KR20060107908A

KR20060107908A - 개구리밥의 엽록체 형질전환 방법

Info

Publication number: KR20060107908A
Application number: KR1020057025499A
Authority: KR
Inventors: 케빈 엠. 콕스; 찰스 지. 펠레
Original assignee: 바이오렉스 인코포레이티드
Priority date: 2003-07-01
Filing date: 2004-06-30
Publication date: 2006-10-16
Also published as: JP2007527218A; EP1639114A2; WO2005005643A2; RU2006102864A; MXPA06000092A; CA2530994A1; US20050044593A1; IL172761A0; WO2005005643A3; AU2004256442A1

Abstract

본 발명은 개구리밥 색소체의 형질전환 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 개구리밥 발현 시스템의 재조합 단백질 생산력을 증가시키는데 유용하다. 본 발명의 조성물은 형질전환된 개구리밥 색소체 및 플라스톰 이식된 개구리밥 세포 및 식물, 그리고 개구리밥 색소체의 형질전환에 유용한 핵산 구조체를 포함한다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 이종 뉴클레오티드 서열을 개구리밥 플라스톰에 도입하는 방법을 제공한다.

개구리밥, 색소체, 색소체 게놈, 색소체 게놈의 형질전환

Description

개구리밥의 엽록체 형질전환 방법{CHLOROPLAST TRANSFORMATION OF DUCKWEED}

본 발명은 개구리밥 색소체의 형질전환 방법 및 조성물에 관한 것이다.

개구리밥은 단자엽의 개구리밥 과(Lemnaceae)에 유일하게 속하는 식물이다. 이의 5가지 속 및 38가지 속의 식물들은 모두, 식물지리학적으로 전 세계적으로 분포되어 있고, 자유롭게 부유하는 담수 식물이다(Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae - A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich). 가장 형태학적으로 축소된 식물로 알려져 있지만, 대부분의 개구리밥 속들은 뿌리, 줄기, 꽃, 종자 및 잎을 포함하는, 보다 큰 식물의 조직 및 기관을 모두 가지고 있다. 개구리밥 종들에 대한 연구가 광범위로 진행되고 있으며, 이들의 생태학, 계통 분류학, 생활주기, 대사, 질병 및 해충 감수성, 생식 생물학, 유전자 구조 및 세포 생물학을 상세히 다루고 있는 상당한 문헌들이 있다(Hillman(1961) Bot. Review 27: 221; Landolt (1986) Biosystematic Investigation on the Family of Duckweeds: The Family of Lemnaceae -A Monograph Study Geobatanischen Institut ETH, Stiftung Rubel, Zurich).

개구리밥의 성장 습성은 미생물 배양 방법에서 다루고 있다. 효모의 무성 번식과 유사한 거시적인 방식으로, 식물은 새로운 잎의 무성적인 출아를 통해 빠르게 증식한다. 이러한 증식은 분열 세포로부터 식물 발아에 의해 이루어진다. 분열 부위는 작으며 잎의 하단면에서 발견된다. 분열 세포는 잎의 주간엽맥(midvein) 양쪽에 위치한 두개의 포켓에 있다. 작은 주간엽맥 부위에서 또한 뿌리가 시작되고, 작은 주간엽맥은 각 잎을 그 모체 잎에 연결시키는 줄기가 발생되는 부위이다. 분열 포켓은 조직 플랩(flap)에 의해 보호된다. 잎은 이들 포켓에서 엇갈리게 발아한다. 2배 증식되는 시간(Doubling time)은 종에 따라 다양하며, 짧게는 20-24시간이다(Landolt(1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67: 271; Chang et al. (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Datko and Mudd (1970) Plant Plzysiol. 65:16; Venkataraman et al. (1970) Z. Pflanzenphysiol. 62: 316).

개구리밥을 집중 배양하는 경우, 시간 단위당 최고 생중량(biomass) 축적율이 산출되었으며(Landolt and Kandeler (1987) The Family of Lemnaceae A Monography Study Vol2: Phytochemistry, Pthysiology, Application, Bibliography, Veroffentlichungen des Geobotanischen Institutes ETH, Stiftung Rubel, Zurich), 건중량은 생체중량(fresh weight)에 6-15%에 이른다(Tillberg et al. (1979) Physiol. Plant. 46:5; Landolt (1957) Ber. Schweiz. Bot. Ges. 67:271; Stomp, unpublished data). 여러 조건에서 증식시킨 다수 개구리밥 종의 단백질 함량은, 건중량의 15-45%인 것으로 보고된 바 있다(Chang et al (1977) Bull. Inst. Chem. Acad. Sin. 24:19; Chang and Chin (1978) Z. Pflanzenphysiol. 89:91; Porath et al. (1979) Aquatic Botany 7:272; Appenroth et al. (1982) Biochem. Physiol. Pflanz. 177:251). 이러한 수치를 보면, 배지 1 L당 개구리밥 단백질 생산치는 효모 유전자 발현 시스템과 동일한 규모이다.

따라서, 개구리밥을 이용한 재조합 단백질 발현 방법은, 다수의 연구 응용 및 산업적 응용에 유용하다. 식물 분자생물학 연구의 전반적인 측면에서, 효모의 실험적인 편의성을 갖추고 있으며 조작될 수 있는 분화된 식물 시스템은, 분리된 유전자의 발생학적 및 생리학적 기능을 분석하는데 매우 신속한 시스템을 제공한다. 유용 폴리펩티드의 산업적 생산에 있어서, 개구리밥을 근간으로하는 시스템은 기존의 미생물 또는 세포 배양 시스템 이상으로 수많은 이점을 가지고 있다. 식물은 포유류 세포와 유사한 번역후 처리 과정이 있어, 생물학적으로 활성인 포유류의 폴리펩티드를 미생물 세포를 이용하여 생산하는 경우와 관련된 한가지 주된 문제점을 해소시키며, 식물 시스템은 미생물 시스템에서는 거의 없는 다수 서브유닛 단백질을 조합할 수 있는 능력을 지닌 것으로 당업자(Hiatt (1990) Nature 3 34:469)에 의해 입증되었다. 개구리밥의 생중량을 재조합 단백질의 산업적 생산에 필수적인 수준으로 규모를 확대하는 것은, 유사한 수준의 포유류 세포에 비해 더욱 빠르고 비용면에서도 효율적이며, 제안된 다른 식물 생산 시스템, 예컨대 콩 및 담배들과는 달리, 개구리밥은 완전히 억제되고 조절된 생중량 생산 용기에서 생육하여 기존의 단백질 생산의 산업적 하부 조직으로의 상기 시스템의 통합을 보다 용이하게 할 수 있다.

개구리밥 핵산 게놈의 형질전환 방법들이 개시되어 있다. 예컨대 미국 특허 제 6,040,498호를 참조한다. 아가로박테리움 매개성 유전자 전이, 탄도 충격 (ballistic bombardment) 또는 전기충격을 포함한 여러가지 방법들중 임의의 하나에 의해, 원하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 발현 카세트를 개구리밥 식물 또는 개구리밥 결절 배양물에 효율적으로 형질전환시킬 수 있다. 개구리밥 색소체 게놈으로의 안정적인 형질전환이 보고된 바 있다. 개구리밥 색소체의 형질전환은, 각 세포에 다수의 엽록체가 있고 각 엽록체에 다수 카피의 플라스톰(plastome)이 있기 때문에, 이로울 수 있으며, 따라서, 플라스톰 형질전환 방법에 의해, 각 식물 세포로부터 많은 다수의 삽입된 트랜스유전자(transgene)를 수득할 수 있다.

개구리밥 시스템의 특징들은, 재조합 단백질 생산에 효율적인 식물 시스템 개발을 위한 이상적인 선택을 창출한다. 따라서, 본 발명은 개구리밥 색소체의 형질전환 방법 및 조성물을 제공한다.

발명의 개요

본 발명은 하나 이상의 이종적인 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 색소체 및 핵산을 가지는 개구리밥 식물 및 이러한 색소체-형질전환된(transplastomic) 개구리밥 식물을 생산하는 유용한 방법을 제공한다. 또한 본 발명은 이러한 형질전환된 색소체를 포함하고 있는 형질전환된 개구리밥 색소체 및 개구리밥 세포를 제공한다.

일부 예에서, 개구리밥 식물은 목적 폴리펩티드를 코딩하는 이종 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 색소체를 가진다. 다른 예에서, 하나 이상의 목적 폴리펩티드는 이종의 뉴클레오티드 서열에 의해 코딩된다. 상기 이종 뉴클레오티드 서열은, 형질전환된 개구리밥 세포의 선별에 유용한, 마커 폴리펩티드 코딩 서열을 포함할 수도 있다.

이종의 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 개구리밥 식물의 색소체는, 전색소체(proplastid), 전분체(amyloplast), 유색체(chromoplast), 엽록체, 에티오플라스트(etioplast) 또는 백색체(leucoplast)일 수 있다.

본 발명의 핵산 구조체는, 개구리밥 플라스톰 서열과 상동인 제1 표적 뉴클레오티드 서열, 개구리밥 플라스톰에 이종적이며 하나 이상의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열, 및 개구리밥 플라스톰 서열과 상동인 제2 표적 서열을 가진다. 일부 예들에서, 핵산 구조체는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함한다.

일부 예들에서, 엽록체 형질전환용 핵산 구조체는 개구리밥에서의 목적 폴리펩티드의 번역 효율을 증가시키는 뉴클레오티드 서열을 가진다. 핵산 구조체는 또한 목적 폴리펩티드를 코딩하는 서열에 작동가능하게 연결된 하나 이상의 전사 종결 서열을 포함할 수 있다.

