KR20060040212A - 표피 성장 인자 수용체에 대한 마우스 단일 클론 항체 및이를 생산하는 하이브리도마 - Google Patents

표피 성장 인자 수용체에 대한 마우스 단일 클론 항체 및이를 생산하는 하이브리도마 Download PDF

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Abstract

본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 대한 마우스 단일 클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 높은 친화도로 인식하고 EGFR이 과발현되는 종양세포의 성장을 억제시킴으로써 암 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있는 EGFR에 대한 마우스 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
표피 성장 인자 수용체, 단일 클론 항체, 하이브리도마

Description

표피 성장 인자 수용체에 대한 마우스 단일 클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마{Hybridoma cell line and monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor}
도 1은 하이브리도마 E86 세포배양 상층액의 표피성장인자 수용체(EGFR ●)와 보바인 세럼 알부민(BSA ○)에 대한 적정곡선(titration curve)을 나타낸 그래프이다.
도 2는 E86 항체의 소단위형(subclass type)기 IgG3임을 이소타이핑 킷트(isotyping kit)로 확인하는 것이다.
도 3은 하이브리도마 E86가 생산하는 EGFR에 대한 단일클론 항체를 단백질 A칼럼을 이용하여 분리 정제 후 10% SDS-PAGE 겔을 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색한 결과를 나타낸 것이다[FT: flow through, W: washing fraction, E: elution fraction].
도 4는 마우스 단일 클론 항체 E86을 이용하여 EGFR 항원과 반응함을 확인하는 면역블롯팅(immunoblotting) 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 경쟁적 ELISA를 통해 본 발명의 단일클론 항체 E86의 항원 결합 친화도를 항체 225와 비교하여 나타낸 것이다.
도 6은 단일클론 항체 E86에 의한 인간 유표피암 A431세포의 시험관내 성장 억제를 나타낸 것이다.
도 7은 단일클론 항체 E86에 의한 누드마우스 내 인간 유표피암 종양세포 A431의 성장억제 효과를 나타낸 것이다.
본 발명은 표피 성장 인자 수용체에 대한 마우스 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 기존 EGFR에 대한 항체보다 높은 친화도로 인식하고, EGFR이 과발현되는 종양세포의 성장을 억제시킴으로써 암 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있는 EGFR에 대한 마우스 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
정상적인 세포증식과 달리 암세포의 경우는 성장인자 및(또는) 수용체의 과다발현 및 성장인자에 의해 조절되는 생화학적 경로의 자율적인 활성화와 같은 많은 요소들에 의해 조절 상실이 유발될 수 있다. 종양발생에 관여하는 수용체의 몇몇 예로는 표피 성장 인자(EGFR), 혈소판-유래 성장 인자(PDGFR), 인슐린-유사 성장 인자(IGFR), 신경 성장 인자(NGFR) 및 섬유아세포 성장인자(FGR)의 수용체가 있다.
표피 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR)는 170 kDa 의 제1형 막횡단 분자이다. EGFR은 다양한 종류의 인간 고체 종양에서 과잉 발현되는 것으로 밝혀져 있다[Mendelsohn, J. Cancer Cells, 7:359(1989), Mendelsohn, J. Cancer Biology, 1:339-344(1990)]. 이의 과잉발현은 폐암, 유방암, 결장암, 위암, 뇌암, 방광암, 두부 및 경부 암, 난소암 및 전립선암에서 관찰되었다. EGFR에 결합하는 리간드, 특히 형질전환 성장인자-알파(TGF-α) 및 표피성장인자(EGF)는 세포 증식과 종양 성장을 유도하는 것으로 입증되었다[Baselga, J., and Mendelsohn, J. Pharmacol Ther, 64:127-154 (1994), Modjtahedi, H., and Dean, C. Intl J Oncol, 4:277-296 (1994), Gullick, W. J. Br Med Bull, 47:87-98 (1991), Salomon, D. S., et al. Crit Rev Oncol Hematol, 19:183-232 (1995)].
