KR20060065419A - 신규 카탈라아제 프로모터 및 이를 이용한 재조합 단백질생산 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 카탈라아제 프로모터 핵산 분자 및 상기 프로모터를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

한세눌라 폴리모르파, 카탈라아제, 프로모터, 발현벡터, 재조합 단백질

Description

신규 카탈라아제 프로모터 및 이를 이용한 재조합 단백질 생산 방법{A novel Catalase promoter and the method of producing recombinant proteins using the same}

도 1은 한세눌라 폴리모르파에서 카탈라아제(CAT) 프로모터로 재조합 단백질 발현 유도를 하기 위하여 구성한 발현 플라스미드 작제도이다. 도 1a는 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger)로부터 유래한 포도당 산화효소(GOD)를 발현하기 위하여 구성한 플라스미드, 도 1b는 인체 혈청 알부민(hSA)을 발현하기 위한 플라스미드, 도 1c는 녹색 형광 단백질(GFP)을 발현하기 위하여 구성한 플라스미드를 나타낸다.

도 2는 한세눌라 폴리모르파에서 CAT 및 MOX 프로모터를 이용하여 GOD를 발현 후, 평판 배지에서 GOD의 활성을 측정한 결과이다. A는 메탄올을 탄소원으로 하는 YPM 복합 평판 배지에서 형질 전환주를 배양하고 발현된 GOD의 활성 측정결과그림, B는 포도당을 탄소원으로 하는 YPD 복합 평판 배지에서 형질 전환주를 배양 후 발현된 GOD의 활성을 측정한 결과를 나타낸다.

도 3은 한세눌라 폴리모르파로부터 CAT 및 MOX 프로모터를 이용하여 GOD를 액체배양에서 발현하여 세포성장에 대한 효소 양을 탄소원별로 비교하여 나타낸 결 과이다. 검은 색은 포도당 배지를 흰색은 메탄올 배지를 나타낸다.

도 4는 한세눌라 폴리모르파로부터 CAT 및 MOX 프로모터를 이용하여 hSA 발현 후, 10%의 SDS-PAGE으로 전개한 다음 은(silver) 염색법으로 단백질을 염색하여 hSA 발현특성을 정성 분석한 결과이다. A는 한세눌라 폴리모르파 MOX 및 CAT 프로모터의 발현 특성을 비교한 결과를, B는 CAT 프로모터에 의한 hSA의 발현 시 5-UTR의 영향을 검토한 결과이다.

도 5는 한세눌라 폴리모르파로부터 CAT 및 MOX 프로모터를 이용하여 GFP의 발현 특성을 현광 현미경으로 검토한 결과와 GFP의 발현 특성을 형광 흡광광도기로 측정하여 정량한 결과이다.

본 발명은 카탈라아제 프로모터 핵산 분자 및 이를 이용하여 목적 단백질을 생산하는 방법에 관한 것이다.

메탄올 자화효모 중에 하나인 한세눌라 폴리모르파는 높은 세포 성장 속도와 강력한 프로모터 및 외래 유전자의 다중 도입이 용이하므로 전통효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)를 대신하여 재조합 단백질의 대량 생산을 위한 산업용 미생물로 높이 평가되고 있다 (Gleeson et al. Yeast, 4, 1(1988); Janowicz et al. Yeast, 7, 431(1991); Romanos et al. Yeast, 8, 423(1992); Faber et al. Yeast, 11, 1331(1995)). 최근 이를 이용한 B형 간염백신의 대량생산이 아르헨티나, 브라질 및 국내 녹십자에서 상용화되면서(Hansenula polymorpha: Biology and Applications, Gellison ed. p.186, Wiley-VCH Verlag GmbH, Weinheim(2002)) 효과적인 외래 단백질 생산 시스템으로 평가되었고 다양한 재조합 단백질 생산에 응용되고 있다. 또한, 한세눌라 폴리모르파의 효율적인 당화 프로세스를 이용하여 인체 당단백질 생산에 적합하도록 조절된 신규 및 제너릭 재조합 단백질의 생산에 관한 연구가 활발히 진행되고 있다 (Kang et al. KR2002-37717; Kang et al. KR2003-43544; Kang et al. PCT/KR03/01285; Kang et al. KR2004-06352; Kang et al. PCT/KR04/001819).

한세눌라 폴리모르파로부터 외래 유전자를 발현하기 위한 프로모터로는 메탄올 대사에 관련된 메탄올 산화효소 (methanol oxidase; MOX)(Ledeboer et al. Nucleic Acids Res. 13, 3063(1985)), 디히드록시아세톤 합성효소 (Dihydroxyacetone synthase)(Janowich et al. Nucleic Acids Res. 13, 3042(1985)) 및 개미산 탈수소효소 (Formate dehydrogenase; FMDH)(Hollenberg et al. EPA0299108(1987)) 등이 개발되어 있으며, 이들 중에서 메탄올 산화효소의 프로모터가 매우 강력하고 정교하게 조절 가능하므로 재조합 단백질 생산에 많이 이용되고 있다. 이들 메탄올 대사 유래의 프로모터들은 일반적으로 메탄올 존재 시 발현이 크게 유도되는 반면, 포도당, 글리세롤 또는 에탄올과 같은 다른 탄소원의 존재 시에는 발현이 억제되므로 재조합 단백질 생산을 위한 세포배양 시 메탄올을 주된 탄소원으로 공급하게 된다. 그러나 메탄올 대사에서 생성되는 포름알데히드(formaldehyde)는 세포 생존에 치명적 영향을 미치므로 이러한 위험을 최소화하기 위하여 메탄올을 매우 정교하게 공급해야 한다. 이로 인하여 세포의 성장속도가 매우 느려지게 되어 장시간의 배양시간이 필요하므로, 낮은 농도의 포도당과 글리세롤 공급 시 프로모터 발현이 MOX 프로모터보다 용이한 FMDH 프로모터가 그 대안으로 이용되고 있다.

한세눌라 폴리모르파는 다른 메탄올 자화효모들, 특히 산업적 응용성이 높아 개발이 성숙단계에 있는 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)와 달리 메탄올 대사관련 프로모터들의 발현이 억제-풀림의 형태 (피키아 파스토리스는 억제-풀림-유도의 형태를 나타내므로 메탄올 없이는 메탄올 대사 관련 프로모터의 유도가 일어나지 않는 단점이 있다)를 나타내며, 포도당 억제가 쉽게 풀리므로 메탄올 유도를 대신할 수 있는 장점이 있다.

