KR20060090651A - 신규한 루비스코 프로모터 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 경미하게 성장한 브라씨카 묘목으로부터 수득가능하고 자엽에서 발현을 지시할 수 있는 일군의 신규한 시공간적 활성 루비스코 프로모터(서열번호 1, 2 또는 3) 및 특정 식물 기관 또는 식물 발육의 특정 단계에서 전이 유전자 발현에 관한 것이다. 당해 프로모터는, 목적하는 유전자 생성물을 암호화하는 유전자와 기능적으로 융합된 하나 이상의 당해 프로모터 서열을 포함하는 DNA 작제물 또는 카세트를 디자인하기 위해 유용하다. 형질전환된 동종 및 이종 식물로부터 및 형질전환된 식물의 후속 세대로부터 기원하는 종자를 수거하여, 특히 해당 조건에서 유전자 생성물의 효율적인 생산을 위해 사용한다.

브라씨카 묘목, 루비스코 프로모터, 유전자 전이 식물

Description

신규한 루비스코 프로모터 및 이의 용도{Novel Rubisco promoters and uses thereof}

본 발명은 유전자 전이 식물에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 특정 식물 발육 단계에서의 전이 유전자 발현에 관한 것이다. 심지어 보다 구체적으로, 본 발명은 브라씨카(Brassica)의 루비스코 프로모터, 및 유전자 생성물의 효율적인 생산, 특히 이의 해당 용도를 위해 동종 또는 이종 식물을 형질전환시키기 위한 하나 이상의 상기 프로모터를 포함하는 DNA 작제물 또는 발현 카세트에 관한 것이다.

리불로스-1,5-비스포스페이트와의 반응을 통한 대기 이산화탄소의 포스포글리세레이트로의 동화 및 전환은 엄격하게 루비스코 효소의 활성에 의존한다[문헌참조: Spreitzer, R.J., Arch. Biochem. Biophys. 414 (2), 141-9,2003 ; Spreitzer, R. J., et al., Annu. Rev. Plant Biol., 53, 449-75, 2002]. 구조적으로, 루비스코 효소는 8개의 소형 서브유니트(SSU) 및 8개의 대형 서브유니트(LSU)로 이루어져 있다. SSU 단백질은 식물 핵 게놈내에 위치하는 여러 유전자에 의해 암호화되어 있는 반면 LSU 유전자는 플라스티드 게놈에서 발견된다. 상이한 식물에서 루비스 코 SSU 유전자 수는 몇몇 배수체 게놈에서, 4개 이상의 복제물에서 14개 이상의 복제물까지 다양하다. 루비스코 SSU 유전자의 4개 이상의 복제물은 아라비도브시스 탈리아나(Arabidobsis thaliana)에 존재하는 것으로 공지되어 있고 배수체 게놈당 12개 또는 그 이상의 복제물이 밀에 존재하는 것으로 공지되어 있다[문헌참조: Sasanuma, T., Mol. Genet. Genomics. 265 (1), 161- 171,2001 ; Sasanuma, T. and Miyashita, N. T., Genes Genet. Syst., 73 (5), 297-309, 1998].

루비스코 효소는 식물에서 가장 보편적으로 존재하는 효소중 하나이다. 루비스코 효소를 암호화하는 유전자의 프로모터는 식물을 형질전환시키기 위한 DNA 작제물을 제조하는데 유용한 강한 프로모터로서 제안되었지만 이의 임의의 특정 성질이 구체화되지는 않았다[문헌참조: 미국 특허 제5,994,628호, 미국 특허원 제2002/0170096호 및 제2003/0097678호].

고등식물에서 RbcS 유전자의 구조, 발생 및 조절은 문헌[참조: Dean, C., et al (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., 40,415-439, 1989)]에 보고되었고 RbcS 유전자의 구조 및 기능을 기초로 딘(Dean)등은 핵 유전자가 일군의 다중유전자 그룹으로 분류될 수 있음을 제안하였다. 이들 일군의 유전자 구조는, 아라비도프시스(Arabidopsis), 토마토, 크리산테뭄(Chrysanthemum), 브라시카 나푸스(Brassica napus) 및 대두와 같은 기타 식물에서 집중적으로 연구되었다. 토마토에는 5개의 루비스코 SSU(rbcS) 유전자가 있고 3개의 염색체 좌에 위치하여 이중 1개는 염색체 3에 있고 기타 4개는 염색체 2에 있다[문헌참조: Sugita, M., et al., Mol. Gen. Genetic., 209 (2), 247-256, 1987]. 더욱이 유전자 3개는 10kb 영역 이내에서 반복 배열로 구성되어 있는 것으로 공지되어 있다. 이러한 상황은 일군의 아라비도프시스 탈리아나 rbcS 유전자에서와 매우 유사하다[문헌참조: Krebbers, E., et al., Plant Mol. Biol. 11,745-759, 988; Niwa, Y., et al., NA Res., 4 (5), 341-343,1997 ; Dedonder, A., et al., Plant Physiol., 101,3, 801-808, 1993; Galili, S., et al., Mol. Gen. Genet., 263 (4), 674-680, 2000].

문헌[참조: Outchkourov, N. S. et al. (Planta, 216 (6), 1003-1012,2002)]은 크리산테뭄(Chrysanthemum) 종(크리산테뭄 모리폴리움(Chrysantemum morifolium) 라마트)의 일군의 루비스코 소형 서브유니트 유전자의 풍부하게 전사된 rbcS1을 클로닝하였고 rbcS1-프로모터의 제어하에 GUS를 발현하는 UidA 유전자를 함유하는 유전자 카세트로 형질전환된 담배 식물이 잎에서 총 가용성 단백질중 10% 이하의 GUS를 제공함을 입증하였다. 심지어, 크리산테뭄 기원의 당해 루비스코 프로모터가 담배잎에서 고발현 수준의 단백질을 제공하지만 기타 발육 단계에서의 고발현은 입증되지 않았다.

미국 특허원 제2002/0170096호는 Ri- 또는 Ti-플라스미드를 사용한 형질전환 시스템에서 대두 SSU 유전자의 프로모터 영역의 용도를 기재하고 있다.

브라씨카 나푸스 암호화 서열에서, 3개의 rbcS 유전자(승인번호 제X75334호, 제X55937호 및 제X61097호)의 5'- 및 3'-조절 영역은 클로닝되고 서열분석되었다[문헌참조: Beck, I., et al., Bot. Acta, 108,327-333, 1995; Fiebig, C. and Link, G., Curr. Genet., 21 (2), 161-8, 1995; Fiebig, C., et al., Bot. Acta, 103, 258-265, 1990]. 서던 분석으로 수득된 데이타에 따르면, 브라씨카 나푸스는 3개 이하의 rbcS 유전자를 함유하는 것으로 사료된다[문헌참조: Nantel, A. M., et al., Plant Mol. Biol., 16 (6), 955-966, 1991]. 브라씨카 나푸스 rbcS 유전자의 mRNA로부터 수득한 cDNA 서열은 문헌[참조: Baszczynski, et al. (Nucleic Acids Res. 16 (10) 4732,1988)]에 보고되었다. 공개된 cDNA중 하나는 승인번호 제X07367호를 부여받았다. 문헌[참조: Beck, et al., Bot. Acta, 108, 327-333,1995]은 담배 기원의 메소필 원형질체에서 브라씨카 나푸스 기원의 RbcS 영역의 일시적 발현 활성을 보고하였다.

기타 브라씨카 종의 일군의 rbcS 유전자는 일군의 브라씨카 나푸스 rbcS 유전자 보다 훨씬 적게 연구되었다. 사실, 유전자 구조 및 활성에 대한 가용한 데이타를 사용해서는 상이한 식물 조직에서 또는 상이한 시공간적 단계동안에 또는 다양한 환경 조건하에 일군의 브라씨카 rbcS 유전자의 상이하게 발현하는 구성원을 동정할 수 없다.

잎은 풍부하게 생성되고 잎 크기는 크기 때문에, 식물에서 유전자 생성물의 발현 및 생산은 흔히, 잎에서 입증되고 유전자 생성물은 이들로부터 수거된다. 발육하는 싹에서 전이 유전자 발현 생성물을 생산할 수 있기 위해서는 예를 들어, 선택된 단계의 자엽 발육 동안에 프로모터가 강하게 발현시키도록 하는 것이 대단히 중요하다. 식물 종자 및 자엽은 특히 생산을 위해 이로운데 그 이유는 자엽 발육 초기에서 아미노산 및 오일을 포함하는 종자 기원의 영양원이 풍부하여 드 노보(de novo) 합성용 원료로서 유용하고 기질 용액으로부터 발현된 유전자 생성물의 회수가 수거된 잎에서보다 더 용이하고 효율적이기 때문이다.

유전자 전이 식물을 디자인하는 경우 중요한 측면은 목적하는 식물 조직에서 또는 목적하는 식물 발육 단계동안에 상당한 수준의 전이 유전자 발현을 수득하는 방법이다. 프로모터의 역할은 근본적으로 당해 측면에서 중요하고 따라서, 상이한 성질 및 발현 프로필을 갖는 신규 프로모터가 요구된다.

유전자 전이 식물에서 유전자 생성물을 생산하는 경우, 고발현 수준의 전이 유전자의 제공은 고려해야될 유일한 측면이 아니다. 특히, 해당 조건에서 외래 또는 이종 유전자 생성물을 생산하는 경우, 바람직하게 선택된 짧은 시간동안에 선택된 식물 조직에서 유전자 생성물을 생산할 수 있도록 해주는 선택된 특정 시공간적 방식으로 강한 발현의 제공이 특히 중요하다. 종자 발아 또는 자엽 발육 동안에 활성인 프로모터는 적합한 장치의 해당 조건에서 전이 유전자 생성물을 생산하기 위해 필요하다. 따라서 상이한 신규 적용을 위해 신규 프로모터가 요구된다.

본 발명의 목적은 시공간적으로 표적화된 고발현 수준의 목적하는 유전자 생성물 또는 단백질을 수득하는 것이다. 따라서, 상이한 발육 단계에서 발현하는 것 뿐만 아니라 특히, 특정 발육 단계 및/또는 식물의 특정 기관에서 고단백질 수준을 제공하는 신규 프로모터가 제공된다.

