KR20060094745A - 층상형 금속 수산화물과 레티노익산의 혼성체를 함유하는암치료용 약학적 조성물 - Google Patents
층상형 금속 수산화물과 레티노익산의 혼성체를 함유하는암치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 기존 레티노익산의 부작용(side-effect)을 제거하고 안정성과 서방성이 우수하고 전달효율을 높힌 새로운 약물 전달 시스템으로서 간암 치료에 탁월한 효과를 나타내는 층상형 금속 수산화물(Layed metal hydroxide)과 레티노익산(Reinoic acid)의 혼성체(LMH-RA)의 약학적 조성물에 관한 것이다.
Description
도 1은 각각의 레티노익산/무기 혼성체들의 모식도를 나타낸 것이다.
(a)는 레티노익산(Retinoic Acid : RA)-LDH(layered double hydroxide)
(b)는 레티노익산(Retinoic Acid : RA)-HDS(hydroxy double salt)
도 2는 레티노익산-층상구조 화합물(금속수산화물 : LDH & HDS) 혼성체에 대한 X-선 회절도를 나타낸 것이다.
(a)는 NO3-LDH
(b)는 RA(Retinoic acid)-LDH(layered double hydroxide)
(C)는 RA(Retinoic acid)산-HDS(hydroxy double salt)
도 3은 RA 및 LDH-RA 혼성체의 자외선-가시광선 스펙트럼 및 RA의 시간에 따른 용출량 데이타(5 mg의 LDH-RA 혼성체를 수용액 중에 분산시켰을 때 자외선-가시광선 스펙트럼 상에서 시간 변화에 따른 흡광도의 변화)를 나타낸 것이다.
도 4은 LDH-RA 혼성체가 간암세포인 CHX세포주에 미치는 영향에 따른 세포형태학적 변화를 나타낸 것이다.
도 5은 간암세포인 CHX세포주로부터 FITC(fluorescein isothiocyanate)발현 시간을 나타낸 것이다.
도 6는 간암세포인 CHX세포주로부터 LDH-FITC 혼성체(hybrid)의 세포내 포과정을 나타낸 것이다.
도 7는 간암세포인 CHX세포주로부터 LDH-FITC 혼성체에 의한 Golgi체 분포 상태를 나타낸 것이다.
도 8는 간암세포인 CHX세포주로부터 LDH-FITC 혼성체에 의한 lysosome부근에서의 분포 상태를 나타낸 것이다.
도 9는 간암세포인 CHX세포주로부터 LDH활성도를 나타낸 것이다.
도 10은 LDH-RA 혼성체에 의한 염색체 분절(DNA fragmenetation)에서의 영향을 나타낸 것이다.
도 11은 레티노익산-LDH 혼성체에 의한 단백질발현 변화를 western blot으로 나타낸 것이다.
도 12는 레티노익산-LDH 혼성체에 의한 xenograft nude mice에서의 암성장 억제 정도를 나타낸 것이다.
도 13은 나노하이브리드 혼성체에 의해 xenograft nude mice의 암성장 억제정도를 암 조직의 H/E염색을 통해 나타낸 것이다.
본 발명은 층상형 금속 수산화물-레티노익산(LMH-RA) 혼성체 및 그의 암치료 효능에 관한 것이다. 좀더 구체적으로, 본 발명은 무기담체로서 층상형 금속 수산화물과 레티노익산 하이브리드 혼성체를 함유하는 암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
일반적으로 층상 구조를 갖는 무기 화합물들은 그 대부분이 층간에 다양한 물질들을 포함할 수 있는 특징을 갖고 있다. 격자층을 이루는 금속 이온을 이질동상 치환시켜 층전하를 발생시키거나 층상을 개질시켜 물리 화학적 흡착 특성을 부여함으로써 다양한 기능성 게스트(guest) 물질들을 층간으로 도입시킬 수 있다(예컨대, 알루미노실리케이트, 메탈 포스페이트 등). 뿐만 아니라, 공극의 크기를 조절하여 선택적 크기의 분자를 물리적으로 흡착시키는 방법도 잘 알려져 있다(예컨대, 가교화 점토, MCM-41 등). 이와 같은 층상 구조를 갖는 무기 화합물의 하나인 금속 이중층 수산화물(layered double hydroxides; 이하 LDHs)은 음이온 점토(anionic clays)라고도 불리는데, 양전하를 띤 금속 수산화물층과 층간에 이 양전하를 상쇄시킬 음이온과 물로 구성되어 있다. 다양한 음이온이 이온 교환 반응과 공침 반응으로 손쉽게 수산화물 층간으로 도입될 수 있는 것으로 알려져 있으며, 이러한 금속 이중층 수산화물과 그의 유도체들은 촉매 반응에서의 기술적인 중요성, 분리 기술, 광학, 의학 공학, 약학 등의 분야에서, 층상 나노혼성체로서 상당한 관심을 받고 있는 바, 이에 대한 연구가 계속되어 왔다.
예를 들면, A. van der Vol. et al.의 문헌['Ordering of intercalated water and carbonate anions in hydrotalcite - An NMR study', Journal Physical Chemistry, 1994, 98, 4050-4054]에서는 하이드로탈사이트(hydrotalcite - [Mg3Al(OH)8]+[0.5CO3·mH2O]- - 마그네슘과 알루미늄을 기본으로 한 금속이중층 수산화물과 같은 구조를 갖는 화합물의 광물명)의 층간 음이온(carbonate)과 층간수의 구조를 1H와 13C NMR을 이용하여 규명하였다.