포도당 억제는 미생물 등에서 보이는 보편적인 현상으로서 포도당의 존재 하에서 포도당 이외의 탄소원과 관련한 대사관련 효소들의 발현을 전사적 수준에서 억제하는 것으로 보고되어 있고, 한세눌라 폴리모르파의 경우에 메탄올 대사와 퍼옥시솜 관련된 대부분의 효소가 전사적 수준에서 억제되며, 특히 메탄올 산화효소는 매우 강하게 억제되는 것으로 알려져 있다. 이에 반하여 개미산 탈수소효소는 메탄올 대사와 관련 있으나 낮은 농도의 포도당에서는 메탄올 산화효소의 경우와 달리 쉽게 억제가 완화되는 것으로 보고되어 있어서 실제 산업현장에서는 FMDH 프로모터를 이용한 재조합 단백질 생산 시스템이 선호되고 있다.

이밖에도 일급 아민류의 대사와 관련한 아민 산화효소(amine oxidase)(Weydemann et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 44, 377-385(1995)) 프로모터, 니트레이트 대사와 관련한 YNT1, YNR1, YNL1 프로모터(Perez et al. Biochem. J. 321, 397-403(1997); Avila et al. FEBS Lett. 366, 137-142(1995); Brito et al. Biochem. J. 317, 89-95(1996)), 인산화와 관련한 산 포스파타제(PHO1) 프로모터(Phongdara et al. Appl. Microbiol. Biotechnol. 50, 77-84(1998)), 해당경로와 관련한 글리세리드 3-인산 탈수소효소(GAP) 프로모터(Heo et al. FEMS Yeast Res. 4, 175-184(2003); 대한민국237979)와 당 신생경로와 관련한 트레할로스 6-인산 합성효소 프로모터(trehalose 6-phosphate synthase)(Reinder et al. J. Bacteriol. 181, 4665-4668(1999))들이 개발되고 있으며, 최근에는 플라즈마 막 H⁺-ATPase(plasma membrane H⁺-ATPase; PMA1) 프로모터(Cox et al. Yeast, 16, 1191-1203(2000) 및 번역 신장 팩터 1a(translation elongation factor 1a; TEF1, TEF2) 프로모터(Terentiev et al. J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31, 223-228(2004))가 개발되었다. 이와 같이 MOX를 대신할 수 있는 여러 프로모터들이 개발되고 있으나, 이들의 발현율은 FMDH 프로모터와 몇몇 프로모터를 제외하고는 MOX 프로모터를 대신할 수 있는 만큼 강력한 발현능력을 나타내지 못하고, 대부분 특허로 보호되고 있어서 고유한 발현시스템을 확보한 산업적 이용에 제한을 받고 있다.

그러므로 기존의 MOX와 FMDH를 대체하여 강력한 프로모터 활성을 가지면서도 메탄올뿐만 아니라 포도당 혹은 글리세롤에서도 쉽게 유도될 수 있는 신규한 프로모터의 발굴이 요구되고 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자는 본 발명에 따른 카탈라아제 효소의 프로모터가 메탄올뿐만 아니라 낮은 농도의 포도당 또는 글리세롤 존재 하에서도 발현을 유도하는 효율적인 프로모터임을 밝히고, 상기 프로모터를 이용하여 재조합 단백질을 효과적으로 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 프로모터 핵산 분자와 목적 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 작동적으로 연결된 핵산서열을 포함하는 벡터를 숙주세포로 형질전환하는 단계, 메탄올, 포도당, 글리세롤 또는 이들의 배합물의 존재 하에 목적 단백질 발현을 유도하는 단계, 및 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 목 적 단백질의 생산 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 카탈라아제 프로모터 핵산 분자에 관한 것이다.

보다 바람직한 양태에서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열 또는 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “프로모터”는 폴리머라제에 대한 결합 부위를 포함하고 프로모터 하위 유전자의 mRNA로의 전사 개시 활성을 가지는, 암호화 영역의 상위(upstream)의 비해독된 핵산 서열을 의미한다. 본 발명과 관련한 프로모터는 한세눌라 폴리모르파의 게놈으로부터 분리한 천연의 카탈라아제(CAT) 유전자의 프로모터로서, 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 가지고 GeneBank에 승인번호 AY748852로 기탁되었다. 본 발명의 CAT 프로모터는 특이한 신호를 필요로 하는 유도성 프로모터로서, 메탄올, 포도당 또는 글리세롤이 유도제로 작용한다.

카탈라아제는 메탄올 대사에서 메탄올 산화에 의하여 생성된 과산화수소를 물과 산소로 전환하는 촉매작용을 수행하는 효소로, 카탈라아제에 관한 연구는 세포의 산화적 스트레스에 관한 연구와 퍼옥시좀(peroxisome)의 대사적 연구에 관한 보고(Hansen and Roggenkamp, Eur. J. Biochem. 184, 173-179(1989); Weiser et al. J. Biol. Chem. 266, 12406-12411(1991); Fukamatsu et al. Plant Cell Physiol. 44, 982-989(2003); Horiguchi et al. J. Bacteriol. 183, 6372- 6383(2001))가 있었으나, 카탈라아제 프로모터 규명에 대한 연구는 보고된 바가 없다.

본 발명의 프로모터는, 한세눌라 폴리모르파의 전체 유전자를 대상으로 제작한 마이크로어레이 슬라이드와 포도당과 메탄올의 탄소원 처리 샘플의 mRNA와의 하이브리다이제이션 실험을 통하여 포도당과 메탄올 탄소원에 의하여 카탈라제의 발현이 12.48배 증가하는 것에서 일차 선별되었다. 한세눌라 폴리모르파 RB11 균주에 대한 유전체 염기서열 정보 (Ramezani-Rad et al. FEMS Yeast Res. 4, 207-215(2003))를 토대로 한세눌라 폴리모르파 A16 균주로부터 얻은 염색체 DNA를 주형으로 PCR을 실시하여 한세눌라 폴리모르파 카탈라아제 프로모터를 포함하는 1,252 bp 크기의 DNA 절편을 얻고 염기서열을 분석한 뒤, CAT 프로모터의 활성 정도를 기존의 MOX 프로모터와 포도당 산화효소 (glucose oxidase: GOD), 재조합 인체혈장 알부민 (human serum albumin; hSA), 녹색형광단백질 (Green Fluorescent Protein; GFP)의 발현 정도로 비교 분석하였다. 정량화할 수 있는 단백질을 코딩하는 유전자(리포터 유전자)가 발현되도록 프로모터의 하위(downstream)에 연결시키고, 유도제 존재 하에 발현된 mRNA 또는 단백질의 양을 측정함으로써 프로모터 활성을 판단한다. 그 결과, CAT 프로모터는 메탄올 탄소원에 의하여 발현이 유도될 뿐만 아니라 낮은 농도의 포도당 탄소원 존재 하에서도 발현 유도가 우수하므로 포도당을 탄소원으로 이용한 발효공정에서 재조합 단백질 생산에 효과적으로 사용 가능하고, CAT 프로모터의 발현 양상이 MOX 프로모터와 달리 유도 초기에 강하므로 세포 배양시간 단축에 의하여 장시간 배양에 따른 발현된 단백질의 변성을 방지할 수 있었 다.