발명의 요약

본 발명은 경미하게 성장한 브라씨카 묘목으로 부터 수득가능한, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하는 신규한 시공간적으로 활성인 일군의 루비스코 프로모터, 및 식물 발육의 특정 식물 기관 또는 특정 단계에서 전이 유전자 발현에 관한 것이다. 프로모터는 DNA 작제물 또는 카세트를 디자인하는데 유용하고 목적하는 유전자 생성물을 암호화하는 유전자와 프레임내 기능적으로 융합된 하나 이상의 당해 프로모터 서열을 포함한다. 형질전환된 동종 또는 이종 0 세대 식물 기원 및 형질전환된 식물의 후속 세대 기원의 종자를 수거하고 특히 해당 조건에서 유전자 생성물의 효율적인 생산을 위해 사용하였다.

당해 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 일군의 루비스코 프로모터로부터 선택된 하나 이상의 루비스코 프로모터를 포함하는 발현 카세트를 디자인하는데 사용하고 당해 프로모터 서열은 목적하는 단백질 또는 유전자 생성물을 암호화하는 이종 또는 동종 핵산 서열에 작동적으로 연결되어 있다.

핵산 서열은 천연적으로 분리되어 존재하는 유전자 또는 천연적으로 분리되어 존재하는 유전자로부터 부분적으로 디자인된 합성 또는 반합성 핵산 서열을 포함하는 리포터 유전자로 예시된다. 리포터 유전자는 예를 들어, GUS, 사람 혈청 알부민(HSA), 항체 및 의학적 활성 단백질을 암호화한다.

DNA 작제물 또는 카세트는 브라씨카 및 카멜리나(Camelina) 종에 의해 예시되는 숙주 식물을 형질전환시키는데 사용된다. 이러한 형질전환된 소위 0 세대 식물은 하나 이상의 루비스코 프로모터 함유 DNA 카세트를 포함한다. 당해 0세대 형질전환된 식물의 종자는 추가 세대의 식물을 제공하기 위해 사용될 수 있지만 천연적으로 종자는 직접적으로 종자 발아 및 자엽 발육 동안에 당해 종자의 묘목으로부터 기원하는 목적하는 유전자 생성물을 생산하는데 사용될 수 있다.

따라서, 본 발명은 당해 일군의 루비스코 프로모터 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 DNA 작제물 또는 카세트를 함유하는, 종자 또는 묘목 뿐만 아니라 형질전환된 식물 또는 이의 후속 세대의 형질전환된 식물에 관한 것이다.

본 발명은 또한 상기 논의된 일군의 루비스코 프로모터의 성질과 상당히 유사한 성질을 갖는 추가의 프로모터를 제조하는 방법에 관한 것이다. 당해 방법은 경미하게 성장한 묘목에서의 발현을 평가하는 단계, 가장 고발현된 유전자를 동정하는 단계 및 발육하는 자엽에서의 유전자 발현을 지시하는 능력을 갖는 유전자 프로모터를 당해 유전자로부터 선별하는 단계를 포함한다.

도 1은 브라씨카 라파(Brassica rapa)의 발아하는 종자에서 상이한 3'UTR형 rbcS-유전자들의 상대적 양을 도시한다.

도 2A, 2B, 2C, 3 및 4는 글로벌 DNA 정렬 프로그램을 사용한 DNA 서열 정렬을 입증한다. 표준 분자: rbcS-300nt. 영역 1 내지 300. 서열 5. 스코링 매트릭스: 선형[미스매치 2, OpenGAp 4m ExtGap 1]. 서열 고찰: 유사성 포맷, 동일한 염기 위치에서 고도의 일치 색상 면적.

도 2A는 클로닝된 브라씨카 라파 rbcS 프로모터(300bp)의 정렬을 도시한다.

도 2B는 클로닝된 브라씨카 라파 rbcS-4A(서열번호 1) 및 rbcS-4B(서열번호 2) 프로모터(300bp)의 정렬을 도시하고 여기서 수평 박스는 상동성 영역이다.

도 2C는 브라씨카 라파 rbcS-2(서열번호 3) 및 비 나푸스 rbcS(X61097)의 프로모터(상부) 및 3'UTR(하부)의 정렬을 도시한다.

도 3은 Rbcs-4A 프로모터(서열번호 1)(상부 라인)과 승인번호 제X61097호로 공개된 브라씨카 나푸스 루비스코 프로모터(하부 라인)의 1kb 서열에 대한 정렬을 도시한다. 당해 서열은 52%의 불일치를 나타낸다.

도 4는 RbcS-4A 프로모터(서열번호 1)(상부 라인)과 승인번호 제AY163904호로 공개된 크리산테뭄 rbcS1 프로모터의 1kb 서열에 대한 정렬을 도시한다. 당해 서열은 57%의 불일치를 나타낸다.

도 5는 상이한 루비스코 3'UTR 유형의 특정 부위에 특이적인 정배향 및 역배향 프라이머의 서열을 도시한다. 당해 프라이머는 상이한 3'UTR 종들이 실시간 PCR에 의해 분리될 수 있음을 보여준다. 정배향 프라이머는 2개 부분(밀줄친 부분 및 이탤릭체 부분)으로 나누어진다. 각각의 프라이머의 좌측 부분은 관련 루비스코 암호화 영역의 마지막 몇 개의 뉴클레오타이드에 상응하고 우측 부분은 특정 3'UTR 서열에 상응한다. 모든 역배향 프라이머는 특정 3' UTR 영역에 어닐링한다. 모든 앰플리콘 크기는 80 내지 100 nt 범위에서 다양하다.

도 6은 rbcS-2(서열번호 1) 및 rbcS-4A(서열번호 3) 프로모터에서 발견되는 보존성 조절 요소들을 도시한 것이다.

도 7은 실시간 PCR을 사용함에 의해 rbcS-2-GUS 및 rbcS4A-GUS(루비스코 프로모터 서열(각각, 서열번호 1 및 서열번호 3))로 형질전환된 유전자 전이 브라씨카 식물에 존재하는, rbcS-2, rbcS-4 및 UidA(GUS) 기원의 mRNA의 양을 입증하는 표이다.

도 8은 유전자 전이 담배 식물의 RNA 샘플에서 HSA mRNA 분자의 양(실시간 PCR 데이타)을 도시한다.

도 9는 다양한 시간동안 발아된 브라씨카 나푸스 종자에서 상이한 루비스코 프로모터의 발현 수준을 도시한다. 데이타는 샘플당 분자 수(총 100ng의 RNA)를 나타낸다.

도 10은 rbcS-4B UidA 유전자 함유 작제물을 갖는 유전자 전이 담배 식물에서 GUS의 발현을 도시한다.

도 11은 일정한 조도에서 24℃ 또는 30℃에서 브라씨카 종자의 발아 동안에 루비스코 프로모터 rbcS-4A하에 GUS의 발현을 도시한다.

도 12는 유전자 전이 카멜리나(Camelina) 식물에서 HSA mRNA 함량(노던 분석)을 도시한다.

도 13은 다양한 시간에서 유전자 전이 브라씨카 나푸스 식물의 발아 종자에서 HSA mRNA 함량을 도시한다.

도 14는 % TSP(총 가용성 단백질)로서 계산되는 유전자 전이 브라씨카, 카멜리나 및 담배 식물에서 HSA 단백질의 양을 도시한다. 최소값과 최대값의 평균을 제공한다.

도 15는 리포터 유전자로서 GUS 및 전장의 rbcS-2(서열번호 2) 프로모터(1.6kb) 또는 절단된 프로모터를 포함하는 작제물로 형질전환된 유전자 전이 담배 식물에서 GUS 활성을 도시한다. 35S 프로모터는 양성 대조군으로서 사용 한다.

도 16은 노던 블롯 분석에 의해 밝혀진 바와 같이 발아하는 브라씨카 묘목에서 루비스코 프로모터의 발현을 도시한다.

도 16A는 12 내지 168시간동안 공수 탱크에서 발육시킨 후 브라씨카 묘목에서 루비스코 SSU mRNA의 합성을 보여주는 노던 블롯이다.

도 16B는 대조군과 동일한 필터상에 로딩되는 경우 시험관내 전사에 의해 생성되는 비표지된 루비스코 RNA를 나타낸다. 대조군 RNA의 양은 pg으로 나타낸다.

도 17은 RbcS-4A(서열번호 1) 프로모터(상부 라인)의 서열과 승인번호 제BH 484651호로서 브라씨카 게놈 프로젝트에 공개된 브라씨카 서열의 정렬을 도시한다.

도 18은 TNFR-작제물을 함유하는 유전자 전이 카멜리나 및 담배 식물에 대한 정량적 노던 데이타를 도시한다. 본 도면에서, Rbcs-2-TNFR-Fc-56UTR은 IgG1 중쇄 불변 영역(C_H2 + C_H3 도메인) 부분에 연결된 rbcs-2 프로모터 및 TNFR 부분(489nt)을 함유하고 천연 rbcs-4 유전자(0.5kb 길이) 기원의 종결인자는 이전의 작제물과 동일하지만 또한 Fc 영역 뒤에(종료 코돈 바로 전에) KDEL 시그날(12nt)이 있다. 긴 Rbcs-2-TNFR-Fc-56UTR은 IgG1 중쇄 불변 영역(C_H2+C_H3 도메인) 부분에 연결된 rbcs-4A 프로모터 및 TNFR 부분(489nt), 및 천연 rbcs-4 유전자(2kb 길이) 기원의 종결인자를 함유한다. 긴 Rbcs-4-TNFR-FcKDEL-56UTR은 이전의 작제물과 동일하지만 또한 Fc 영역 뒤에(종료 코돈 바로 전에) KDEL 시그날(12nt)이 있다.

도 19는 인공 HSA 유전자(서열번호 15)를 도시한다. 분리된 천연 사람 유전 자(cDNA, 즉, 엑손만 있고 인트론 없음)의 서열은 코돈 최적화되어 있다.