Yun Sang Kyeong and et. al.의 문헌['Layered double hydroxides intercalated by polyoxometalate anions with keggin(α-H2W12O40 6-), dawson(α-P2W18O62 6-), and finke(Co4(H2O)2(PW9O34)2 10-) structures' , Inorganic Chemistry, 1996, 35, 6853-6860]에는 수산화물과 아디페이트가 층간 삽입된 Mg3Al LDH의 전구체로부터 이온교환 반응을 통해 폴리옥소메탈레이트(P2W18O62 6- 또는 Co4(H2O)2(PW9O34)2 10-)으로 가교화시키는 합성법 및 그에 대한 구조적, 열적 성질의 평가 결과에 대해 기재되어 있다. Ji-Won Moon and et. al.의 문헌['Crystal structures of some double hydroxide minerals', Mineralogical Magazine, 1973, 39[304], 377-389]에는 몇가지 LDH들의 구조적 특징과 가능한 금속 양이온 및 흔한 층간 음이온의 종류 및 구조에 대해 소개되어 있다.
F. Cavani et al. 의 문헌['Hydrotalcite-type anionic clays: Preparation, properties and applications', Catalysis Today, 1991, 11, 173-301]에는 LDH의 역사적 배경 및 가능한 구성 성분(예를 들면, 금속 양이온 및 층간 음이온의 종류 ), 구조적 성질, 및 응용성 등이 총망라하여 개관되어 있다. 하지만, 생체 물질 측면에서는 유전자 DNA나 RNA등과 같이 인산 이온을 함유한 생체 물질들만이 이용된 바가 알려져 있을 뿐이다(한국특허출원 제2003-00676호).
한편, 최근 들어 레틴오이드 유도체(레틴올, 레틴오이산 등) 고유의 항산화 특성에 의한 피부 미백, 잡티제거, 기미, 주근깨 제거 및 예방과 주름 방지의 효과를 갖는 기능성 화장품 원료로서 각광받고 있으나, 비타민 자체가 공기중에서 매우 불안정하여 파괴되기 쉬워 그 취급 및 활용이 매우 용이하지 않은 단점이 있다. 그리고 비타민 중 항암 물질로 알려진 비타민A(레티놀)과 레티노이드 (Retinoid)는 항암 활성을 나타내는 고농도로 투여시 인체에 피부자극(irritation) 등과 같은 심각한 부작용으로 인해 실제 사용된 적이 없다. 미국특허 제4,310,546호에는 N-(4-아실옥시페닐)-all-트랜스-레틴아미드 화합물이 기술되어 있고, 미국특허 제4,323,581호에는 N-(4-하이드록시페닐)-all-트랜스-레틴아미드가 기술되어 있으며, 미국특허 제4,665,098호에는 펜레티마이드(fenretimide)로 알려진 N-(4-하이드록시페닐)레틴아미드가 기술되어 있다.
한편 레티노이드는 세포내에 존재하는 자신의 수용체인 RAR(retinoic acid receptor)와 RXR(retinoid X receptor)에 이합체로 결합하여 RAR/RXR의 핵내 유입이 증가하도록 촉진시켜 세포분화 및 개체의 발달에 관여하며[Dino moras et al., Nature, 1995, 375, 377-382], 또한 레티노이드는 간접적으로 전사활성인자 AP-1(activation protein-1)과 작용하여 활성을 억제함으로써 암 발생, 전이에 관여하는 AP-1의 표적유전자 발현을 억제하여 항암효과를 나타내는 것으로 알려져 있다 (Yang-Yen H. F. et al., New Biol. 3 : 1206-1219, 1991). 또한, 레티놀 및 레티노이드는 세포의 무분별한 증식을 억제하고 분화 또는 세포사(Apoptosis)를 유발하므로 암을 억제 및 치료하는데 유용하게 이용될 것으로 알려져 왔다(Hong W.K. and Itri L.M., Biol. Chem. Med., 2nd ed. edited by Sporn et al., New York : Raven Press ; 597 - 630, 1994). 그러나, 레티노이드 사용에 있어 따르는 한계는 레티노이드와 수용체의 결합에 의해 활성화되는 단백질 중 일부에 의해 피부 자극과 각 기관별 독성 및 기형등의 부작용이 수반되는 문제점이 있다(Hathcock J.N. et al., Am. J. Clin. Nutr., 52, 183-202, 1990). 최근에 기존의 레티노이드 보다 우수한 항암 효과를 보이면서 부작용이 감소된 몇 종류의 레티노이드 유도체들이 공개되었다. 그러나, 이들 역시 레티노이드계 약물의 내재적인 문제점으로서 고용량으로 투여할 경우 조직에 대한 자극성을 나타내기 때문에 사용량에 제한을 받는 등, 항암제로서의 요건을 여전히 만족시켜 주지 못하고 있다. 이는 흡수율의 문제로 용해가 잘 안되는 단점으로 고용량을 처리하게 되는데 이런 단점을 보완하여 LDH-RA가 그 해답을 제시 하고자 한다.
