KR100601975B1 - 펌프와 밸브를 이용한 혼성화 챔버의 교반 장치 - Google Patents

펌프와 밸브를 이용한 혼성화 챔버의 교반 장치 Download PDF

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Abstract

본 발명은 혼성화 챔버, 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널, 상기 에어 체널상에 설치된 두개의 밸브, 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널, 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프를 구비하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 장치 및 이를 이용한 교반 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, DNA 칩을 이용한 혼성화(hybridization)시 샘플을 보다 효율적으로 확산(diffusion)시켜 프로브(probe)와 표적(target) 물질 간에 혼성화 효과를 증대시킬 수 있다.

Description

펌프와 밸브를 이용한 혼성화 챔버의 교반 장치{Hybridization chamber agitation device using a pump and valves}
도 1은 종래기술로서 어피메트릭스(Affymetrix)사의 혼성화 장치(Hybstation)을 나타낸 사진이다.
도 2는 종래기술로서 테칸(Tecan)사의 혼성화 장치를 나타낸 사진이다.
도 3은 종래기술로서 회전식 오븐 방식의 혼성화 장치를 나타낸 도면이다.
도 4는 종래기술로서 카트리지 회전 방식의 혼성화 장치를 나타낸 도면이다.
도 5는 종래기술로서 메모렉(Memorec)사의 엑티브 순환 방식을 이용한 혼성화 장치를 나타낸 도면이다.
도 6은 종래기술인 테칸사의 혼성화 장치를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 7은 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 장치를 개략적으로 나타낸 도면이다.
도 8은 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 방법의 순차적 흐름을 나타낸 순서도이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 푸싱 타임(pusing time)과 브레이크 타임(break time)에 따른 혼성화 칩의 강도(intensity)의 CV 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 바이오칩의 혼성화 챔버에 사용되는 교반 장치에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 혼성화 챔버내 용액의 효율적인 교반 장치 및 이를 이용한 교반 방법에 관한 것이다.
바이오칩(bio chip)이란 기질상에 분석하고자 하는 DNA, 단백질 등의 생분자(biomolecules) 프로브를 고밀도로 부착시킨 칩으로서, 상기 프로브와 샘플내 표적물질과의 혼성화(hybridization) 여부를 검출하여 유전자 발현 양상, 유전자 결함, 단백질 분포, 반응 양상 등을 분석해낼 수 있다. 바이오칩은 프로브의 종류에 따라 DNA 칩이나 단백질칩 등으로 나누고, 프로브의 부착형태에 따라 고체 기질상에 부착된 마이크로어레이 칩(microarray chip)과 미세채널상에 부착된 랩온어칩(lab-on-a-chip)으로 나눌 수 있다. 이러한 바이오칩에서는, 샘플내 표적물질과 프로브간의 혼성화 챔버내에서 효과적인 혼성화를 이루기 위해 교반 시스템이 필요하다.
종래의 혼성화 시스템에 관한 특허들은 크게 2가지로 나누어서 펌프(pump)를 이용한 방식으로서 막 펌프(membrane pump) 2개를 이용한 Tecan 특허(US 20030013184)와 플로우 시스템 펌프(flow system pump)를 이용한 Affymetrix 특허(US 6391623)가 있으며, 공기(air)와 용액(solution)을 이용한 혼합 방식으로서 회전식 오븐(rotary oven)을 사용한 EP 0933126과 회전식 카트리지(catridge)를 이용한 US 20020001803이 있다.
종래 affymetrix 사의 특허(US 6391623)는 도 1에서 보여지듯이, 혼성화 챔버과 유체 전달 시스템에 의해 펌프와 연결되어 있고 유체의 순환에 의해 혼성화과 촉진된다. 그러나, 어러한 하이브스테이션(Hybstation)을 이용한 혼성화의 경우 연동 펌프(Peristaltic Pump)와 순환 유체 채널을 사용하기 때문에 투입 샘플량이 많다. 이러한 단점으로 인하여 실제의 경우 회전식 오븐을 사용하여 16시간 혼성화 후 하이브스테이션은 세정과 건조용으로 장비를 운용하고 있다.
종래 Tecan 사의 특허(US 20030013184)는 도 2에서 보여지듯이, 혼성화 챔버의 양말단에 2개의 채널이 연결되어 있으며, 표적 용액을 칩 표면에 프로브와 더 잘 혼성화하기 위하여 각 채널별로 교반용 막과 2개의 마이크로 펌프가 필요하다. 그러나, 챔버내 교반을 효과적으로 주기 위하여 표적 용액을 덮개관까지 채우고 샘플을 혼합함으로써 챔버의 오염이 많다.