본 발명의 프로모터를 코딩하는 서열은 변형이 가능하다. 본 기술분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상의 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 프로모터 활성을 보유하는 한, 본 발명의 염기서열로부터 유래된 것과 균등한 것임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명에서 용어, “상동성”이란 천연형(wild type)의 핵산 서열과의 동일한 정도를 나타내는 것으로 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있다. 본 발명의 서열번호 1의 프로모터 영역을 코딩하는 핵산 서열과 바람직하게는 70% 이상, 보다 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상 동일한 핵산 서열을 포함한다.

또한, 본 발명의 프로모터는 프로모터 활성을 보유하는 한, 하나 이상의 핵산 염기가 치환, 결실, 삽입 또는 이들의 조합에 의해 변이된 프로모터 핵산 서열을 갖는 변이체를 포함한다. 프로모터 핵산 서열은 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합으로 서열상의 변이를 유도할 수 있다. 이러한 서열 변이를 통하여 천연 프로모터와 동일한 활성을 나타낼 수도 있으나, 바람직하게는, 활성이 증가된 프로모터, 유도제에 대한 특이성이 증가된 프로모터 등 목적에 적합하게 프로모터의 기능을 개선시킬 수 있다.

상기 모든 범주의 프로모터를 코딩하는 핵산 분자는 목적 유전자의 발현을 유도하는 발현 벡터의 프로모터 성분으로 제공되고, 상기 프로모터를 이용한 다양 한 벡터의 변형이 본 발명의 범주에 포함된다.

또 다른 양태에서 본 발명은 상기 프로모터 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 용어, “발현 벡터”란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있도록 프로모터 등의 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 본 발명과 관련된 발현 벡터는 프로모터가 CAT 프로모터인 벡터로, 플라스미드 벡터, 코즈미드 벡터, 박테리오파지 벡터, 효모 벡터, 또는 아데노바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 아데노-연관 바이러스 벡터 같은 바이러스 벡터를 포함한다. 프로모터는 목적 유전자의 발현을 유도하도록 작동가능하게 연결되어 있으며 벡터는 숙주세포의 게놈 내로 통합되어 있는 형태일 수도 있다.

본 발명에서 “작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명에서 “조절 요소”란 단백질을 암호화하는 핵산 서열의 전사, 번역 또는 발현의 증진을 돕거나 이에 영향을 미치는 비해독화된 핵산 서열을 의미한다. 본 발명의 발현벡터는 조절 요소로 CAT 프로모터를 필수적으로 포함하고, 단백질의 발현에 영향을 미칠 수 있는 발현 조절 서열 예를 들어, 개시코돈, 종결코돈, 폴리 아데닐화 시그널, 인핸서, 막 표적화 또는 분비를 위한 신호서열 등을 포함할 수 있다.

폴리아데닐화 시그널은 전사체의 안정성을 증가시키거나 세포질 수송을 용이하게 한다. 인핸서 서열은 프로모터에서 다양한 부위에 위치하여 인핸서 서열이 없을 때의 프로모터에 의한 전사 활성과 비교하여, 전사 활성을 증가시키는 핵산 염기서열이다. 신호서열에는 숙주가 에스케리치아(Escherichia)속 균인 경우에는 PhoA 신호서열, OmpA 신호서열 등이, 숙주가 바실러스속 균인 경우에는 α-아밀라아제 신호서열, 서브틸리신 신호서열 등이, 숙주가 효모인 경우에는 MFα 신호서열, SUC2 신호서열 등이, 숙주가 동물세포인 경우에는 인슐린 신호서열, α-인터페론 신호서열, 항체 분자 신호서열 등이 이용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 벡터는 복제 가능한 발현벡터인 경우, 복제가 개시되는 특정 핵산 서열인 복제원점 (replication origin)을 포함할 수 있다.

또한, 벡터는 선택마커 (selection marker)를 포함할 수 있다. 선택마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제 (selective agent)가 처리된 환경에서 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하므로 형질전환된 세포를 선별 가능하다. 효모에서 대표적으로 사용되는 선택마커에는 암피실린, 테트라사이클린에 각각 내성인 β-락타메이즈 유전자와 테트라사이클린 내성 유전자 및 G418 유전자가 있다. 또한, 효모의 ura3-52, his3-△1, leu2-△1, trp1-△1, lys2-201 등의 영양요구성 균주에서 사용될 수 있는 URA3, HIS3, LEU2, TRP1 또는 LYS2 같은 마커들을 포함할 수 있다.

상기 벡터로 목적 단백질을 코딩하는 핵산서열은 프로모터 하위에 인 플레임(in flame)으로 삽입되어 발현된다. 상기 벡터로 삽입 가능한 목적 단백질은 특별히 제한되지 않으나, 의학, 산업적으로 유용한 목적 단백질에는 호르몬, 사이토카인, 효소, 응고인자, 수송 단백질, 수용체, 조절 단백질, 구조 단백질, 전사 인자, 항원, 항체 등이 있다.