현재 사용되고 있는 간암치료제는 약전에 기재된 주사제 5-플루오로우라실(5-fluorouracil, 5-FU), 시타라빈(sytarabine) 및 알킬옥산(alkyloxane) 등이 있으나, 이들은 암세포를 사멸하는 기능보다는 암세포의 성장을 저해하는 기능에 초점을 둔 것으로서 간암의 근원적인 치료방법이 되지 못하고 있다. 또한, 간암의 획기적인 치료방법으로 알려진 '홀륨-키토산 복합체 치료제'(DW-166HC)은 아직 임상적으로 그 안정성 및 효과가 입증되지 않아 앞으로도 많은 환자를 대상으로 한 장기간의 임상시험이 진행되어야 하며, 암덩어리가 2개 이상 여러 장기에 퍼져 있거나 다른 장기로 전이되었을 경우, 복수 또는 황달의 증상이 있을 경우, 암덩어리에 연결된 혈관이 여러개인 경우에는 상기의 치료방법이 적용될 수 없다는 문제점이 있다. 더욱이, 상기 치료법은 병원에서 의사의 시술에 의해서만 치료를 받을 수 있다는 제한성을 가지고 있다.
LDH-RA와 관련된 특허는 많지 않다. 국내,외적으로는 몇건의 특허가 있는데 나노복합 물질은 층상 복수소화물 (LDH)를 기본으로 한다. 층상 복수소화물은 천연산인 것과 사실상 합성된 것 모두일 수 있다. 합성된 층상 복수소화물의 가능한 제조방법이 미국특허 제3,539,306호 및 3,650,704호에 개시되어 있으며 특히 히드로진사이트와 3-벤조일-α-메틸벤젠아세트산의 혼성체(특허출원:10-2002-0047318)을, 층상 이중 히드록사이드(layered double hydroxide)내에 음이온으로서 도입되는 층상 이중층 금속 수산화물을 무기 담체로 하고 비타민 및 그의 유도체를 층간 삽입하여 완성되는 비타민-무기 혼성체 및 그의 제조 방법(특허출원:10-2001-0046774)을, 자외선 함유하는 사람의 피부에 적용하기 적합한 자외선 차단제 조성물(특허출원:1019930002369)이 출원되어 있으나, 이들 특허에는 LDH-RA의 항암효과에 대한 작용은 기재되어 있지 않다.
간이 인체 내 모든 물질의 대사에 관여하는 특성을 감안하며 암치료제 개발은 매우 어려운 일이나, 정상세포에는 최소한의 독성을 나타내면 간암세포에는 최대한의 항암 효과을 나타낼 수 있는 LDH-RA와 같은 선택적인 항암효과 활성물질이 개발될 수 있다면 획기적인 간암 치료제로서 매우 유용하게 사용될 수 있을 것이다.
본 발명의 목적은 상기 종래기술의 단점을 극복하고 기존 레틱노익산의 부작용을 제거하고 안정성과 서방성이 우수하고 전달효율을 높힌 새로운 약물 전달 시스템으로서 금속 이중층 수산화물과 레티노익산 혼성체를 함유하는 간암 치료용 약학적 조성을 제공하는 것이다.
본 발명은 음이온 교환반응에 의해 금속 이중층 수산화물의 층간에 레티노익산을 삽입시킴으로써 LDH-RA혼성체를 만들고자 하는 것이다. 레티노익산은 매우 불안정할 뿐만 아니라 자체의 독성으로 인한 부작용이나 면역반응 등의 문제점을 수반하였으므로, 새로운 약물 전달체가 요구되어 왔다. 금속 이중층 수산화물은 산성 조건에서 녹고, 중성이나 염기성 영역에서는 매우 안정한 특성이 있다. 이러한 특성은 쉽게 레티노익산에 대한 안정성 및 서방성을 부여하여 약물전달체로서의 효과를 기대할수 있다. 또한, 본 발명에 의한 물질은 인체에 무해한 금속 수산화물로 구성되어 있을 뿐 아니라 발현 또한 인위적으로 적절히 조절할 수 있는 이점이 있다. 본 발명은 레티노익산과 무기 금속 수산화물의 혼성체를 암 치료용 조성으로 사용하도록 하는 최초의 시도로서도 큰 의의를 갖는다. 이에 따라, 본 발명은 공기등에 불안정한 레티노이드 유도체를 안정화시키며 서방성 방출 효과를 통해 좀더 장기간, 소량으로 지속적인 효과를 유지하고 암의 세포사를 유도할 수 있도록 레티노익산 혼성체를 제공하는 데 그 목적이 있다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 층상형 금속 수산화물(Layed metal hydroxide)과 레티노익산(Retinoic acid)의 하이브리드 혼성체(LMH-RA)를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 조성물은 레티노익산의 함암효과로 인하여 (Yang-Yen H. F. et al., New Biol. 3 : 1206-1219, 1991, Hong W.K. and Itri L.M., Biol. Chem. Med., 2nd ed. edited by Sporn et al., New York : Raven Press ; 597 - 630, 1994) 각종 암의 치료에 이용될 수 있으나, 특히 본 발명의 실시예에서는 간암 예방 및 치료에 효과가 높음을 입증하였다.