종래 EP0933126는 도 3에서 보여지듯이 회전식 오븐(rotary oven) 방식을 사용하고 있다. 이는 Affymetrix 하이브스테이션에서 실제적으로 사용하는 방식으로 칩 내용물마다 차이가 있으나 회전식 오븐에서 16시간 동안 혼성화시킨다.
종래 US20020001803는 도 4에서 보여지듯이 카트리지(cartridge)를 사용하여 회전하는 방식으로서, 칩 카트리지 제작 후 원심력을 이용하여 혼성화를 실시한다.
종래 Memorec A-hyb는 도 5에서 보여지듯이, 격막 펌프(Diaphragm pump)를 사용하여 액티브 순환(Active circulation)시키는 방식이나, 샘플이 순환되어야 하므로 투입 샘플량(약 220ul)이 많다.
이에, 본 발명자들은 상기 종래기술들의 문제점들을 극복하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 통합된 채널상의 하나의 펌프와 두개의 밸브를 이용하면 효과적으로 혼성화 챔버를 교반 할 수 있음을 확인하고, 본　발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 주된 목적은 샘플량을 적게 하면서도 혼성화 챔버내의 용액을 효과적으로 혼성화시킬 수 있는 교반장치를 제공하는 데 있다.
본 발명의 다른 목적은 상기 교반 장치 이용한 혼성화 챔버내 용액의 교반 방법을 제공하는데 있다.
본 발명은 혼성화 챔버, 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널, 상기 에어 체널상에 설치된 두개의 밸브, 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널, 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프를 구비하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 장치 및 이를 이용한 교반 방법에 관한 것이다.
본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 혼성화 챔버, 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널, 상기 에어 체널상에 설치된 두개의 밸브, 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널, 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프를 구비하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 장치를 제공한다.
본 발명의 교반 장치에 있어서, 상기 혼성화 챔버내의 용액에서 서로 혼성화되는 물질들은 교반에 의한 촉진되는 혼성화를 필요로 하는 어떤 물질도 가능하나, 바람직하게는 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), 펩타이드 및 단백질로 구성된 군에서 선택된 생물분자인 것을 특징으로 한다. 이러한 생물분자들 중 일부는 프로브로서 혼성화 챔버내의 고체 기질(substrate)에 고정화되고, 다른 일부는 표적물질로서 용액내에 포함되어 질 수 있다.
본 발명의 교반 장치에 있어서, 상기 혼성화 챔버는 교반 장치에 고정되어 구비될 수도 있으나, 바람직하게는 별도로 분리가능한 카트리지 형태로 제작되어 교반 장치에 장착되는 것을 특징으로 한다. 이때, 카트리지 내에는 프로브 분자들이 고정된 고체 기질(substrate), 즉 바이오 칩이 삽입될 수 있다.
본 발명의 교반 장치에 있어서, 상기 밸브는 전기적 신호에 의해 개폐될 수 있는 어떤 밸브도 가능하나, 바람직하게는 예컨대 bio-chemvalve사의 series 075P와 같은 솔레노이드 밸브인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 교반 장치에 있어서, 상기 펌프는 전기적 신호에 의해 에어 채널내의 공기를 상승시키거나 하강시킬 수 있는 어떤 펌프도 가능하나, 바람직하게는 예컨대 uniflow사의 스테핑 모터(stepping motor) 방식의 마이크로 펌프 인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 다른 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 상기 본 발명의 교반장치의 두개의 밸브중 하나를 개방하고 다른 하나를 폐쇄시킨 상태에서 펌프를 상승시키고, 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키고, 상기 밸브의 개폐 상태를 그대로 유지하면서 펌프를 상승시키고, 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키는 단계들을 포함하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 방법을 제공한다.
본 발명의 교반 방법에서, 펌프를 상승 또는 하강시킨다는 의미는 펌프에 의해 공기를 밀어주거나 당겨준다는 것을 의미하며, 펌프 자체의 상승 또는 하강을 의미하는 것은 아니다.