목적 단백질의 구체적인 예로는, 트롬보포이에틴, 인간 성장 호르몬, 성장 호르몬 방출 호르몬, 성장 호르몬 방출 펩타이드, 인터페론류, 인터페론 수용체류, 콜로니 자극인자류, 글루카콘-유사 펩타이드류 (GLP-1등), 지프로테인 관련수용체 (G-protein-coupled receptor), 인터루킨류, 인터류킨 수용체류, 효소류, 인터류킨 결합 단백질류, 사이토카인 결합 단백질류, 마크로파지 활성인자, 마크로파지 펩타이드, B 세포인자, T 세포인자, 단백질 A, 알러지 억제인자, 세포 괴사 당단백질, 면역독소, 림포독소, 종양 괴사인자, 종양 억제인자, 전이 성장인자, α-1 안티트립신, 알부민, α-락트알부민, 아포리포단백질-E, 적혈구 생성인자, 고 당쇄화 적혈구 생성인자, 안지오포에이틴류, 헤모글로빈, 트롬빈, 트롬빈수용체 활성 펩타이드, 트롬보모듈린, 혈액인자 Ⅶ, Ⅶa, Ⅷ, Ⅸ, 및 XⅢ, 플라즈미노젠 활성인자, 피브린-결합 펩타이드, 유로키나제, 스트렙토키나제, 히루딘, 단백질 C, C-반응성 단백질, 레닌 억제제, 콜라게나제 억제제, 수퍼옥사이드 디스뮤타제, 렙틴, 혈소판 유래 성장인자, 상피세포 성장인자, 표피세포 성장인자, 안지오스타틴, 안지오텐신, 골 형성 성장인자, 골 형성 촉진 단백질, 칼시토닌, 인슐린, 아트리오펩틴, 연 골 유도인자, 엘카토닌, 결합조직 활성인자, 조직인자 경로 억제제, 여포 자극 호르몬, 황체 형성 호르몬, 황체 형성 호르몬 방출 호르몬, 신경 성장인자류, 부갑상선 호르몬, 릴랙신, 씨크레틴, 소마토메딘, 인슐린 유사 성장인자, 부신피질 호르몬, 글루카곤, 콜레시스토키닌, 췌장 폴리펩타이드, 가스트린 방출 펩타이드, 코티코트로핀 방출인자, 갑상선 자극호르몬, 오토탁신, 락토페린, 미오스타틴, 수용체류, 수용체 길항물질, 세포표면항원, 바이러스 유래 백신 항원, 단일클론 항체, 다중클론 항체 및 항체 단편 등이 있으며, 이로 제한되지 않는다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 숙주세포에 관한 것이다. 상기 벡터로 형질전환 가능한 숙주세포로는 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이로 제한되는 것은 아니다. 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa))등과 같은 하등 진핵 세포, 곤충 세포, 식물 세포, 포유동물 등을 포함하는 고등 진핵생물 유래의 세포를 숙주세포로 사용할 수 있다. 바람직하게는 효모, 그 중에서도 메틸자화 효모인 한세눌라 속, 피키아 (Pichia) 속, 칸디다 (Candia) 속 또는 토루로피시스 (Torulopsis) 속의 효모가 보다 더 바람직하다.

상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포 내로 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 숙주세포에 따라 당 분야에서 공지된 바와 같이 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 일렉트로포레이션 (electroporation), 인산 칼슘(CaPO4) 침전, 염화칼슘(CaCl2) 침전, 레트로바이러스 감염 (retroviral infection), 미세주입법 (microinjection), PEG, DEAE-덱스트란 (DEAE-dextran), 양이온 리포좀법 (cationic liposome), 초산 리튬-DMSO법 등이 있고, 본 발명의 구체적인 양태에서는 초산 리튬-DMSO법을 사용하였다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기 프로모터 핵산 분자와 목적 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 작동적으로 연결된 핵산 서열을 포함하는 벡터를 숙주세포로 형질전환하는 단계, 메탄올, 포도당, 글리세롤 또는 이들의 배합물의 존재 하에 목적 단백질 발현을 유도하는 단계, 및 목적 단백질의 분리 정제를 포함하는 목적 단백질의 생산 방법에 관한 것이다.

세포 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행되고, 배양 온도 및 시간, 배지의 pH, 유도제 종류, 유도제 투여시간 및 투여량 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다.

단백질은 통상적인 생화학 분리 기술, 예를 들어 단백질 침전제에 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등을 이용할 수 있으며, 통상적으로 순도가 높은 단백질을 분리하기 위하여 이들을 조합하여 이용한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의거하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐, 본 발명의 권리 범위가 하기 실시예에만 한정된 것은 아니다.

실시예 1: 마이크로어레이를 활용한 한세눌라 폴리모르파 카탈라아제 발현 양상 분석

한세눌라 폴리모르파 DNA 마이크로어레이 분석을 위하여 한세눌라 폴리모르파 CBS 4732(http://pedant.gsf.de/cgi-bin/wwwfly.pl?Set=Pichia_ angusta_CBS_4732_RST&Page=index)의 RST(random sequencing tags)를 이용하여 1,202쌍의 한세눌라 폴리모르파 ORF에 대한 프라이머를 제작하였다. 각각의 프라이머 길이는 18 mer이며 전방 프라이머(forward primer)에는 5-aminolink를 갖도록 구성하여 마이크로어레이 배열시 방향성을 갖도록 하였다.

한세눌라 폴리모르파 마이크로어레이를 제작하기 위한 전체 유전자들은 한세눌라 폴리모르파 A16 야생형 균주의 유전체 DNA를 Holm 등(Holm et al. Gene, 42, 169-173(1986))의 방법에 따라서 획득하여 위에서 준비한 프라이머들을 이용한 96-웰 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)(반응부피 100 ㎕; 8 ㎍/㎖ 의 chromosomal DNA, 1 pmole/㎕의 프라이머 세트, 50 ㎕의 2X premix Taq DNA polymerase)으로 얻었다. 이로부터 얻은 PCR 반응물은 분리 정제하여 완충용액에 100 ng/㎕의 농도로 농축하고 384-웰에 옮겨 ProSys5510 마이크로어레이(Cartesian Technologies, Irvine, CA, USA)를 이용하여 슈퍼 알데히드 슬라이드 글라스(super-aldehyde slide glass, CEL associates, Houston, TX, USA)위에 스포팅하고 나트륨 보로하이드라이드(sodium borohydride) 수용액으로 세정하여 한세눌라 폴리모르파 마이크로어레이 슬라이드를 완성하였다.