본 발명에 있어서, 상기 층상형 금속 수산화물은 금속 이중층 수산화물(Layed double hydroxide) 또는 금속 수산화 염(Hydroxy duoble salt)일 수 있으며, 이들은 모두 2가와 3가의 금속염을 용액으로 만들고 염기용액으로 적정하여 제조되는 것을 특징으로 하나, 금속 수산화염은 금속원소가 한가지로 조성을 이루는 반면 금속 이중층 수산화물은 두가지 이상의 금속 원소를 조성에 포함한다는 점만 다르다. 따라서, 본 발명의 하이브리드 혼성체는 LDH-RA 또는 HDS-RA일 수 있다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 혼성체는 금속 이중층 수산화물 또는 금속 수산화 염층간에 레티노익산이 이온교환법, 공침법 또는 흡착법에 의해 삽입되어 제조되는 것을 특징으로 한다. 공침법에서는 레티노익산이 금속 이중층 수산화물 또는 금속수산화 염의 합성시에 반응물로 첨가되어 금속 이중층 수산화물(금속수산화염) 층간에 삽입된 형태로 합성되고, 이온교환법에서는 금속 이중층 수산화물 혹은 금속수산화염이 합성된 후에 레티노익산이 첨가되어 층간에 존재하는 음 이온 종과 교환된다. 흡착법에서는 금속 이중층 수산화물 또는 금속수산화 염을 열처리하여 층간의 음이온을 제거한 후 레티노익산을 첨가하여 금속 이중층 수산화물 또는 금속수산화염의 층간에 삽입한다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 혼성체는 하기 화학식1을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 1]
[M2+ 1-x N3+ x (OH)2 ][RAn- ]x/n ·yH2 O
식 중, M2+ 은 Mg2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+ 로 이루어진 군 중에서 선택된 2가 금속 양이온이며, N3+ 는 Al3+ , Fe3+ , V3+ , Ti3+ 및 Ga3+ 로 이루어진 군 중에서 선택된 3가 양이온이며, x는 0.1 내지 0.5의 범위를 갖는 수이며, RA는 레티노익산 또는 그 유도체이며, n은 RA의 전하수이며, y는 0을 초과하는 양수이다.
본 발명에 있어서, 바람직하게는 상기 혼성체는 하기 화학식2를 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물을 제공한다:
[화학식 2]
[M3 OhM2 Td(OH)8] [RAn-]2/n · yH2O
식 중, M2+ 은 Mg2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+ 로 이루어진 군 중에서 선택된 2가 금속 양이온이며, RA는 레티노익산 또는 그 유도체이며, n은 RA의 전하수이며, y는 0 을 초과하는 양수이다.
또한, 상기 화학식 1에서 금속의 배합비와 관련한 x의 범위는 0.1 내지 0.5 정도가 바람직하며, 0.25 내지 0.33의 범위를 갖는 것이 특히 바람직하며, 이 범위를 벗어나는 경우, 금속 이중층 수산화물의 무기 전달체내에서 약물의 바람직한 캡슐화가 일어나지 않아, 즉, 층간 삽입이 이루어지지 않아 목적하는 혼성체의 생성이 용이하지 않게 된다.
또한, 본 발명의 금속 이중층 수산화물과 레티노익산(Retinoic acid)의 혼성체는 수화물 형태로 이용될 수 있으며, 그 수화물화 정도는 y로 나타낼수 있다. 여기서, y는 공기중 수분 함량 정도 등의 다양한 요인에 의해 변화될 수 있는 값으로 보편적으로 0을 초과하는 양수로서 나타내어 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 층상 이중층 금속 수산화물 및 수산화 이중 염을 무기 담체로 하여 레티노익산 또는 그의 유도체가 층간 삽입된 것을 특징으로 하는 레티노익산-무기 혼성체 및 그의 암치료 효과와 이를 이용한 약학적 조성물을 제공한다. 좀더 구체적으로 본 발명의 금속 이중층 수산화물과 레티노익산(Retinoic acid)의 혼성체는 층상 이중층 금속 수산화물 및 수산화 이중 염을 무기 담체로 하여 레티노익산 또는 그의 유도체를 층간 삽입하고 암세포에 세포사를 유도하여 암치료의 약학적 효능을 특징으로 한다.
본 발명의 LDH-RA 및 HDS-RA 혼성체는 층상구조를 갖는 무기화합물들의 층간에 retinoic acid를 포함되어지는 특징을 갖고 있다(실시예 1,2 참조). 격자층을 이루는 금속이온을 이질 동상 치환시켜 층전하를 발생시키거나 층상을 개질시켜 물리 화학적 흡착특성을 부여함으로써 다양한 기능성 guest물질들을 층간으로 도입시킬 수 있다는 장점이 있다. 층상구조를 갖는 무기화합물의 하나인 금속 이중층 수산화물 (layered double hydroxides; 이하 LDHs)은 음이온 점토(anionic clays)라고도 불리는데, 양전하를 띤 금속 수산화물층과 층간에 이 양전하를 상쇄시킬 음이온과 물로 구성되어 있다. 이 혼성체는 일반적으로 [M2+ 1-xN3+ x(OH)2] [An-]x/n· yH2O로 표현될 수 있으며, M2+은 2가 양이온 이며, N3+는 3가 양이온이 가능하며, 이들의 비율을 변화시킴으로써 층전하 밀도를 조절할 수 있는 특징이 있다. An-는 n 전하를 띠는 음이온이다. 이러한 다양한 음이온은 이온교환 반응과 공침반응으로 손쉽게 수산화물 층간으로 도입될 수 있다. 금속 이중층 수산화물과 그의 유도체들은 촉매반응에서의 기술적인 중요성, 분리 기술, 광학, 의학 공학 등의 분야에서, 층상 나노혼성체로서 상당한 관심을 받고 있다.
