, 이 진동대에는 3개의 특징적 피크(peak)가 있음을 Sitsya등(2000)이 발표한 바와 같이, 도 5에 의하면 메틸기와 카르복시기의 C=O 진동이 1765 cm^-1 에, 아미드 I(amide I)과 아미드 II(amide II)는 1681, 1594 cm^-1 에 피크가 나타나는데 AMD에서도 이것을 확인하였으며, 이로써 펙틴에 아미드기가 치환되었음을 확인하였다.

SFP의 IR 분광분석 결과는 Bae등(2003)에 따라 1300, 1060, 1694 cm^-1에서 설포닐(sulfonyl, O=S=O) 이중결합의 진동이 나타났으며, 810 cm^-1에서는 (C-O-S)의 진동을 확인하였다. ANP의 IR 분광분석 결과 C-N 스트레칭(stretching)의 1250 ∼ 1300 cm^-1 피크와 N-H 스트레칭의 700 ∼ 800 cm^-1 피크를 확인하였다(Yalpani, 1985).

4. 결합양식 확인을 위한 ¹ H- 및 ¹³ C-NMR 분광분석

펙틴과 유도체들의 구조 및 당쇄 결합 양식을 조사하기 위하여 핵자기 공명 분광분석법(nuclear magnetic resonance spectroscopy)을 사용하였다. 시료들은 D₂O(∼10 mg/mL)에 녹여, UNITY INOVA 분광분석기(Varian Co., USA)을 이용하여 ¹H-NMR 과 ¹³C-NMR 을 측정하였으며, 그 결과는 첨부도면 도 6에 나타내었다.

도 6에 의하면, HMP의 4.6 ∼ 4.8 ppm 에서의 피크는 유리된 카르복시기의 H-5 원자인데 유리된 카르복시기의 H원자가 감소하고 메틸에스테르 결합의 수소가 증가할수록 이 피크는 4.6 ppm 방향으로 이동한다. H-4는 4.4 ppm에서 보여지며 탈메틸화에 의해 다운필드(downfield)로 약간 이동한다. ¹H-NMR을 통해 메틸화도(degree of methylation, DM)을 구할 수 있는데 이는 메틸 에스테르 피크의 적분값을 메틸 에스테르와 유리 카르복시기 피크k의 적분의 합으로 나눈 값이다(Christoph et al., 2003).

¹³C-NMR을 통해 확인한 HMP, ADP, SFP, ANP의 분자 구조는 첨부도면 도 7에 나타내었다. HMP는 주골격인 람노갈락투로난(rhamnogalacturonan)과 거기에 결합된 측쇄의 피크가 보이는 반면 모든 유도체들은 주골격인 호모갈락투로난( homogalaturonan)만이 존재하여 유도체 과정 중 측쇄가 제거됨을 알 수 있었다. 그리고, HMP의 172 ppm의 피크는 메틸 에스테르기의 C-6이고 176 ppm은 갈락투론산의 C-6을 나타낸 것으로, 펙틴과 ADP에는 두 개의 피크가 모두 보이는 반면 SFP와 ANP는 176 ppm 의 하나의 피크만 있는 것으로 보아 메틸기가 치환에 의해 없어진 것으로 판단된다(Mukhiddinov et al., 2000).

실험예 2: 펙틴과 펙틴 유도체의 물리적 성질 측정

1. 용해도(Water solubility)

펙틴과 펙틴 유도체들의 물에 대한 용해도는 Chang & Cho(1997)의 방법에 의하여 측정하였다. 각 시료를 10 mg/mL의 농도로 1 mL 제조한 후, 25 ℃에서 24시간 교반시켰다. 과포화된 분산액을 1600ㅧ g에서 15분간 원심분리( -- rpm)한 후 상등액을 취하여 상등액 3배 부피의 에탄올을 첨가한 후 3500 × g 에서 15분간 원심분리하여 침전물을 회수하고, 60 ℃ 진공오븐에서 건조 및 칭량한 후 1 mL의 물속에 용해된 무게를 측정하여 물에 대한 용해도를 계산하였다. 실온(25℃)에서 물에 대한 용해도를 측정한 결과는 다음 표 2에 나타내었다.