도 20은 인공 또는 반합성 경쇄(항-헤베인 1C2) 암호화 영역(서열번호 16)을 도시한다. 당해 서열은 3개 부분으로 이루어진다:

마우스 시그날 펩타이드(22개의 아미노산)를 암호화하는 66nt 길이 서열(당해 서열은 승인 번호 제AF078548호의 부분 서열과 100%의 유사성을 갖는다);

파아지 디스플레이 라이브러리(VTT로부터 수득됨)로부터 분리된 324nt 길이 경쇄 항 헤베인 1C2 항원 가변 영역(승인 번호 제AB095291호(진뱅크)는 도 20에서의 가변 영역의 16 내지 305 nt의 영역(서열번호 16)과 100%의 유사성을 갖는다);

승인 번호 제BC063599호의 서열과 100%의 유사성을 갖는 카파 경쇄 불변 영역의 324nt 길이.

도 21은 인공 rbcS-4 종결인자 서열(서열번호 17)을 도시한다. 본래에 당해 서열은 게놈 워킹 기술에 의해 브라씨카 라파의 게놈으로부터 클로닝되었다. 유사한 서열은 브라씨카 게놈 프로젝트에서 공개되었다. 승인 번호 제BH691838호는 88%의 부분적인 유사성을 갖는다.

도 22는 인공 중쇄(항-헤베인 1C2) 암호화 영역(서열번호 18)을 도시한다. 당해 서열은 3개의 부분으로 이루어진다:

마우스 시그날 펩타이드(17개 아미노산)를 암호화하는 57nt 길이 서열(승인번호 제X67210호의 서열 일부와 100%의 유사성을 갖는다);

파아지 디스플레이 기술에 의해 제조된 387nt 길이 중쇄 항 헤베인 1C2 항원 가변 영역(승인번호 제AB067222호(진뱅크)는 도 22에 보여지는 가변 영역의 1 내지 295nt 영역과 95%의 유사성을 갖는다);

990nt의 IgG1 중쇄 불변 영역(승인번호 제BC024289호의 서열은 99%의 유사성을 갖는다)(대립형질 차이 때문에 근소한 차이가 있을 수 있다).

도 23은 인공 시그날 서열(69nt) 및 TNFR 부분(489nt)을 도시한다. 승인번호 제NM_001066호의 서열은 또한 미국 특허 제5,605,690호에 기재된 서열과 100%의 유사성을 갖는다. 유사한 서열은 기타 TNFR 서열로부터 수득할 수 있다.

도 24는 아라비도프시시스 VSP1(영양 저장 단백질-1유전자)-3' UTR의 인공 부위 및 rbcS-4-종결인자 부분을 도시한다(진뱅크 승인 번호 제NM_122387호). 본원에서 RbcS-4 종결인자는 절단 부위 뒤에서 시작하여 350nt 까지의 도 21에 나타낸 전장 rbcS-4-종결인자이다.

당해 도면에 기재된 리포터 유전자는 본 발명의 일부가 아님을 주지해야 한다. 당해 리포터 유전자는 본 발명의 루비스코 프로모터의 실행 가능성을 예시하기 위해 사용될 뿐이다.

본 발명에 사용되는 용어는 이들이 일반적으로 재조합 DNA 기술 및 식물에서 전이 유전자 발현 분야에서 사용되는 의미를 갖는다. 그러나, 본 발명에서 몇몇 용어는 보다 광범위하거나 어느정도 상이한 방식으로 사용된다. 따라서, 몇몇 용어는 하기에서 보다 상세하게 정의된다.

정의

용어 "리포터 유전자"는 GUS 효소로서, 또는 분광측정 방법, 면역분석법등과 같은 공지된 측정 방법을 적용함에 의해 용이하게 입증될 수 있는 동종 또는 이종 단백질 또는 기타 대사 유전자 생성물을 암호화하는 유전자를 의미한다. 리포터 유전자는 임의의 선택되거나 목적하는 단백질 또는 유전자 생성물을 암호화할 수 있는 "구조 유전자"이다. 리포터 유전자의 예는 GUS 단백질을 암호화하는 uidA 유전자 및 사람 혈청 알부민(HSA)을 암호화하는 유전자(서열번호 15)이다. 당해 유전자는 특히 산업적으로 유용한 DNA 작제물 또는 카세트의 연구 및 개발에서 모델 유전자로서 유용한데 이는 당해 유전자가 용이하게 검출가능한 마커 단백질을 암호화하고 있기 때문이다.

용어 "동종 프로모터"는 숙주 식물 종에 내인성인 프로모터를 의미한다. 다른 말로, 숙주 식물이 기원하는 동일한 식물 종에 고유한 것이거나 존재하는 것이다. 다른 말로, 숙주 식물 종에 고유한 것이다.

용어 "이종 프로모터"는 당해 프로모터가 숙주 식물 종에 외인성임을 의미한다. 당해 프로모터는 형질전환되지 않은 식물 종에는 존재하지 않는다. 다른 말로, 숙주 식물에 고유한 것이 아니고 숙주 식물은 당해 프로모터를 함유하는 작제물로 형질전환되어야만 한다.

용어 "동종 시스템"은 숙주 식물과 동일한 종으로부터 기원하는 프로모터를 포함하는 DNA 작제물 또는 카세트를 의미한다. 다른 말로, 당해 시스템은 숙주 식물에 고유한 내인성 프로모터를 포함하는 DNA 작제물 또는 카세트이다. 동종 시스템에서, 동종 프로모터는 바람직하게 이종성일 수 있는 리포터 유전자와 프레임내로 기능적으로 융합된다.

용어 "이종 시스템"은 숙주 식물 종에 외인성인 프로모터를 포함하는 DNA 작제물 또는 카세트를 의미한다. 이의 고유 조건에서 숙주 식물은 당해 프로모터를 포함하지 않는다. 다른 말로, 프로모터는 숙주 식물에 고유한 것이 아니고 숙주 식물은 다른 유기체로부터 기원하는 외래 프로모터로 형질전환되어야만 한다. 이종 시스템에서, 이종 프로모터는 바람직하게 이종 또는 동종일 수 있는 리포터 유전자와 프레임내로 기능적으로 융합된다.

용어 "동종 유전자, 단백질 또는 유전자 생성물"은 유전자가 숙주 식물 종에 내인성임을 의미한다. 다른 말로, 당해 유전자는 숙주 식물 종에 고유한 것이고 비형질전환된 숙주 식물 종은 또한 당해 단백질 또는 유전자 생성물을 생산하다.

용어 "이종 유전자, 단백질 또는 유전자 생성물"은 당해 유전자가 숙주 식물 종에 외인성임을 의미한다. 비형질전환된 식물은 당해 단백질을 생산하지 않는다. 다른 말로, 이것은 숙주 식물 종에 고유한 것이 아니고 숙주 식물은 이종 단백질 또는 유전자 생성물을 생산할 수 있기 전에 다른 유기체로부터 기원하는 외래 유전자로 형질전환되어야만 한다.

용어 "0 세대"는 형질전환된 식물을 의미한다. 0 세대 식물 기원의 종자는 자엽 발육동안에 발아 종자 또는 묘목으로부터 목적하는 유전자 생성물을 생산하기 위해 직접적으로 사용될 수 있지만 이들은 또한 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 이의 조합체를 포함하는 하나 이상의 일군의 루비스코 프로모터 구성원을 갖는 하나 이상의 DNA 작제물 또는 카세트를 포함하는, 식물의 추가 세대 또는 후속 세대를 제공하기 위해 사용될 수 있다. 이들이 하나 이상의 DNA 작제물을 함유하도록 검사받고 선택된 당해 식물의 종자는 바람직하게 생산 목적을 위해 사용된다.

발명에 대한 총론

본 발명은 발아 묘목 및 싹에서 전이 유전자 발현에 관한 것이다. 본 발명에 따라, 강한 단백질 발현이 목적하는 유전자 생성물을 암호화하는 유전자를 브라씨카, 특히 브라씨카 라파로부터 클로닝된 신규한 루비스코 프로모터와 융합시킴에 의해 성취된다. 신규한 프로모터는 경미하게 성장한 브라씨카의 자엽에서 풍부하게 발현하는 rbcS 유전자로부터 선택된 rbcS 유전자 기원의 루비스코 프로모터 그룹으로부터 선택된다.

신규한 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하는 일군의 루비스코 프로모터를 포함한다. 프로모터 서열은 분리된 고유 루비스코 프로모터로부터 기원하는 것이지만 유사한 서열이 합성 및 반합성 방법을 포함하는 다른 수단에 의해 제조될 수 있다.

루비스코 프로모터는 목적하는 유전자 생성물을 암호화하는 리포터 유전자와 프레임내로 기능적으로 융합되는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3을 포함하는 재조합 DNA 작제물 또는 발현 카세트를 디자인하기 위해 유용하다.

본 발명의 프로모터는 브라씨카 종의 경미하게 성장한 묘목의 발육하는 자엽에서 고도로 발현되는 유전자를 선별하고 동정함에 의해 수득된다. 당해 고도로 발현되는 유전자의 3'-UTR은 분리되고 특성 분석된다. 당해 방법에 의거 강한 루비스코 프로모터는 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 서열을 갖고 발육하는 자엽에서 시공간적 방식으로 유전자 발현을 구동시키는 능력을 갖고 있음을 특징으로 한다.