본 발명은 하나 이상의 이종적인 뉴클레오티드 서열을 개구리밥 플라스톰에 도입하는 방법을 제공한다. 상기 방법은, 핵산 구조체가 색소체의 게놈으로 도입되도록 허용하는 조건하에서, 핵산 구조체를 미소발사체(microprojectile)에 흡착시키고 충격을 가하는(bombarding), 엽록체 형질전환용 핵산 구조체로 개구리밥 조직에 충격을 가하는 단계를 포함한다. 일부 예들에서, 이종의 뉴클레오티드 서열은 개구리밥 엽록체 게놈내로 도입된다.

본 발명은 색소체-형질전환된(transplastomic) 개구리밥 식물의 수득 방법을 제공한다. 상기 방법은 엽록체 형질전환용 핵산 구조체가 개구리밥 조직의 적어도 하나 이상의 색소체로 도입되는 조건하에서, 미소발사체에 흡착된 엽록체 형질전환용 핵산 구조체로 개구리밥 조직에 충격을 가하는 단계 및 상기 개구리밥 조직으로부터 개구리밥 식물을 재생하는 단계를 포함한다. 일부 예들에서, 상기 핵산 구조체는 개구리밥 조직에 선별가능한 표현형을 부여하는, 선별 마커 서열을 포함하며, 상기 개구리밥 조직은 형질전환 후 선별 배지에서 유지되며, 이 경우 선별 배지는 선별성 마커 서열로 형질전환된 색소체가 있는 개구리밥 세포의 생존을 우선적으로 촉진한다.

발명의 상세한 설명

색소체는 광합성을 수행하는 식물 세포에서 발견되는 세포기관으로, 아미노산 탄수화물 복합체, 지방산 및 색소의 생합성에서 주된 작용을 한다. 분화된 식물의 색소체는 전분체, 유색체, 엽록체, 에티오플라스트 및 백색체를 포함하여 여러가지 유형이 있다. 이들 색소체 모두는 미분화된 색소체 전구체인 전색소체로부터 유래된다. 엽록체는 가장 일반적인 색소체로, 식물 세포의 광합성 장소이다. 각 광합성 식물 세포는 다수개의 엽록체를, 일반적으로 세포당 50 내지 100개 포함하고 있다. 엽록체는 플라스톰(plastome)이라고 지칭하는 원형의 DNA 분자 형태의 자체 게놈을 가지고 있다. 각 엽록체는 다중 카피, 일반적으로 50-100 카피수의 플라스톰을 포함하고 있다.

형질전환된 플라스톰(트랜스플라스톰이라고 함)에서의 트랜스유전자 발현이 식물 핵 형질전환에 비해 여러가지 이점을 가지고 있기 때문에, 식물 플라스톰은, 외부의 트랜스유전자의 도입에 표적이 되고 있다. 특히, 각 엽록체에는 다수 카피수의 플라스톰이 존재하고 각 세포에는 다수개의 엽록체가 있기 때문에, 플라스톰 형질전환 방법을 이용하여 각 식물 세포에 많은 수의 트랜스유전자를 삽입시킬 수 있다. 이로 인해, 식물 핵의 게놈에 동일한 트랜스유전자를 삽입하였을때의 발현율에 비해 트랜스유전자를 더 높은 수준으로 발현시킬 수 있다.

식물 색소체는 유전자 조작에 매력적인 대상이므로, 본 발명은 개구리밥 색소체의 형질전환 방법 및 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 개구리밥 발현 시스템의 재조합 단백질 생산력 증가에 유용하다. 본 발명의 조성물로는 형질전환된 개구리밥 색소체, 색소체-형질전환된 개구리밥 세포 및 식물 뿐만 아니라, 개구리밥 색소체의 형질전환용 핵산 구조체를 포함한다. 또한 본 발명은 개구리밥 플라스톰에 하나 이상의 이종의 뉴클레오티드 서열 도입 방법을 제공한다. 본 발명의 조성물 및 방법은 하기에 상세히 기술되어 있다.

정의:

용어 "발현" 또는 "생산"은 전사, 번역 및 유전자 산물의 조합을 포함한, 유전자 산물의 생합성을 의미힌다. 용어 "개구리밥"은 개구리밥 과(Lemnaceae)에 속하는 일원을 의미한다. 상기 과는 현재 5개의 속과 38개의 종으로 분류된다: 렘나(Lemna) 속(렘나 에퀴녹티얼리스(Lemna aequinoctialis), 렘니 디스페르마(L. disperma), 렘나 에큐아도리엔시스(L. ecuadoriensis), 렘니 지바(L. gibba), 렘나 자포니카(L. japonica), 렘나 마이너(L. minor), 렘나 미니스큘라(L. miniscula), 렘나 오브스큐라(L. obscura), 렘나 페르푸실라(L. perpusilla), 렘나 테네라(L. tenera), 렘나 트리술카(L. trisulca), 렘나 투리오니페라(L. turionifera), 렘나 발디비아나(L. valdiviana)); 스피로델라(Spirodela) 속(스피로델라 인테메디아(S. intermedia), 스피로델라 폴리리자(S. polyrrhiza)); 울피아(Wolffia) 속(울피아 안구스타(Wa. angusta), 울피아 아리자(Wa. arrhiza), 울피아 아우스트랄리나(Wa. australina), 울피아 보레알리스(Wa. b, 울피아 브라실리엔시스(Wa. brasiliensis), 울피아 컬럼비아나(Wa. columbiana), 울피아 엘롱가타(Wa. elongata), 울피아 글로보사(Wa. globosa), 울피아 마이크로스코피카(Wa. microscopica), 울피아 네글렉타(Wa. neglecta); 울피엘라(Wolfiella) 속(울피엘라 카우다타(Wl. caudata), 울피엘라 덴티큘라타(Wl. denticulata), 울피엘라 글라디아타(Wl. gladiata), 울피엘라 히알리나(Wl. hyalina), 울피엘라 린굴라타(Wl. lingulata), 울피엘라 레푼다(Wl. repunda), 울피엘라 로툰다(Wl. rotunda), 울피엘라 네오트로피카(Wl. neotropica)), 및 란돌티아(Landoltia) 속(란돌티아 푼크타타(L. punctata). 그외 개구리밥과의 다른 속 또는 종 역시 본 발명에 포함된다. 렘나 종은 Les et al. (2002) Systematic Botany 27:22 1-40에 기재된 분류표로 분류할 수 있다.

용어 "개구리밥 결절(duckweed nodule)"은, 세포의 적어도 약 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 또는 100%가 분화된 세포인, 개구리밥 세포를 포함하는 개구리밥 조직을 의미한다. "분화된 세포"는 미분화 세포 또는 다른 조직 유형에서 발견되는 세포와 식별되는 적어도 하나의 표현형 특징(예, 특이한 세포 형태 또는 마커 핵산 또는 단백질의 발현)이 있는 세포이다. 개구리밥 결절 배양물의 분화된 세포는, 이의 인접 세포 벽이 융합되어 상호연결된 세포의 타일형태로 덮힌 평활면을 형성하며, 조직 전역에 산재된 잎의 원시세포로 조직화되기 시작하는 결절을 가진다. 결절 배양물의 조직 표면은 플라스마데스마타(plasmadesmata)를 통해 서로 연결된 상피 세포이다.

뉴클레오티드 서열에 대한 언급시 사용되는 "작동가능하게 연결된"은 서로 기능적으로 상호관련성 있게 배치된 다수의 뉴클레오티드 서열을 의미한다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 DNA 서열은 연속적이며 리딩 프래임내에서 두개의 단백질 코딩 부위를 연결하는 것이 필수적이다. 예컨대, 발현 조절 서열이 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열 전사를 조정하도록 배치되는 경우, 발현 조절 서열은 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 다른 예로, 표적 뉴클레오티드 서열이 표적 게놈 서열에 표적 부위와 상동 재조합할 수 있도록 배치되어 발현 카세트가 표적 게놈 서열로 전이되는 경우, 표적 뉴클레오티드 서열은 발현 카세트에 작동가능하게 연결된다.

본원에서 "개구리밥 플라스톰에 이종적인" 뉴클레오티드 서열은 삽입되는 수여체 플라스톰 본래의 것이 아닌 뉴클레오티드 서열을 의미한다.

A. 색소체

본 발명에서 형질전환되는 개구리밥 색소체는, 임의의 세포 유형으로부터 유래된 것일 수 있으며, 분화 또는 미분화 상태일 수 있다. 사용될 수 있는 개구리밥 색소체의 예로는, 미분화된 전색소체, 전분체, 유색체, 엽록체, 에티오플라스트 및 백색체가 있다.

색소체는 플라스톰이라고 하는 고유의 게놈을 포함하고 있다. 전형적으로, 각각의 색소체는 다수의 플라스톰, 가장 전형적으로는 색소체당 50 내지 100개의 플라스톰을 포함하고 있다. 본 발명의 핵산 분자로 형질전환 될 수 있는 플라스톰은 "수여체 플라스톰"이라고 하며, 이종의 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 수여체 플라스톰은 "색소체-형질전환된"이라고 한다. 일부 예들에서, 색소체-형질전환된 색소체의 플라스톰 모두 실질적으로 상동하며, 즉, 이들 모두는 형질전환성 핵산 분자의 코딩 부위를 포함하며, 바람직하기로는 임의의 관련 발현 조절 서열 또는 상기 코딩 서열의 발현을 촉진하기 위한 적어도 충분한 임의의 발현 조절 서열을 포함한다. 이러한 색소체를 포함하고 있는 색소체-형질전환된 색소체, 세포 및 식물은 "호모색소체-형질전환된(homotranspiastomic)"이라고 한다.

