KR20060062713A - 펌프와 밸브를 이용한 혼성화 챔버의 교반 장치 - Google Patents

펌프와 밸브를 이용한 혼성화 챔버의 교반 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혼성화 챔버, 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널, 상기 에어 체널상에 설치된 두개의 밸브, 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널, 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프를 구비하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 장치 및 이를 이용한 교반 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, DNA chip을 이용한 혼성화(hybridization)시 샘플을 보다 효율적으로 확산(diffusion)시켜 프로브(probe)와 표적(target) 물질 간에 혼성화 효과를 증대시킬 수 있다.

Description

펌프와 밸브를 이용한 혼성화 챔버의 교반 장치{Hybridization chamber agitation device using a pump and valves}
도 1은 종래기술로서 어피메트릭스(Affymetrix)사의 혼성화 장치(Hybstation)을 나타낸 사진이다.
도 2는 종래기술로서 테칸(Tecan)사의 혼성화 장치를 나타낸 사진이다.
도 3은 종래기술로서 회전식 오븐 방식의 혼성화 장치를 나타낸 도면이다.
도 4는 종래기술로서 카트리지 회전 방식의 혼성화 장치를 나타낸 도면이다.
도 5는 종래기술로서 메모렉(Memorec)사의 엑티브 순환 방식을 이용한 혼성화 장치를 나타낸 도면이다.
도 6은 종래기술인 테칸사의 혼성화 장치를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 장치를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 방법의 순차적 흐름을 나타낸 순서도이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 푸싱 타임(pusing time)과 브레이크 타임(break time)에 따른 혼성화 칩의 강도(intensity)의 CV 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 바이오칩의 혼성화 챔버에 사용되는 교반 장치에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 혼성화 챔버내 용액의 효율적인 교반 장치 및 이를 이용한 교반 방법에 관한 것이다.
바이오칩(bio chip)이란 기질상에 분석하고자 하는 DNA, 단백질 등의 생분자(biomolecules) 프로브를 고밀도로 부착시킨 칩으로서, 상기 프로브와 샘플내 표적물질과의 혼성화(hybridization) 여부를 검출하여 유전자 발현 양상, 유전자 결함, 단백질 분포, 반응 양상 등을 분석해낼 수 있다. 바이오칩은 프로브의 종류에 따라 DNA 칩이나 단백질칩 등으로 나누고, 프로브의 부착형태에 따라 고체 기질상에 부착된 마이크로어레이 칩(microarray chip)과 미세채널상에 부착된 랩온어칩(lab-on-a-chip)으로 나눌 수 있다. 이러한 바이오칩에서는, 샘플내 표적물질과 프로브간의 혼성화 챔버내에서 효과적인 혼성화를 이루기 위해 교반 시스템이 필요하다.
종래의 혼성화 시스템에 관한 특허들은 크게 2가지로 나누어서 펌프(pump)를 이용한 방식으로서 막 펌프(membrane pump) 2개를 이용한 Tecan 특허(US 20030013184)와 플로우 시스템 펌프(flow system pump)를 이용한 Affymetrix 특허(US 6391623)가 있으며, 공기(air)와 용액(solution)을 이용한 혼합 방식으로서 회전식 오븐(rotary oven)을 사용한 EP 0933126과 회전식 카트리지(catridge)를 이용한 US 20020001803이 있다.
종래 affymetrix 사의 특허(US 6391623)는 도 1에서 보여지듯이, 혼성화 챔 버과 유체 전달 시스템에 의해 펌프와 연결되어 있고 유체의 순환에 의해 혼성화과 촉진된다. 그러나, 어러한 하이브스테이션(Hybstation)을 이용한 혼성화의 경우 연동 펌프(Peristaltic Pump)와 순환 유체 채널을 사용하기 때문에 투입샘플량이 많다. 이러한 단점으로 인하여 실제의 경우 rotary oven을 사용하여 16시간 hybridization 후 hybstation은 washing과 Drying용으로 장비를 운용하고 있다.