본 발명의 일군의 루비스코 프로모터의 당해 3개의 프로모터는 하나 이상의, 임의로 2개 이상의 루비스코 프로모터가 이종 단백질 또는 유전자 생성물을 암호화하는 유전자 또는 핵산 서열에 기능적으로 연결되어 포함되어 있는 DNA 작제물 또는 발현 카세트를 디자인하기 위해 사용된다. 일반적으로, 이종 유전자 생성물이 생산되지만 당해 프로모터는 또한 동종 단백질 또는 유전자 생성물을 암호화하는 유전자와 기능적으로 조합될 수 있다. 이에 의해, 숙주 식물은 여러 복제물의 고유 유전자로 형질전환될 수 있어 산업적으로 중요하고 목적하는 고유 단백질의 수율이 증가될 수 있다. 몇몇 경우에, 유전자 발현을 추가로 개선시키기 위해, 당해 프로모터 하나 이상을 임의로 조합하여 반복적인 양상으로 DNA 작제물 또는 발현 카세트로 삽입시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 리포터 유전자는 용이하게 검출 가능한 마커 단백질인 GUS를 암호화하는 uidA 유전자이다. 또 다른 예시된 "리포터 유전자"는 사람 혈청 알부민(HSA)을 암호화하는 유전자이다. 유용한 리포터 유전자는 의학적 활성 단백질의 선택된 일부와 조합된 면역글로불린 Ig(G) 중쇄의 선택된 일부로부터 합성적으로 디자인될 수 있다. ER 체류 시그날 KDEL의 존재 또는 부재하에 면역글로불린 (Ig)G 중쇄 일부와 종양 괴사 인자 수용체(TNFR)의 세포외 도메인으로 이루어진 당해 합성 유전자 및 헤베인 1C2 항원에 대해 지시된 사람 항체의 중쇄 및/또는 경쇄를 포함하는 항체 리포터 유전자는 본 발명의 실행 가능성을 예시하기 위해 사용된다. 상기 열거된 "리포터 유전자"는 단지 예일 뿐이고 본 발명의 프로모터를 포함하는 DNA 작제물 또는 카세트가 목적하는 생성물을 암호화하는 임의의 기타 리포터 유전자와 프레임내로 기능적으로 융합될 수 있다는 것은 당업자에게 자명하다.

본 발명에 따른 동종 시스템을 나타내는 하나 이상의 내인성 프로모터 또는 본 발명에 따른 이종 시스템을 나타내는 하나 이상의 외인성 프로모터를 포함하는 재조합 작제물 또는 발현 카세트는 각각 동종 및 이종 식물을 형질전환시키기 위해 유용하다. 식물 종의 예는 브라씨카 종, 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 및 카멜리나 사티바(Camelina sativa)이다. 식물 형질전환 과정은 당업자에게 익숙한 것이고 따라서 임의의 기타 식물 종은 본 발명에 기재된 작제물로 또한 형질전환될 수 있다. 적용가능한 형질전환 시스템은 예를 들어, 통상적인 아그로박테리움 매개 형질전환 시스템으로 제한되지 않는다. 특히, WO 02/38779 및 US 10/416,091에 기재된 신규한 형질전환 시스템에 따른 카멜리나 식물의 형질전환이 사용될 수 있다.

숙주 식물은 상기된 하나 이상의 DNA 작제물 또는 발현 카세트로 형질전환된다. 0 세대인 형질전환된 숙주 식물 기원의 종자를 수거하고 유전자 전이 종자를 제공하는 후속 식물 세대를 제조하기 위해 사용되고 여기서, 당해 유전자 전이 종자는 당해 종자가 해당 조건하에, 예를 들어, 완충 한천 플레이트 또는 통기 용기, 예를 들어, 적절한 발효 장치상에서 발아하도록 하여 목적하는 단백질 또는 유전자 생성물을 생산하는데 사용된다. 형질전환된 종자는 우수한 영양 공급원을 제공하고 형질전환된 종자는, 적절한 완충액일 수 있고 성장 호르몬 및 기타 유익한 성장 및 발아 촉진 성분들을 함유할 수 있는 주로 물을 포함하는 용액내에서 묘목으로 발아할 수 있다. 당해 배양에 의해 멸균 조건하에서 생산하고 유전자 생성물을 용이하게 회수할 수 있다.

본 발명에서, 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 루비스코 프로모터를 제조하는 방법이 또한 제공된다. 당해 방법을 사용하여 본 발명의 루비스코 프로모터로서 유용한 유사한 프로모터를 제공할 수 있다. 따라서, 당해 방법을 사용하여 해당 조건하에 형질전환된 종자로부터 목적하는 유전자 생성물을 생산하기 위한 새로운 유용한 프로모터를 제조할 수 있다. 당해 방법에서, 경미하게 성장한 묘목의 발현을 평가하고 자엽의 발육동안에 고도로 발현되는 유전자를 동정하고 이의 프로모터의 특성을 분석한다. 발육동안에 자엽에서의 발현을 지시할 수 있는 프로모터는 DNA 작제물 및 발현 카세트를 디자인하기 위해 선택된다.

하기의 실시예는 설명을 목적으로 기재된 것이고 결코 본 발명의 다양한 양태를 제한하지 않는다.

실시예 1. 브라씨카 라파(캄페스트리스(campestris))의 발아 종자의 자엽에서 발현되는 루비스코 mRNA 유형

브라씨카 라파(캄페스트리스) 발아 종자의 자엽에서 발현될 가장 풍부한 유형의 루비스코 mRNA를 동정하기 위해 cDNA 라이브러리를 작제하였다.

총 RNA를 4일된 브라씨카 묘목으로부터 분리하고 mRNA 분획물을 올리고(d)T 셀룰로스를 사용하여 총 RNA 제조물로부터 분리하였다. 제1 쇄 cDNA를 올리고(d) T 및 M-MLV(점 돌연변이) 역전사효소를 사용하여 합성하였다. 다음 PCR 단계는 루비스코 SSU 암호화 영역의 3번째 엑손에 특이적인 정배향 프라이머 e3a 5'-CAUCAUCAUCAUCAACCGTCAAGTCCAGTGCATCAGTTTCAT-3'(서열번호 4) 및 CloneAmp 과정(Life Technology)에 따라 특이적으로 디자인된 올리고(d)T 유도체인 5'-CUACUACUACUATTTTTTTTTTTTTTT-3' (서열번호 5) 역배향 프라이머 atu를 사용하여 수행하였다. 당해 2개의 프라이머는 효소 UDG(우라실 DNA 글리코실라제)에 의해 파괴되는 이들의 5'-말단의 여러 dUMP 잔기상에 포함된다. PCR 단계는 2사이클로 수행하고 이어서 PCR 생성물을 UDG로 분해하고 RT-PCR 생성물의 돌출된 3' 말단에 상응하는 특정 돌출된 3' 말단을 함유한 선형화된 pAMP1 벡터(Life Technologies)로 직접 삽입한다. 당해 벡터를 함유한 삽입체를 사용하여 컴피턴트 이. 콜리 균주 XL-1를 형질전환시켰다. 100개의 플라크를 선별하고 분석하였다. 플라스미드 DNA 로부터의 삽입체는 PCR로 증폭시키고 수득한 PCR 생성물의 서열을 분석하였다. 각각의 유형의 삽입체를 함유하는 별도의 콜로니의 상대적인 수를 서열 분석의 도움으로 계산하였다.

도 1을 참조로, 클로닝된 3'UTR의 서열 분석은 상이한 루비스코 mRNA 종간에 현저히 명백한 차이를 나타낸다. '56'으로 호칭되는 서열은 클로닝된 모든 루비스코 mRNA의 56%를 차지하였다. '29'로 호칭되는 기타 서열은 모든 루비스코 mRNA의 29%를 차지하였다. 클론의 나머지 15%는 기타 유형의 루비스코 mRNA에 상응하였다.

cDNA 라이브러리로부터 취득한 29형 및 56형 서열은 공개된 서열과 비교하였다. 서열 정렬은 당해 루비스코 mRNA가 신규한 루비스코 프로모터로부터 발현된 것임을 지적하였다. 29형 서열은 rbcS-2로 호칭되고 56형 서열은 rbcS-4로 호칭된다.

실시예 2. 브라씨카 라파로부터 수득한 루비스코 프로모터의 클로닝

'56' 및 '29'형 서열을 기초로, 프로모터 클로닝의 후속 단계에 사용되는 역배향 프라이머를 디자인하였다.

rbcs-2 프로모터의 클로닝

EST-라이브러리를 먼저 작제하였다. 가장 알반적으로 발견되는 유형의 UTR은 UTR 2였다. 당해 UTR-2를 사용하여 게놈 워킹 단계용 역배향 프라이머를 디자인하였다. 브라씨카 라파의 게놈 DNA를 EcoRV, DraI, HincII, PvuII, SmaI 및 SspI로 분해하고 어댑터

(5'-GTAATACGACTCACTATAGGGCACGCGTGGTCGACGGCCCGGGCTGGT)(서열번호 6) 및 5'-p-ACCAGCCC-NH2 3'(서열번호 7)에 연결하여 6개의 DNA 라이브러리를 수득하였다.

이어서 어댑터 프라이머 AP1 5'-GTAATACGACTCACTATAGGGC-3' (서열번호 8) 및 UTR2-특이적인 LI 프라이머 5'-GGCCACACTTGACAATCCGATATAACATGCCTCA-3' (서열번호 9)을 사용하여 PCR 증폭(1번째 및 2번째)을 수행하였다.

2번째 PCR은 AP2 프라이머 5'-ACTATAGGGCACGCGTGGT-3' (서열번호 10) 및 2번째 UTR2-특이적인 L2 프라이머 5'-CAAATGGAAATGAAATGAGGTAG-3' (서열번호 11)를 사용하여 수행하였다.

가장 긴 900pb 생성물은 DraI DNA 라이브러리를 사용하여 수득하였다. 당해 단편을 pGEM3Zf(+) 벡터에 클로닝하고 서열분석하였다. 당해 서열을 진뱅크 데이타베이스의 서열과 비교하였다. 발견된 가장 동종성인 서열은 비. 나푸스 rbcS(승인 번호 제X61097호)이었다.

취득한 클론중 하나(Rud3)의 5' 말단 근처에 비. 나푸스 rbcS에는 결여된 22 nt의 긴 스트레치(비. 나푸스 rbcS의 1037nt로부터 개시됨)가 존재한다. 추정 전사 개시 부위 하부에 위치하는 2개의 역배향 프라이머 RbNco 및 RbSiB(X61097과의 상동성을 기초로 함) 및 X61097 상동성을 기초로하는 2개의 정배향 프라이머 BNRb1 및 BNRb3을 디자인하였다. 전장 rbcS-2-유전자를 정배향 프라이머로서 BNRb1을 사용하고 역배향 프라이머로서 UTR2-L2를 사용하여 증폭시켰다. 이어서, 길이가 상이한 2개의 프로모터를 정배향 프라이머로서 BNRb3 및 역배향 프라이머로서 RbSiB의 조합체(시그날 펩타이드 존재) 또는 정배향 프라이머로서 BNRb3 및 역배향 프라이머로서 RbNco의 조합체(시그날 펩타이드 부재)를 사용하여 2번째 PCR로 증폭시켰다.

rbcS-4 프로모터의 클로닝

프로모터 클로닝을 여러 단계로 수행하였다. 3개의 공개된 루비스코 유전자의 제1 엑손의 개시부와 동일한 서열과 일치하는 2개의 역배향 프라이머(1번째 및 2번째 PCR을 위한)를 게놈 워킹의 제1 단계를 위해 사용하였다.