한세눌라 폴리모르파 마이크로어레이를 이용하여 포도당과 메탄올 탄소원에 대한 한세눌라 폴리모르파의 유전자 발현특성을 검토하기 위하여 한세눌라 폴리모르파 A16 균주를 포도당을 탄소원으로 하는 복합 액상배지 YPD-2 (Bacto yeast extract 1%, Bacto peptone 2%, glucose 2%)에서 지수성장기(O. D 0.8~1.0, 600 nm)까지 배양 후 메탄올을 탄소원으로 하는 YPM-1 (Bacto yeast extract 1%, Bacto peptone 2%, methanol 1%) 복합 액상배지에서 배양하여 세포를 취하고 원심분리 후 Hot phenol 방법(Elion and Warner, Cell, 39, 663-673(1984))으로 전체 mRNA를 얻었다. 또한, 산화적 스트레스 (oxidative stress)에 대한 한세눌라 폴리모르파의 유전자 발현 양상을 함께 검토하기 위하여 위의 배양조건에 이황화 메나디온(menadione bisulfite) 1 mM을 2시간 처리하여 인위적인 산화적 스트레스를 유발한 다음, 위와 같은 방법으로 세포를 회수하여 mRNA를 얻었다.

이들 mRNA는 직접 표지(direct labeling)방법과 간접 표지(indirect labeling) 방법으로 형광염료를 표지하였다. 직접 표지는 Hegde 등(Hegde et al. Biotechniques, 29, 548-562(2000))의 방법을 응용하였다. 24 ㎕의 RNAse-free 정제수에 mRNA 시료 100 ㎍과 oligo-dT 2 ㎍을 용해시켜 70℃에서 10분간 배양하고 얼음에 냉각시킨 다음, 5X 역전사효소반응 완충용액, 0.1 M DTT, 10X dNTP(5 mM d(AGC)TP, 2 mM TTP), 라벨링 형광염료(fluorescent nucleotide; 1 mM Cy3^TM-dUTP/Cy5^TM-dUTP, Amersham Bioscience, Piscataway, NJ, USA), RNAsin(RNAse inhibitor), 그리고 200 U의 Superscript^TM reverse transcriptase (Invitrogen, USA)를 첨가하여 반응부피 50 ㎕, 반응온도 42℃에서 2시간 동안 역전사 반응을 수행하였고 이로부터 Cy3과 Cy5가 표지된 cDNA를 얻었다. 그리고 간접 표지는 3DNA^TM Submicro^®EX Expression Array Detection Kit를 사용하였으며 두 가지 표지방법을 비교 분석하였다.

표지된 cDNA는 MinElute^TM PCR 정제 키트(Qiagen, USA)로 정제하고 진공 건조하여 15 ㎕의 TE buffer(10 mM Tris-Cl, pH 8.5)에 현탁시켰으며, 8.8 ㎕의 하이브리다이제이션 완충용액(10% SDS(sodium dodecyl sulfate), 20X SSC(sodium chloride/sodium citrate))을 첨가하여 99℃에서 5분 반응시키고 상온에서 5분 냉각시킨 후, 한세눌라 폴리모르파 마이크로어레이 슬라이드에 도입하여 45℃에서 16~18시간 동안 혼성화(hybridization) 반응을 수행하였다.

혼성화된 슬라이드는 2X SSC/0.2% SDS 완충용액, 2X SSC 완충용액, 0.2X SSC 완충용액, 그리고 증류수를 사용하여 순서대로 세정하고 1,000 rpm으로 원심분리하여 건조시켰다.

혼성화반응으로부터 발색된 슬라이드는 ScanArray 5000(Gsi Lumonics, Kanata, OT, USA)으로 스캐닝한 다음, GenePix^TM Pro 4.0(Axon Instruments, Foster City, CA, USA)과 S-PLUS 프로그램을 사용하여 분석하여 얻은 결과를 정규화(normalization) 하였으며(Stare et al. Computer Methods Programs Biomed. 64, 45-62(2001)), 배양조건에 따른 유전자의 발현 변화가 2배 이상을 나타내는 결과를 선별하여 검토하였다. 데이터 클러스터링은 클러스터(Cluster) 프로그램(Eisen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95, 14863-14868(1998))을 사용하였으며 트리뷰(TreeView) 프로그램(http://rana.lbl.gov.EisenSoftware.htm)을 사용하여 도식적으로 평가하였다.

표 1은 야생형 한세눌라 폴리모르파를 YPD-2 복합 액상배지에서 지수성장 초기까지 배양하여 세포를 회수하여 세척하고 YPM-1 복합 액상배지로 옮겨서 메탄올 메타볼리즘과 관련하여 발현된 mRNA에 대한 한세눌라 폴리모르파의 DNA 마이크로어레이 결과(Oh et al. J. Microbiol. Biotechnol. 14, 1239-1248 (2004))의 일부를 나타낸다. 표 1에 나타난 바와 같이 메탄올 유도에 의한 메탄올 산화효소의 발현율이 약 19배로 증가하였으며, 카탈라아제의 발현율 역시 약 13배로 매우 높게 증가하는 것을 관찰하였다. 또한, 카탈라아제는 산화적 스트레스 하에서 메탄올 산화효소보다 매우 높은 유전자 발현을 보였다. 따라서 이 결과를 기초로 하여 카탈 라아제의 프로모터를 메탄올 대사와 관련한 메탄올 유도 프로모터로 선별하였다.

메탄올 대사관련 효소	발현율 (Induction fold)
	메탄올 (Methanol)	메나디온 (Menadion)
메탄올 산화효소	18.68	1
카탈라아제	12.48	25

실시예 2: 한세눌라 폴리모르파 CAT 프로모터 획득

위 결과로부터 CAT 프로모터 유전자를 획득하기 위하여, 최근 완성된 한세눌라 폴리모르파 RB11 균주에 대한 유전체 염기서열 정보 (Ramezani-Rad et al. FEMS Yeast Res. 4, 207-215(2003))로부터 한세눌라 폴리모르파 카탈라아제 ORF (open reading frame)의 전체 염기서열 정보를 얻었다. 이를 토대로 하여 한세눌라 폴리모르파 카탈라아제의 구조 유전자의 상위 1,000 내지 2,000 bp에 대하여 제작한 서열번호 2와 서열번호 3의 프라이머를 사용하여 한세눌라 폴리모르파 A16 균주의 염색체 DNA를 주형으로 PCR을 실시하였고, 한세눌라 폴리모르파 카탈라아제 프로모터를 포함하는 1,252 bp 크기의 DNA 절편을 얻었다(서열번호 1). 본 발명에서 획득한 한세눌라 폴리모르파 카탈라아제 프로모터의 유전자 염기서열을 AY748852로 GeneBank에 등재하였으며 유전자를 대장균에 클로닝하여 한국생물자원센터 (KTCT)에 기탁번호 KCTC10722BP(기탁일: 2004년11월15일)로 기탁하였다.