본 발명의 교반 방법은 종래의 혼성화 챔버내 용액의 순환(circulation)에 의한 교반방식과 달리 챔버내 용액이 채널을 통한 순환(circulation)되지 않고 에어 채널내의 공기에 의해 양 말단이 폐쇄된 시스템(closed system)에서 교반되는 것을 특징으로 한다. 따라서, 종래와 달리 많은 샘플량을 요하지 않고 적은 샘플만으로도 혼성화 반응을 수행할 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 교반 방법에 있어서, 펌프롤 상승한 후 다시 펌프를 하강하기까지의 브레이크 타임(break time)이 1 내지 3분인 것을 특징으로 한다. 상기 시간범위의 브레이크 타임을 두는 것이 혼성화 효율을 높이고 혼성화 칩의 강도(intensity)의 CV 변화를 줄이는데 유리하다.
본 발명은 혼성화 시스템에 있어 칩에 표적 용액을 효과적으로 확산하기 위한 방식에 관한 것으로서, 표적 용액이 칩에 고정화되어있는 프로브에 효과적으로 결합할 수 있도록 마이크로 펌프의 상하이동과 밸브를 조절하여 폐쇄 시스템 내에서 용액에 흐름을 줄 수 있는 방식이다.
본 발명은 펌프의 크기에 상관이 없으나, 마이크로 어레이나 랩온어칩 등에 사용하기에 적합하도록 밸브 및 펌프의 크기는 수-수십 μm로 소형화하는 것이 바람직하다.
이하, 도면을 참조하여, 본 발명을 상세히 설명한다.
도 6은 종래기술인 테칸사의 혼성화 장치를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 5을 참조하면, 종래기술인 테칸사의 혼성화 장치는 혼성화챔버(1)의 양말단에 2개의 채널(2, 2')이 있으며, 채널과 혼성화 챔버는 오염을 방지하기 위해 2개의 막(membranes)(3, 3')으로 가로막혀있고, 각 채널은 말단에 각각 하나씩 2개의 펌프(4, 4')와 연결되어 있다. 펌프에 가해진 기계적 힘은 채널내 공기를 밀어내고 막을 통해 혼성화 챔버내 용액을 교반하게 된다. 2개의 펌프로 힘을 전달하므로 정확한 제어가 어려워 채널 오염의 우려가 있기 때문에 이를 차단하는 막(membranes)이 필수적이다.
도 7은 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 장치를 개략적으로 나타낸 도면이다. 도 7을 참조하면, 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 장치는 혼성화 챔버(1), 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널(2, 2'), 상기 에어 체널상에 설치된 두개의 밸브(3, 3'), 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널(4), 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프(5)를 구비한다. 본 발명은 도 6의 테칸사의 혼성화 장치와 달리, 샘플에 교반을 주기 위하여 2개의 주사기 펌프를 사용하지 않고 3-way 밸브를 연결하여 한개의 펌프로 기포의 흐름을 제어한다. 따라서, 펌프를 하나만 사용하므로 단가가 저렴해지고, 펌프 하나만을 제어하면 되므로 채널 오염의 우려가 적어 막(membranes)이 필요 없다.
도 8은 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 방법의 순차적 흐름을 나타낸 순서도이다. 도 8을 참조하면, 본 발명의 혼성화 챔버의 교반 방법은 본 발명의 교반장치의 두개의 밸브중 하나를 개방(오픈 원)하고 다른 하나를 폐쇄(+표시된 원)시킨 상 태에서 펌프를 상승시키는 제 1 단계(도 8의 1), 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키는 제 2 단계(도 8의 2), 상기 밸브의 개폐 상태를 그대로 유지하면서 펌프를 상승시키는 제 3 단계(도 8의 3), 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프를 하강시키는 제 4 단계(도 8의 4)를 포함한다. 이러한 4단계의 사이클이 반복되면서 혼성화 챔버내의 용액을 교반시키게 된다. 단계별로 혼성화 챔버내의 채워진 부분의 좌우 이동은 용액의 이동을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하기로 한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 예시하기 위한 것이므로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는다.
실시예 1: 정치와 교반에 따른 용액 확산 시간 측정
아크릴재질의 구조물을 이용하여 카트리지를 삽입할 수 있는 구조물을 제작하였다. 덮개와 카트리지를 밀착시키는 과정에 있어 높이를 150um가 되게 실링 패드(sealing pad)를 대고 이를 나사를 이용하여 고정하고 덮개의 양 홀(hole)에 2개의 밸브(bio-chemvalve사의 시리즈 075P)와 1개의 펌프(uniflow사의 스테핑 모터 방식)를 연결하여 도 7과 같은 본 발명의 교반장치를 완성하였다. 완성된 구조물의 입구 홀(inlet hole)에 탈이온수 45ul를 넣고 1ul의 잉크를 넣은 후 교반 펌프를 연결하였다. 실험진행에 있어 펌프의 속도를 달리하여 밀고 당기기를 반복하여 잉크의 확산을 관측하였다.