일부 예들에서, 색소체-형질전환된 색소체는 이종의 뉴클레오티드 서열로 안정적으로 형질전환된다. 이종의 뉴클레오티드 서열이 일정 기간 검출가능한 조건에서 개구리밥 색소체로 안정적으로 형질전환된 것으로 확인되었으며, 이는 이종의 뉴클레오티드 서열이 플라스톰에서 유지됨을 의미한다. 재조합 검출 방법은 당업계에 잘 알려져 있으며, 예컨대 이종의 뉴클레오티드 서열을 검출할 수 있는 프로브를 이용한 서든 분석 또는 PCR에 의한 트랜스유전자 증폭이 있다.

B. 색소체 형질전환 벡터

1. 발현 카세트

본 발명에 따른 형질전환된 개구리밥 색소체는, 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유한 발현카세트를 포함하고 있는 색소체 형질전환 벡터로, 형질전환에 의해 수득할 수 있다. 발현 카세트는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 포함한다. 본 발명의 일부 예에서, 개구리밥 색소체로 도입되는 핵산 분자는 2 이상의 발현 카세트를 포함하며 각각은 적어도 하나의 목적 폴리펩티드를 코딩한다.

발현 조절 서열은, 하나 이상의 프로모터, 하나 이상의 인핸서 서열 또는 프로모터 및 인핸서 서열을 모두 포함할 수도 있다. 발현 조절 서열은 목적 뉴클레오티드 서열에 천연적이거나 또는 외래적일 수 있다. "천연"은 천연형 게놈에서 발현 조절 서열이 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것이다. "외래적(외부)"은, 천연형 게놈에서 발현 조절 서열이 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결되어 있지 않은 것이다.

발현 조절 서열은 개구리밥 색소체에서 서열의 전사를 촉진할 수 있다면, 임의의 생물체로부터 유래된 것일 수 있다. 식물 색소체 프로모터의 예로는, psbA 유전자 프로모터, rbcL 유전자 프로모터, atpB rRNA 프로모터, 및 담배의 16S rRNA 프로모터 서열이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. Boyton et al.(1988) Nature 240:1534-153 8; Daniell et al.(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:88-92; 및 Sriramn et al.(1998) Plant Physiol. 117:1495-1499를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 프로모터의 예는 Zurawski et al.(1981) Nucleic Acids Res. 9:325 1-3270; Zurawski et al. (1982) 79:7699-7703; Krebbers et al. (1982) Nucleic Acids Res. 10:4985-5002. Mullet et al. (1985) Plant Molec. Biol. 4:39-54; Hanley-Bowdoin and Cbua (1989), Mol. Gen. Genet. 215:217-24; Svab et al. (1990) Proc. Nati. Acad. Sd. USA 87:8526-8530; and Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:9 13-17에 개시되어 있으나, 이에 한정되지 않으며, 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 또한 본 발명의 발현 조절 서열은 재조합 기술 또는 다른 합성 방법에 제조될 수 있다. 예컨대 NCBI Accession Numbers. AJ276677 및 ABA276676을를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

발현 조절 서열은 원하는 조절 수준을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들면, 일부 경우들에서, 특정 환경 자극(예, 열 충격 유전자 프로모터, 결핍 유발성 유전자 프로모터, 병원체 유발성 유전자 프로모터, 상처 유발성 유전자 프로모터 및 명/암 유발성 유전자 프로모터)에 대한 반응시 활성화되는 발현 조절 서열이나 또는 식물 성장 조절자(예, 아브시스 산, 옥신, 사이토키닌 및 지베렐린산에 의해 발현되는 유전자의 프로모터)를 이용하는 것이 이로울 수 있다. 예컨대, 빛에 의해 발현이 조절되는 유전자의 발현 조절 서열을 이용하여 빛 조절성 발현을 제공할 수 있다. 이러한 유전자의 예로는, SSU 또는 클로로필 A/B 결합성 단백질 유전자가 있다. 예컨대, Shiina et al. (1997) Plant Physiol. 115:477-483 및 Eilenberg et al. (1998) Planta 206:204-14를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명에 다른 유발성 프로모터를 사용할 수도 있다. 예컨대 미국 특허 제 5,925,806호를 참조하며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 상기 특허는 색소체 게놈에 삽입된 트랜스유전자의 발현 유발을 위한 시스템을 개시하고 있다. 방법은, 구성 프로모터(constitutive promoter) 또는 유발성 프로모터의 조절하에 있는 바이러스 RNA 중합효소를 코딩하는 서열을 식물의 핵에 형질전환시키는 단계 및 트랜스 유전자를 상기 식물의 색소체로 도입하는 단계를 포함하며, 상기 트랜스유전자는 바이러스 RNA 중합효소에 특이적인 프로모터에 작동가능하게 연결되어 있다. 이후 식물 핵에서 바이러스 RNA 중합효소의 발현 유발을 통해, 색소체 트랜스유전자의 발현을 유도할 수 있다.

개구리밥 색소체에서 전사를 지시하는 다른 프로모터를, 당업계에 공지된 방법으로 동정할 수 있다. 예컨대, 프로모터 후보 서열을 발현 조절 서열이 결핍된 마커 서열 옆에 삽입할 수 있으며, 이러한 발현 카세트를 개구리밥 색소체 형질전환에 사용할 수 있다. 마커 서열의 발현율을 이용하여 개구리밥 색소체에서의 프로모터 세기를 결정할 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 전사 효율 증가 방법은 당업계에 알려져 있다. 이러한 방법으로는, 예컨대 발현 카세트에 직렬로 다수의 프로모터 삽입 및 발현 카세트에 인핸서 서열 첨가가 있다.

또한 발현 카세트는 전사 종결 서열을 포함할 수도 있다. 당업계에 알려진 임의의 적합한 종결 서열을 본 발명에 따라 사용할 수 있다. 종결 부위는 전사 개시 부위와 천연적일 수 있으며, 목적 뉴클레오티드 서열과 천연적일 수 있으며, 또는 다른 기원으로부터 유래된 것일 수 있다. 전사 종결 서열의 예로는 psbA 종결 서열 및 rpsl6 종결 서열이 있다. 다른 적절한 종결 서열은 당업자에게 자명한 것이다.

발현 카세트는 플라스톰내로 삽입되기 위해 표적화된 하나 이상의 코딩 서열을 포함할 수 있다. 일부 예들에서, 각 핵산 서열은 하나 이상의 발현 조절 서열 및 전사 종결 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다. 또한 다수개의 발현 카세트가 제공될 수 있다.

색소체 형질전환 벡터는 전형적으로 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 카세트를 함유하고 있다. 목적 폴리펩티드는 임의의 폴리펩티드, 예컨대 인슐린, 성장 호르몬, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 베타-글루코세레브로시다제, 베타-글루코로니다제, 망막모세포종 단백질, p53 단백질, 안지오스타틴(angiostatin), 렙틴(leptin), 에리트로포이에틴, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 플라스미노겐, 단클론 항체, 단편 항원 결합성(Fab) 단편, 사이토카인, 수용체, 인간 백신, 동물 백신, 식물 폴리펩티드, 펩티드 및 혈청 알부민일 수 있다. 본 발명은 임의의 특정 목적 폴리펩티드의 발현에 한정되지 않는다.

일부 예들에서, 개구리밥 플라스톰은 다중결합(multimeric) 단백질(예, 단일클론 항체, 헤모글로빈, P450 옥시다제 및 콜라겐 등)이 생산되도록 조작된다. 개구리밥에서 생물학적으로 활성형인 다중결합 단백질을 생산하기 위한 접근법의 한가지 예로, 폴리펩티드 서브유닛 모두를 코딩하는 유전자를 포함하고 있는 엽록체 형질전환 벡터 이용이 있다. 예, During et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:281 및 van Engelen et al. (1994) Plant Mol. Biol. 26:1701을 참조한다. 이후 상기 벡터는 본원에 개시된 방법을 이용하여 개구리밥 플라스톰으로 도입된다. 이러한 방법에 의해, 다중결합 단백질 조합에 필수적인 폴리펩티드 모두를 발현하는 클로날(clonal) 개구리밥 세포 또는 식물 주가 확립된다. 일부 경우들에서는, 다중 결합 단백질의 모든 서브유닛 보다 적게 또는 심지어 하나의 단백질 서브유닛을, 형질전환된 개구리밥 식물 또는 개구리밥 결절 배양물에서, 예컨대 산업적 또는 화학적 공정이나 또는 진단학적, 치료학적 또는 백신면역 목적을 위해, 생산하는 것이 적합할 수 있다.

일부 예들에서, 개구리밥 플라스톰은 형질전환된 세포 또는 조직의 선별에 사용될 수 있는 선별성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 함유하고 있는 발현 카세트를 포함한다. 마커 폴리펩티드는 항생제 내성을 부여하는 폴리펩티드 및 제초성 화합물에 대한 내성을 부여하는 폴리펩티드를 포함한다. 제초제 내성 유전자는 일반적으로 제초제에 둔감한 변형된 표적 단백질이나 또는 제초제가 작용할 수 있기 전에 식물체내 제초제를 분해하거나 또는 무독화시키는 효소를 코딩한다. DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:25 13; DeBlock et al.(1989) Plant Physiol. 91:691; Fromm et al. (1990) BioTechnology 8:833; Gordon-Kamm et al. (1990) Plant Cell 2:603를 참조한다. 예를 들어, 글리포스페이트 또는 설포닐유레아 제초제에 대한 내성은, 표적 효소의 돌연변이들, 5-에놀피루빌시키메이트-3-포스페이트 신타제(EPSPS) 및 아세토락테이트 신타제(ALS)를 코딩하는 유전자를 이용하여 수득한다. 글루포시네이트 암모늄, 보로목시닐 및 2,4-디클로로페녹시아세테이트(2,4-D)에 대한 내성은, 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제, 니트릴라제 또는 2,4-디클로로페녹시아세테이트 모노옥시게나제를 코딩하는 세균 유전자를 이용하여 수득하며, 이들은 각 제초제를 무독화한다.