실시예 3: 포도당 산화효소 리포터 유전자를 활용한 한세눌라 폴리모르파 CAT 프로모터 발현 양상 검증

아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger) 유래의 포도당 산화효소(glucose oxidase: GOD)를 리포터 단백질로 사용하여 MOX 프로모터와 CAT 프로모터의 발현양상을 상호 비교하기 위해서, CAT 프로모터를 이용한 GOD 발현용 플라스미드를 도 1a에 나타낸 바와 같이 제작하였다. 메탄올 산화효소 프로모터에 의하여 발현되도록 제작된 플라스미드 pDLMOX-GOD(H) (Kang et al. Glycobioligy, 14, 243-251 (2004))로부터 MOX 프로모터를 CAT 프로모터로 교체하여 플라스미드 pHpCATp-GOD를 제작하였다. 즉, N-말단과 C-말단에 BglII와 HindIII 제한효소 인식부위를 갖도록 제작한 한세눌라 폴리모르파 CAT 프로모터 DNA 절편을 제한효소 BamHI과 HindIII로 절단하여 얻은 6.3 kb 크기의 플라스미드 pDLMOX-GOD(H)에 삽입하여 플라스미드 pHpCATp-GOD를 얻었다.

형질전환은 상기 각각의 플라스미드를 한세눌라 폴리모르파 DL1(ATCC26012)과 A16(CBS4732)에 초산 리튬-DMSO법(Hill et al. Nucleic Acid Res. 19, 5791(1991))에 의하여 수행하였다. 형질전환된 재조합 균주는 류신 (Leu) 영양요구성 선별을 통한 YNB 최소 평판배지 (Yeast Nitrogen Base without amino acid 0.67%, glucose 2%, Leu DO supplement (BD Biosciences Clontech, USA) 0.069%)에서 계대배양하여 안정화 과정을 수행하였으며 GOD를 발현하는 형질전환 균주를 선별하여 발현특성을 검토하였다.

발현용 플라스미드 제작과 이들의 형질전환 균주 제작에 사용된 일반적인 실험방법은 강 등(Kang et al. Biotechnol. Bioengineer. 76, 175-185(2001))의 방법에 준하였다.

형질전환 균주의 도입 플라스미드 카피 수는 서던 블럿팅으로 결정하였다. 서던 블럿팅은 강 등(Kang et al. Biotechnol. Bioengineer. 76, 175-185(2001))의 방법에 따라 수행하였다.

CAT 프로모터에 의한 GOD의 발현 양상은 평판배지와 액상배양에서의 GOD 활성측정에 의하여 평가하였다. 평판배지에서의 활성측정은 다음과 같다. 선별된 형질전환 균주를 YPD-2, YPD-0.05 (Bacto yeast extract 1%, Bacto peptone 2%, glucose 0.05%), 및 YPM-2 (Bacto yeast extract 1%, Bacto peptone 2%, methanol 2%) 등의 복합 평판배지에 일정한 크기의 스팟을 형성하도록 피펫으로 종배양액을 분주한 다음 24~36시간 동안 37℃에서 배양 후, 활성 측정용 top agar를 콜로니가 형성된 평판배지 위에 붓고 포도당 산화효소반응을 수행하였다. 발현된 GOD의 활성은 평판 배지 상에 나타나는 발색환으로 평가하였다. 종배양은 YPD-2 복합 액체배지에서 20시간, 37℃로 배양하여 얻었다. 활성 측정용 top agar 용액은 agar 1%, glucose 0.7%, peroxidase (horseradish peroxidase, Sigma) 1 U/㎖, O-dianosine (Sigma) 67 ㎎/L을 100 mM의 인삼칼륨 완충용액 (pH 6.0)에 제조하여 사용하였다. 액상배양 측정은 형질전환 균주를 각각의 복합 액상배지에서 37℃로 배양 후 일정 부피를 취하여 GOD 발색반응 수용액에 첨가하여 효소반응을 수행하였으며, 일정부피의 염산 수용액을 첨가하여 효소반응을 종결하였다. 발색은 UV-흡광광도기(UV-spectrophotometer, Shimadzu, Japan)를 이용하여 525 nm에서 흡광도를 측정하여 정량하였다. 발색 반응용 수용액은 위에서 제조한 활성 측정용 top agar 용액 중에서 아가를 제외하고 인산칼륨 완충용액에 제조하였다.

도 2는 CAT 및 MOX 프로모터에 의하여 재조합 GOD를 발현하는 한세눌라 폴리모르파 DL1과 A16 형질전환 균주의 평판 배지 상에서의 발현특성을 나타낸다. 메탄올을 탄소원(YPM)으로 하여 세포를 배양한 경우, CAT 프로모터에 의한 GOD의 발현이 MOX 프로모터에 의한 발현에 상응하는 결과를 나타내었으며, 특히 한세눌라 폴리모르파 A16 균주의 경우에는 CAT 프로모터가 MOX 프로모터보다 비교적 우수하게 나타났다(도 2의 A). 그리고 포도당을 탄소원(YPD)으로 세포를 배양한 경우, MOX 프로모터에 의한 GOD의 발현은 억제된 것을 볼 수 있으나, CAT 프로모터의 경우에는 GOD의 발현이 유도되었음을 알 수 있었고(도 2의 B), 또한 한세눌라 폴리모르파 A16 균주의 경우가 DL1의 경우보다 포도당에 의한 억제가 더욱 완화된 것을 알 수 있었다(도 3). 포도당 및 메탄올 복합 액상배지에서 배양 초기 6시간 내에서 GOD발현을 비교한 결과, 메탄올에 의한 CAT 프로모터 발현이 포도당에 의한 발현보다 우수하였으나, 포도당에서의 발현율이 배양 초기에도 상당히 높게 나타나는 것을 볼 수 있어서 포도당 억제가 상당히 완화되는 것을 알 수 있었다.