종래 Tecan 사의 특허(US 20030013184)는 도 2에서 보여지듯이, 혼성화 챔버의 양말단에 2개의 채널이 연결되어 있으며, Target solution을 chip표면에 probe와 더 잘 혼성화하기 위하여 각 채널별로 agitation용 membrane과 2개의 micro pump가 필요하다. 그러나, Chamber내 agitation을 효과적으로 주기 위하여 Target solution을 덮개관까지 채우고 sample을 mixing함으로써 chamber의 오염이 많다.
종래 EP0933126는 도 3에서 보여지듯이 회전식 오븐(rotary oven) 방식을 사용하고 있다. 이는 Affymetrix hybstation에서 실제적으로 사용하는 방식으로 chip contents마다 차이가 있으나 Rotary oven에서 16시간 동안 hybridization 시킨다.
종래 US20020001803는 도 4에서 보여지듯이 카트리지(cartridge)를 사용하여 회전하는 방식으로서, Chip cartridge제작 후 centrifugal force를 이용하여 Hybridization을 실시한다.
종래 Memorec A-hyb는 도 5에서 보여지듯이, 격막 펌프(Diaphragm pump)를 사용하여 액티브 순환(Active circulation)시키는 방식이나, 샘플이 순환되어야 하므로 투입 sample량(약 220ul)이 많다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 통합된 채널상의 하나의 펌프와 두개의 밸브를 이용하면 효과적으로 혼성화 챔버를 교반 할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 샘플량을 적게 하면서도 혼성화 챔버내의 용액을 효과적으로 혼성화시킬 수 있는 교반장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 교반 장치 이용한 혼성화 챔버내 용액의 교반 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 혼성화 챔버, 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널, 상기 에어 체널상에 설치된 두개의 밸브, 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널, 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프를 구비하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 장치 및 이를 이용한 교반 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혼성화 챔버, 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널, 상기 에어 체널상에 설치된 두개의 밸브, 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널, 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프를 구비하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 장치를 제공한다.
본 발명의 교반 장치에 있어서, 상기 혼성화 챔버내의 용액에서 서로 혼성화되는 물질들은 교반에 의한 촉진되는 혼성화를 필요로 하는 어떤 물질도 가능하나, 바람직하게는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), 펩타이드 및 단백질로 구성된 군에서 선택된 생물분자인 것을 특징으로 한다. 이러한 생물분자들 중 일부는 프로브로서 혼성화 챔버내의 고체 기질(substrate)에 고정화되고, 다른 일부는 표적물질로서 용액내에 포함되어 질 수 있다.
본 발명의 교반 장치에 있어서, 상기 혼성화 챔버는 교반 장치에 고정되어 구비될 수도 있으나, 바람직하게는 별도로 분리가능한 카트리지 형태로 제작되어 교반 장치에 장착되는 것을 특징으로 한다. 이때, 카트리지 내에는 프로브 분자들이 고정된 고체 기질(substrate), 즉 바이오 칩이 삽입될 수 있다.
본 발명의 교반 장치에 있어서, 상기 밸브는 전기적 신호에 의해 개폐될 수 있는 어떤 밸브도 가능하나, 바람직하게는 예컨대 bio-chemvalve사의 series 075P와 같은 solenoid valve 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 교반 장치에 있어서, 상기 펌프는 전기적 신호에 의해 에어 채널내의 공기를 상승시키거나 하강시킬 수 있는 어떤 펌프도 가능하나, 바람직하게는 예컨대 uniflow사의 stepping motor방식의 micro pump 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 교반장치의 두개의 밸브중 하나를 개방하고 다른 하나를 폐쇄시킨 상태에서 펌프를 상승시키고, 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키고, 상기 밸브의 개폐 상태를 그대로 유지하면서 펌프를 상승시키고, 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키는 단계들을 포함하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 방법을 제공한다.
본 발명의 교반 방법에서, 펌프를 상승 또는 하강시킨다는 의미는 펌프에 의해 공기를 밀어주거나 당겨준다는 것을 의미하며, 펌프 자체의 상승 또는 하강을 의미하는 것은 아니다.