시료	물에 대한 용해도(%)
HMP	74.4
DMP	29.6
ADP	72.6
SFP	69.2
ANP	54.0

상기 표 2에 나타낸 바와 같이, HMP와 SFP, ADP는 용해도가 높은 반면 ANP과 DMP는 용해도가 감소하였다. 상용 LMP(DE 38 %)의 경우 같은 조건에서 용해도가 74.6 %로 HMP와 차이가 없었으나, DMP의 용해도가 급격히 떨어진 것은 산에 의한 구조의 붕괴에 의한 것으로 생각된다. 그러나, DMP는 가열시 물에 녹아 점성이 있는 용액이 되었지만, ANP는 가열에 의한 용해도의 변화가 없었다.

2. 유동특성(Flow property)

각 시료의 점성을 비교하기 위해서 25 ℃에서 2%의 농도로 증류수에 녹인 후 레오메터기(Rheostress RS1, Thermo Haake, Germany)를 이용하여 측정하고, 전단율(shear rate)을 0 ∼ 500 sec^-1로 변화시키면서 전단응력(shear stress, Pa)을 측정하였다. 점도(shear viscosity)는 다음 수학식 3에 의하여 측정하였다.

즉, 펙틴(HMP)과 펙틴의 유도체화에 의한 점도의 차이를 비교하기 위하여, 25 ℃에서 2% 농도로 전단율에 따른 전단응력을 측정한 결과를 첨부도면 도 8에 나타내었다. 도 8에 의하면, HMP 2% 용액은 뉴턴 유동적인 흐름을 보였는데 다른 유도체들과 비교해 보면 ADP 만이 의가소성적인(pseudoplastic) 흐름을 보여 오히려 펙틴보다 점도가 증가했으며, DMP도 산에 의해 측쇄와 구조가 많이 변형되었음에도 점도의 차이는 별로 보이지 않았다.

그러나, SFP와 ANP는 뉴턴 유동적인 흐름을 보임과 동시에 전단율 증가에 따 른 전단응력의 값이 훨씬 떨어져 점도의 감소가 뚜렷하게 나타남을 확인하였다. 이에 따라, SFP와 ANP의 점도 저하에 따라 그 가공적성이 향상되어 식품이나 의약용도로 용이하게 사용될 가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

실험예 3: 펙틴과 펙틴 유도체의 생리활성 ( in vitro )

1. 항콜레스테롤 활성(담즙산 결합능 확인)

담즙산 결합능을 시험관내(in vitro) 실험으로 측정하였다. 사용된 담즙산(bile acid)은 콜린산(cholic acid) 형태의 것을 사용하였고, Camire 등(1993)과 Boyd 등(1966) 의 방법을 변형하여 실험하였다.

즉, 담즙산 200 μM 을 함유하는 0.01 M 소듐포스페이트 완충액(sodium phosphate buffer, pH 7.0)에 시료 2 mg/mL 되도록 첨가하여 2 시간 동안 37 ℃에서 수화시킨 후 0.2 ㎛ 시린지 필터(syringe filter, Waters Co. USA)로 여과하였다. 여과된 시료 0.2 mL를 취하여 70 % 황산 1 mL을 넣고 5 분간 반응시킨 후 0.25 % 푸르푸랄 0.2 mL를 첨가하고, 약 1 시간 가량 충분히 반응시킨 후 510 nm에서 흡광도를 측정하였다. 각 시료 1 mg 당 결합한 담즙산의 양을 다음 표 3에 나타내었다.

구분	결합된 담즙산 (μM/㎎)	콜레스틸아민에 대한 담즙산 결합비 (%)
HMP	1.27 ± 1.10^2)a3)	1.14 ± 0.9^A3)
DMP	9.40 ± 3.23^b	8.42 ± 2.89^B
ADP	3.44 ± 2.98^e	3.08 ± 2.67^C
SFP	0.00 ± 0.00	0.00 ± 0.00
ANP	38.71 ± 0.90^d	34.66 ± 0.81^D
CA¹⁾	111.70 ± 0.87^e	100.00 ± 0.78^E
1) 콜레스틸아민 2) 평균±표준편차 3) 서로다른 문자로 표시된 평균은 던칸의 다중범위 테스트[p<0.05]에 의해 유의적인 차이가 있음을 의미.