따라서, 이러한 EGFR 리간드와 EGFR 사이의 상호작용 차단은 EGFR을 과잉 발현하는 종양치료법에 있어서 종양의 성장 및 생존을 억제할 수 있고, 일부 연구진은 이러한 종양치료방법에서 EGFR과 리간드의 결합을 막는 항체가 유용할 수 있다고 제안하였다[Baselga, J., and Mendelsohn, J. Pharmacol Ther, 64:127-154 (1994), Mendelsohn, J. Cancer Cells, 7:359(1989), Mendelsohn, J. Cancer Biology, 1:339-344(1990), Modjtahedi, H., and Dean, C. Intl J Oncol, 4:277-296 (1994), Tosi, E., et al. Int J Cancer, 62:643-650 (1995)]. 또한, 항EGFR 항체가 수용체에 대한 EGF 및 TGF-α의 결합을 차단하면서 종양세포 증식을 억제한다는 증거도 제시되었다. 하지만, 이와 동시에 항EGFR 항체는 EGF 및 TGF-α 독립적 세포 성장을 억제하지는 않는 것으로 나타났다[Modjtahedi, H., and Dean, C. Intl J Oncol, 4:277-296 (1994)].
이와 같은 발견을 통해, EGFR에 대한 다양한 쥐 및 래트의 단일클론 항체(MAb)가 개발되어 시험관내 및 생체 내에서 종양 세포의 성장을 억제하는 작용에 대하여 시험되었다[Masui, H., et al. Cancer Res, 46:5592-5598 (1986), Masui, H., et al. Cancer Res, 44:1002-1007 (1984), Goldstein, NI., et al. Clin Cancer Res, 1:1311-1318 (1995)]. 이 임상 분야에서 명백하게 가장 발전된 항체는 임클론(ImClone)에서 개발한 C225(Cetuximab)라는 키메라 항체로서, 이 항체는 225라 불리는 마우스 단일클론 항체를 기본으로 하여 마우스의 가변 영역이 인간의 IgG1 불변 영역에 연결된 것이다[Modjtahedi, H., and Dean, C. Intl J Oncol, 4:277-296 (1994)]. 225 항체는 배양된 EGFR-발현 종양 세포주의 증식을 억제할 뿐만 아니라, 흉선 없는 마우스에서 이종이식편으로 배양될 때 생체 내에서 이러한 종양의 증식을 억제할 수 있다[Masui, H., et al. Cancer Res, 46:5592-5598 (1986)]. 그러나, 마우스 단일클론 항체를 인간 치료법에 직접 사용할 경우 마우스 Ig 서열로 인한 마우스 유래의 단백질 존재로 인해 그 항체가 급속히 제거되거나 그 항체에 대한 환자의 면역 반응이 생성될 수 있는 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응의 가능성이 있다. 이러한 단점은 마우스 (혹은 다른 포유동물) 항체의 불변 영역 전체를 인간 항체의 불변 영역으로 대체함으로써 최소화 할 수 있다. 마우스 항체의 불변 영역을 인간 항체의 서열로 대체하는 것을 일반적으로 키메라화라고 한다.
225항체를 키메라화한 C225 항체는 시험관내에서 EGF 매개의 종양세포 성장 을 억제하고 누드마우스의 생체 내에서 인간 종양이 형성되는 것을 억제하는 것으로 증명되어 있다. 또한, 이 항체는 특정 화학치료제와 상승 작용하여 이종이식편 마우스 모델의 생체 내에 존재하는 인간 종양을 근절시키는 것으로 밝혀져 있다[Modjtahedi, H., and Dean, C. Intl J Oncol, 4:277-296 (1994)]. 현재 C225를 이용하여 두경부암, 전립선암 및 폐암에 걸린 환자에 대한 제Ⅱ/Ⅲ단계 임상 시험이 진행 중이며 이러한 연구의 예비 결과를 통해 암 환자에서 효과가 뛰어난 것으로 밝혀지고 있다. 또한, 2004년 2월 FDA 승인을 받음으로써 다른 치료제에 효과를 보이지 않는 전이된 말기 대장암 환자에 대해서 투여할 수 있게 되었다.