게놈 DNA를 브라씨카 라파 잎으로부터 분리하고 6개의 분획물로 나누었다. 각각의 분획물을 6개의 제한 효소(EcoRV, DraI, PvuII, StuI, SspI, XmnI)중 하나로 분해하고 상기 언급된 게놈 워킹 어댑터에 연결하였다. 각각의 제한-연결 혼합물은 게놈 DNA 라이브러리를 나타낸다.

다음 단계는 어댑터 특이적 AP1 및 AP2(정배향) 및 유전자 특이적(역배향) 프라이머를 사용하는 2개의 연속 PCR(1번째 및 2번째)을 포함한다. 루비스코 SSU 유전자의 제1 엑손의 상이한 부분으로 어닐링된 3개의 상이한 역배향 프라이머를 사용하여 PCR를 개시함으로써 하기 열거된 중복 PCR 생성물을 수득하였다:

RbcS-RN: 5'-ACCCGGGCCCAGGAGAGCATAGAGGAAGCC-3' (서열번호 12),

RbcS-Rl: 5'-CGGTGAATGGAGCGACCATCGTGGCTTGAG-3' (서열번호 13),

RbcS-R2: 5'-CTGTGAATGGAGCAACCATGGCCGCTTGAG-3' (서열번호 14).

상기된 6개의 게놈 DNA 라이브러리는 2번째 PCR 후 증폭 생성물을 나타낸다. 이들 생성물을 TA 클로닝을 사용하여 pGEM-T-Easy 벡터(Promega)에 직접 클로닝하였다. M13 범용 및 역배향 프라이머와 함께 PCR을 사용하여 콜로니를 스크리닝하였다. 삽입체를 갖는 플라스미드 DNA를 함유한 콜로니를 액체 배양으로 성장시키고 분리된 플라스미드 DNA를 서열 분석을 위해 사용하였다.

약 90개의 플라스미드 DNA 삽입체 함유 클론의 총 수를 분석하였다. 서열분석으로부터 수득한 데이타를 기준으로, 서열을 서열 유사성에 따라 5개의 그룹으로 나누었다. 3개의 프로모터가 진뱅크에 공개된 것들과 유사한 것으로 동정되었다. 더욱이, 클론된 프로모터 영역에 특이적인 특정 디자인된 정배향 프라이머 및 '56'형의 3'UTR(rbcS-4 유형의 3'UTR)에 특이적인 역배향 프라이머를 사용하여 게놈내에 56형의 3'UTR(rbcS-4 유형의 3'UTR)을 갖는 추정 프로모터를 동정하였다. 당해 프로모터는 '56A'로 명명하였다.

수득된 서열을 기초로, 동일한 정배향 프라이머(AP1, AP2) 및 신규한 역배향 프라이머를 사용한 다음 PCR 세트를 제조하기 위해 동일한 게놈 DNA 라이브러리를 사용하여 신규한 역배향 프라이머를 디자인하였다. 당해 과정을 4회 반복하였다. 제4 PCR 사이클 후, 수득한 서열을 프로모터 특이적 정배향 프라이머로 지정하였다. 역배향 프라이머가 BpiI에 대한 특정 부위를 포함하도록 디자인하여 NcoI에 해당하는 제한 부위를 제조하였다. 당해 프라이머 및 HiFi KOD 폴리머라제를 사용한 PCR에 의해 다른 서열중에 56형 프로모터 rbc-4A(서열번호 1)를 동정할 수 있었다. 게놈 워킹 기술에 의해 '56'형 3' UTR을 갖는 또 다른 프로모터가 게놈내에 결합되어 있는 것으로 밝혀졌다. 이러한 rbcS-4B 프로모터(서열번호 2)는 약 230nt의 길이(1953 내지 2175 nt 서열번호 1 및 794 내지 1016 nt 서열번호 2)상에서 rbcS-4A와 98% 유사하였지만 rbcS-4A와 rbcS-4B의 원거리 부분에서는 유사성이 40% 미만이었다. 도 2B는 이들 2개의 프로모터의 -267 내지 +33 nt 영역을 정렬시킨 것이다. rbcS-4B 프로모터는 또한 교정-판독(proof-reading) KOS 폴리머라제에 클로닝하였고 이의 기능적 활성을 추가로 연구하였다.

동일한 방법을 사용하여, 게놈 워킹의 총 4개의 단계를, rbc-4A 프로모터(서열번호 1)를 클로닝하는데 적용하고 2개의 단계를 rbcS-1, rbcS-3 및 rbcS-5 프로모터(각각, 서열번호 21, 서열번호 22 및 서열번호 23)를 클로닝하는데 적용하였다. 게놈 워킹의 최종 단계 후, 전장 프로모터를 교정 판독 Pfu 효소를 사용하여 클로닝하였다. 클로닝된 프로모터 서열의 3' 말단은 이들이 리포터 유전자와 연결될 수 있도록 디자인하였다. 수득한 프로모터 서열을, 진뱅크 BLAST 시스템을 사용하여 분석하였다. 각각 승인번호가 제X55937호 및 제X75334호인 rbc-S3 및 rbcS-5 프로모터와 유사한(98 내지 99% 이하) 브라씨카 프로모터를 동정하였다. 클로닝되고 공지된 모든 프로모터를 컴퓨터 정렬 프로그램을 사용하여 서로 비교하였다. 이러한 분석은 모든 프로모터가 대부분 300nt 영역에 위치하는 다소 유사한 부분을 갖고 있음을 보여주었다. 이들 rbcS 프로모터(rbcS-4B를 제외함(하기에 나타냄))의 300bp 길이의 인접 부분의 정렬을 도 2A(rbcS-2는 서열번호 3이고 rbcS-4A는 서열번호 1이다)에 제공한다. 게놈 워킹 데이타는 동일한 3'UTR에 연결되고 3'말단에서 마지막 230bp가 매우 유사한 2개의 부분적으로 상이한 rbcS-4(rbcS-4A와 rbcS-4B로 호칭됨)가 존재한다(도 2B)(rbcS-4A는 서열번호 1이고 rbcS-4B는 서열번호 2이다). 한편, 프로모터의 나머지(원거리) 부분은 이들이 다른 루비스코 프로모터와 정렬되었을 때 나타나는 바와 같이 동일하게 낮은 수준의 상동성(40%)을 나타낸다.

공개된 브라씨카 나푸스 루비스코 프로모터(승인번호 제X61097호)중 하나와 rbcS-2(서열번호 1)의 정렬은 이들 간에 약간의 차이(91% 유사성)를 입증한다(도 2C). 3'UTR 영역에도 차이가 있다. 따라서, 이들 2개의 프로모터는 동일한 것이 아니고 아마도 브라씨카 종에서 일군의 rbcS 유전자의 발생 또는 선택 과정동안에 분기된 것으로 보인다.

도 3에 따르면, rbcS-4A(서열번호 1) 프로모터 서열과 공개된 브라씨카 루비스코 프로모터(X61097)의 정렬은 52%의 불일치를 나타내었다.

유사하게, 도 4에 따르면 rbcS-4A 프로모터 서열과 공개된 크리산테뭄 rbcS-1 프로모터(AY163904)의 정렬은 57%의 불일치를 나타내었다.

명백하게, rbsC-4A 프로모터중에서 브라씨카 게놈 프로젝트 데이타베이스와 매우 높은 상동성(약 93%의 유사성)을 갖는 rbsC-4A 프로모터에서 단지 3개의 스트레치(서열번호 1의 1007 내지 1440nt, 1776 내지 1950 nt 및 1959 내지 2175 nt)가 존재한다. 승인번호 제BH484651호는 브라씨카 올레라세아(Brassica oleracea)에 대한 게놈 클론을 나타내고 CD811761은 브라씨카 나푸스의cDNA 클론을 나타낸다. rbcS-4A 프로모터의 다른 부분은 브라씨카 게놈 프로젝트를 포함하는 임의의 데이타베이스에서 발견되지 않았다.

명백하게, rbcS-2(서열번호 3) 및 rbcS-4A 및 B(각각, 서열번호 1 및 2)의 뉴클레오타이드 서열은 본원에 기재된 바와 같이 신규하고 유용하다.

실시예 3. 융합 작제물 rbcS-4A-GUS, rbcS-4A-HSA, rbcS-4B-GUS, rbcS-2- GUS, rbcS-2-HSA, rbcS-2-Ab(L+H)-lC2, rbcS-4A-Ab (L+H)-lC2, rbcS-2-TNFR-Fc 및 rbcS-4A-TNFR-Fc

역배향 프라이머를 사용하여 프로모터를 증폭시켜 이들의 3' 말단상에 Nco-I에 해당하는 제한 부위를 수득하였다. 5'말단 상에 NcoI 부위를 갖는 GUS 유전자 함유 벡터 pCAMBIA1301(CAMBIA)를 사용하였다. HSA 융합 단백질은 HSA 유전자가 삽입된 pBIN19 기반 플라스미드 pGPTV중에서 디자인하였다. 인공 폴리A 시그날을 갖는 코돈 최적화된 HSA 유전자 서열은 도 19에 나타낸 바와 같이 첨가하였다. RbcS-4A 및 rbcS4B는 Bpil, HindIII를 사용하여 절단하였다. RbcS-2는 NcoI, HindIII를 사용하여 절단하였다. 프로모터 RbcS 4A, rbcS-4B 및 rbcS-2를 NcoI, HindIII에 의해 개방되는 pCAMBIA1301 또는 pGPTV 벡터에 클로닝하였다. 이들 작제물에 사용되는 종결인자는 다음과 같다: GUS 함유 pCAMBIA1301 벡터중에서 nos-종결인자 및 rbcS-4 유형의 3'UTR 및 진뱅크로부터 공지된 브라씨카 라파 rbcS 종결인자의 일부를 HSA 함유 pGPTV 플라스미드에 사용하였다.