실시예 4: 한세눌라 폴리모르파 CAT 프로모터에 의한 재조합 hSA의 발현

서열번호 2와 3의 PCR로부터 획득한 CAT 프로모터를 이용하여 재조합 인체혈장 알부민(human serum albumin; hSA) 발현을 검토하였다. hSA 발현용 플라스미드는 도 1b 에 나타낸 바와 같이 플라스미드 pDLMOX-GOD(H)를 제한효소 BamHI과 HindIII로 절단하여 MOX 프로모터와 GOD 유전자를 제거한 후, N-말단과 C-말단에 BglII와 HindIII 제한효소 인식부위를 갖도록 제작한 한세눌라 폴리모르파 CAT 프로모터 DNA 절편을 삽입하여 pCAT-BEH를 얻었다. hSA 유전자는 pYHSA12(+/-)(Kang et al. Biotechnol. Bioengineer. 76, 175-185(2001))으로부터 서열번호 4, 5 및 6의 hSA(UTR+)―forward, hSA(UTR-)―forward, 및 hSA(UTR+/-)―reverse의 각각의 프라이머를 이용하여 EcoRI과 HindIII의 제한효소 인식부위를 갖고, 알부민의 5-UTR(untranslated region, 비번역구간)이 포함된(UTR+) 또는 5-UTR이 포함되지 않은(UTR-) hSA 유전자 단편들을 얻었다. 각각의 hSA 유전자 단편은 EcoRI과 HindIII로 절단하여 얻은 플라스미드 pCAT-BEH에 삽입하여 pCAT-hSA(UTR+)EH와 pCAT-hSA(UTR-)EH를 얻었다.

CAT 프로모터에 의한 hSA의 발현특성은 선별된 형질전환 균주를 YPD-2 또는 YPM-2 복합 액상배지에서 72시간 동안 배양하고 SDS-PAGE를 통하여 발현 분비된 hSA를 검토하였으며, 강 등의 방법(Kang et al. Biotechnol. Bioengineer. 76, 175-185(2001))에 따라 수행하였다.

도 4는 CAT 및 MOX 프로모터에 의하여 hSA가 발현되는 특성을 검토한 결과이다. 재조합 hSA 발현의 경우에도 실시예 3의 재조합 GOD 발현의 경우와 마찬가지로 MOX 프로모터에 의한 발현보다 CAT 프로모터에 의한 발현이 높게 나타났으며 한세눌라 폴리모르파 A16 균주의 발현율이 상대적으로 높게 것을 나타났다. 정량적인 분석결과, CAT 프로모터의 재조합 hSA의 발현율이 최소 2배에서 최대 3배 이상 높게 나타났다. 그림에 나타난 바와 같이, 두 프로모터의 발현 양상이 서로 상이함을 볼 수 있는데, MOX 프로모터의 경우에는 배양시간에 따라서 발현율이 증가하지만 CAT 프로모터의 경우에는 배양 초기의 발현율이 상대적으로 높은 것을 알 수 있다.

도 4의 B는 hSA 발현시 알부민 구조 유전자 상부의 비번역 구간인 5-UTR의 존재 유무가 재조합 단백질 발현에 미치는 영향을 검토한 결과이다. 허 등(Heo et al. FEMS Yeast Res. 4, 175-184(2003))과 강 등(Kang et al. Biotechnol. Bioengineer. 76, 175-185(2001))의 결과에서 MOX 프로모터로부터 hSA를 발현할 때에 5-UTR이 없는 경우의 발현율이 높았으나, 글리세르알데히드 3-인산 탈수소효소(glyceraldhyde 3-phosphate dehydrogenase) 프로모터의 경우에는 5-UTR이 존재하는 경우의 발현율이 높은 것으로 보고하였다. 본 발명의 경우, CAT 프로모터는 MOX 프로모터의 경우와 같이 5-UTR이 없는 경우가 재조합 단백질 발현에 효과적인 것으로 나타났다. 이들의 결과로 볼 때, 메탄올 대사와 관련된 프로모터의 경우에는 발현하고자 하는 단백질의 5-UTR이 없는 경우가 단백질 발현에 효과적임을 예측할 수 있으며, 이는 특정 대사관련 단백질 번역 프로세스가 그들의 프로모터와 구조 유전자 사이의 특정인자로부터 규칙성 있게 영향을 미치기 때문으로 추정된다.

실시예 5: 한세눌라 폴리모르파 CAT 프로모터에 의한 재조합 GFP의 발현

상기 확보된 CAT 프로모터로부터 또 다른 재조합 단백질인 녹색형광단백질(Green Fluorescent Protein; GFP)을 발현하기 위해 도 1c에 나타낸 바와 같이 플라스미드 pDLMOX-GOD(H)를 제한효소 HindIII로 절단하여 GOD 유전자를 제거하고 여기에 박과 최(Nok-Hyun Park and Wonja Choi, Yeast, 19, 1057-1066(2002))로부터 제공받은 pUC19/yEGFP3 플라스미드를 서열번호 7과 8 프라이머로 PCR에 의하여 제한효소 HindIII 인식부위가 삽입된 GFP DNA 단편을 삽입하였으며, 이로부터 MOX 프로모터 발현용 플라스미드 pDLMOX-yEGFPm을 얻었다. 그리고 CAT 프로모터 발현용 플라스미드 pDLCATp-yEGFPm은 pDLMOX-yEGFPm을 제한효소 BamHI과 HindIII로 절단하여 얻은 벡터 DNA 단편에 플라스미드 pHPCATp-GOD를 제한효소 BglII와 HindIII로 처리하여 얻은 한세눌라 폴리모르파 CAT 프로모터 유전자 단편을 삽입하여 얻었다.

CAT 프로모터에 의한 GFP의 발현 특성은 선별된 형질전환 균주를 YPD-2 혹은 YPM-2 복합 액상배지에서 72시간 동안 배양하여 재조합 단백질의 발현정도를 일정 세포농도를 기준으로 형광광도계(Spectrofluorophotometer, RF 5310PC, Shimadzu, Japan)를 사용하여 결정하였다. GFP의 형광측정을 위한 여기 흡광도 파장(excitation wavelength)은 488 nm이었고 방출 흡광도 파장(Emission wavelength)은 510 nm이었다. 형광 현미경을 이용한 발현 검토는 Carl Zeiss Laser scanning system (LSM 510 META, Carl Zeiss GmbH, Germany)을 이용하였다. 여기 및 방출파장은 형광광도계 분석조건과 동일하였다.

도 5는 CAT 및 MOX 프로모터에 의한 재조합 GFP의 발현 특성을 검토한 결과이다. 형광 현미경에 의한 관찰로부터 동일한 배양조건에서 두 프로모터간의 발현 차이를 쉽게 확인할 수 있고 A16의 경우에 그 차이가 매우 명확하게 나타남을 알 수 있었다. 특히 형광 흡광광도기에 의한 정량적인 결과를 보면, CAT 프로모터에 의한 GFP의 발현율이 MOX 프로모터의 경우 보다 1.5배 이상 높게 나타났다. 서던 블럿팅에 의한 GFP 발현 카세트의 도입 카피 수를 검토한 결과, MOX 프로모터의 경우가 3카피이고 CAT 프로모터의 경우가 2카피로 나타나서 이들의 카피 수를 발현율과 함께 평가할 때에 총 발현율은 CAT 프로모터가 2배 이상 높은 것으로 나타났다.