본 발명의 목적에 있어서, 마커 서열은 아미노글리코시드 3'-아데닐릴트랜스퍼라제(예, Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 II(Fraley et al. (1986) CRC Critical Reviews in Plant Science 4:1); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제 III; 시안아미드 하이드라타제(Maier-Greiner et al. (1991) Proc. Nati. Acad. Sci. USA 88:4250); 아스파르테이트 키나제; 디하이드로디피콜린네이트 신타제(Pen et al. (1993) BioTechnology 11:715); bar 유전자(Told et al. (1992) Plant Physiol. 100:1503; Meagher et al. (1996) Crop Sci. 36:1367); 트립토판 디카르복실라제(Goddijn. et al. (1993) Plant Mol. Biol. 22:907); 네오마이신 포스포트랜스퍼라제(NEO; Southern et al. (1982) J. Mol. Appl. Gen. 1:327); 히그로마이신 포스포트랜스퍼라제(.HPT 또는 HYG; Shimizu et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:1074); 디하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR; Kwok et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4552); 포스피노트리신 아세틸트랜스퍼라제(DeBlock et al. (1987) EMBO J. 6:2513); 2,2-디클로로프로피오틴산 디할로게나제(Buchanan-Wollatron et al. (1989) J. Cell. Biochern. 13D:330); 아세토하이드록시산 신타제(U.S. Pat. No. 4,761,373 to Anderson et al.; Haugim et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 221:266); 5-에놀피루빌-시키메이트-포스페이트 신타제(aroA; Comai et al. (1985) Nature 3 17:741); 할로아릴니트릴라제(WO 87/0418 1 to Stalker et al.); 아세틸-코엔자임 A 카르복실라제(Parker et al. (1990) Plant Physiol. 92:1220); 디하이드로프테로에이트 신타제(sulI; Guenineau et al. (1990) Plant Mol. Biol. 15:127); 및 32 kDa 광시스템 II 폴리펩티드(psbA; Hirschberg et al. (1983) Science 222:1346 (1983)를 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 젠타마이신(예, aacC1, Wohlleben et al. (1989) Mol. Gen. Genet. 2 17:202-208); 클로람페니콜(Herrera-Estrella et al. (1983) EMBO J. 2:987); 메토트렉세이트(Herrera-Estrella et al. (1983) Nature 3 03:209; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Biol. 16:807); 히그로마이신(Waldron et al. (1985) Plant Mol. Biol. 5:103; Zhijian et al. (1995) Plant Science 108:219; Meijer et al. (1991) Plant Mol. Bio. 16:807); 스트렙토마이신(Maliga et al. (1973) Nature 255:401-402; Etzold et al. (1987) FEBS Lett. 219:343-346; and Fromm et al.(1989) Plant Mol. Biol. 12:499-505); 스펙티노마이신(Frornm et al. (1987) EMBO J 6:3233-3237); 린코마이신(Cseplo and Maliga (1984) Mol. Gen. Genet. 196:407-412; Cseplo et al. (1988) Mol. Gen. Genet. 214:295-299); 블레오마이신(Hille et al. (1986) Plant Mol. Biol. 7:171); 설폰아미드(Guerineau et al. (1990) Plant Mol. Bio. 15:127); 브로목시닐(Stalker et al. (1988) Science 242:419); 2,4-D(Streber et al. (1989) BioTechnology 7:811); 포스피노트리신(DeBlock et al. (1987) EMBO J.6:25 13); 스펙티노마이신(Bretagne-Sagnard and Chupeau, Transgenic Research 5:131)에 대한 내성을 코딩하는 유전자를 포함한다.

bar 유전자는, 포스피노트리신(PPT) 또는 비알라포스(bialaphos) 등과 같은 글루포시네이트 타입의 제초제에 대한, 제초제 내성을 부여한다. 전술한 바와 같이, 벡터 구조체에 사용될 수 있는 다른 선별성 마커로, 바이알라포스 및 포스피노트리신 내성에 대한 pat, 이미다졸린온 내성에 대한 ALS, 히그로마이신 내성에 대한 HPH 또는 HYG, 글리포세이트 내성에 대한 EPSE 신타제, Hc-독소 내성에 대한 Hm1, 옥시플루오르펜과 같은 디페닐 에테르(DPE) 제초제 내성에 대한 프로토포리이노겐 옥시다제 및 이의 변이체, 및 당업계에서 일상적으로 사용되며 알려져 있는 다른 선별제를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. Yarranton(1992) Curr. Opin. Biotech. 3:506; Chistopherson et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6314; Yao et al. (1992) Cell 71:63; Reznikoff(1992) Mol. Microbiol. 6:2419; Barkley et al. (1980) The Operon 177-220; Hu et al. (1987) Cell 48:555; Brown et al. (1987) Cell 49:603; Figge et al. (1988) Cell 52:713; Deuschle et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5400; Fuerst et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:2549; Deuschle et al. (1990) Science 248:480; Labow et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10:3343; Zambretti et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:3952; Baim et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:5072; Wyborski et al. (1991) Nuc. Acids Res. 19:4647; Hillenand-Wissman (1989) Topics in Mol. And Struc. Blol. 10:143; Degenkolb et al. (1991) Antimicrob. Agents Chemother. 35:1591; Kleinschnidt et al. (1988) Biochemistry 27:1094; Gatz et al. (1992) Plant J. 2:397; Gossen et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5547; Oliva et al. (1992) Antimicrob. Agents Chemother. 36:9 13; Hlavka.et al. (1985) Handbook of Experimental Pharmacology 78; Gill et al. (1988) Nature 334:721, 미국 특허 제 6,282,837호, 제 6,288,306호, 및 제 5,767,373호, PCT 공개번호 WOOl12825, 및 미국 특허 공개공보 20010016956를 참조한다. 상기 문헌들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

본 발명에 이용가능한 마커 폴리펩티드의 다른 예는, 베타인 알데하이드 디하이드로게나제(BADH)이다. 상기 효소는 독성의 베타인 알데하이드를 내삽무압제(osmoprotectant)인 무독성의 글리신 베타인으로의 변환을 촉매한다. Daniell H. et al. (2001) Current Genetics 39:109-16 참조한다.

전술한 선별 마커 서열로 한정되는 것은 아니다. 임의의 선별 마커 서열을 본 발명에 사용할 수 있다.

본 발명은 개구리밥에서의 이의 발현을 강화하기 위한 발현된 뉴클레오티드 서열의 변형을 제공한다. 이러한 변형은, 색소체에 바람직한 코돈을 이용하여 목적 뉴클레오티드 서열을 합성하는 것이다. 예를 들어, 일부 경우들에서 아데닌/티민 함량이 50% 보다 높은 트랜스유전자는 아데닌/티민 함량이 보다 낮은 트랜스유전자보다 색소체에서 더 효율적으로 발현된다. 예, 미국 특허 제 5,545,817호가 있으며, 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 변이된 코돈 사용법을 이용한 뉴클레오티드 서열 합성 방법은 당업계에서 이용가능하다. 예, 미국 특허 제 5,380,831호 및 제 5,436,391호; Perlak et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 15:3324; Iannacome et al. (1997) Plant Mol. Biol. 34:485; 및 Murray et al. (1989) Nucleic Acids. Res. 17:477를 참조하며, 이들은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 유전자 서열의 전체 또는 임의의 일부가 최적화되거나 또는 합성될 수 있는 것으로 인정된다. 즉, 완전히 최적화되 서열 또는 부분적으로 최적화된 서열을 또한 이용할 수 있다. 또한 다른 변형은 목적 뉴클레오티드 서열에 만들어, 개구리밥에서의 이의 발현을 강화할 수 있다 이러한 변형으로는, 가짜 폴리아데닐레이션 시그널을 코딩하는 서열, 트랜스포존 유사 반복 서열 및 유전자 발현에 해로울 수 있는 특정화된 서열의 제거를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가능한 경우, 서열은 예측된 헤어핀 이차 mRNA 구조를 방지하도록 변형될 수 있다.

2. 표적 뉴클레오티드 서열

본 발명의 색소체 형질전환 벡터는 제1 및 제2 표적 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이들 각각은 개구리밥의 플라스톰 서열과 상동하다. 이러한 표적 뉴클레오티드 서열은 발현 카세트 측면에 위치하며, 플라스톰에 전이되어지는 색소체 형질전환 벡터 부위의 5' 및 3' 말단에 한정된다. 표적 뉴클레오티드 서열은 상동 재조합에 의해 수여체 플라스톰으로의 발현 카세트가 삽입되도록 한다.

표적 서열은 수여체의 플라스톰 부분과 상동하다. 전형적으로, 발현 카세트 측면에 위치한 표적 뉴클레오티드 서열은, 수여체 플라스톰의 표적 부위와 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 100% 상동하며, 수여체 플라스톰을 이용하여 상동 재조합할 수 있다.