작제물 Rbcs-2-Ab(L + H)-1C2 및 RbcS-4-Ab(L + H)-1C2는 천연 브라씨카 루비스코 RbcS-4 유전자(게놈으로부터 직접 유래함) 기원의 동일한 항체 영역 및 동일한 종결인자(폴리 A)를 함유한다. 항체 단백질 분자는 본래에 헤베인 1C2 항원에 대해 생성되었다. RbcS-2-Ab(L + H)-1C2는 도 20에 보여진 바와 같이 RbcS-2 프로모터, 경쇄(항-헤베인 1C2) 암호화 영역, 도 21에 보여진 바와 같이 RbcS-4 종결인자(서열번호 17), 도 22에 보여진 바와 같이 또 다른 RbcS-2 프로모터, 중쇄(항 헤베인 1C2)(서열번호 18) 암호화 영역 및 또 다른 Rbcs-4 종결인자(서열번호 20)로 이루어진다. RbcS-4-Ab(L + H)-1C2 작제물은 Rbcs-4 프로모터, 경쇄(항-헤베인 1C2(서열번호 16)) 암호화 영역, RbcS-4 종결인자, 또 다른 RbcS-4 프로모터(서열번호 2), 중쇄(항-헤베인 1C2)(서열번호 18) 암호화 영역 및 또 다른 RbcS-4 종결인자(서열번호 20)로 이루어진다.

작제물 Rbcs-2-Ab (L+H)-lC2 및 RbcS-4-Ab (L+H)-lC2에 대해 rbcS-2 및 rbcS-4 프로모터를 SalI, HindIII로 절단하고 pVK1-CHC(불변 중쇄)-rbcS-4-종결인자에 연결하고 salI 및 HindIII로 분해하여 pVK1-RbcS-2(Rbcs-4A) 프로모터-CHC-RbcS-4-종결인자를 수득하였다. RbcS-4 종결인자를 본래에 BsiWI, EcoRI에 의해 CHC와 함께 클로닝하였다. 1C2 항체의 가변 중쇄 영역(VH-1C2)은 BpiI, Bsp120I로 절단하고 동일한 부위에서 pVK1-Rbcs-2(Rbcs-4)-프로모터-CHC-RbcS-4-종결인자 벡터에 클로닝하였다. 수득한 플라스미드는 전체 H쇄(중쇄) 유니트를 함유하는 플라스미드이다. 동일한 전략을 사용하여 전체 L(경)쇄 유니트를 수득하였다. L쇄 유니트는 이어서 35S-gusA 또는 35SUideA 유전자가 제거된 pCAMBIA1301 벡터에 클로닝하였다. 이로써 pCAMBIA1301-L-쇄를 수득하였다. 최종 단계에서, H-쇄 유니트를 pCAMBIA1301-L쇄 벡터에 삽입하여 최종 pCAMBIA1301-H-L을 수득하였다. 당해 플라스미드는 아그박테리움(Agrobacterium) 매개 전략을 사용하는 식물 형질전환을 위해 사용하였다.

Ig-TNFR(ENBREL) 작제물은 rbcS-2 또는 rbcS-4 프로모터, IgCHC 부분(CH2 및 CH3 도메인)을 포함하는 도 23에 나타낸 바와 같은 TNFR(종양 괴사 인자 수용체) 부분(489nt) 및 종결인자를 함유한다. TNFR 부분은 역전사에 이어서 PCR로 사람 mRNA로부터 직접 클로닝하고 TA-클로닝 과정에 의해 pGEM-T-Easy 플라스미드에 연결하고 M13 범용 및 역배향 프라이머를 사용하여 양 방향으로부터 서열분석하였다. Ig CHC 부분은 PCR로 수득하고 이후 서열분석하였다. 클로닝 전략은 BsiWI 부위에 의한 Ig CHC 부위의 연결 및 프로모터의 rbcS-종결인자 함유 pVK1 플라스미드(pUC19 유도체)로의 도입을 포함한다. 이어서, BsmB1에 의해 분해된 TNFR 부분은 당해 플라스미드로 도입하였고 전체 삽입체는 대형 pCAMBIA1300 또는 pCAMBIA2300 플라스미드에 재클로닝하였다.

IgCHC 부분은 2개의 변이체로 수득하였다. 첫 번째는 이의 3'말단이 임의로 변화되지 않았고 두 번째는 이의 3'말단에 KDEL을 함유하였다. 이러한 시그날은 12nt의 긴 서열 AAAGACGAGCTG(서열번호 24)이고 종료 코돈 바로 직전에 도입한다. 여러 종결인자는 Ig-TNFR 작제물에 사용하였다. 하나는 항체 작제에 사용된 것과 동일한 rbcS-4 종결인자(약 500nt)이다. 또 다른 종결인자는 보다 긴 rbcS-4 종결인자(약 2kb)이다. 여전히 사용되는 또 다른 종결인자는 아라비도프시스 VSP1(영양 저장 단백질-1 유전자)로부터 기원하는 것이고 종료 코돈 뒤 우측 및 절단 부위 전에 위치하는 부부을 사용하고 도 24에 나타낸 바와 같이 rbcS-4 종결인자(서열번호 17) 부분에 연결하였다. 몇몇 작제물에서, 1개 또는 2개의 MAR(매트릭스 접착 영역) 서열(약 2kb)을 또한 도입하였다. 작제물이 2개의 MAR 서열을 함유하는 경우, 이들은 프로모터 앞 및 종결인자 뒤에 도입하였다.

실시예 4. 식물 형질전환

본 발명의 기재에 따른 신규한 프로모터의 기능성을 예시하기 위해, 본 발명자는 브라씨카 종 식물, 니코티아나 타바쿰 식물 및 카멜리나 사티바 식물을 형질전환시켰다. 당업자는 기타 종의 식물을 형질전환시킬 수 있다.

브라씨카 식물은 잎 디스크 접종에 의해 pCAMBIA1301 또는 pGPTV-HPT 이분 벡터를 함유하는 에이. 투메파시엔스(A. tumefaciens)를 사용하여 형질전환시켰다. 담배 식물 니코티아나 타바쿰 재배종 삼성은 잎 디스크 접종에 의해 pGPTV-HPT 이분 벡터를 함유하는 에이. 투메파시엔스 균주 LBA4404를 사용하여 형질전환시켰다. 추정 형질전환체를 30mg/l 하이그로마이신에 대해서 선별하였다. 양성 주를 추가의 연구를 위해 온실로 옮겼다.

카멜리나 식물을 잎 디스크 접종에 의해 pCAMBIA1300 이분 벡터를 함유하는 에이. 투메파시엔스 균주 C58(헬퍼 플라스미드 pGV3850)을 사용하여 형질전환시켰다. 추정 형질전환체는 20mg/l의 하이그로마이신에 대해서 선별하였다. 양성 주는 추가의 연구를 위해 온실로 옮겼다.

실시예 5. 발현 분석을 위한 정량적 GUS 분석

당해 분석은 담배 잎 또는 카멜리나 묘목을 사용하여 수행하였다. 새로운 식물 물질을 2-ME를 함유하는 트리스-완충액중에서 기계적으로 파쇄하였다. 추출물중에 단백질 농도를 바이오-래드 분석을 사용하여 측정하였다. GUS 활성은 효소 반응에 대한 기질로서 메틸-움벨리페릴을 사용하는 분광기로 측정하였다. 항온처리는 +37℃에서 30분이었고 발색은 450nm 파장에서 분광기를 사용하여 측정하였다. 비 유전자 전이 식물을 음성 대조군으로서 사용하였다.

실시예 6. 실시간 RT-PCR 및 노던 분석을 사용한 mRNA의 발현 분석

브라씨카 또는 카멜리나 발아 종자 또는 담배 잎의 자엽으로부터 분리된 총 RNA 는 유전자 특이적 역배향 프라이머를 사용하여 역전사시켰다. 역배향 프라이머는 HSA, GUS, 항-헤베인 1C2 항체의 중쇄 및 경쇄 및 루비스코 SSU 암호화 영역의 제3 엑손 뿐만 아니라 공지된 모든 3'UTR의 비유사성 부분을 위해 디자인하였다. 수득된 cDNA는 정배향 및 동일한 역배향 프라이머를 사용하는 실시간 PCR 단계를 위해 사용하였다.

실시간 과정은 당해 방법의 SYBR그린 정량적 변법을 사용하는 방식에 따라 주로 API7000 기계로 수행하였다. 수동 표준 염료는 ROX이다. 보정 곡선은 게놈으로부터 증폭된 PCR 생성물을 사용하여 작성하였고 실시간 과정과 동일한 프라이머를 사용하여 정제하였다. 당해 결과는 본래 취득한 1ng의 RNA샘플당 분자 수로 표현하였다.

노던 분석을 위해, 총 RNA를 식물 재료로부터 분리하고 아가로스 겔상에서 전개하고 막으로 이동시켰다. 이어서 RNA를 UV 광에 대한 짧은 노출에 의해 막에 가교 결합시켰다. 다음 단계는 세균 T7 또는 SP6 프로모터로부터 시험관내 합성된 특정 RNA 프로브와 하이브리드화시키는 것이다. 하이브리드화를, 모든 프로브에 대해 특별히 최적화된 최적의 온도에서 밤새 수행하였다. 세척 후 막을 프로브상에 DIG-표지를 인지하는 항체로 항온처리한다. RNA 프로브(즉, 특정 mRNA)의 양은, 음성 및 양성 대조군(다양한 농도)을 사용하여 증진된 발광에 의해 검출하여 실험 샘플에서 특정 mRNA의 양을 측정한다.

실시예 7. 발아 종자에서 루비스코 유전자 및 총 루비스코 mRNA의 발현 수준은 자엽 발육 말기에 근접할수록 증가한다.

일정한 광 조건하에 총 RBCS mRN 함량은 처음 3 내지 4일동안에 증가하여 다음 5 내지 7일동안 고수준으로 유지되었다(도 16).