직경 17.3mm, 높이 150um의 정사각형의 챔버를 탈이온수로 채운 후 잉크 5ul를 넣고 교반 방식에 따른 확산시간을 상기기재 방식을 적용하여 측정하였다. 펌프를 한번 상승할 때의 부피인 푸싱(pushing) 부피는 4ul로 고정하고, 푸싱 타임은 변화하여 교반 속도를 변화시켰다.
표 1은 교반 속도에 따른 확산시간의 변화를 기록한표이다.
[표 1]
Figure 112004057268253-pat00001
상기 표 1로부터, 교반 속도에 따라 샘플의 확산 속도가 크게 차이가 남을 알 수 있다.
실시예 2: 푸싱 타임/브레이크 타임에 따른 혼성화 칩 강도 CV 변화
실시예 1에서 사용한 교반장치를 사용하여, 푸싱 타임/브레이크 타임에 따른 혼성화 칩 강도 CV 변화를 측정하였다. 이 때 사용된 칩은 아민을 실리콘 웨이퍼에 코팅한 후 제작된 구조물에 맞게 자른 후 스팟터를 이용하여 동일 프로브(서열: TGT TCT CTT GTC TTG)를 고정화하였다. 이렇게 제작된 칩을 아크릴구조물에 고정하기 위하여 칩의 안정성을 증가시키기 위하여 플라스틱구조물에 접착제를 이용하여 카트리지의 형태로 만들었다 (한국 특허출원번호 2004-0039981 참조). 이를 아크릴구조물에 장착한 후 표적 용액 (Cy3가 표지된 프로브(CAA GAC AAG AGA ACA)를 혼성화 버퍼를 혼합한 용액)을 챔버에 주입한 후 펌프를 이용하여 교반을 하였다. 혼성화 과정 종료 후 카트리지를 3X SSPET 버퍼와 1X SSPET 버퍼로 각 5분간 세정한 후 레이저 스캐너를 이용하여 칩의 이미지를 분석하였다. 분석 후 각 스팟의 강도를 정량하고 이를 근거로 스팟 간 강도 CV를 측정하였다. 브레이크 타임은 펌프를 이용하여 공기를 밀어준 후 또 다시 펌프가 공기를 밀어주기까지 걸리는 시간이다.
도 9는 본 발명의 실시예에서 푸싱 타임(pusing time)과 브레이크 타임(break time)에 따른 혼성화 칩의 강도(intensity)의 CV 변화를 나타낸 그래프이다. CV는 변동계수(coefficient variation)로서 낮을수록 좋다. 도 9에서 보여지듯이, 4ul의 부피를 푸시할 때 푸시 시간 = 0.1sec, 브레이크 타임 = 2.3min으로 X값을 설정하였을 때 스팟 강도 CV와 PM/MM 비 CV가 최소값을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 브레이크 타임은 있는 것이 좋으며, 1-3min 정도가 바람직하였다.
실시예 3: 하이브스테이션 시스템 적용실험
본 발명의 교반 방식(하이브스테이션 혼성화 방식)을 MODY3 칩에 적용하여 기존의 커버 슬라이드 패치 방식과 비교하였다. 실험에 사용된 프로브들은 아래 표 2와 같다.
[표 2]
Figure 112004057268253-pat00002
먼저, 표적 핵산 MODY3에 대한 상기 프로브들을 기판 상에 고정화하여 마이크로어레이를 완성하였다. 즉, 분자량 10000의 폴리에틸렌글리콜(polyethylenglycol, PEG), 0.025M 탄산나트륨 버퍼(pH 10), 포름아미드를 1:1:2로 혼합한 용액에, WP(wild probe) 또는 MP(mutant probe)를 넣은 다음, 그 최종 용액을 실리콘 웨이퍼 표면에 바이오로봇 프린터 (모델 PixSys 5500, Cartesian Technologies, Inc., CA, 미국)를 이용하여 스폿팅하였다. 그런 다음, 37℃에서 4 시간 동안 습한 인큐베이터에서 방치하고, 이어 배경 노이즈의 제어에 필요한 공정, 즉, 표적 핵산이 웨이퍼 표면에 부착하지 않도록 하기 위해 스폿팅되지 않은 위치의 웨이퍼 표면 아민기가 음전하를 띄도록 반응을 실행하고 건조기에 보관하였다.