펙틴이 콜레스테롤을 감소시킨다는 연구로 Lee와 Yun(1999)은 식이 콜레스테롤과 펙틴 섭취시 운동이 혈장지질을 감소시킨다는 결과를 보고하였고, Suprijana 등(1997)의 펙틴 섭취가 혈중 콜레스테롤을 감소시키며 간에서의 콜레스테롤이 유의적으로 감소시켰다는 보고가 있었다. 이러한 이유를 펙틴이 수용성 식이섬유로서 발효되어 미생물에 의해 단쇄지방산으로 변환된 후 문정맥을 통해 흡수되어 간의 콜레스테롤의 합성을 저하시키는 기전과 담즙산 결합능으로 보았으나, 상기한 실험결과 HMP의 담즙산 결합능은 1.27 μM/mg로 미미하였다.

그러나, 상기 표 3 에 나타낸 바와 같이, 펙틴(HMP) 외의 유도체들은 SFP를 제외한 모든 유도체에서 담즙산 결합능이 증가했으며 ANP는 시료 1 mg당 38.43 μmol의 담즙산과 결합하며, 담즙산 결합수지인 콜레스틸아민(cholestyramine) 대비 35.57 %로 가장 활성이 좋았다. 이는 담즙산은 분자내에 음이온의 전하를 가진 카르복실기를 함유하고 있기 때문에 여기에 치환된 아미노기가 이온결합을 형성하기 때문이라 생각된다(Jin et al., 1995).

상기와 같은 결과에 기인하여, AMP는 항콜레스테롤제제로 응용 가능성이 다분함을 예상할 수 있다.

2. 항고혈압 활성 (안지오텐신 전환 효소 저해 활성)

안지오텐신 전환 효소(angiotensin converting enzyme, ACE) 저해능의 측정은 Cushman과 Cheung(1971)의 방법을 이용하여 수행하였다.

즉, 염으로 NaCl 0.3 M 을 함유한 0.1 M 포타슘 포스페이트 완충용액(potassium phosphate buffer, pH 8.3)에 녹인 2.5 mM의 기질(Hippuryl-L-histidyl-L-leucine) 150 μL 와 ACE 조효소액(0.1 unit/mL) 100 μL, 완충액에 녹인 시료 100 μL를 혼합하여 37 μ에서 30 분간 반응시킨 후 1 N HCl을 첨가 해 반응을 정지 시켰다. 여기에 에틸아세테이트 2 mL를 가하고 15초 교반 후 2500 rpm 에서 5분간 원심분리한 다음 상층액을 취하여 완전히 건조시킨 다음 여기에 증류수 2 mL을 넣어 추출된 히푸르산(hippuric acid)을 228 nm에서 흡광도를 측정한 결과를 첨부도면 도 9에 나타내었다.

Na 등(2003)의 연구에서 배에서 추출한 펙틴의 섭취가 혈압을 조절하고, 혈장 레닌(renin), 심장비대증(cardiac hypertrophy)을 감소시킨다는 결과가 있었다.

상기 레닌은 혈중 안지오텐시노겐(angiotensinogen)을 분해하여 안지오텐신 I(angiotensin Ⅰ)을 만들고, 상기 ACE는 안지오텐신 I을 안지오텐신 Ⅱ로 전환시키는 작용을 한다. 상기 안지오텐신 II는 모세혈관을 수축시켜 혈압을 상승시키는 작용을 하는 호르몬이다. 실험 결과 HMP의 ACE 활성 저해능을 확인하였으며, 펙틴이 레닌-안지오텐신 계(rennin-angiotensin system)에 영향을 미처 항고혈압활성을 나타냄을 확인하였다.

한편, 각 시료의 IC₅₀ (50 % inhibitory concentration) 값으로 비교해 보면 HMP는 43.99 mg/mL인데 반해 ANP 13.58 mg/mL, DMP 19.61 mg/mL, ADP 21.10 mg/mL로 HMP보다 감소했음을 확인할 수 있다. 각 펙틴 유도체들의 농도에 따른 ACE 저해 활성에 대한 결과를 다음 표 4와 첨부도면 도 9에 나타내었다.

농도 (㎎/mL)	ACE 저해활성(%)
농도 (㎎/mL)	HMP	DMP	ADP	SFP	ANP
5.0	10.81	10.62	6.75	6.97	9.05
7.5	14.14	17.09	8.90	5.87	20.98
10.0	15.80	24.13	20.69	8.07	32.91

상기 표 3에 나타낸 바와 같이, ANP의 경우 항고혈압 특성이 우수하여 항고혈압 효과가 있는 건강식품 및 항고혈압제제로서의 사용 가능성을 예측할 수 있다.