브라씨카 나푸스 발아 종자에서 상이한 루비스코 유전자의 발현 수준 및 또한 총 루비스코 mRNA 생성량을 측정하기 위해, 본 발명자는 일정한 광 조건하에 실시간 PCR를 사용하여 0, 1, 2, 3 및 4일에 종자에서 총 루비스코 mRNA의 양을 측정하였다. 이것은 도 9에 나타낸다.

도 9에서 보여지는 정량적 데이타(제1 칼럼)은 평균 샘플당 1ng의 mRNA에서 루비스코 mRNA 분자의 양 또는 수를 입증한다. 명백하게, mRNA 분자의 양은 0일 내지 4일까지 증가하여 4일째에 가장 높은 양을 보여준다. 4일째 발아시, 샘플 대부분에서 측정된 RBCS mRNA의 양은 총 mRNA 4ng당 약 4 내지 7 x 10⁷ 분자이다.

실시예 8. RBCS mRNA의 rbcS-4 유형은 식물 발생의 종자 발아 단계에서 가장 보편적이고 활성 유형의 mRNA이다

상이한 유형의 RBCS mRNA의 양을 상기된 실시간 과정으로 분석하였다. rbcS-2, rbcS-3, rbcS-4 및 rbcS-5의 발현 수준은 당해 mRNA 종의 3'UTR의 비유사 부분에 특이적인 프라이머를 사용하여 0 내지 4일째에 브라씨카 나푸스 종자 발아에 대해 측정하였다(도 5). 정배향 프라이머는 이들이 특정 3'UTR 유형에 상응하는 보다 긴 우측 부분을 갖도록 디자인하였다. 각각의 프라이머의 보다 짧은 좌측 부분은 RBCS 암호화 영역의 말단에 상응한다. 당해 좌측 부분은 길이를 증가시키고 따라서 프라이머의 Tm을 증가시키는데 일조하지만 이의 특이성을 방해하지 않는다(도 5).

도 9에 요약된 데이타(칼럼 3 내지 6)는 발현 수준에서 상당한 차이를 입증한다. 4일의 종자 발아 동안에 가장 풍부한 유형은 rbcS-4 RBCS mRNA이지만 본 발명자가 이미 상기 주지한바와 같이 부분적으로 유사한 프로모터에 의해 구동되는 적어도 2개의 rbcS(각각 rbcS-4A 및 -B; 서열번호 2 및 서열번호 3)가 존재하고 동일한 3'UTR(rbcS-4 유형의 3'UTR)에 연결되어 있다. 이것은 각각의 rbcS-4 유전자가 유전자의 총 활성에 기여할 수 있음을 의미할 수 있다. 그러나, rbcS-4B-GUS 유전자 전이 담배 식물로부터 수득한 정량적 발현 데이타(도 10)에 따르면 프로모터의 활성은 매우 낮고 rbcS-4 유형의 3'UTR를 함유하는 총 mRNA 양에 대해 명백한 효과를 갖는 것처럼 보이지 않는다.

본원에 명백하게 제공된 데이타는 식물 발생의 종자 발아 후기 단계에서 rbcS-4 유형의 RBCS mRNA가 우세함을 입증한다.

현재, 도 9에 나타낸 결과에 따르면, 실시간 PCR은 rbcS-4 프로모터가 조사된 어떠한 다른 루비스코 프로모터 보다 4일째 발아에서 보다 활성임을 보여주었다. 상이한 RBCS 유전자의 발현 수준은 상이한 역학에 따르고, 예를 들어, 3일째에, rbcS-2(서열번호 3) 및 rbcS-3(서열번호 21)는 rbcS-4(서열번호 22) 및 rbcS-5(서열번호 23) 보다 활성이었다. 이들의 특징은 발아 종자 또는 싹에서 생성될 외래 단백질 또는 기타 목적하는 유전자 생성물의 제조 방법을 위해 프로모터를 선별하는 경우 극히 중요하다.

불안정한 전이 유전자 단백질은 발아 종자 조직에서 식물 세포의 증진된 단백질 이동 능력 때문에 매우 신속하게 분해될 수 있다. 지연된 활성 역학을 갖는 rbcS-4와 같은 프로모터를 사용하는 경우, 가수분해 액포의 작용으로부터 전이 유전자 단백질 생성물의 축적을 보호할 가능성이 높다. 더욱이, 전이 유전자 작제물에서 rbcs-4A를 사용하는 추가의 이득은 이것이 종자 발아의 후반 단계에서 분석된 4개의 프로모터중 가장 강한 프로모터라는 사실 때문이다.

도 13은 rbcS-4-HSA 또는 (rbcs-2-HSA) x 2에 대한 유전자 전이 비. 나푸스 종자 발아에서 HSA mRNA의 축적을 비교한 것이다. (rbcS-2-HSA) x 2는 rbsS-2-HSA의 변이체이고 여기서 rbcS-2의 2개의 유니트는 반복적으로 배열되어 있다. HSA mRNA가 (rbcS-2-HSA) x 2에 대해 유전자 전이된 종자에서 보다 일찍이 축적하기 시작한다는 것은 자명하다. 한편, rbcS-4-HSA 유전자 전이 식물에서 HSA mRNA는 이후에 축적하기 시작하지만 축적량이 다소 높다. 도 9에서 예상할 수 있는 바와 같이, rbcs-4 프로모터 활성의 역학은 rbcS-2보다 지연되고 따라서, 2개의 프로모터는 비고유 조건의 경우에서도 기능적이라는 것이 자명하다. 이와 관련하여, 고유 조건은 게놈의 적당한 부위에 위치하는 루비스코 프로모터 및 루비스코 유전자를 함유하는 정상적인 비유전자 전이 식물을 의미한다. 비고유 조건은 본 경우에서와 같이 인공적인 상황을 의미한다. 브라씨카 루비스코 유전자 및 외래 리포터 유전자는 때때로 게놈의 위치에 삽입된다.

실시예 9. 목적하는 유전자 생성물을 제조하기 위한 rbcS-2 및 rbcS-4 프로모터를 함유한 이종 및 동종 유전자 전이 식물

rbcS-2(서열번호 1) 및 rbcS-4(서열번호 2 및 서열번호 3) 프로모터를 브라씨카, 담배 및 카멜리나 식물을 사용한 식물 형질전환 실험에 사용하여 '프로모터 강도'를 측정하고 또한 동종 및 이종 시스템(즉 동일하거나 상이한 종 기원의 프로모터를 함유하는 작제물로 형질전환된 식물)에서 발현 수준을 비교하였다.

프로모터를 역배향 프라이머로 증폭시켜 이의 3' 말단상에 NcoI 해당 제한 부위를 수득하였다. 실시예 2에 기재된 바와 같이 디자인된 5' 말단상에 NcoI 부위를 갖는 GUS 유전자 함유 pCAMBIA1301 벡터(CAMBIA)를 사용하였다.

브라씨카의 게놈내에 삽입되는 프로모터 rbcS-2(서열번호 3) 또는 rbcS-4A 및 B(서열번호 1 및 2) 함유 작제물은 동종 시스템을 나타내고 담배 및 카멜리나 식물 게놈내에서 동일한 작제물의 삽입은 이종 시스템을 나타낸다. 리포터 유전자와 프레임내로 융합된 rbcS-2 또는 rbcS-4 프로모터를 함유하는 재조합 작제물은 실시예 3에 기재된 바와 같이 디자인하고 이를 사용하여 실시예 4에 기재된 바와 같이 식물을 형질전환시켰다.

rbcS-4A-GUS 또는 rbcS-2-GUS를 함유하는 유전자 전이 브라씨카 식물의 mRNA 발현 데이타는 도 7에 제공한다. 리포터 유전자의 mRNA 발현 수준은 4일동안 발아된 유전자 전이 브라씨카 식물 종자의 자엽으로부터 측정하였다.

도 7에 나타낸 표에서,

1) 양 식물 형질전환체에서 전이 유전자(GUS) mRNA의 발현은 상응하는 고유 루비스코 유전자(rbcS-2 또는 rbcS-4A)의 발현 보다 약 5 내지 6배 적고,

2) 유전자 전이 식물에서 고유 rbcS-4A 유전자의 발현 수준은 비 유전자 전이 식물중에서의 발현 수준에 상응하지만 rbcS-2 유전자 전이 식물에서 고유 rbcS-2 유전자의 발현 수준은 비유전자 전이 식물의 수준 보다 적은 것으로 입증된다. 이러한 결과는 2개의 프로모터의 일부 특성, 즉, 동종 식물에서 rbcS-2 프로모터의 보다 사일런싱 의존성이라는 성질을 지적할 수 있다.

담배 형질전환 실험을 위해, rbcS-2-HSA 및 rbcS-4A-HSA 작제물을 사용하고 이들 각각에 대한 7개의 HSA 생산 식물 주를 수득하였다. 5일째 유전자 전이된 담배 발아 종자에서 측정된 HSA 유전자의 mRNA 발현 수준은 이들 식물주의 양 유형에서 거의 동일한 발현 수준임을 입증한다(도 8). 담배 형질전환 실험은 rbcS-2 및 rbcS-4 프로모터사이에는 어떠한 차이가 없지만 이들 둘다는 이종 시스템에서 발현함을 명백하게 보여준다.

RbcS-2-GUS, RbcS-4-GUS, 짧은 Rbcs-2-TNFR-Fc-56UTR, 짧은 Rbcs-2-TNFR-FcKDEL-56UTR, 긴 Rbcs-4-TNFR-Fc-56UTR, 긴 Rbcs-4-TNFR-FcKDEL-56UTR을 함유한 유전자 전이 카멜리나 및 담배 식물을 수득하고 분석하였다. 당해 결과는 도 18A 및 B에서 표로서 나타낸다. GUS-활성 측정은 양성 대조군으로서 사용되는 통상적인 35Sp-GUS 작제물을 함유한 식물에서 보다 rbcS-2(rbcS-4)-GUS 유전자 전이 식물에서 효소 활성 수준이 크다는 것을 입증한다. 노던 데이타는 몇몇 TNFR-Fc-함유 카멜리나 및 담배 식물을 위해 유용하다. (rbcs-4-TNFR-Fc에 대한) 발현 수준은 고유 rbcS 유전자의 발현 수준(브라씨카에서 일군의 전체 RBCS 유전자에 대한 총 RNA 약 50 내지 100pg/㎍)에 필적한다.