MAB 425는 종양 세포 내에서 과발현되고, EGFR, 특히 A431 암세포에 대한 원조 뮤린 항체이다. 그의 인간화 및 키메라 형태가 예컨대, EP 0531 472 A1; Kettleborough, CA., et al. Protein Eng, 4:773-783 (1991); Bier, H., et al. Cancer Chemother Pharmacol, 47: 519-524 (2001); Bier, H., et al. Cancer lmmunol lmmunother, 46:167-173(1998)에 개시되어 있다. 여기서, EMD 72000은 그의 불변부가 κ 및 인간 γ-1 사슬을 갖는 항체(h425)이고 머크에 의해서 제II단계 임상 시험이 진행 중이다.
항체의 면역원성을 줄이기 위한 다른 방법으로는 WO 91/10741 Al, WO 94/02602 Al 및 WO 96/33735 Al에 기재된 바와 같이 마우스 항체 유전자를 인간의 항체 유전자로 바꾸어준 형질전환 마우스인 제노마우스(XenoMouse) 기술에 의해 제공될 수 있다. 이 기술에 의해 제조되고, 최근 임상적으로 시도되는 특정 항체 는 ABX-EGF[Abgenix, Crit Rev Oncol Hematol, 38: 17-23 (2001); Cancer Res, 59: 1236-43 (1999)]이다. 현재 ABX-EGF(panitumumab)은 Abgenix사와 Immunex사가 공동으로 신장암, 직장암, 폐암 환자들에게 임상시험을 진행 중이다.
상기 기재한 바와 같이, 단일 클론 항체(MAb)는 질환에 대한 많은 진단 및 치료 접근법에서 중요한 역할을 수행하고, 완전한 인간 항체를 개발할 수 있게 하는 최근의 기술 도약과 함께 훨씬 더 관심을 끌게 되었다. 항체 및 항체 유도체는 최근 개발 중인 생물학적 약물의 25％를 차지하고, 이들 중 많은 것들이 암 치료제로서 개발되고 있다. 최근, 미국 식약청(FDA)은 암 치료를 위한 여러 가지 항체에 대해 집중적으로 승인하고 있다.
이에, 본 발명자들은 기존의 EGFR에 대한 항체보다 효과가 우수한 항체를 제조하기 위하여, EGFR을 마우스에 면역시키는 과정으로 하이브리도마를 제조하고 이로부터 EGFR을 높은 친화성을 갖고 인식하고 EGFR 발현 종양 세포주의 증식을 억제할 뿐만 아니라, 흉선 없는 마우스의 생체 내에서 인간 종양이 성장하는 것을 억제할 수 있는 단일 클론 항체를 개발함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 임상적으로 유용한 치료적 수단을 제공하기 위해 높은 친화성을 갖는 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 결합하는 마우스 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마를 제공하는데 그 목적이 있다.
본 발명은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하고 EGFR이 과발현되는 종양세포의 성장을 억제시키는 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마 E86[KCLRF-BP-00107]를 그 특징으로 한다.
이와 같은 본 발명을 더욱 상세하게 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 표피 성장 인자 수용체(EGFR)를 기존 EGFP에 대한 항체 보다 높은 친화도로 인식하고 EGFR이 과발현되는 종양세포의 성장을 억제시킴으로써 암 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있는 EGFR에 대한 마우스 단일클론 항체 및 이를 생산하는 하이브리도마에 관한 것이다.
먼저, 본 발명의 EGFR에 대한 마우스 단일클론 항체를 제조하기 위하여, EGFR 또는 인간 유세포암 A431세포와 동량의 완전 보조항원(Complete Freund Adjuvant)을 유상화될 때까지 잘 혼합하여 마우스의 복강에 주사하여 면역시키고 상기 면역화된 마우스의 비장세포를 골수종(myeloma) 세포와 혼합하고 세포융합을 실시하여 하이브리도마를 제조하였다. 제조한 하이브리도마 중에서 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 세포주를 선별하기 위하여 면역원으로 사용했던 EGFR을 항원으로 하여 하이브리도마세포가 분비하는 항체와 반응시키는 ELISA와 면역블랏팅(immunoblotting)을 실시하였다. 이 중 EGFR에 특이적이고 높은 친화도를 갖는 하이브리도마 E86를 선별하였고, 이를 한국 세포주연구재단에 2004년 10월 19일자로 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00107을 부여받았다.