3. 항균 활성 (Antimicrobial activity)

항균 활성 실험방법은 Seo 등(1995)의 방법으로 96 웰 플레이트(96 well plate)를 이용하여 실험하였다. 본 실험에 사용한 균주는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus, KACC10001)과 비브리오 피셔리(Vibrio fischeri, KACC 11254) 이며, 상기 균은 각각 영양배지(nutrient broth)에 24 시간 배양하고 배양액 10 μL에 시료 90 μL를 넣어 18 시간 다시 배양한 후 540 nm에서 흡광도를 측정한 후 대조군과 비교함으로서 균 감소율을 조사하였다. 항균활성의 결과 그람 양성균인 바실러스 세레우스(B. cereus)에 대한 항균력을 첨부도면 도 10에 나타내었으며, 그람 음성균인 비브리오 피셔리(V. fischeri)에 대한 항균력을 첨부도면 도 11에 나타내었다.

도 10 및 도 11에 의하면 HMP는 두 균 모두에서 농도별 항균력 증가가 없는것으로 보아 활성이 없는 것으로 판단되었으나, 모든 HMP 유도체들에서 항균활성이 증대되었다. 즉, ANP는 B. cereus 균에 대해 IC₅₀ 농도가 0.9 mg/mL로 가장 높은 항균력을 가지는 것으로 나타났고, DMP는 V. fischeri 균에 대해 IC₅₀ 농도가 0.31 mg/mL로 가장 높게 나타났다. 상기한 결과로부터 ANP를 보존성이 미약한 식품에 첨가하여 보존료로서 적용 가능성이 예측된다.

4. 항응고 활성 (Anticoagulant activity)

항응고 활성 실험은 HMP와 SFP에 대해서만 실행하였으며 APTT와 PT 실험을 수행하였다. 상기 PT(Prothrombin time)는 외적 경로(혈관벽이나 주위조직의 손상으로 응고)의 항응고 반응을 활성화시키고 APTT(activated partial thromboplastin time)는 내적 기전(혈액자체에서 응고)의 인자를 활성화 시켜 혈액을 응고시키는데, 여기에 혈장과 항응고 시약을 함께 반응시켜 응고시간의 지연을 측정하는 것이다. SFP는 증류수에 녹인 후 여과하여 사용하였고 응고시간 측정은 혈액 응집 분석기(blood coagulation analyzer)로 측정하였다.

APTT는 혈장(plasma) 50 μL와 시료 50 μL 를 37 ℃에 2 분 방치 후 CaCl₂ 첨가하고, 2분 후에 APTT 100 μL를 첨가한 후 피브린(fibrin) 생성까지의 시간을 판정하였다. PT는 혈장 50 ℃L와 시료 50 μL를 37 ℃에 2분 방치 한 다음 PT시약 100 μL 첨가 후 피브린 생성까지의 시간을 판정하였다. SFP의 APTT와 PT 실험 결과는 다음 표 5에 나타내었다.

SFP 농도 (㎍/mL)	PT	INR¹⁾	APTT
0	12.7 초	1.14	34 초
25	22.6 초	3.75	3분 이상
50	25.0 초	4.61	3분 이상
100	32.7 초	8.02	3분 이상
1)INR: international normalized ratio

먼저, HMP는 100 μg/mL 농도에서 APTT와 PT 실험 결과 혈액 응고시간 지연을 보이지 않아 펙틴 시료 자체에 항응고 활성이 없음을 확인하였다.

SFP는 25 ∼ 100 μg/mL 농도별로 실험하였는데, 농도의 선택은 커드란(curdlan, DS 0.86), 키토산(chitosan, DS 2.60) 이 10 ∼ 50 μg/mL 에서 3분 이내의 혈액 응고 지연되는 결과를 보임에 따라 치환도가 항응고 활성에 영향을 미치므로 DS 0.14인 SFP의 농도를 이의 2 ∼ 2.5배 로 잡았다.