본 실시예에서는, 표적 핵산(tgggttctgccctttgcgctgggatggtgaagcttccagcc) 의 몸체 또는 양말단에 형광물질로서 Cy3-dUTP를 표지하였다. 상기와 같이 표지된 표적 핵산의 혼성화 조건은 0.1% 6xSSPET (0.1% Trition X-100을 포함하는 Saline Sodium Phosphate EDTA Buffer) 용매에 용해된 187nM 농도의 표적 핵산과 마이크로어레이를 37℃에서 16 시간 동안 반응시킨 칩과, 하이브스테이션을 이용하여 반응시킨 칩을 0.05 % 6xSSPET와 0.05 % 3xSSPET로 각 5 분씩 상온에서 세척하고, 5 분간 상온에서 건조시킨 후, 스캐닝하였다. 이 때 스캐닝은 액손 (Axon) 스캐너 (모델 GenePix 4000B, Axon Instrument, Inc., CA, 미국)를 이용하였고, 스캐닝 데이터를 해석하는 프로그램으로는 동사의 진픽스 프로 3.0 (GenePix Pro 3.0) 프로그램을 사용하여 비율 성분과 강도 성분을 계산하였다. 표 3은 양 방식의 실험조건을 비교한 표이다.
[표 3]
Figure 112004057268253-pat00003
테스트 칩을 기존 방식과 본 발명의 Hyb 방식마다 각각 20장씩 시험하여 스팟 강도와 PM/MM 비의 평균과 CV를 구한 결과, 표 4와 같다
[표 4]
Figure 112004057268253-pat00004
표 4에서 보여지듯이, 본 발명의 신규 hyb 방식이 기존 참고 방식보다 강도 CV와 PM/MM 비 CV가 훨씬 적은 것을 알 수 있었다.
이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따르면 DNA 칩을 이용한 혼성화(hybridization)시 샘플을 보다 효율적으로 확산(diffusion)시켜 프로브(probe)와 표적(target) 물질 간에 혼성화 효과를 증대시킬 수 있다. 또한, 하이브스테이션 시스템에서 상기 방식을 사용함으로써 적은 양의 샘플(약 45ul)로 교반 방식을 이용하여 혼성화 할 수 있으며, 두개의 펌프를 이용한 기존의 혼성화 시스템에 비하여 저가의 시스템을 구축할 수 있으며, 펌프와 밸브만으로 폐쇄 시스템내에 혼합이 가능함으로써 기존의 격막 펌프 및 연동 펌프를 이용한 혼성화 시스템을 대체할 수 있다.

Claims (8)

  1. 혼성화 챔버, 상기 혼성화 챔버의 양 말단에 연결된 두개의 에어 채널, 상기 에어 채널상에 각각 설치된 두개의 밸브, 상기 두개의 에어 채널이 연결된 하나의 통합 에어 채널, 및 상기 통합 에어 채널상에 설치된 하나의 펌프를 구비하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 장치.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 혼성화 챔버내의 용액에서 DNA, RNA, PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), 펩타이드 및 단백질로 구성된 군에서 선택된 생물분자들이 서로 혼성화되는 것을 특징으로 하는 교반 장치.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 혼성화 챔버는 분리가능한 카트리지 형태로 장착되는 것을 특징으로 하는 교반 장치.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 밸브는 솔레노이드(solenoid) 밸브인 것을 특징으로 하는 교반 장치.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 펌프는 스테핑 모터(stepping motor)방식의 마이크로 펌프인 것을 특징으로 하는 교반 장치.
  6. 제 1항의 교반장치의 두개의 밸브중 하나를 개방하고 다른 하나를 폐쇄시킨 상태에서 펌프에 의해 공기를 공급하고, 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프에 의해 공기를 빼내고, 상기 밸브의 개폐 상태를 그대로 유지하면서 펌프에 의해 공기를 공급하고, 상기 밸브의 개폐 상태를 서로 바꾼 상태에서 펌프에 의해 공기를 빼내는 단계들을 포함하는 혼성화 챔버내 용액의 교반(agitation) 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 혼성 챔버내 용액이 채널을 통한 순환(circulation)없이 폐쇄 시스템(closed system)에서 교반되는 것을 특징으로 하는 교반 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 펌프에 의해 공기를 공급한 후 다시 펌프에 의해 공기를 빼내기까지의 브레이크 타임(break time)이 1 내지 3분인 것을 특징으로 하는 교반 방법.
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