두가지 서열간의 서열 비교, 및 상동성%과 유사성% 결정은, 수학적 알고리즘을 이용하여 수행될 수 있다. 본 발명에서, 2개의 뉴클레오티드 서열간의 상동성%는 GCG 소프트웨어 패키지의 GAP 프로그램, BLOSUM62 측정 행렬(scoring matrix)(Henikoff et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sd. USA 89:10915) 및 갭 웨이트(gap weight) 40, 50, 60, 70, 또는 80 및 길이 웨이트 1, 2, 3, 4, 5 또는 6을 이용하여 결정한다.

제1 및 제2 표적 뉴클레오티드 서열은, 수여체 플라스톰의 동일 부위, 중첩 부위, 인접 부위 또는 별개 부위와 상동적일 수 있다. 표적 서열은 수여체 플라스톰의 임의의 부위와 상동적일 수 있으며, 예컨대 상기 부위는 유전자, 슈도유전자 또는 유전자간 서열(intergenic sequence)을 포함한다. 표적 서열은, 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열이 플라스톰에 삽입되어 개구리밥 플라스톰에 천연적인 하나 이상의 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결될 수 있도록 설계될 수 있다. 이러한 예로, 천연 발현 조절 서열을 이용하여 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 유발할 수 있다. 다른 예로, 어느 하나 또는 2개의 표절 뉴클레오티드 서열은, 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열의 발현 유발에 사용될 수 있는 하나 이상의 발현 조절 서열을 포함할 수도 있다.

표적 뉴클레오티드 서열은 수여체 플라스톰과의 상동 재조합을 허용하는 충분한 임의 길이일 수 있다. 100개의 뉴클레오티드 미만의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 표적 뉴클레오티드 서열은, 일부 경우에서 재조합을 허용하는데 충분할 수 있다. 다른 예로, 좀더 긴 표적 뉴클레오티드 서열은 보다 효율적인 상동 재조합을 제공할 수 있다. 이러한 표적 뉴클레오티드 서열의 길이는 적어도 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800 또는 900개의 뉴클레오티드이거나 또는 적어도 1000 또는 그 이상일 수 있다.

본 발명은 렘나 마이너 엽록체 게놈의 16S에서 23S rRNA 부위의 서열을 제공한다. 상기 뉴클레오티드 서열은 서열 3으로 기재되어 있다. 일부 예들에서, 표적 뉴클레오티드 서열은 서열의 적어도 200, 300,400, 500, 600, 700, 800, 또는 900개의 뉴클레오티드가, 또는 적어도 1000, 1500, 2000, 2500, 또는 3000 이상이 상동일 수 있다. 그러나, 본 발명의 표적 뉴클레오티드 서열은, 임의의 개구리밥 플라스톰 서열에 상동적일 수 있다. 표적 서열로 사용될 수 있는 유전자간 서열의 부가적인 비제한적인 예로는, tRNAGlu(trnE)에서 tRNAThr(trnT) 부위, trnE에서 tRNATyr (trnY), trnY에서 tRNAAsp(trnD) 부위, rps8에서 rps14 부위, 리불로스-1,5-비스포스페이트 카르복실라제/옥시게나제 거대 서브유닛(rbcL)에서 아세틸-코엔자임 A 카르복실라제(accD)의 베타 서브유닛 부위, 사이토크롬 b(559)(psbE)의 거대 서브유닛 폴리펩티드에서 사이토크롬 f(petA) 부위, tRNAGly(trnG)에서 tRNAMet(trnM) 부위, psbA에서 tRNAHis(trnH) 부위, tRNAVal(trnV)에서 16s rRNA 부위, trnV에서 rps7/rpsl2 부위 및 개구리밥 플라스톰의 비필수 유전자 범위내 부위를 포함한다.

C. 형질전환 방법

본 발명의 색소체-형질전환된 개구리밥 세포 및 식물은, 개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열로 개구리밥 색소체를 형질전환함으로써 제조한다. 상기 이종의 뉴클레오티드 서열은 무작위 삽입 또는 부위 특이적 삽입(예, 상동 재조합)에 의해 삽입될 수도 있다. 이종의 뉴클레오티드 서열은 분리된 색소체내에 삽입될 수 있으며 또는 생체내에서 색소체로 형질전환될 수 있다. 형질전환된 색소를 사용하여 생체내 또는 생체외에서 이종의 뉴클레오티드 서열을 발현시킬 수 있다.

색소체 형질전환은 임의의 적합한 형질전환법, 예컨대 식물 프로토플라스트 전기충격(Taylor and Walbot (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:5824-28), PEG를 토대로한 방법(Golds et al. Biotechnology 11:95-97), 미세주입(Neuhas et al. (1987) Theor. Appl. Genet. 74:30-36), 또는 입자 충격(particle bombardment)(Boynton et al. (1988) Science 240:1534-38; Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 87:8526-8530; Svab and Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. 90:913-917; and U.S. Patent Nos. 5,451,513, 5,545,817, 5,545,818, 5,576,198, and 5,866,421; 모든 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함됨)에 의해 수행될 수 있다.

입자 충격에 의한 개구리밥 핵 형질전환은 미국 특허 제 6,040,498에 개시되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 본 발명의 일 예로서, 탄도 형질전환 방법(ballistic transformation method)은 (a) 표적물로 개구리밥 조직을 제공하는 단계; (b) 조직내 세포 벽을 관통하여 조직의 세포내에 뉴클레오티드 서열이 삽입되어 형질전환된 조직을 제공할 수 있는 충분한 속도로, 엽록체 형질전환 벡터를 수송하는 미소발사체를, 개구리밥 조직에 발사하는 단계를 포함한다. 본 발명의 특정 예에서, 상기 방법은 이후 선별제를 이용한 형질전환 조직의 배양 단계를 더 포함한다. 다른 대체 예에서, 상기 선별 단계후에 형질전환된 조직으로부터 형질전환된 개구리밥 식물의 재생 단계를 포함한다.

임의의 탄도 세포 형질전환 장치를 본 발명의 실시예 사용할 수 있다. 장치의 예는, Sanford et al. (1988) Particulate Science and Technology 5:27; Klein et al. (1987) Nature 327:70, 및 미국 특허 4,945,050, 5,036,006, 5,100,792, 5,179,022, 5,204,253, 5,371,015, 및 5,478,744에 개시되어 있으며, 이들 문헌은 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 이러한 장치는 일반적으로 충격에 사용되는 압력 조절을 허용한다. 본 발명의 방법에 사용된 압력은 일반적으로 약 500 psi 내지 약 2500 psi이며, 예컨대 약 1100 psi 내지 약 2200 psi이다.

뉴클레오티드 서열은 침강(precipitation)에 의해 미소운반체 입자상에 고정시킬 수 있다. 정확한 침강 파라미터는 입자 가속화 공정과 같은 인자에 따라 공지된 바와 같이 변경될 것이다. 운반체 입자는 선택적으로 폴리라이신과 같은 캡슐화제로 코팅하여, 유럽 0270356에 논의된 바와 같이, 이에 고정화된 뉴클레오디트 서열의 안정성을 향상시킬 수 있다. 금 및 텅스텐을 포함한 임의의 미소운반체를 본 발명에 사용할 수 있다. 미소운반체의 크기는 약 0.6 ㎛ 내지 약 1.6 이다.

충격이 가해지는 조직은 개구리밥 잎, 개구리밥 결절, 단편화된 개구리밥 결절(미소결절) 및 일부 재생된 결절을 포함한 임의의 개구리밥 세포 또는 조직일 수 있다. 개구리밥 결절, 미소결절 및 부분적으로 재생된 결절의 제조 방법은 미국 특허 제 6,040,498호 및 미국 특허 출원번호 09/915,873 및 10/158,243에 기재되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다.

색소체-형질전환된 개구리밥 세포 또는 결절 조직은, 색소체-형질전환된 식물 또는 동질색소체-형질전환된 식물(homotransplastomic plant)로 재생될 수 있다. 형질전환된 개구리밥 조직으로부터 개구리밥 식물 재생 방법은, 미국 특허 제 6,040,498호 및 미국 특허 출원 09/915,873 및 10/158,243에 개시되어 있으며, 이는 원용에 의해 본 발명에 포함된다. 또한 결절 배양물로부터 형질전환된 개구리밥 잎 재생 방법 역시 본원에 개시되어 있다.

다양한 선별 프로토콜을 본 발명에 사용할 수 있다. 예를 들어, 일부 예들에서는, 형질전환된 잎 또는 결절을 선별 과정중 일부 기간동안 어둠속에 유지시키고, 빛이 있는 쪽으로 이동시킬 수 있다. 다른 예로, 잎 또는 결절은 선별 공정 전체 단계 걸쳐 빛이 있는 쪽에서 유지시킨다.

일부 예들에서, 형질전환된 잎 또는 결절의 선별은 미분화된 상태를 유지시킬 수 있는 배지에서 이루어지고, 이후 식물은 잎 재생을 유발하는 배지로 이동되며, 반면에 다른 예에서는, 전체 선별 공정은 잎 재생을 유발하는 배지에서 이루어진다.