하이브리도마 E86 세포 배양액을 이소타이핑 킷트(isotyping kit)를 이용하 여 단일클론임을 확인하고, 단일클론 항체 E86가 IgG3 타입임을 확인하였다[도 2]. 또한, 상기 단일클론 항체 E86의 중쇄부분은 서열번호 1의 염기서열 또는 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되며, 경쇄 부분은 서열번호 3의 염기서열 또는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시된다.
상기 하이브리도마 E86에서 생산된 표피 성장 인자 수용체에 대한 마우스 단일클론 항체는 표지 성장 인자 수용체에 대해 높은 친화력을 갖고 있으며 시험관내에서 EGFR이 과발현되는 종양 세포 성장을 억제하고 누드마우스의 생체 내에서 인간 종양이 형성되는 것을 억제하는 것으로 증명되어 항암 치료제로서 이용될 수 있다. 높은 친화력의 마우스 단일클론 항체 E86의 불변영역을 인간 항체의 서열로 대치하는 인간화 항체로의 개발을 통해 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 최소화하여 EGFR이 과발현되는 종양에 대한 실질적인 인간 치료법에 사용될 수 있다.
이하, 본 발명은 다음 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명하겠는바, 본 발명이 이에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 마우스의 면역화
하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화된 마우스를 얻기 위하여, 구입한 정제된 EGFR (sigma: E3641), 또는 인간 유표피암 A431 세포를 동량의 완전 보조항원(Complete Freund Adjuvant)을 유상화될 때까지 잘 혼합하여 4 ∼ 6주된 Balb/c 마우스의 복강에 2주 간격으로 5회 이상 주사하였다. 마지막 면역 후 3 일 후에 마우스 꼬리 부위의 혈관에서 소량의 혈액을 뽑아내 ELISA법에 의해 혈청 중에 항체가를 측정하여 EGFR에 대한 항체를 확인하였다.
실시예 2: 세포 융합
하이브리도마 세포의 제조에 필요한 세포 융합을 실시하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제조한 면역원을 주사하여 얻은 마우스의 비장세포와 골수종 세포(myeloma cell, SP2/0-Ag14)를 50 mL의 시험관에 모았다. 세포융합의 모(parent)세포로는 SP2/0ㆍAg14을 사용하였다. 이 모세포는 10% FBS를 함유하는 RPMI 배지에서 최대밀도 5 ×105 /mL 정도로 항상 유지시켰다. SP2/0-ag14 세포 2.0 ×107세포수와 1.0 ∼ 1.3 × 108 세포수에 대하여, HAT(100 μM hypoxanthine, 400 nM aminopterin, 16 μM thymidine, 10% 우태아 혈청, 2.5 ㎍/ml gentamicin 이 함유된 DMEM)배지를 사용하여 세포융합, HAT 선택 및 클로닝을 수행하였다. 본 실시예에서 마우스의 비장(spleen)을 꺼내 곱게 갈아 한스완충액(Hans' buffered saline solution, HBSS)을 이용하여 현탁액을 만들고, 이때 얻어진 비장세포를 15 mL의 시험관에 넣어 원심분리하고, 이 방법을 2회 반복하여 비장세포를 충분히 세척하였다. 한편, 모세포인 SP2/0ㆍAg14도 HBSS를 이용하여 2회 원심분리하고 비장세포와 SP2/0ㆍAg14를 각각 10 mL씩 재현탁시킨 후 각각의 세포수를 세어서 비장세포와 SP2/0ㆍAg14를 10 : 1 이 되도록 50 mL의 원심분리관에서 섞어 다시 원심 분리하여 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 손가락으로 가볍게 두드 려 분산시키고 37 ℃에서 1분간 유지시킨 후 한스완충액에 들어있는 45% 폴리에틸렌 글라이콜(polyethylene glycol, PEG) -5% 디엠에스오(DMSO)의 융합유도제(fusogen) 1 mL를 1분간에 걸쳐 넣고 또 다시 1분간 약간 흔들어 준 후 배양배지(RPMI) 9 mL을 3분간 걸쳐 첨가하고, 50 mL이 될 때까지 흔들어 주면서 서서히 RPMI을 첨가하였다. 이 현탁액을 다시 원심분리한 후 세포침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1 ∼ 2 ×105 /mL 정도로 재현탁시키고, 96웰(well) 마이크로 타이터 플레이트에 0.2 mL씩 깔은 후 37 ℃ 습식(humidified) 이산화탄소 배양기에서 배양하였다.
