KR20060032778A

KR20060032778A - 바이오칩 측정 장치 및 방법

Info

Publication number: KR20060032778A
Application number: KR1020040081733A
Authority: KR
Inventors: 강욱; 배수진; 파파얀게리브이
Original assignee: 한국전기연구원
Priority date: 2004-10-13
Filing date: 2004-10-13
Publication date: 2006-04-18
Also published as: KR100615040B1

Abstract

본 발명은 일반적인 바이오칩을 그대로 사용하여 측정하여도, 광학적 잡음을 현저히 감소시킨 형광 이미지의 검출이 가능하고, 간단한 구조로 저렴한 단가의 제작이 가능하며, 바이오칩을 신속하게 대량 측정할 수 있도록 하는 바이오칩 측정 장치 및 방법을 제안한다.

본 발명의 바이오칩 측정 장치는, 얇은 평행 육면체 형태인 기판 상의 일면에 하나 이상의 바이오 시편이 배열된 바이오칩으로부터 방출되는 형광을 관측하기 위한 바이오칩 측정 장치이며, 상기 바이오칩을 지지하는 바이오칩 홀더; 상기 바이오칩의 상기 투명 기판 측면으로 광을 입사시켜, 입사된 광이 상기 기판 내부에서 전반사되어 상기 바이오 시편 부근에 도달하도록 하는 여기광 공급부; 및 상기 기판 내부에서 전반사된 광에 의하여 상기 바이오 시편으로부터 발생되는 형광을 채집하여 검출하는 형광 검출부를 포함하여 구성된다.

바이오칩, 형광, 여기광, DNA 칩, 측정 장치

Description

바이오칩 측정 장치 및 방법{APPARATUS AND METHOD FOR MEASURING BIO CHIPS}

도 1은 종래 기술의 바이오칩 측정 장치의 모식도를 예시하였다.

도 2는 또 다른 종래 기술(미국 특허 공개 공보 제2002/0123132호)의 바이오 칩 측정 장치를 도시한다.

도 3은, 도 2의 종래 기술의 신호 대 잡음 비의 개선 원리를 설명하기 위한 도면이다.

도 4는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오칩 측정 장치의 구성을 개략적으로 나타낸다.

도 5는 본 발명의 제2 실시예에 따른 바이오칩 측정 장치의 구성을 개략적으로 나타낸다.

도 6은 기판 지지용 홀더(118)의 바람직한 한 구조를 예시적으로 도시한다.

도 7은 평행 여기광(colliminated light)이 바이오칩(103) 기판의 측면으로 입사하여 기판(SU) 내부에서 진행될 때의 광 경로를 도시한다.

도 8은 먼지(DS)가 기판 표면에 접촉되어 있는 상태를 도시한다.

도 9는, 본 발명에 의해 제작된 바이오칩 측정 장치를 이용하여 수행된 비교 시험 과정에서 사용된 광의 조사 방법들을 도시한다.

도 10은 표 1 및 표 2의 조건에 따라 획득된 형광 상의 일부를 도시한다.

도 11은 광 조사 조건 Ua를 사용하여 칼라 유리 필터인 KS19와 간섭 필터인 Xf3095의 성능을 비교한 결과를 도시한다.

도 12는 본 발명의 바이오칩 측정 방법의 바람직한 실시예를 도시한다.

<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명>

101: 기판 102: 바이오 시편

103: 바이오칩 105: 대물렌즈

106: 차폐 필터 107: 광 검출기

108: 형광 114: 기판 상면

116: 기판 하면 117: 기판 측면

104: 광원 120: 여기광 공급부

130: 형광 검출부

본 발명은 바이오칩 측정 장치 및 방법에 관한 것으로, 보다 상세히는, 바이오칩으로부터 형광 정보를 측정하기 위한 장치 및 방법에 관한 것이다.

바이오칩(bio-chip)은, 생물학적 분자들(예: DNA 분자)의 배열을 포함하는 칩을 말하며, 일반적으로 소정 기판 위에 마이크로 단위의 매우 작은 셀들이 행렬 형태로 제도(plotting)되어 있는 구조로 되어 있다. 기판으로는 일반적으로 유리 판이 사용되나, 예를 들어 실리콘 등의 다른 재료로 된 기판이 사용될 수도 있다. 바이오칩의 극히 미세한 크기의 셀들에는 다양한 DNA 분자들이 분포되어 있다.

바이오칩 측정 장치는 바이오칩에 형성된 마이크로 단위의 미소 셀들에서 방출되는 형광을 측정하여 이를 영상화하기 위해 특별히 고안된 장치로서, 이러한 측정 장치를 사용하여 마이크로 셀들로부터의 형광 영상을 획득하여 셀들의 정보를 판독할 수 있다.

바이오칩 측정 장치의 구성은 원리적으로 두 종류로 나눌 수 있다. 우선, 주사(scanning) 방식의 장치가 있고, 두 번째로 카메라와 같이 측정 대상의 면적을 한 번에 보는 방식이 있는데, 주사 방식의 장치에서는 셀로부터 정보를 판독하는 과정이 셀에서 셀로 순차적으로 진행된다.

측정 대상의 면적을 한 번에 보는 장치의 경우는, 현미경의 시야(field of view)에 들어오는 바이오칩의 모든 셀을 동시에 분석한다. 이 방식의 장치는, 측정 대상인 모든 셀로부터 평행하게 형광 정보를 얻기 때문에 주사 방식의 장치에 비해 고속으로 자료를 분석할 수 있다는 장점이 있다. 게다가 이와 같은 측정 대상을 한 번에 보는 방식의 장치는 일반적으로 주사 방식의 장치보다 보다 단순한 구조를 갖고 있고, 작동도 간편하므로 대량의 분석 작업에 더 적합하다.