실시예 10. 유전자 전이 식물에서 단백질 발현

GUS 유전자 암호화 영역을 포함하는 작제물은 루비스코 프로모터 rbcS-4A에 연결시키고 아그로박테리움 매개 형질전환을 사용하여 평지씨유(브라씨카 라파)를 형질전환시켰다. 유전자 전이 식물은 종자가 생성될때까지 온실에서 성장시켰다. 유전자 전이 식물의 종자는 20℃ 통기 물, 24℃ 통기 20mM KNO₃ 물 또는 30℃ 통기 물에서 발아시켰다. 다양한 배양 시간 후, 발현된 GUS 단백질은 적당한 완충액중에서 파쇄하고 원심분리하여 싹으로부터 분리하였다. GUS 비활성은 분광기로 측정하였다(도 11). 명백하게, 싹 당 GUS 활성은 성장 배지에서 KNO₃를 사용하는 72시간 배양 후 가장 높았다.

rbcS-2 또는 rbcS-4의 제어하에 HSA 함유 유전자 전이 브라씨카 나푸스, 카멜리나 사티바 및 담배 식물의 단백질 발현을 또한 분석하였다. 유사하게 RbcS-2-HSA의 반복 작제물을 함유한 식물을 분석하였다. 단백질 발현은 4일동안 일정한 광 및 24℃에서 발아된 싹으로부터 분석하였다. 도 15는 데이타를 총 가용성 단백질 %로서 보여준다. 반복 작제물을 함유하는 식물은 단일 작제물을 함유한 식물 보다 단백질의 발현 수준이 높다는 것은 자명하다. 추가로, 단백질 발현은 rbcS-2 프로모터하에서 보다 rbcs-4 프로모터하에서 보다 높다는 것은 자명하다. 2개의 rbcS-2-HSA 작제물을 갖는 반복 작제물은 본 발명에 따른 다중 작제물의 예이고 당업자는 또한 2개 이상의 반복 작제물로 식물을 형질전환시킬 수 있다. 유사하게 당업자는 구동 프로모터로서 rbcS-4A를 갖는 반복 작제물을 사용하여 보다 높은 함량의 단백질을 수득할 수 있다.

TNFR 작제물을 함유한 유전자 전이 카멜리나 사티바 및 담배 식물의 단백질 발현을 분석하였다. 당해 결과는 도 18에 나타낸다.

실시예 11. 최대 활성을 제공하기 위해 RbcS 프로모터는 전장이어야만 한다

리포터 uid A 유전자와의 융합 작제물에서 절단된 버젼의 rbcS-2 프로모터를 클로닝하였다(0.3 및 0.6 kb의 길이). 담배 식물은 당해 작제물을 함유한 아그로박테리움으로 형질전환시키고 GUS 활성은 성숙한 담배 식물의 잎으로부터 측정하였다. 수득한 데이타는, GUS 유전자에 연결된 rbcS-2(1.6kb) 또는 35S 프로모터를 갖는 고발현 성숙한 담배 식물 분석으로부터 수득한 데이타와 비교하였다. 도 15에 나타낸 바와 같은 결과는 프로모터의 길이 감소로 인해 등록된 GUS 활성이 감소됨을 명백하게 입증한다. 따라서, rbcS-2 프로모터의 원거리 영역이 기본(유도성이 아님) 프로모터 활성을 지지하는 필수 조절 요소를 함유하고 있다는 것은 자명하다. 공지된 토마토 rbcS1 프로모터 및 본 발명의 클로닝된 브라씨카 rbcS-2 및 rbcS-4A 프로모터의 실리코에서 비교 분석을 통해 이들 모두에서 유사한 보존 조절 요소들을 발견할 수 있었다(도 6). 공지된 박스 대부분은 -500 내지 -600nt 영역에 위치한다는 것이 명백하다. 당해 프로모터의 당해 원거리 부분은 몇몇 중요한 조절 요소들을 가질 수 있거나 이들은 예를 들어, rbcS-4A의 5' 영역에 MAR(매트릭스 부착 영역)이 존재할 수 있기 때문에 프로모터 작용에 관여할 수 있다는 것(컴퓨터 MAR 예측 분석)을 제안할 수 있다.

<110> UNICROP LTD <120> Novel Rubisco Promoters and Uses Thereof <130> A3542PC-KR <150> US 60/484,707 <151> 2003-07-03 <150> FI 20031052 <151> 2003-07-10 <150> US 10/884,283 <151> 2004-07-02 <160> 32 <170> KopatentIn 1.7 <210> 1 <211> 2175 <212> DNA <213> Brassica rapa <400> 1 gtttcctgag tgttgcacct cctcagtctg agccgtatta agttcaaacc aaactgccgc 60 ttctgctcta gctttactca ggactgaaac cgaggagtag tgtatcttct caaaagccag 120 accatttctc gccttccata gatgccagag tatccaagga aaaaacatcg tatcgctatc 180 ttttggagac ttcctactca tttccaggag atgatataaa cctgccaccg ggagtttgat 240 cgaggacctt tcccaagtgt ccttcgccat ggggcaagaa aaaagtagat ggcagatcga 300 ttcaatacca ccattacata ctttgcaagc agagtctact tgaatacctc tactacgaag 360 acgttccatg accgctaaag ccccagagag agctttccaa aggaaatgct taatttttgg 420 aggagcacgg atcttccaca gagatttcca aaggtatttc tccaggggag gaagagaagt 480 tgaaatgcta ccatcttcct caggaagcga atcgacaaat ctttaaccac tccgtgatgt 540 gtagattcca tcttttgtga agccccactt ataaccatct tcctgcatcc tatttggctt 600 caagcgaagg atgatctcag 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taatcggtta gatcggtttc 660 aaaaaaaatt tgttcccaaa tttcaatccg aactaaccta gctaaccaaa acttcgaatc 720 gaagtaacca agctacctaa aattactcaa aattttgaac cgaactaaca gaattaacca 780 aaacattgga ccgaattaac caattttacc caaattttta accgaaatat aatcagaacc 840 aaaaacttaa gttagtttcg gtaaaatttt aaaaactgaa ctacccaaat accaaactga 900 actgaatttt ttttatgttc gacaagattt tagtcgaacc gaactacctg aatccgcagg 960 aagttaccca tcacagagag atgcacaaag cattacctaa aaacgttaca tttagtgttt 1020 tggtaccact tttattgatt tttttttttg acagctattg atttagttta tagtttttaa 1080 ctattaagta acagtttgtt tttcgtgtca aaaaaaaaag taacagtttt tatacggttt 1140 tacttttaac ttaccaatcg gacccactat tcttttgttt ttgttggttt gaatatggac 1200 atgaccatta cagtagtatc attactcata agttaattag tacgacatac atgtataatt 1260 caagtacatc tcgtatagta atttcaattg tgaatttaat aatgaaccta atcaaattaa 1320 gcgaaactaa ttcatataaa tagaaggtcc gcgaacattg aaatgtagat catgcgtcag 1380 aattgtcctc tctcagtagg aaggagccaa aagcattggc tcaagttgag acgagtaacc 1440 atacacattc atacgttttc ttacaagata agataagata atgttatttc 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Claims (18)

1. 발육하는 자엽에서 유전자 발현을 지시할 수 있는 경미하게 성장한 브라씨카 라파(Brassica rapa)로부터 유도될 수 있고 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 포함함을 특징으로 하는, 일군의 루비스코 프로모터.
2. 단백질 또는 유전자 생성물을 암호화하는 이종 또는 동종 핵산 서열에 작동적으로 연결된 서열번호 1, 서열번호 2 및 서열번호 3으로 이루어진 뉴클레오타이드 서열 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 루비스코 프로모터를 포함하는 발현 카세트.
3. 제2항에 있어서, 루비스코 프로모터가 서열번호 1의 서열임을 특징으로 하는 발현 카세트.
4. 제2항에 있어서, 루비스코 프로모터가 서열번호 2의 서열임을 특징으로 하는 발현 카세트.
5. 제2항에 있어서, 루비스코 프로모터가 서열번호 3의 서열임을 특징으로 하는 발현 카세트.
6. 제2항에 있어서, 핵산 서열이 사람 혈청 알부민을 암호화하는 발현 카세트.
7. 제2항에 있어서, 핵산 서열이 합성된 것임을 특징으로 하는 발현 카세트.
8. 제2항에 있어서, 핵산 서열이 의학적 활성 단백질의 일부를 암호화함을 특징으로 하는 발현 카세트.
9. 제2항에 있어서, 리포터 유전자가 항체를 암호화함을 특징으로 하는 발현 카세트.
10. 식물 또는 이의 후속 세대가 제2항에 따른 하나 이상의 발현 카세트를 포함함을 특징으로 하는 형질전환된 식물.
11. 제10항에 있어서, 식물이 브라씨카(Brassica) 또는 카멜리나 사티바(Camelina sativa)임을 특징으로 하는 형질전환된 식물.
12. 제10항에 있어서, 식물이 카멜리나 사티바 종자임을 특징으로 하는 형질전환된 식물.
13. 제2항에 따른 하나 이상의 발현 카세트를 포함함을 특징으로 하는, 제10항에 따른 형질전환된 식물의 종자.
14. 제13항에 있어서, 브라씨카 또는 카멜리나 사티바 종자임을 특징으로 하는 종자.
15. 제2항에 따른 하나 이상의 발현 카세트를 포함함을 특징으로 하는, 제13항에 따른 발아된 종자의 형질전환된 묘목.
16. 제16항에 있어서, 브라씨카 또는 카멜리나 사티바 묘목임을 특징으로 하는 형질전환된 묘목.
17. 제16항에 있어서, 카멜리나 사티바 묘목임을 특징으로 하는 형질전환된 묘목.
18. 경미하게 성장한 묘목에서 발현을 평가하는 단계, 가장 고도로 발현된 유전자를 동정하는 단계 및 발육하는 자엽에서 유전자 발현을 지시하는 능력을 갖는 프로모터를 당해 유전자로부터 선별하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 제1항에 따른 일군의 루비스코 프로모터를 제조하는 방법.

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