실시예 3: 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마의 선별
상기에서 제조한 하이브리도마 중에서 EGFR 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마를 선별하기 위해 EGFR 항원을 이용한 ELISA 분석방법으로 스크리닝하였다. 마이크로타이터 플레이트에 EGFR 항원을 한 웰당 각각 50 ㎕(1 ㎍/㎖)씩을 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 하이브리도마의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(PBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, PBST 용액으로 충분히 세척하고 퍼옥시다제의 기질용액을 넣어 반응시킨 후 그 반응정도는 엘리자 해 독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. 실험결과, EGFR에 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들은 먼저 선별하였고, 여러 번 반복 실험을 통하여 EGFR 항원에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포주를 선별하고 면역블랏팅(immunoblotting)으로도 확인하였다[표 1].
Figure 112004051142573-PAT00001
상기 표 1의 이중 높은 역가를 보이는 클론을 골라 완전한 단일클론이 되도록 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 E86을 선별하였다. E86 하이브리도마세포의 상등액은 효소면역법으로 역가를 측정하고 면역블랏팅을 실시하여 EGFR과의 결합을 확인하였다[도 1 및 도 4]. 또한, 이소타이핑 킷트(Pierce:#37501)로 소단위형(subclass type)을 확인한 결과 E86 클론은 IgG3으로 판명되었다[도 2].
상기 하이브리도마 E86은 한국 세포주연구재단에 2004년 10월 19일자로 기탁하였고, 수탁번호 KCLRF-BP-00107을 부여받았다.
실시예 4: 단일클론 항체의 대량 생산
실시예 3에서 하이브리도마 세포로 부터 단일클론 항체 E86을 대량 생산하기 위하여 생후 10주의 암컷 Balb/c 마우스에 대하여, 0.5 ml/마리의 프리스탄 (pri-stane, Sigma, USA)을 복강 내 투여하고, 그 15일 후, 하이브리도마 세포 E86을 5× 106 ∼ 1.0 ×107 세포수/1ml/마리로 복강 내 주입하였다. 6일 후 정도부터 마우스의 복부비대를 관찰하여, 복수를 채취하였다.
채취된 복수는 4 ℃에서 3,000rpm으로 20분간 원심분리하고, 상층액과 침전물을 분리하였다. 수득된 상층액으로부터 친화 컬럼 Protein A(Pharmacia, Sweden)를 사용하여 단일클론 항체 E86을 정제하였다. 안정 및 세척 버퍼(Equilibrium and wash buffer)로는 20 mM 트리스, 150 mM NaCl, pH 7.2를 사용하였고, 용출 버퍼(elution buffer)로는 0.1M 글리신, pH 2.5를 사용하였다. 용출 분획(Elution fraction)은 1M 트리스, pH 9.9를 사용하여 pH 7.2로 보정하였다. 10% SDS-PAGE로 용출 분획을 확인한 뒤[도 3], PBS(pH 7.2)에 투석하여 Centricon YM-10으로 농축하였다. 수득된 항체 용액에 대하여 280 nm에서 흡광도를 측정하고, 마우스 IgG의 분자 흡광 계수로부터 항체농도를 산출하였다.