본 발명에서 '금속 이중층 수산화물과 레티노익산(Retinoic acid)의 혼성체'란 단순한 혼합물(mixture)이 아니라 구성 성분 사이의 화학적 결합력을 바탕으로 이루어진 혼성체(hybrid)를 말한다. 예를 들면, 양이온성 층상 금속 수산화물과 음이온성 화장품 원료용 활성 성분의 경우, 서로 반대 전하를 갖는 성분 사이의 정전기적 상호 작용이 주된 화학적 결합력으로 작용한다. 이온 교환법이나 공침법이 이에 기초한 제조 방법이라고 할 수 있다. 이온 교환 방법은 합성된 금속 이중층 수산화물의 층간에 존재하는 질산 (NO3-), 염화 (Cl-), 탄산 (CO3 2-) 등의 이온을 이온화된 약물 분자로 치환하는 방법이고, 공침 방법은 금속 혼합 용액의 적정시 해당 약물 분자를 이온화시켜 첨가함으로서 층의 형성과 동시에 약물 분자가 캡슐화 되도록 유도하는 방법이다. 반면, 흡착법에서는 층상 금속 수산화물 내에 먼저 도입된 유기물(예를 들면, 토코페롤숙시네이드)과 나중에 도입되는 활성 성분(예를 들면, 레티놀) 사이의 반데르발스(van der Waals) 힘이 주된 화학적 결합력이 된다. 하지만, 이상은 설명을 위한 구분일 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니며, 실제로는 구성 성분이나 제조 조건에 따라 부분적으로 정전기적 상호 작용과 반데르발스 힘이 공존할 수 있을 것이다.
본 발명의 약학적 조성물은 약제학적으로 통상으로 허용되는 부형제, 보조제, 희석제, 등장화제, 보존제, 활탁제, 용해보조제와 함께 약제학적으로 통상으로 허용되는 약학적 제제형태로 제제화할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 상기 활성성분인 LDH-RA 하이브리드 복합체를 기준으로 성인에게 1㎍/kg/일 내지 400mg/kg/일 투여할 수 있으며, 질병의 심각정도에 따라 증감할 수 있다.
상기 약학적 조성물은 정제, 발포성 정제, 캡슐제, 과립제, 산제, 서방성 정제, 서방성 캡슐제(단독 및 복합 단위 제제), 정맥 내 및 근육 내 주사용 앰풀제 형태의 주사제, 현탁액, 좌제, 또는 기타 적합한 약제학적 형태로 투여할 수 있다.
상기 약학적 조성물을 함유하는 약제학적 제제를 제조하기 위해서, 활성 화 합물은 생리학적으로 내성이 있는 부형제 및/또는 희석제 및/또는 보조제와 함께 바람직한 방식으로 지시된 양으로 제형화된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세히 설명한다. 하지만, 하기 실시예는 예시적인 것에 지나지 않으며, 결코 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다.
<실시예 1>
레티노익산-무기 혼성체의 경우는 직접 공침하는 방법으로 합성되었다.
(1)금속양이온 Zn(II)과 Al(III)를 적절한 비율(1 < Zn/Al < 4)로 혼합한 용액에 0.2 M NaOH와 레티노익산 유도체를 혼합한 용액을 적가하여 공침시킴으로써 침전을 얻고 이를 원심분리한 후 세척하여 합성하였다. 전 과정은 공기중의 CO2에 의한 오염을 막기 위해 질소분위기 하에서 수행하였다. 얻어진 화합물의 화학식은 다음과 같다.
MII 1-xAlIII x(OH)2(C20H27O2)x·m H2O
( MII : Mg, Zn, Ni, … 0.1〈 x〈 0.5 )
(2)금속양이온 Zn(II) 용액에 0.2 M NaOH와 레티놀 산 유도체를 혼합한 용액을 적가하여 공침시킴으로써 침전을 얻고 이를 원심분리한 후 세척하여 합성하였다. 전 과정은 공기중의 CO2에 의한 오염을 막기 위해 질소분위기 하에서 수행하였다. 얻어진 화합물의 화학식은 다음과 같다.
MII 5(OH)8(C20H27O2)2·m H2O
( MII : Zn, Ni, … )
이의 X-선 회절분석 결과는 도 2에, 자외선 분광 스펙트럼은 도 3에 나타내었다. 합성된 각 비타민-무기 복합하이브리드의 층간 거리가 각 비타민의 크기의 두 배에 상응하고 자외선 스펙트럼의 흡수피크가 각 레티노익 산의 자외선 흡수 피크와 일치하는 것으로 보아 비타민들이 금속수산화물 층간에 수직하게 이중층사이에서 안정화되어 있음을 알 수 있었다. 이를 바탕으로 격자층간에서 예상되는 비타민의 가능한 배열을 도 1에 도시하였다.
<실시예 2>
7개의 시험관에 LDH-RA 혼성체를 5 mg씩 칭량하여 40 mL의 증류수에 분산시키고 35 ℃에서 270 rpm으로 회전하는 항온시스템에서 반응시킨 후 각 시간에 따라 하나씩 원심분리 시켜 얻은 상등액에 대하여 자외선-가시광선 흡수 스펙트럼을 측정하였다. 그 결과를 도 2에 도시하였으며, 최대 흡수를 보이는 288 nm에서의 흡광도를 반응 시간에 따라 도시하였다.(제 3도) 레티노익산는 반응 초기 2시간 경과 후 60 %가 빠져 나오고, 지속적으로 소량의 레티노익산이 빠져 나옴을 알 수 있다. 이로써, 금속수산화물 격자층간에 안정화된 레티노익산이 지속적으로 대상부위에 공급되어 작용할 수 있음을 알 수 있다.