위의 결과들을 종합적으로 보면, 본 발명에서 제공하는 CAT 프로모터에 의한 재조합 단백질의 발현 시스템은 MOX 프로모터보다 최대 3배 이상 높게 나타났다. 그리고 CAT 프로모터는 메탄올 탄소원에 의한 발현 유도뿐 만 아니라, 특히 낮은 농도의 포도당 탄소원 존재 하에서도 발현이 매우 우수하므로 포도당을 탄소원으로 이용한 발효공정에서 재조합 단백질 생산에 매우 효과적임을 알 수 있다. 또한, 프로모터의 발현 양상이 MOX 프로모터와 달리 유도 초기에 강하게 나타나므로 세포 배양시간을 단축할 수 있어 MOX 프로모터의 경우에서 지적되는 장시간 배양에 따른 발현된 단백질의 변성을 방지할 수 있는 장점을 지니고 있다.

즉 단백질 가수분해에 의한 분해가 야기되는 경우에는 배양시간을 단축하여 생성된 재조합 단백질의 배양 체류시간을 줄이는 것이 유리한데, 실제 산업공정에서 MOX 프로모터에 의한 재조합 단백질 생산 공정이 재조합 단백질의 발현 수율을 높이기 위하여 장시간의 배양을 요구하는 단점이 지적되고 있어서, 이와 같은 경우들에 대한 해결방안으로 본 발명에서 제공하는 CAT 프로모터가 매우 효과적인 것으로 평가된다.

본 발명의 프로모터는 메탄올, 포도당, 글리세롤에 의해 유도되는 강력한 프로모터로, 상기 프로모터를 이용할 경우, 한세눌라 속, 피키아 (Pichia) 속, 칸디다 (Candia) 속 또는 토루로피시스 (Torulopsis) 속 등의 효모를 포함하는 다양한 세포에서 의학, 산업적으로 유용한 목적 단백질을 높은 수율로 획득할 수 있다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> A novel Catalase promoter and the method of producing recombinant proteins using the same <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1252 <212> DNA <213> Hansenula polymorpha <220> <221> promoter <222> (1)..(1252) <223> Promoter of Hansenula polymorpha catalase <400> 1 gatctccaag gcgtctgtgg tggacgacgt gattgcgtcg aacgagattc tgtacaacga 60 caagctgggc agaaaaatcg accactgcat tgtgatcaag tacctgaatg cagttggaga 120 ctccaaggtt gcaatggacg agtactattc cgagctaatg ttaggaggcc acaacagaat 180 cagcattcac aacgtttgcg aggactcgtt gctagccaca cctttaatca tcgatttgct 240 ggtcatgacc gagtttttgt ccagagtcac ctacaaaaag gtttctgaca acaagtatgc 300 cgacatgtac tctgtgctga gtttcttgag ctactggctc aaggctccgc ttactcggcc 360 gggctaccag gccatcaacg ggctcaacaa gcagagacag ggcctggaca acttcttgcg 420 tatccttatt ggtctcgagc ctttggacga acttaggttt gaagagagac tggtgtaatt 480 taacaagact taatttcaaa ctcttccaaa cactcaatca ccgttttcag gttctcgatg 540 gtgttgttcg ccgcgaccct aatcgctctc tcggaaactc cgtcgaacgt gatggtgagg 600 acgttgtcgt cgacggtgta aacagcctgc agctcgctgg gcttgagcgt cgggtcgggc 660 tggagcgagc tctgtgcaat gcgggcctgt tttgccgagc aaaatgggat ccagtacgat 720 ctagacggtc agacaacaac aatgacgact acttacagtt tgtgagagaa caccataaga 780 aaaagattgt tgcacagccc gctttgagaa ggaaataacc gtagcctata tcagtcactc 840 ctcgcaccgc aacgattctg aaatgattgc gatttcctaa tccagcctta caaattcaag 900 caacccaatt ggccccacaa acgcagcaag tccaaaaaat gtgctcgaca agtttgtgga 960 ttttgctgta ccgcggcggg tgaacgatgc aaagtgctgt ttcttgaaga caattggtca 1020 tcagcattca gcattcagca tggatctcgt gatcggagag caactgtaga gtgactctta 1080 ttaattatgc aaccaagtcc agaaactctc ctcagatatg tcagcaattt tgaaactagt 1140 aaaataatag tctatgcatg caggcggggg caacagtact aattgaagcc taagcaaaaa 1200 tatataaagg ctcccggccg caccccaact tggctaatca ctgttgaaca aa 1252 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying the promoter of Hansenula polymorpha catalase <400> 2 gatctccaag gcgtctgtgg tgga 24 <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying the promoter of Hansenula polymorpha catalase <400> 3 cccaagcttt ttgttcaaca gtgattagcc 30 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying the human serum albumin (UTR+) <400> 4 ccggaattcg gcacgaggtc aacccc 26 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for amplifying the human serum albumin (UTR-) <400> 5 ccggaattca tgaagtgggt aacc 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for amplifying the human serum albumin (UTR+/-) <400> 6 ggaaagcttg gtaggctgag atgc 24 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying the green flourescent protein <400> 7 gccaagctta tgtctaaagg tgaagaa 27 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer for amplifying the green flourescent protein <400> 8 ggcaagcttt tatttgtaca attcatc 27

Claims (6)

1. 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열; 또는

   뉴클레오타이드 서열에 상보적인 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 프로모터 핵산 분자.
2. 제1항의 프로모터 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터.
3. 제2항의 벡터로 형질전환된 숙주세포.
4. 제3항에 있어서, 효모인 숙주세포.
5. 제4항에 있어서, 한세눌라 속, 피키아 (Pichia) 속, 칸디다 (Candia) 속 또는 토루로피시스 (Torulopsis) 속인 숙주세포.
6. 제1항의 프로모터 핵산 분자와 목적 단백질을 코딩하는 핵산 분자가 작동적으로 연결된 핵산서열을 포함하는 벡터를 숙주세포로 형질전환하는 단계; 메탄올, 포도당, 글리세롤 또는 이들의 배합물의 존재 하에 목적 단백질의 발현을 유도하는 단계; 및 목적 단백질을 분리 정제하는 단계를 포함하는 목적 단백질의 생산 방법.

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