APTT 실험 시 정상대조군(SFP의 첨가 없이 혈장과 APTT 시약만을 반응시킨 것)의 응고시간(clotting time)은 34 초였으나, SFP을 25 ∼ 100 μg/mL 첨가시 모두 3 분을 초과하는(3 분이 초과되면 기기 특성상 정확한 시간 측정 불가능) 높은 활성을 보였으며, PT 실험은 정상 대조군이 12.7 초, INR(PT시약에 따라 응고 시간이 차이가 나 생산 LOT마다 WHO의 국제 표준물질과의 비교계산에 의해 결정되는 ISI치를 표시하여 PT ratio 수치에 ISI를 대입하여 계산하여 나온 수치)은 1.14 였으나, SFP를 25 ∼ 100 μg/mL 첨가시 22.6, 25, 32.6 초로 그 농도 증가에 따른 응고 시간의 지연을 보였다.

즉, 혈관계 질환을 유도하는 혈전의 생성을 방지하는 항응고성 물질로서 가장 광범위하게 쓰이는 헤파린(heparine)과 비교하여, 본 발명의 SFP가 보다 우수한 항응고성을 발현함을 확인할 수 있었다.

이러한 특성으로 상기 SFP를 항응고제로 적용가능함을 예측할 수 있다.

5. 실험용 쥐에 대한 경구 투여 급성 독성실험

6주령의 특정병원부재(SPF) SD계 래트(rat)를 사용하여 급성독성실험을 실시하였다. 군당 2 마리씩의 동물에 펙틴 유도체(SFP, ANP)를 각각 0.5% 메틸셀룰로즈 용액에 현탁하여 1 g/kg/1 ㎖의 용량으로 단회 경구투여하였다. 시험물질 투여 후 동물의 폐사여부, 임상증상, 체중변화를 관찰하고 혈액학적 검사와 혈액생화학적검사를 실시하였으며, 부검하여 육안으로 복강장기와 흉강장기의 이상여부를 관찰하였다. 시험결과, 시험물질을 투여한 모든 동물에서 특기할 만한 임상증상이나 폐사된 동물은 없었으며, 체중변화, 혈액검사, 혈액생화학 검사, 부검소견 등에서도 독성변화는 관찰되지 않았다. 이상의 결과 실험된 펙탄 유도체는 모두 랫트에서 500 mg/kg까지 독성변화를 나타내지 않으며 경구 투여 최소치사량(LD50)은 500 mg/kg이상인 안전한 물질로 판단되었다.

5) 실험용 쥐에 대한 비경구 투여 독성실험

상기 경구 투여 독성실험과 동일한 래트를 사용하여, 본 발명의 펙틴 유도체(SFP, ANP)를 각각 2 mg 씩 근육주사 방법으로 투여하였다. 실험용 쥐 한 마리에는 2주 간격으로 2번, 다른 한 마리의 실험쥐에는 2 주 간격으로 2회 투여 후, 1 개월의 간격을 둔 다음 다시 2 주 간격으로 3회 투여를 실시하였다.

처음 주사 후 6 개월간 질병 유무(clinical sign), 체중, 체온 등 외관(physical examination), 혈액세포의 이상(haematology), 배설물의 이상(urinalysis)을 관찰하였으나 모두 정상치의 값을 나타내었다.

제제화 예

상기에서 확인된 바와 같이, 본 발명의 펙틴 유도체는 우수한 혈액에 대한 항응고 활성, 항균활성, 담즙산 결합능 및 ACE 활성 저해능을 나타내어 항 콜레스테롤 제제, 항균제, 면역증강제 등의 약제 조성물로 제제화할 수 있으며, 또한 건강보조식품으로 제조할 수 있다.

1) 시럽제의 제조

본 발명의 펙틴 유도체(SFP, ANP) 각각의 유효성분 2 %(중량/부피)로 함유하는 시럽은 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

펙틴 유도체(SFP, ANP) 각각 2g, 당 25.4g 을 온수 80 g에 용해시켰다. 이 용액을 냉각시킨 후, 여기에 글리세린 8.0 g, 사카린 0.8 g, 향미료 0.04 g, 에탄올 4.0 g, 소르빈산 0.4 g 및 증류수로 이루어진 용액을 제조하여 혼합하였다. 이 혼합물에 물을 첨가하여 100 ㎖가 되게 하였다.

2) 정제의 제조

유효성분 15 mg이 함유된 정제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

펙틴 유도체(황산염화 펙틴)(SFP) 250 g을 락토오스 175.9 g, 감자전분 180 g 및 콜로이드성 규산 32 g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160 g, 활석 50 g 및 스테아린산 마그네슘 5 g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

3) 주사액제의 제조

유효성분 10 mg을 함유하는 주사액제는 다음과 같은 방법으로 제조하였다.