<실시예 3>
암 세포주인 CHX로부터 세포 형태적인 변화를 확인하기 위해 6-well plate 중에서 4개의 well 각각에 약 104의 세포수를 분주한 다음 이를 5% CO2 배양기 (incubator)에서 37℃하에 배양한다. 이 중 첫 번째 well의 세포는 대조군의 경우 어떤 약물도 처리하지 않고, 나머지 3개의 well 각각에는 LDH 40㎍/ml, RA 250㎍/ml, LDH-RA 1000㎍/ml농도로 처리하여 12시간후 각 well에 분주한 세포의 형태적인 변화를 확인했다. 도 4에서처럼 대조군은 세포증식이 왕성한 반면 LDH와 RA군은 다소 증식이 지연되나 세포사는 일어나지 않았지만 LDH-RA군은 강하게 세포증식이 억제되고 세포사가 크게 증가되는 경향을 보였다.(도 4) 또한 LDH-RA에 의해 세포사가 일어나는 시간대를 확인하기 위해 세포사를 확인하는 방법으로 Tunel Assay를 이용하였으며 그 결과 2, 3시간대에 가장 강한 형광으로 관찰된 것으로 보아 이 시간대에 LDH-RA가 세포사를 초래한다고 사료된다.(도 5)
<실시예 4>
본 발명의 방법에 따라 수득된 LDH-RA에 의한 세포내 변화를 확인하기 위해 암세포주인 CHX내에서 시간별로 LDH가 내포되는 양상을 추적하기 위해 세포주를 cover glass위에 분주하고 배양한 다음 미리 제조한 LDH-FITC(Fluoescenin Isothiocyanate)를 투여하여 내포(endocytosis)를 수행한다. 이때 0, 1, 2, 3시간마다 세포를 phosphated buffer saline(PBS)로 세척한 후 메탄올로 10분간 고정 한 후 slide glass위에 엎고서 차광상태에서 Bio-Rad사의 공초점형광현미경(Laser-scanning confocal microscopy)로 관찰하였다. 각 시간별 FITC의 형광을 관찰한 결과 0 hr에는 암세포 주위나 암세포 내에서 녹색형광이 관찰되지 않으나 1, 2hr부터 보이기 시작하여 3hr 경과시 가장 강하게 녹색형광이 관찰되었다.(도 6) 특히 핵막과 소포체 주변부에서 강하게 관찰됨을 알 수 있는데 이는 LDH-FITC가 핵막주변의 산성 기관인( < pH 6)인 소포체, 골지체, 리소소옴에 의해 LDH내부의 FITC가 빠져서 형광이 더 잘 관찰되는 것으로 보이며, 결국 FITC는 LDH에 의해 매개되어 세포소기관 주변까지 쉽게 도달 되고 이 주변부의 산성으로 인해 FITC의 방출이 유도되리라 사료된다 (도 7).
<실시예 5>
특히 세포 어느 소기관에서 LDH내 FITC의 배출에 관여하는지 조사하기 위해 FITC의 세포내 분포와 각 소기관의 분포를 살펴 본 결과 도 7에 나타난 바와 같이 서로 일치하여 LDH-FITC가 핵막주변에 최초로 세포질에 내포되어 도달하는 소기관은 골지체와 리소좀으로 산성인(pH < 6) 이들 소기관에서 FITC가 LDH로부터 빠져 나와서 결국 세포소기관과 핵막부위에 분포 되는 것이라 사료된다 (도 6).