일부 예들에서, 형질전환된 개구리밥 색소체 및 색소체-형질전환된 개구리밥 식물 및 세포는 호모플라스토믹(homolastomic)이다. 호모플라스토믹 세포 및 식물은 선별성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 개구리밥 색소체를 형질전환시키고, 이후 마커 폴리펩티드를 발현하는 개구리밥 세포의 생존성을 허용하는 선별 배지에서 색소체-형질전환된 개구리밥 식물 또는 세포를 유지시킴으로써 생산할 수 있다. 일 예에서, 선별 배지는 호모플라스토믹이거나 또는 선별성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 색소체 모두를 실질적으로 가지는 개구리밥 세포의 증식만을 허용하거나, 또는 선별성 마커 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 호모플라스토믹인 개구리밥 세포의 증식만을 허용한다. 호모플라스토믹이거나 마커 폴리펩티드를 코딩하는 서열로 형질전환된 색소체 모두를 실질적으로 가지는 개구리밥 식물 또는 세포를 생산하기 위해 여러 회의 선별이 요구될 수 있다. 색소체-형질전환된 개구리밥 세포 또는 식물이 호모플라스토믹인지를 결정하기 위해, 서든 분석 또는 PCR 분석을 수행할 수도 있다.

일부 예들에서, 마커 폴리펩티드에 의해 부여되는 마커 표현형 선별로, 마커 폴리펩티드를 코딩하는 서열이 연결되어진 제2 코딩 서열을 가지는 개구리밥 세포 선별을 허용한다. 이러한 제2 코딩 서열은 전형적으로 목적 폴리펩티드를 코딩하며, 선별된 개구리밥 세포를 사용하여 목적 폴리펩티드를 생산할 수 있다.

도 1은 렘나(Lemna) 엽록체 게놈의 16S에서 23S rRNA 부위를 나타낸 것이다. 구체적인 사항은 실시예를 참조한다.

도 2는 발현벡터 pBCTO1의 구조도이다. 구체적인 사항은 실시예를 참조한다.

도 3은 pBCTO1 트랜스유전자 부위내 PCR 프라이머 71, 248, 210 및 234의 위치이다. 이들 플라이머는 pBCTO1 트랜스유전자의 개구리밥 엽록체로의 삽입 확인에 사용되었다. 구체적인 사항은 실시예를 참조한다.

실시예 4는 발현벡터 pBCTO4의 구조도이다. 구체적인 사항은 실시예를 참조한다.

하기 실시예는 예시하기 위한 것일뿐 한정하는 것은 아니다.

렘나 엽록체 형질전환 벡터

렘나 엽록체 형질전환용 벡터를 구축하였다. 벡터는 렘나 엽록체 게놈의 16S에서 23S rRNA 부위에 상동 재조합을 위해 고안된 서열을 포함하고 있다(도 1). 렘나 엽록체 게놈을 이용하여 상동 재조합을 형성하기 위해 사용된 서열은 하기와 같이 동정하였다. 담배, 옥수수, 벼, 아라비돕시스 및 시금치의 엽록체 게놈의, 16S에서 23S rRNA 부위를 정렬하여, 서열 상동성이 높은 부위를 결정하였다. 상기 정렬에서 확인된 보존적 부위를 초대로, 렘나 엽록체 게놈의 16S에서 23S 부위를 즈옥시키기 위한 PCR 프라이머를 설계하였다. 이들 PCR 프라이머의 서열은 하기와 같다.

프라이머 167: 5' GCTGGTCCGAGAGGATGATC 3'(서열번호 1)

프라이머 166: 5' GTTATAGTTACGGCCGCCGT 3' (서열번호 2)

표준 조건에서 렘나 마이너스의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 5.4 kb의 PCR 산물은 pT7Blue 벡터(Novagen^®, Madison, WI)에 클로닝하여 플라스미드 pBCTOO를 제조하였다. PCR 산물 전체를 서열분석하여 렘나 엽록체 게놈의 l6S에서 23S 부위인 것으로 확인하였다. PCR 산물의 서열은 서열번호 3에 기재되어 있다. 렘나 게놈은 16S rRNA 유전자, tRNA 이소루신 유전자(trnI), tRNA 알라닌 유전자(trnA), 및 23S rRNA 유전자를 포함한다.

trnI과 trnA 유전자 사이 부위에 트랜스유전자를 삽입시킨는 벡터를 제작하였다. 렘나 엽록체 게놈과 선별성 마커 카세트의 재조합을 위한 상동 부위상 사이 에 트랜스유전자를 포함하고 있는, 렘나 엽록체 형질전환 벡터를 다음과 같이 제작하였다. 전술한 바와 같이 확인된 렘나 게놈 서열을 토대로, 16S에서 23S rRNA 부위로부터 2.5 kb의 단편을 증폭시키는 PCR 프라이머를 제작하였다. 이들 프라이머의 서열은 하기와 같아.

프라이머 207: 5' ACAAGGTAGCCGTACTGGAAGGTGCGGCTG 3'(서열번호 4)

프라이머 203: 5' TTCAACTCCCCGAAGCATTTCGTC 3'(서열번호 5)

표준 조건에서 렘나 마이너스의 게놈 DNA를 주형으로 PCR을 수행하였다. 5.4 kb의 PCR 산물은 pT7Blue 벡터(Novagen^®, Madison, WI)에 클로닝하였다.

벡터 pBCTO1를 제조하기 위해, RbcL 라이보좀 결합부(서열번호 7), 아미노글리코시드 3''-아데닐릴트랜스퍼라제(aadA) 유전자 및 담배 psbA 3'UTR(서열번호 8)과 함께 담배 16S rRNA 프로모터(서열번호 6)를 포함하고 있는 스펙티노마이신/스트렙토마이신 선별 마커 카세트(NCBI Accession Number AF061065)를 PstI/NsiI로 클로닝하여 pBCT00의 렘나 trnI과 trnA 사이에 삽입함으로써, 플라스미드를 제조하였다. 플라스미드 pCBTO4의 구조도는 도 2에 개시되어 있다.

벡터 pBCTO4를 제조하기 위해, RbcL 라이보좀 결합부(서열번호 7), 아미노글리코시드 3''-아데닐릴트랜스퍼라제(aadA) 유전자 및 담배 psbA 3'UTR(서열번호 8)과 함께 담배 16S rRNA 프로모터(서열번호 6)를 포함하고 있는 카나마이신 선별 마커 카세트(NCBI Accession Number AF061065)를 PstI/NsiI로 클로닝하여 pBCT00의 렘나 trnI과 trnA 사이에 삽입함으로써 플라스미드를 제조하였다. 카나마이신 선 별 마커 카세트는, 아미노글리코시드 3' 포스포트랜스퍼라제(NCBII Accession No. P00554) 코딩 유전자를 PCR로 증폭하여, 이를 RbcL 결합부와 함께 담배 16S rRNA 프로모터의 하위 및 담배 psbA 3'UTR의 상위에 삽입함으로써, 제조하였다. 상기 카세트는 렘나 trnI과 trnA 사이의 PstI 부위에 클로닝하여 벡터 pBCTO4를 제조하였다. 플라스미드 pBCTO4의 구조도는 도 4에 기재되어 있다.

렘나 결절 준비

본 실시예에서는 임의의 렘나 균주를 사용할 수 있지만, 렘나 마이너 균주 8627을 형질전환에 사용하였다. 형질전환을 위한 개구리밥 결절 배양물은 다음과 같이 준비하였다. 개구리밥 입을 취하고, 멸균 메스를 이용하여 뿌리를 제거한 후, 잎의 하면이 아래가 되도록, 5 μM의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 0.5 μM의1-페닐-3(1,2,3-티아디아졸-5-일)유레아 티디아주론(Sigma P6186), 3% 자당, 0.4 디프코 박터-아가(Fisher Scientific) 및 0.15% 젤리트(Sigma)가 보충된 MS 배지(Murashige and Skoog medium (1962) Physiol. Plant. 15:473) pH5.6 상에 두었다. 5 내지 6주간 입을 배양하였다. 이때, 일반적으로 결절(작고, 노르스름한 세포 덩어리)이 잎 하면의 중심부에 나타난다. 상기 결절 조직 조직(평균 직경 3-6 mm)를 모체 잎에서 탈착하여, 3% 자당, 0.4% 디프코 박터-아가, 1 μM의 2,4-디클로로페녹시아세트산 및 2 μM의 벤질아데닌이 보충된 MS 배지에서 배양하였다.

입자 충격(particle bombardment)에 의한 렘나 결절의 엽록체 형질전환:

퀴아젠 맥시-프랩 키트(QIAGEN, Valencia, Ca)를 이용하여 정제된 pBCTO1과 pBCTO4 DNA를 준비하였고, 이를 금 미소운반체(0.6 ㎛; Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA)로 제조사의 안내서에 따라 코팅하였다. 입자 충격 전에, 약 50개의 렘나 결절(약 0.5-10 mm 직경)을 MS 배지(pBCTO1) 또는 5 μM의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 0.5 μM의1-페닐-3(1,2,3-티아디아졸-5-일)유레아 티디아주론, 3% 자당, 0.4 디프코 박터-아가 및 0.15% 젤리트가 보충된 MS 배지(pBCTO4)가 있는 페트리 플레이트 가운데 두었다. 바이오-래드사(PDS-1000/ He, Bio-Rad, Hercules, CA)의 Bio-Rad PDS-l000/He 유전자총(biolistic) 장치를 이용하고, 제조사의 프로토콜인 표적물과의 거리 9 cm, 헬륨 압력 1100-2200 및 진공 28inch 조건으로 결절에 2회 충격을 가하였다.

pBCTO1의 경우, 충격후 결절을 MS 배지에서 48시간 암배양하였다. 이후 결절을 25 ㎍/ml 스펙티노마이신 디하이드로클로라이드가 함유된 MS 배지로 이동한 후 2주간 명(light) 배양하였다(pBCTO1). 이후 결절은 25 ㎍/ml 스펙티노마이신이 함유된 0.5 x SH 배지로 이동시킨 후 계속 명 배양하였다. 결절은 주마다 1회 신선한 배지로 옮겨주었다. 0.5 x SH 배지에서 6 내지 8주 후 결절에서 입 조직이 생성되기 시작하였다.

pBCTO4의 경우, 충격을 가한 후 5 μM의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 0.5 μM의1-페닐-3(1,2,3-티아디아졸-5-일)유레아 티디아주론, 3% 자당, 0.4 디프코 박터-아가 및 0.15% 젤리트가 보충된 MS 배지에서, 결절을 48시간 배양하였다. 이후 결절은 5 μM의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 0.5 μM의1-페닐-3(1,2,3-티아디아졸-5-일)유레아 티디아주론, 3% 자당, 0.4 디프코 박터-아가, 0.15% 젤리트 및 50 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 MS 배지로 이동시켜, 4주간 배양한 다음, 5 μM의 2,4-디 클로로페녹시아세트산, 0.5 μM의1-페닐-3(1,2,3-티아디아졸-5-일)유레아 티디아주론, 3% 자당, 0.4 디프코 박터-아가, 0.15% 젤리트 및 100 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 MS 배지로 이동시켜 4주간 더 배양하였다. 결절은 입이 재생될때까지, 100 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 0.5 x SH 배지에 8 내지 12주간 두었다.