본 발명의 교반 방법은 종래의 혼성화 챔버내 용액의 순환(circulation)에 의한 교반방식과 달리 챔버내 용액이 채널을 통한 순환(circulation)되지 않고 에어 채널내의 공기에 의해 양 말단이 폐쇄된 시스템(closed system)에서 교반되는 것을 특징으로 한다. 따라서, 종래와 달리 많은 샘플량을 요하지 않고 적은 샘플만으로도 혼성화 반응을 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 교반 방법에 있어서, 펌프롤 상승한 후 다시 펌프를 하강하기까지의 브레이크 타임(break time)이 1 내지 3분인 것을 특징으로 한다. 상기 시간범위의 브레이크 타임을 두는 것이 혼성화 효율을 높이고 혼성화 칩의 강도(intensity)의 CV 변화를 줄이는데 유리하다.
본 발명은 hybridization system에 있어 chip에 target 용액을 효과적으로 diffusion하기 위한 방식에 관한 것으로서, target 용액이 chip에 고정화되어있는 probe에 효과적으로 binding할 수 있도록 micro pump의 상하이동과 valve를 조절하여 closed system 내에서 용액에 흐름을 줄 수 있는 방식이다.
본 발명은 pump의 크기에 상관이 없으나, micro array나 lab-on-a-chip 등에 사용하기에 적합하도록 valve 및 pump의 크기는 수-수십 μm로 소형화하는 것이 바람직하다.
이하, 도면을 참조하여, 본 발명을 상세히 설명한다.
도 6은 종래기술인 테칸사의 혼성화 장치를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 5을 참조하면, 종래기술인 테칸사의 혼성화 장치는 혼성화챔버(1)의 양말단에 2개의 채널(2, 2')이 있으며, 채널과 혼성화 챔버는 오염을 방지하기 위해 2개의 막(membranes)(3, 3')으로 가로막혀있고, 각 채널은 말단에 각각 하나씩 2개의 펌프(4, 4')와 연결되어 있다. 펌프에 가해진 기계적 힘은 채널내 공기를 밀어내고 막을 통해 혼성화 챔버내 용액을 교반하게 된다. 2개의 펌프로 힘을 전달하므로 정확한 제어가 어려워 채널 오염의 우려가 있기 때문에 이를 차단하는 막(membranes)이 필수적이다.
도 7은 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 장치를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 7을 참조하면, 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 장치는 혼성화 챔버(1), 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널(2, 2'), 상기 에어 체널상에 설치된 두개의 밸브(3, 3'), 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널(4), 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프(5)를 구비한다. 본 발명은 도 6의 테칸사의 혼성화 장치와 달리, 샘플에 agitation을 주기 위하여 2개의 syringe pump를 사용하지 않고 3-way valve를 연결하여 한개의 펌프로 bubble의 흐름을 제어한다. 따라서, 펌프를 하나만 사용하므로 단가가 저렴해지고, 펌프 하나만을 제어하면 되므로 채널 오염의 우려가 적어 막(membranes)이 필요 없다.
도 8은 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 방법의 순차적 흐름을 나타낸 순서도이다. 도 8을 참조하면, 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 방법은 본 발명의 교반장치의 두개의 밸브중 하나를 개방(오픈 원)하고 다른 하나를 폐쇄(+표시된 원)시킨 상 태에서 펌프를 상승시키는 제 1 단계(도 8의 1), 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키는 제 2 단계(도 8의 2), 상기 밸브의 개폐 상태를 그대로 유지하면서 펌프를 상승시키는 제 3 단계(도 8의 3), 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키는 제 4 단계(도 8의 4)를 포함한다. 이러한 4단계의 사이클이 반복되면서 혼성화 챔버내의 용액을 교반시키게 된다. 단계별로 혼성화 챔버내의 채워진 부분의 좌우 이동은 용액의 이동을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: Standing과 agitation에 따른 용액 diffusion time 측정
아크릴재질의 구조물을 이용하여 카트리지를 삽입할 수 있는 구조물을 제작하였다. 덮개와 카트리지를 밀착시키는 과정에 있어 높이를 150um가 되게 sealing pad를 대고 이를 나사를 이용하여 고정하고 덮개의 양 hole에 2개의 valves(bio-chemvalve사의 series 075P)와 1개의 pump(uniflow사의 stepping motor방식)를 연결하여 도 7과 같은 본 발명의 교반장치를 완성하였다. 완성된 구조물의 inlet hole에 DI water 45ul를 넣고 1ul의 잉크를 넣은 후 agitation pump를 연결하였다. 실험진행에 있어 pump의 속도를 달리하여 pushing-pull을 반복하여 잉크의 확산을 관측하였다.