실시예 5: 경쟁적 ELISA을 통한 마우스 단일클론 항체 E86의 항원 결합능 측정
96 웰 플레이트의 각 웰에 EGFR(sigma:E3641) 200 ng을 4 ℃에서 밤새도록 코팅하였다. 튜브에 EGFR-EGFR Ab(각각 E86, 225) 복합체를 만들어 37 ℃에서 3시간동안 반응시켰다. EGFR Ab 농도는 각 웰당 10 ng으로 고정하며, EGFR 농도는 각각 2.5 ×10-8 M, 1 ×10-8 M, 5 ×10-9 M, 2.5 ×10-9 M, 1 ×10-9 M, 5 ×10-10 M, 2.5 ×10-10 M, 1 ×10-10 M, 5 ×10-11 M, 2.5 ×10-11 M, 1 ×10-11 M으로 하여 반응시켰다. 각각의 조건은 duplicate로 하였다. EGFR이 흡착된 96 웰 플레이트는 PBS 내 2% BSA로 37 ℃에서 2시간동안 블락킹시켰다. 블락킹이 끝난 후, TBST로 3번 세척한 후에, EGFR-EGFR Ab 복합체를 각 웰에 넣어 결합하지 못한 Ab를 플레이트에 코팅된 EGFR과 반응시켰다. 반응이 끝나면 TBST로 3번 세척한 후, HRP-conjugated secondary Ab (goat anti-mouse IgG)를 100 ng/ml로 넣어, 37 ℃에서 1시간동안 반응시킨 후 TBST로 3번 세척하고 TMB 용액으로 발색시키고 1M 인산으로 반응을 중지시켜 분광광도계로 450 nm에서 흡광도를 측정하였다. Kd값은 Klotz plot을 이용하여 구하였다. 마우스 단일클론 항체 E86의 Kd값은 5.6×10-10 M로서 기존의 cetuximab의 기본 항체인 225(5.4 ×10-9 M)보다 높은 결합능을 보였다[도 5].
실시예 6: 마우스 단일클론 항체 E86에 의한 시험관내 인간 유표피암 A431 세포 성 장의 억제
E86 항체가 암 세포 성장을 억제할 수 있는지를 측정하기 위하여 세포 억제 분석(In Vitro Tumor Cell Proliferation Assay)을 실시하였다. 인간 유표피암 A431 4 ×103개의 세포를 혈청이 함유되어 있지 않은 DMEM:F12 배지 100 ㎕에 희석하여 96 웰 플레이트의 각 웰에 100 ㎕씩 접종하였다. E86 항체를 DMEM:F12 배지에 희석하여 각각 0.005, 0.05, 0.5, 5 nM 농도로 첨가하였다. 각각의 조건은 triplicate로 하였고, 배양은 37 ℃에서 6일간 하였다. 대조군은 Ab를 넣지 않은 웰로 사용하였다. 배양 후에, 배양액을 제거하고 0.25% 글루타르알데하이드(glutaraldehyde)로 고정시키고 0.9% NaCl로 세척하여 상온 건조시켰다. 세포를 크리스탈 바이올렛(2 mg/ml)으로 상온에서 15분간 염색한 후, 증류수로 세척하고 상온 건조시킨 후에 각 웰 마다 메탄올을 100 ㎕ 넣어 분광광도계로 595 nm에서 측정하였다. 성장억제율(%)은 다음 수학식 1과 같이 계산하였다.
Figure 112004051142573-PAT00002
그 결과 E86 항체는 5.6 nM에서 54.7%의 성장억제를 나타내었다[도 6].
실시예 7: 마우스 단일클론 항체 E86에 의한 누드마우스 내 인간 유표피암 성장의 생체 내 억제효과
상기의 마우스 단일클론 항체 E86가 시험관내 뿐만 아니라 생체 내에서도 활 성을 유지하고 포유류 내 형성된 종양의 성장을 억제하는지 조사하였다. 본 실험을 위해 누드마우스(female, BALB/c-nu/nu mice, 6-8 ages)에게 A431 인간 유표피암 세포 1 ×107/mouse을 0일째 경피 접종하여 종양이 형성된 후(크기 ≥ 0.15 cm3) 대조군으로 PBS와 골수종 IgG 및 E86 항체 100 ㎍을 일주일에 한번씩 총 3주간 복강 투여하였다[각각 n=5]. 세포접종 후부터 3일 간격으로 지속적으로 종양의 크기를 관찰하였다. 종양의 크기는 부척 달린 캘리퍼스(vernier caliper)로 일주일에 두 번 측정하였고 이는 최소한 30일 이상 관찰하였다. 종양의 크기는 다음 수학식 2와 같이 계산하였다.
종양의 크기 = 길이 × 폭 × 높이 × π/6
35일이 경과한 후 항체 E86을 투여받은 마우스의 종양크기는 PBS 혹은 대조군 IgG 항체를 투여받은 마우스에 비해 약 58%의 억제 효과가 관찰되었다[도 7].