펙틴 유도체(황산염화 펙틴)(SFP) 1 g, 염화나트륨 0.6 g 및 아스코르빈산 0.1 g을 증류수에 용해시켜서 100 ㎖을 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 200 ℃에서 30 분간 가열하여 멸균시켰다.

4) 건강보조 음료의 제조

펙틴 유도체(SFP, ANP) 각각 500 ㎎을 적당량의 물에 용해시킨 후에 보조성분으로서 비타민 C, 교미제로서 구연산, 구연산나트륨, 올리고당을 적당량 가하고, 보존제로서 적당량의 나트륨벤조에이트를 가한 후에 물을 가하여 전량을 100 ㎖로 만들어 음료용 조성물을 제조하였다. 이때 타우린이나 마이오 이노시톨, 엽산, 판토텐산 등을 단독으로 혹은 함께 첨가할 수 있다.

참고예: 통계처리

본 발명의 제조예, 실시예 및 실험예에서 얻어진 실험결과는 SPSS 12.0(Statistical package for the Science) 프로그램을 이용하여 분산분석(Anova) 하였고, 각 측정 평균값간의 유의성은 p<0.05 수준에서 던칸의 다중 범위 테스트(Duncan's multiple range test)를 이용하여 검증하였다(SAS, 2000).

상술한 바와 같이, 본 발명의 펙틴 유도체는 점도 특성이 식품으로 적용시 가공 적성을 향상시킬 수 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 펙틴(HMP)에 비교하여 높은 담즙산 결합능을 보였으며, ACE 활성 저해능이 농도별로 유의적으로 증가하였고, 그람 양성균(B. cereus)과 그람음성균(V. fischeri)에 대하여 전혀 항균력이 없던 HMP와는 달리 펙틴 유도체는 우수한 항균력을 발현하였다.

또한, 전혀 항응고활성을 보이지 않은 HMP와 달리 펙틴 유도체는 혈액에 대한 우수한 항응고활성을 보여, 심혈관계 질환에 대한 예방효과 및 치료효과를 기대할 수 있음을 시사하였고, 담즙산 결합능이 우수하여 항콜레스테롤 제제 및 항콜레스테롤 효과를 가지는 건강식품으로서의 적용 가능성이 있음을 확인할 수 있으며, ACE 활성 저해능이 우수하여 항고혈압 제제 및 항고혈압 효과를 가지는 건강식품으 로서의 적용가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

또한, 본 발명의 펙틴 유도체는 항균활성이 우수하여 항균제 및 항균능을 가지는 건강식품으로서의 적용가능성이 있음을 확인할 수 있었다.

Claims

다음 화학식 1로 표시되는 피라노스(pyranose) 고리구조를 포함하는 것을 특징으로 하는 펙틴 유도체;

[화학식 1]

상기 화학식 1에서, R은 황산염기, 아미드기, 아민기이고, R₁은 수소 또는 황산염기이다.
제 1 항에 있어서, 상기 펙틴 유도체는 황산염기 치환도가 10 ∼ 20 % 범위인 황산염화 펙틴인 것을 특징으로 하는 펙틴 유도체.
제 1 항에 있어서, 상기 펙틴 유도체는 아미드기 치환도가 10 ∼ 30 % 범위인 아미드화 펙틴인 것을 특징으로 하는 펙틴 유도체.
제 1 항에 있어서, 상기 펙틴 유도체는 아민기 치환도가 20 ∼ 40 % 범위인 황산염화 펙틴인 것을 특징으로 하는 펙틴 유도체.
청구항 1의 펙틴 유도체를 유효성분으로 하는 것임을 특징으로 하는 항고혈압 제제.
청구항 1의 펙틴 유도체를 유효성분으로 하는 것임을 특징으로 하는 항고혈압용 건강보조제.
청구항 1의 펙틴 유도체를 유효성분으로 하는 것임을 특징으로 하는 항콜레스테롤 제제.
청구항 1의 펙틴 유도체를 유효성분으로 하는 것임을 특징으로 하는 항콜레스테롤용 건강보조제.
청구항 1의 펙틴 유도체를 유효성분으로 하는 것임을 특징으로 하는 항균제.
청구항 1의 펙틴 유도체를 유효성분으로 하는 것임을 특징으로 하는 항균제용 건강보조제.