직경 17.3mm, 높이 150um의 정사각형의 chamber를 탈이온수(DI water)로 채운 후 ink 5ul를 넣고 교반 방식에 따른 확산시간을 상기기재 방식을 적용하여 측 정하였다. 펌프를 한번 상승할때의 부피인 Push volume은 4ul로 고정하고, Push time은 변화하여 agitation rate를 변화시켰다.
표 1은 교반 속도에 따른 확산시간의 변화를 기록한표이다.
[표 1]
Figure 112004057268253-PAT00001
상기 표 1로부터, Agitation 속도에 따라 sample의 diffusion 속도가 크게 차이가 남을 알 수 있다.
실시예 2: Pushing time / break time에 따른 hybridization chip intensity CV 변화
실시예 1에서 사용한 교반장치를 사용하여, Pushing time / break time에 따른 hybridization chip intensity CV 변화를 측정하였다. 이 때 사용된 chip은 amine을 silicon wafer에 코팅한 후 제작된 구조물에 맞게 자른 후 spotter를 이용하여 동일 probe(sequence : TGT TCT CTT GTC TTG)를 고정화하였다. 이렇게 제작된chip을 아크릴구조물에 고정하기 위하여 chip의 안정성을 증가시키기 위하여 플라스틱구조물에 접착제를 이용하여 카트리지의 형태로 만들었다 (한국 특허출원번호 2004-0039981 참조). 이를 아크릴구조물에 장착한 후 target solution (Cy3가 labeling된 probe(CAA GAC AAG AGA ACA)를 hybridization buffer를 혼합한 용액)을 chamber에 주입한 후 pump를 이용하여 agitation을 하였다. hybridization 과정 종료 후 cartridge를 3X SSPET buffer와 1X SSPET buffer로 각 5분간 washing한 후 laser scanner를 이용하여 chip의image를 분석하였다. 분석 후 각 spot의 intensity를 정량하고 이를 근거로 spot간 intensity CV를 측정하였다. break time은 pump를 이용하여 air를 밀어준 후 또 다시 pump가 air를 밀어주기까지 걸리는 시간이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 푸싱 타임(pusing time)과 브레이크 타임(break time)에 따른 혼성화 칩의 강도(intensity)의 CV 변화를 나타낸 그래프이다. CV는 coefficient variation으로서 낮을 수록 좋다. 도 9에서 보여지듯이, 4ul의 volume을 push할 때 Push time = 0.1sec, Break time = 2.3min으로 X값을 설정하였을 때 Spot intensity CV와 PM/MM ratio CV가 최소값을 갖는 것을 확인할 수 있었다. break time은 있는 것이 좋으며, 1-3min 정도가 바람직하였다.
실시예 3: Hybstation system 적용실험
본 발명의 교반 방식(hybstation hybridization 방식)을 MODY3 chip에 적용하여 기존의 커버 슬라이드 patch방식과 비교하였다. 실험에 사용된 프로브들은 아래 표 2와 같다.
[표 2]
Figure 112004057268253-PAT00002
먼저, 표적 핵산 MODY3에 대한 상기 프로브들을 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 완성하였다. 즉, 분자량 10000의 폴리에틸렌글리콜(polyethylenglycol, PEG), 0.025M Sodium carbonate buffer(pH 10), formamide를 1:1:2로 혼합한 용액에, WP(wild probe) 또는 MP(mutant probe)를 넣은 다음, 그 최종 용액을 실리콘 wafer 표면에 바이오로봇 프린터 (모델PixSys 5500, Cartesian Technologies, Inc., CA, 미국)를 이용하여 스폿팅하였다. 그런 다음, 37℃에서 4 시간 동안 습한 인큐베이터에서 방치하고, 이어 배경 노이즈의 제어에 필요한 공정, 즉, 표적 핵산이 wafer 표면에 부착하지 않도록 하기 위해 스폿팅되지 않은 위치의 wafer 표면 아민기가 음전하를 띄도록 반응을 실행하고 건조기에 보관하였다.