여기서 골지체가 담체내 FITC가 배출되는 소기관인지 확인하기 위해 Alexa Fluor anti-golgi-97 antibody로 염색하여 측면에서 형광분포를 관찰하였는데, 골지체 주변부에 녹색 형광이 보이는 것으로 보아 LDH-FITC가 최초로 세포막을 내포하여 세포질내에 유입되면서 핵막 주변 및 부근 소기관인 골지체에서 도달하는 것으로 보인다. 이는 FITC가 골지체의 산성에 의해 LDH-FITC로부터 빠져나오기 때문이다. 리소좀의 경우도FITC가 배출되는 소기관인지 확인하기 위해 lysoTracer Red DND-99을 통해 확인한 바 리소좀 부위에서 적색형광의 분포가 관찰되었는데 이는 골지체와 마찬가지로 LDH-FITC가 내포되면서 리소좀의 산성(pH < 6)으로 인해 FITC가 LDH-FITC로부터 용출되어지는 것이라 여겨진다.(도 8)
<실시예 6>
본 발명의 방법에 따라 수득된 LDH-RA에 의한 항암 효율을 측정하기 위해 세포사의 유무를 나타내는 젖산 탈수소효소(lactic acid dehydrogenase)의 활성도를 측정하였다. 이를 위해 96-well plate에 CHX 세포주를 분배한 다음 아무런 처리를 하지 않은 정상군과 LDH 1,000㎍/ml을 처리한 LDH군, RA 250㎍/ml를 처리한 RA군, LDH-RA를 각각 25, 50 100㎍/ml농도로 처리한 LDH-RA군으로 나눈 다음 12시간 동안 배양하였다. 그리고 pyruvate substrate (NADH 1mg/ml)를 20 ㎕씩 가한 다음, 상온에서 2분간 혼합한 후 37℃에서 30분간 더 흔들었다. 발색시약(color reagent, Sigma 505-2)를 20㎕씩 가한 후 상온에서 20분간 혼합한 다음 0.4N NaOH를 100㎕씩 가하고 상온에서 15분간 더 혼합한 후 ELISA reader로 흡광도(A570/A630)를 측정하였다. 그 결과로 탈수소효소의 효소활성도는 정상군과 LDH군에서는 각각 6± 1.5%, 13± 2%였고 RA군은 42± 5%이고 LDH-RA군은 낮은 농도로부터각각의 효소 활성도가 41± 2%, 76± 6% 그리고 86± 5% 이었다. 특히 LDH-RA는 RA에 비해 같은 농도에서도 젖산 탈수소효소의 활성도가 2배 이상 높은데 이는 LDH에 의해 RA가 세포내로 유입이 증가하여 RA에 의한 세포사 경로 활성화가 높아져서 RA만을 투여한 경우보다 증가된 세포사를 유도한 것으로 사료되어진다.(도 9)
<실시예 7>
염색체 분절화를 유도하는지 파악하기 위해 CHX 세포주를 6-well plate에 1x104 cells/well를 분주한 다음 12 시간동안 배양하고 세포에 LDH군에는 1,000㎍/ml, RA군에는 250㎍/ml을, LDH-RA군에는 40 ㎍/ml농도로 1, 2일동안 처리한 후 세포를 모은 다음 세포 용해액인 lysis buffer (10 mM Tris-HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA, 0.2% Triton X-100) 200㎕를 첨가한 후 30 분간 얼음에 유지한 다음 proteinase K(100 ㎍/ml)를 첨가하고 50℃에서 5시간동안 항온조에 유지한다음 이를 phenol/chloroform의 동량을 넣고 잘 혼합후 상기와 같이 15,000 rpm에서 15분간 원심분리한다. 상등액을 취해 100% EtOH로 침전시켜 침전물을 건조시켜 이를 RNase(50 ㎍/ml)가 함유한 dH2O 35㎕를 첨가하여 녹인 후 이 용액을 1.5% agarose gel을 제조하여 전기영동을 실시한 다음 염색체 분절화의 유무를 조사하였는데 도 4처럼 정상군에서는 형태학적으로 현미경하에서 관찰시 증식이 왕성하여 세포사의 흔적이 전무한 상태이고 LDH군 역시 시간에 관계없이 DNA fragmentation이 일어나지 않거나 미미할 정도이지만 RA, LDH-RA군에서는 각각 강하게 세포사의 흔적으로 세포사가 유도되는 과정에서 유도되는 핵내효소인 endonuclease에 의해 절단하여 200 - 400 bp 길이 만큼 불연속적으로 ladder가 출현되는 것을 확인되는데 보통 1K bp이하에서만 나타 내는데 이런 세포사 현상은 LDH에 의해 분비된 RA에 의해 세포사가 초래되어 나타낸 것으로 사료된다(도 10).
<실시예 8>
CHX 세포주를 6-well plates의 4개의 well 각각에 1x 104 cells를 분주한 다음 12 시간동안 배양하고 4개의 well을 정상군, LDH군, RA군, 및 LDH-RA군으로 정하고 정상군을 무처리, LDH군에는 LHD 1,000㎍/ml, RA군에는 RA 250㎍/ml을, LDH-RA군에는 LDH-RA 40 ㎍/ml농도로 세포에 12시간동안 처리한 후 세포를 모은 다음 세포 용해액인 lysis buffer (50 mM Tris-HCl pH 7.5, 1% (v/v) Triton X-100, 150 mM NaCl, 10% (v/v) glycerol, 2 mM dithiothreitol, 10 mM MgCl2)로 처리하여 그 추출액 30μg을 10% polyacrylamide SDS gels (SDS-PAGE)에 용출한 후 Immobilon-P membrane (Amersham)에 옮겨서 단백질의 발현을 확인하기 위해 enhanced chemilumenescence (ECL)로 발색시켜 확인하였다. 이를 위해 antibody를 일차적으로 (Santa Cruz, 1:1,000 희석) 일차항체로서 모든 세포에 공통적으로 존재하는 표준단백질 β-actin, 세포사 관여 단백질인 Caspsase-3 그리고 세포생존 관여 단백질인 AKT 및 Bcl-2를 표지한다. 