이상에서 상술한 바와 같이, 본원발명에 따른 표지성장인자 수용체에 대한 마우스 단일클론 항체는 표지성장인자 수용체에 대해 높은 친화력을 갖고 있으며 시험관내에서 EGFR이 과발현되는 종양 세포 성장을 억제하고 누드마우스의 생체 내에서 인간 종양이 형성되는 것을 억제하는 것으로 증명되어 항암 치료제로서 이용될 수 있다. 높은 친화력의 마우스 단일클론 항체 E86의 불변영역을 인간 항체 의 서열로 대치하는 인간화 항체로의 개발을 통해 인간 항-마우스 항체(HAMA) 반응을 최소화하여 EGFR이 과발현되는 종양에 대한 실질적인 인간 치료법에 사용될 수 있다.
<110> IN2GEN CO., LTD. <120> Hybridoma cell line and monoclonal antibody to the epidermal growth factor receptor <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 366 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of mouse monoclonal antibody E86 <400> 1 caggtccagc tgcaggagtc tggccctggg atattgcagc catcacagac gcttagcctg 60 gcctgtactt tctctgggat ttcactgagt acttctggta tgggtttgag ctggcttcgt 120 aagccctcag ggaaggcttt agagtggctg gcaagcattt ggaataatga taactactac 180 aacccatctt tgaagagccg gctcacaatc tccaaggaga cctccaacaa ccaagtattc 240 cttaaactca ccagtgtgga cactgcggat tctgccacat actactgtgt ttggagagag 300 tactacggta gtcggtacga gtggtttgct cactggggcc aagggaccac ggtcaccgtc 360 tcctca 366 <210> 2 <211> 122 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain of mouse monoclonal antibody E86 <400> 2 Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Ile Leu Gln Pro Ser Gln 1 5 10 15 Thr Leu Ser Leu Ala Cys Thr Phe Ser Gly Ile Ser Leu Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Met Gly Leu Ser Trp Leu Arg Lys Pro Ser Gly Lys Ala Leu Glu 35 40 45 Trp Leu Ala Ser Ile Trp Asn Asn Asp Asn Tyr Tyr Asn Pro Ser Leu 50 55 60 Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Lys Glu Thr Ser Asn Asn Gln Val Phe 65 70 75 80 Leu Lys Leu Thr Ser Val Asp Thr Ala Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys 85 90 95 Val Trp Arg Glu Tyr Tyr Gly Ser Arg Tyr Glu Trp Phe Ala His Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 3 <211> 330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of mouse monoclonal antibody E86 <400> 3 gacattcagc tgacccagtc tcctgcttcc ttagctgtat ctctggggca gagggccacc 60 atctcataca gggccagcaa aagtgtcagt acatctggct atagttatat gcactggaac 120 caacagaaac caggacagcc acccagactc ctcatctatc ttgtatccaa cctagaatct 180 ggggtccctg ccaggttcag tggcagtggg tctgggacag acttcaccct caacatccat 240 cctgtggagg aggsggatgc tgcaacctat tactgtcagc acattaggga gcttacacgt 300 tcggaggggg gaccaagctc gagatctaac 330 <210> 4 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain of mouse monoclonal antibody E86 <400> 4 Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Tyr Arg Ala Ser Lys Ser Val Ser Thr Ser 20 25 30 Gly Tyr Ser Tyr Met His Trp Asn Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Arg Leu Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn Ile His 65 70 75 80 Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Ile Arg 85 90 95 Glu Leu Thr Arg Ser Glu Gly Gly Pro Ser Ser Arg Ser Asn 100 105 110

Claims (4)

  1. 표피성장인자 수용체(EGFR)에 특이적으로 결합하고 EGFR이 과발현되는 종양세포의 성장을 억제시키는 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 E86[KCLRF-BP-00107].
  2. 청구항 1의 하이브리도마 E86[KCLRF-BP-00107]으로부터 생산된 표피성장인자 수용체(EGFR)에 대한 마우스 단일클론 항체.
  3. 제 2 항에 있어서, 서열번호 1로 표시되는 중쇄 암호화 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
  4. 제 2 항에 있어서, 서열번호 3으로 표시되는 경쇄 암호화 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항체.
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