입자 충격에 의한 렘나 잎의 엽록체 형질전환

렘나 잎의 형질전환시, 약 30개의 렘나 잎을 0.5 x SH 배지상의 #5 왓트만 종이 조각의 중간에 두고, 렘나 결절을 이용한 상기 방법과 같이 충격을 가하였다. 충격을 가한 후, 잎은 0.5 x SH 배지상에서 48시간 동안 암 배양한 다음, 3% 자당, 0.4 디프코 박터-아가, 0.15% 젤리트, 5 μM의 2,4-디클로로페녹시아세트산, 2 μM의벤질아데닌 및 50 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 MS 배지로 옮겼다. 결절 조직이 형성될때까지 6-8주간 매주 신선한 배지로 잎을 이동시켰다. 결절 조직은 입이 재생될때까지, 100 ㎍/ml 카나마이신이 보충된 0.5 x SH 배지에 6 내지 10주간 매주 신선한 배지로 교체하였다.

엽록체 형질전환체의 분석

렘나 엽록체 게놈내 pBCT01 트램스유전자의 삽입을 확인하기 위해, 잎을 재생하는 결절 조직에 대해 PCR을 실시하였다. 25 ㎍/ml 스펙티노마이신이 함유된 SH 배지에서 8주간 배양한 조직을 분석에 사용하였다. DNeasy DNA 추출 키트(Q1AGEN, Valencia, CA)를 이용하여 결절 조직으로부터 게놈 DNA를 추출하여, 표준 조건하에서 PCR을 수행하였다. 상동 재조합 양쪽 부위의 삽입을 검사하기 위한 두가지 프라이머 세트를 설계하였다. 프라이머 71과 248은 16S 재조합 부위에서의 삽입을 검사하기 위한 것으로 1796 bp의 산물을 증폭시키며, 프라이머 210과 234는 23S 재조합 부위에서의 삽입을 검사하기 위한 것으로 2610 bp의 산물을 증폭시킨다. 프라이머 위치는 도 3에 나타나 있다.

프라이머 71: 5' AAAACCCGTCCTCAGTTCGGATTGC 3'(서열번호 9)

프라이머 248: 5' CCGCGTTGTTTCATCAAGCCTTACG 3'(서열번호 lO)

프라이머 210: 5' CTGTAGAAGTCACCATTGTTGTGC 3'(서열번호 11)

프라이머 234: 5' GGTTCGGACCTCCACTTAGT 3'(서열번호 12)

예상한 PCR 산물이 모두 6개의 독립적인 개구리밥 배양물에서 나타났으며, 이들중 2개의 샘플은 매우 높은 트랜스유전자 삽입율을 나타내었다. 이들 배양물들중 하나에서 분리한 PCR 산물의 서열을 분석하여 pBCTO1의 트랜스유전자 서열과 동일한 것으로 확인되었으며, 이는 트랜스유전자와 플라스톰사이에 재조합 상동성이 이루어졌음을 입증하는 것이다.

본 명세서에 언급된 모든 공개물 및 특허 출원은 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자의 수준에서 나타낸다. 모든 공개물 및 특허 출원은, 각각의 공개물 또는 특허 출원이 원용에 의해 포함되는 것으로 특별히 개별적으로 제시되어 있지만, 이들은 동일한 범위로 원용에 의해 본원에 포함된다.

전술한 발명은 예시에 의해 일부 상세히 개시되며 이해를 명확히하기 위한 실시예를 개시하지만, 특정 변경 및 수정이 첨부된 청구범위내에서 실시될 수 있음이 명백하다.

SEQUENCE LISTING <110> Biolex, Inc. Cox, Kevin M. Peele, Charles G. <120> Chloroplast Transformation of Duckweed <130> 40989/279828 <150> US 60/484,166 <151> 2003-07-01 <150> US 60/492,179 <151> 2003-08-01 <160> 12 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 167 <400> 1 gctggtccga gaggatgatc 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR primer 166 <400> 2 gttatagtta cggccgccgt 20 <210> 3 <211> 5373 <212> DNA <213> Lemna minor <220> <221> misc_feature <222> 3530, 4789 <223> n = A,T,C or G <400> 3 gctggtccga gaggatgatc agccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 60 aggcagcagt ggggaatttt ccgcaatggg cgaaagcctg acggagcaat gccgcgtgga 120 ggtagaaggc ccacgggtcg tgaacttctt ttctcggaga agaagcaatg acggtatctg 180 aggaataagc atcggctaac tctgtgccag cagccgcggt aagacagagg atgcaagcgt 240 tatccggaat gattgggcgt aaagcgtctg taggtggctt ttcaagtccg tcgtcaaatc 300 ccagggctca accctggaca ggcggtggaa actaccaagc tggagtacgg taggggcaga 360 gggaatttcc ggtggagcgg tgaaatgcgt 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<400> 4 acaaggtagc cgtactggaa ggtgcggctg 30 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer 203 <400> 5 ttcaactccc cgaagcattt cgtc 24 <210> 6 <211> 119 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 6 gctcccccgc cgtcgttcaa tgagaatgga taagaggctc gtgggattga cgtgaggggg 60 cagggatggc tatatttctg ggagcgaact ccgggcgaat acgaagcgct tggatacag 119 <210> 7 <211> 16 <212> DNA <213> Nicotiana tabacum <400> 7 ttgtagggag ggattt 16 <210> 8 <211> 189 <212> DNA <213> Nicotiana tabacaum <400> 8 gatcctggcc tagtctatag gaggttttga aaagaaagga gcaataatca ttttcttgtt 60 ctatcaagag ggtgctattg ctcctttctt tttttctttt tatttattta ctagtatttt 120 acttacatag acttttttgt ttacattata gaaaaagaag gagaggttat tttcttgcat 180 ttattcatg 189 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer 71 <400> 9 aaaacccgtc ctcagttcgg attgc 25 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer 248 <400> 10 ccgcgttgtt tcatcaagcc ttacg 25 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer 210 <400> 11 ctgtagaagt caccattgtt gtgc 24 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCR Primer 234 <400> 12 ggttcggacc tccacttagt 20 3 1 3

Claims

개구리밥(duckweed) 플라스톰(plastome)에 이종적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 색소체(plastid)를 가지며, 상기 개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열은 색소체에서 기능할 수 있는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결된, 개구리밥 식물.
제 1항에 있어서, 상기 개구리밥 플라스톰에 이종적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열은 목적 폴리펩티드를 코딩하는 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 2항에 있어서, 상기 목적 폴리펩티드는 인슐린, 성장 호르몬, 알파-인터페론, 베타-인터페론, 베타-글루코세레브로시다제, 베타-글루코로니다제, 망막모세포종 단백질, p53 단백질, 안지오스타틴(angiostatin), 렙틴(leptin), 에리트로포이에틴, 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자, 플라스미노겐, 단일클론 항체, Fab 단편, 단일 체인 항체, 사이토카인, 수용체, 인간 백신, 동물 백신, 식물 폴리펩티드, 펩티드 및 혈청 알부민으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 1항에 있어서, 상기 색소체는 목적 폴리펩티드를 코딩하는 개구리밥 플라스톰에 이종적인 적어도 2가지의 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 1항에 있어서, 상기 개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열은 식물 세포 선별에 사용될 수 있는 마커 폴리펩티드 코딩 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 5항에 있어서, 상기 마커 폴리펩티드는 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항생제에 대한 내성을 부여하는 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 1항에 있어서, 개구리밥 플라스톰에 이종적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 색소체는 전색소체(proplastid), 전분체(amyloplast), 유색체(chromoplast), 엽록체, 에티오플라스트(etioplast) 및 백색체(leucoplast)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 9항에 있어서, 상기 개구리밥 플라스톰에 이종적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로 형질전환된 색소체는 엽록체인 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 1항에 있어서, 상기 색소체에서 기능할 수 있는 발현 조절 서열은 식물의 16S rRNA 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 9항에 있어서, 상기 색소체에서 기능할 수 있는 발현 조절 서열은 담배의 16S rRNA 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 10항에 있어서, 상기 담배의 16S rRNA 프로모터 서열은 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 1항에 있어서, 상기 개구리밥 식물은 스피로델라(Spirodela) 속, 울피아(Wolffia) 속, 울피엘라(Wolfiella) 속 및 렘나(Lemna) 속으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
제 12항에 있어서, 상기 개구리밥 식물은 렘나 마이너(Lemna minor), 렘나 미니스큘라(Lemna miniscula), 렘나 에퀴녹티얼리스(Lemna aequinoctialis) 및 렘나 지바(Leinna gibba)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 개구리밥 식물.
a) 개구리밥 플라스톰 서열과 상동한 제1 표적 뉴클레오티드 서열;