본 실시예에서는, 표적 핵산(tgggttctgccctttgcgctgggatggtgaagcttccagcc) 의 몸체 또는 양말단에 형광물질로서 Cy3-dUTP를 표지하였다. 상기와 같이 표지된 표적 핵산의 혼성화 조건은 0.1% 6xSSPET (0.1% Trition X-100을 포함하는 Saline Sodium Phosphate EDTA Buffer) 용매에 용해된 187nM 농도의 표적 핵산과 마이크로어레이를 37℃에서 16 시간 동안 반응시킨 chip과, hybstation을 이용하여 반응시킨 chip을 0.05 % 6xSSPET와 0.05 % 3xSSPET로 각 5 분씩 상온에서 세척하고, 5 분 간 상온에서 건조시킨 후, 스캐닝하였다. 이 때 스캐닝은 액손 (Axon) 스캐너 (모델 GenePix 4000B, Axon Instrument, Inc., CA, 미국)를 이용하였고, 스캐닝 데이터를 해석하는 프로그램으로는 동사의 진픽스 프로 3.0 (GenePix Pro 3.0) 프로그램을 사용하여 비율 성분과 강도 성분을 계산하였다. 표 3은 양 방식의 실험조건을 비교한 표이다.
[표 3]
Figure 112004057268253-PAT00003
Test chip을 기존 방식과 본 발명의 Hyb 방식마다 각각 20장씩 시험하여 spot intensity와 PM/MM ratio의 평균과 CV를 구한 결과, 표 4와 같다
[표 4]
Figure 112004057268253-PAT00004
표 4에서 보여지듯이, 본 발명의 신규 hyb 방식이 기존 reference 방식보다 intensity CV와 PM/MM ratio CV가 훨씬 적은 것을 알 수 있었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 DNA chip을 이용한 혼성화(hybridization)시 샘플을 보다 효율적으로 확산(diffusion)시켜 프로브(probe)와 표적(target) 물질 간에 혼성화 효과를 증대시킬 수 있다. 또한, hybstation system에서 상기 방식을 사용함으로써 적은 양의 sample(약 45ul)로 agitation 방식을 이용하여 hybridization 할 수 있으며, 두개의 pump를 이용한 기존의 hybridization system에 비하여 저가의 system을 구축할 수 있으며, pump와 valve만으로 closed system내에 mixing이 가능함으로써 기존의 Diaphragm pump 및 Peristaltic Pump를 이용한 hybridization system을 대체할 수 있다.

Claims (8)

  1. 혼성화 챔버, 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널, 상기 에어 체널상에 설치된 두개의 밸브, 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널, 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프를 구비하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 혼성화 챔버내의 용액에서 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), 펩타이드 및 단백질로 구성된 군에서 선택된 생물분자들이 서로 혼성화되는 것을 특징으로 교반 장치.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 혼성화 챔버는 분리가능한 카트리지 형태로 장착되는 것을 특징으로 하는 교반 장치.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 밸브는 솔레노이드(solenoid) 밸브인 것을 특징으로 하는 교반 장치.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 펌프는 스테핑 모터(stepping motor)방식의 마이크로 펌프인 것을 특징으로 하는 교반 장치.
  6. 제 1항의 교반장치의 두개의 밸브중 하나를 개방하고 다른 하나를 폐쇄시킨 상태에서 펌프를 상승시키고, 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키고, 상기 밸브의 개폐 상태를 그대로 유지하면서 펌프를 상승시키고, 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키는 단계들을 포함하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 혼성 챔버내 용액이 채널을 통한 순환(circulation)없이 폐쇄 시스템(closed system)에서 교반되는 것을 특징으로 하는 교반 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 펌프롤 상승한 후 다시 펌프를 하강하기까지의 브레이크 타임(break time)이 1 내지 3분인 것을 특징으로 하는 교반 방법.
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