그런 다음 PBS로 세척 후 blotting 용액을 첨가하여 부반응을 제거하고 이차항체인 Horseradish Peroxidase-conjugate anti-goat IgG (HRP)를 표지한 다음 ECL blotting reagent로 3분간 배양하고 chemiluminescence은 30 sec에서 20분간 X-ray film에 노출시켜 발색정도를 확인하였다. β-actin은 모든 군에서 발현이 되지만 세포생존에 관여하는 AKT와 Bcl-2는 정상군과 LDH군에서만 발현이 되고 RA군과 LDH-RA군의 경우에는 세포사에 관여하는 단백질인 Caspase-3가 강하게 발현하는데 이는 RA가 RXR와 RAR의 이합체 형성을 유도하게 된다. 이 이합체가 핵내의 AP-1 전사 과정에서 DNA의 염기서열상 AP-1결합부위에 부착하여 하부염기서열에 국재한 IFN의 전사발현을 촉진하게되므로 결과적으로 RA가 세포사를 유도하는데 조력하리라 사료된다. 따라서 LDH-RA를 통해 RA의 증가된 세포내로 유입이 이뤄져서 소량으로도 효과적인 약리작용을 수행할 수 있으므로 향후 LDH-RA의 항암제 개발의 가능성을 보여주는 것이다. (도 11)
<실시예 9>
CHX 세포주 1x 107 cells/well 세포를 모아서 Athymic nu/nu micedml ent다 리 복부에 피하 주사한 다음 매주마다 암덩어리가 출현되는지를 관찰하고 최초 암 덩어리가 3주후부터 생성되고 그 크기가 5mm 되는 시점에 약물 투여하지 않은 대조군, LDH(1 mg/ml)를 투여한 LDH군, RA(0.5 mg/ml)를 투여한 RA군, LDH-RA(50 ㎍/ml)를 투여한 LDH-RA군 4개의 군을 총 8주 동안 2주 간격으로 추가 투여를 한 다음 암 성장을 육안으로 관찰하여 8주후에 접사사진기로 촬영하였다(도 12). 대조군은 8주 후에 암 덩어리가 30mm정도였으며 LDH군은 다소 크기가 감소하지만 암성장에 지장을 줄만큼의 영향은 주지 못하였으며 RA군은 암덩어리가 약 20%정도의 감소하였다. 이에 반해 LDH-RA군은 그 크기가 80%이상 감소함을 알수 있었다. 다음 단계로 쥐를 마취한 다음 암조직을 절제하고 formalin에 담가서 microtome을 통해 5μm두께로 절단한 다음 헤마토크시린-에오신(H/E) 염색법을 통해 현미경하에서(배율 50) 관찰한 결과 대조군은 암덩어리가 거의 전조직에서 세포증식이 일어나 더 이상 증식이 지연되면서 괴사가 일어나 전조직에 확대된 상태로 분포하지만 LDH군의 경우도 대조군과 유사하게 괴사성 암조직이 분포한다. 반면 RA군은 다소 암조직의 증식 억제로 괴사가 지연되고 암조직의 분포가 15%정도 감소를 보이고, LDH-RA군의 경우 암조직의 세포사로 암조직의 크기가 크게 감소하고 조직 절편상 85%이상이 조직괴사가 일어나 암의 증식 내지 성장이 억제됨을 알 수 있었다(도 13). 따라서 LDH-RA는 암세포의 세포사를 유도하는데 LDH가 세포내로 내포시키는 매개체역할을 하여 세포내 소기관인 골지체나 리소소옴에 전달하여 이곳의 산성 pH에서 RA방출을 유도하여 전사과정에서 LFN합성을 유도하므로 세포사를 진행시켜 항암효과를 나타낸다고 사료된다.
본 발명의 LDH-RA 혼성체는 실시예 1와 2로부터 약물의 안정성의 확보 및 서방적 성질을 입증하였으며 실시예 5와 6으로부터 RA보다 낮은 농도에서도 향상된 항암 효율을 보여주고 있다. 이는 LDH가 암세포에 효과적으로 RA를 전달시키며 높은 농도에 유발되는 RA의 독성를 완화시킬 수 있다. 따라서 LDH-RA는 RA의 부작용을 제거한 항암제 조성으로서 암의 치료에 탁월한 효과를 보이는 첫 번째 예이다.
Claims (6)
- 층상형 금속 수산화물(Layed metal hydroxide)과 레티노익산(Retinoic acid)의 하이브리드 혼성체(LMH-RA)를 유효성분으로 함유하는 암 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 층상형 금속 수산화물은 금속 이중층 수산화물(Layed double hydroxide) 또는 금속 수산화 염(Hydroxy duoble salt)인 것을 특징으로 하는 암치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 혼성체는 층상형 금속 수산화물 층간에 레티노익산이 이온교환법, 공침법 또는 흡착법에 의해 삽입되어 제조되는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물.
- 제 1항에 있어서, 상기 혼성체는 하기 화학식1을 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물:[M2+ 1-x N3+ x (OH)2 ][RAn- ]x/n ·yH2 O식 중, M2+ 은 Mg2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+ 로 이루어진 군 중에서 선택된 2가 금속 양이온이며, N3+ 는 Al3+ , Fe3+ , V3+ , Ti3+ 및 Ga3+ 로 이루어진 군 중에서 선택 된 3가 양이온이며, x는 0.1 내지 0.5의 범위를 갖는 수이며, RA는 레티노익산 또는 그 유도체이며, n은 RA의 전하수이며, y는 0을 초과하는 양수이다.
- 제 1항에 있어서, 상기 혼성체는 하기 화학식2를 갖는 것을 특징으로 하는 암 치료용 약학적 조성물:[M3 OhM2 Td(OH)8] [RAn-]2/n · yH2O식 중, M2+ 은 Mg2+, Ni2+, Cu2+ 및 Zn2+ 로 이루어진 군 중에서 선택된 2가 금속 양이온이며, RA는 레티노익산 또는 그 유도체이며, n은 RA의 전하수이며, y는 0을 초과하는 양수이다.
- 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 간암 치료용인 것을 특징으로 약학적 조성물.
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