b) 개구리밥 플라스톰에 이종적인 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나를 포함하는 발현 카세트의 뉴클레오티드 서열; 및

c) 개구리밥 플라스톰 서열과 상동한 제2 표적 뉴클레오티드 서열을, 작동가 능하게 연결된 성분으로서 포함하는 핵산 분자.
제 14항에 있어서, 상기 발현 카세트는 상기 목적 폴리펩티드를 코딩하는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 발현 조절 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 14항에 있어서, 상기 색소체에서 기능할 수 있는 발현 조절 서열은 담배의 16S rRNA 프로모터 서열인 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 16항에 있어서, 상기 담배의 16S rRNA 프로모터 서열은 서열번호 6에 기재된 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 14항에 있어서, 개구리밥에서 기능하는 라이보좀 결합 부위의 뉴클레오티드 서열중 적어도 하나를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 18항에 있어서, 상기 개구리밥에서 기능하는 라이보좀 결합 부위는 서열번호 7에 기재된 담배의 rbcL 라이보좀 결합부위 뉴클레오티드 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 14항에 있어서, 전사 종결 서열을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하 는, 핵산 분자.
제 20항에 있어서, 상기 전사 종결 신호는 서열번호 8에 기재된 담배 psbA 유전자의 3' 비번역 부위의 뉴클레오티드 서열인 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 14항에 있어서, 상기 적어도 하나 이상의 목적 폴리펩티드는 형질전환된 개구리밥 세포 선별에 사용될 수 있는 마커 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 22항에 있어서, 상기 마커 폴리펩티드는 스펙티노마이신 및 스트렙토마이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 항생제에 대한 내성을 부여하는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 14항에 있어서, 상기 제1 및 제2 표적 뉴클레오티드 서열은 개구리밥 플라스톰에서 상동 재조합을 진행시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 14항에 있어서, 상기 개구리밥 색소체는 개구리밥 엽록체이고, 상기 개구리밥 플라스톰은 엽록체 게놈인 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 14항에 따른 핵산 분자를 포함하는 개구리밥의 엽록체.
제 26항에 따른 엽록체를 포함하는 개구리밥 세포.
제 27항에 따른 개구리밥 세포를 포함하는 개구리밥 식물.
제 14항에 있어서, 제1 표적 뉴클레오티드 서열 및 제2 표적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는, 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열과 상동한 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
a) 개구리밥 엽록체 게놈 서열과 상동한 제1 표적 뉴클레오티드 서열;

b) 개구리밥에서 기능하는 발현 조절 서열;

c) 개구리밥에서 기능하는 라이보좀 결합 부위의 뉴클레오티드 서열;

d) 목적 폴리펩티드를 코딩하는 개구리밥 엽록체에 이종적인 뉴클레오티드 서열;

e) 개구리밥에서 기능하는 전사 종결 서열; 및

f) 개구리밥 엽록체의 게놈 서열과 상동한 제2 표적 뉴클레오티드 서열을, 작동가능하게 연결된 성분으로서 포함하는 핵산 분자.
제 30항에 있어서, 제1 표적 뉴클레오티드 서열 및 제2 표적 뉴클레오티드 서열로부터 선택된 뉴클레오티드 중 적어도 하나는, 서열번호 3에 기재된 뉴클레오 티드 서열과 상동한 것을 특징으로 하는, 핵산 분자.
제 30항에 따른 핵산 분자를 포함하는 개구리밥 엽록체.
제 32항에 따른 엽록체를 포함하는 개구리밥 세포.
제 33항의 개구리밥 세포를 포함하는 개구리밥 식물.
개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열이 상기 개구리밥 결절의 적어도 하나의 색소체내로 도입되는 조건 하에서, 미소발사체(microprojectile)에 흡착된 제 14항의 핵산 분자로, 색소체 결절에 충격을 가하는(bombarding) 단계를 포함하는, 개구리밥 플라스톰에 이종적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 개구리밥 색소체에 도입하는 방법.
제 35항에 있어서, 상기 개구리밥 색소체는 개구리밥의 엽록체인 것을 특징으로 하는, 개구리밥 플라스톰에 이종적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 개구리밥 색소체에 도입하는 방법.
개구리밥 플라스톰에 이종적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열을 포함하는 개구리밥 색소체로서, 상기 개구리밥 플라스톰에 이종적인 적어도 하나의 뉴클레오 티드 서열을 포함하는 개구리밥 색소체가 제 35항에 따른 방법에 의해 제조된 것을 특징으로 하는, 개구리밥 색소체.
제 37항에 따른 개구리밥 색소체를 포함하는 개구리밥 세포.
제 38항에 따른 개구리밥 세포를 포함하는 개구리밥 식물.
a) 개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열이 개구리밥 결절의 적어도 하나의 색소체내로 도입되는 조건 하에서, 미소발사체에 흡착된 제 14항의 핵산 분자로 색소체 결절에 충격을 가하는 단계; 및

b) 상기 개구리밥 결절로부터 개구리밥 식물을 재생하는 단계;

를 포함하는, 색소체-형질전환된(transplastomic) 개구리밥 식물의 수득 방법.
제 40항에 따른 방법으로 제조된, 색소체-형질전환된 개구리밥 식물.
a) 개구리밥 세포에 대한 선별가능한 표현형을 부여하는 마커 서열을 포함하는, 제 14항에 따른 핵산 분자를 제공하는 단계;

b) 개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열이 개구리밥 결절의 적어도 하나의 색소체내로 도입되는 조건 하에서, 미소발사체에 흡착된 상기 핵산 분 자로 색소체 결절에 충격을 가하는 단계;

c) 상기 개구리밥 결절을, 선별가능한 표현형을 가진 개구리밥 세포를 생존시키는 선별 배지에서 유지시켜, 마커 서열을 포함하고 있는 개구리밥 세포를 선별하는 단계; 및

d) 상기 개구리밥 결절로부터 개구리밥 식물을 재생하는 단계;

를 포함하는, 안정적인 색소체-형질전환된 색소체를 포함하고 있는 개구리밥 식물의 수득 방법.
제 42항에 있어서, 상기 선별 배지는 핵산 분자로 형질전환된 모든 색소체를 실질적으로 지니고 있는 개구리밥 세포를 우선적으로 생존시키는 것을 특징으로 하는, 안정적으로 형질전환된 색소체를 포함하고 있는 개구리밥 식물의 수득 방법.
제 42항의 방법으로 제조된 색소체-형질전환된 개구리밥 식물.
a) 개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열이 개구리밥 결절의 적어도 하나의 색소체내로 도입되는 조건 하에서, 미소발사체에 흡착된 제 14항의 핵산 분자로 색소체 결절에 충격을 가하는 단계; 및

b) 상기 핵산 분자로부터 목적 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 개구리밥 식물을 배양하는 단계;

를 포함하는, 목적 폴리펩티드를 생산하는 방법.
a) 개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열이 개구리밥 결절의 적어도 하나의 색소체내로 도입되는 조건 하에서, 미소발사체에 흡착된 제 14항의 핵산 분자로 색소체 결절에 충격을 가하는 단계; 및

b) 상기 개구리밥 결절로부터 개구리밥 식물을 재생하는 단계; 및

c) 상기 핵산 분자로부터 목적 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 개구리밥 식물을 배양하는 단계;

를 포함하는, 목적 폴리펩티드를 생산하는 방법.
개구리밥 플라스톰에 이종적인 적어도 하나의 뉴클레오티드 서열로 안정적으로 형질전환된 색소체를 가지는 개구리밥 세포로서, 상기 개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열은 색소체에서 기능할 수 있는 발현 조절 서열에 작동가능하게 연결되어 있는 것을 특징으로 하는, 개구리밥 세포.
a) 제 27항에 따른 개구리밥 세포를 제공하는 단계로서, 개구리밥 플라스톰에 이종적인 뉴클레오티드 서열은 하나 이상의 목적 폴리펩티드를 코딩하는 것인 개구리밥 세포를 제공하는 단계;

b) 목적 폴리펩티드가 발현되는 조건하에서 상기 개구리밥 세포를 배양하는 단계;

를 포함하는, 하나 이상의 목적 폴리펩티드의 생산 방법.
a) 서열번호 3에 기재된 뉴클레오티드 서열;

b) 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 적어도 100개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 단편 서열;

c) 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 적어도 200개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 단편 서열;

d) 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 적어도 400개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 단편 서열;

e) 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 적어도 600개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 단편 서열;

f) 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 적어도 800개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 단편 서열;

g) 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 적어도 1000개 이상의 연속적인 뉴클레오티드를 포함하는, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열의 단편 서열;

h) 개구리밥의 엽록체 게놈과 상동 재조합 가능한, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 90% 서열이 상동한 뉴클레오티드 서열; 및

i) 개구리밥의 엽록체 게놈과 상동 재조합 가능한, 서열번호 3의 뉴클레오티드 서열과 적어도 95% 서열이 상동한 뉴클레오티드 서열;

로 이루어진 군으로부터 선택되는 뉴클레오티드 서열을 가지는 핵산 분자.