종래 기술의, 측정 대상을 한 번에 보는 방식의 휴대용 바이오칩 측정 장치는 러시아의 분자생물학연구소(Engelhardt Institute of Molecular Biology)와 국립광학연구소(S. I. Vavilov State Optical Institute)에 의해 개발되었다( BarskyV., Perov A., Tokalov S. et al. Fluorescence data analysis on gel-based biochips// J. Biomol. Screening. 2002. V. 7. P. 247-257). 도 1에는 상술한 종래 기술의 바이오칩 측정 장치의 모식도를 도시하였다.

바이오칩에 대한 광의 조사(illumination)는 대물렌즈(5)의 양 쪽 측면에 배치된 두 개의 반도체 레이저(laser diode)(4)에 의해 수행된다. 레이저(4)로부터 방출된 여기광은, 대물렌즈(5)에 의해 광 경로가 방해되지 않도록 바이오칩(3)의 표면에 대해 비스듬한 방향으로 조사된다.

두 개의 레이저를 사용함으로써 여기광이 조사되는 면적의 크기를 증가시킬 수 있어 보다 넓은 면적으로부터의 형광을 높은 정밀도로 관측할 수 있다. 바이오칩(3)은 일반적인 현미경 슬라이드 유리를 기판(1)으로 사용하고, 광이 조사되는 표면에는 측정될 바이오 시편(2)이 소정의 패턴으로 제도(plotting)되어져 있다. 형광(8)에 의한 바이오 시편(2)의 영상은 대물렌즈(5)를 통하여, CCD 카메라(7)의 검출 면에 투사되어 판독된다.

상술한 종래 기술의 측정 장치의 문제점은, 광이 조사되는 표면에 부착된 먼지나 이물질에 의하여 유발되는 형광 영상의 품질 저하이다. 먼지 등은 여기광을 산란시키며 또한 먼지 고유의 형광을 발생시켜 형광 영상의 정확한 검출에 유해한 광을 발생시킨다. 이러한 유해한 광의 검출에 의해 생성된 배경 신호(background signal)는 부가적인 잡음으로 나타나며, 일반적으로 형광 측정 신호는 매우 미약하기 때문에 신호 대 잡음비(SNR)를 악화시키는 요인이 된다.

도 2는 또 다른 종래 기술(미국 특허 공개 공보 제2002/0123132호, Tunami et al)의 바이오 칩 측정 장치이다. 도시된 장치에서는, 일반적인 현미경 슬라이 드 유리를 기판으로 하여 준비된 바이오칩(13)을 사용하며, 전내부반사형광방법(Total Internal Reflection Fluorescent Method)에 의하여 바이오칩의 측정을 수행한다.

여기서, 레이저 광원 또는 백색 광원 등의 광원(10)에 의해 방출된 광은 렌즈(11)에 의해 평행광(collimated light)으로 되며, 방출된 광은 여기 필터(12)를 통과하여 선택된 파장 대역을 갖는 여기광으로 변화된다. 광원에는, 필요에 따라 시준렌즈(collimating lens)(11) 및/또는 여기 필터(12)를 포함시키거나 그렇지 않을 수 있다. 도 2에 도시된 바와 같이, 여기광(excitation light)은 그 경로가 제어되어 DNA 칩 등의 바이오칩(13) 위로 사선 방향으로 투사된다.

여기서, 여기광은 바이오칩(13)의 한 면으로부터 입사하여 다수의 바이오 시편(CL11, CL12, CL13)이 놓여져 있는 반대 면으로 투사된다. DNA 칩(13) 상에서 여기광의 입사각은 임계각과 같거나 초과하도록 그 각도가 제어되어 조사된다. DNA 칩(13) 위에 일렬로 배열된 바이오 시편(CL11, CL12, CL13)에는 동일한 형태를 갖는 다수의 DNA 조각이 배치된다. 바이오칩에 배열된 시편으로부터 발생된 형광은 대물렌즈(14)에 의해 모아지고, 필터(15)를 거쳐, CCD 등의 광학 검출기(16) 위에 투사된다.

이하에서는, 도시된 바이오칩 측정 장치의 작동을 설명한다. 도시된 바이오칩 측정 장치에서는, 기판 내에서 진행한 광이 시편이 배열된 면에 임계각 이상의 각도로 입사하도록 되어 전반사가 일어나게 되어 있다. DNA 칩(13)의 기판을 형성하는 매질은 일반적으로 그 굴절율이 공기보다 높기 때문에, 기판과 공기의 경계면 으로 임계각 이상의 각도로 입사한 광은 전반사되고, 전반사 과정에서 입사광은 저 굴절율 매체 표면 근처의 일부 영역으로 진행되나 곧 반사된다. 저 굴절율의 매체 표면 근처로 일시적으로 진행되는 광을 에버네센트 광(evanescent light)이라 하며, 에버네센트 광이 발생하는 경계면 부근의 영역을 에버네센트 장(evanescent field )이라고 한다.

도 2의 종래 기술에서는, 이러한 에버네센트 광을 이용하여, 먼지로 오염된 기판에서도 높은 신호 대 잡음비를 얻도록 하는데, 그 원리를 도 3에 도시하였다. 도 3은 도 2의 기판 위의 한 시편(CL12) 부근을 부분적으로 확대한 것으로서, 여기광의 입사각(θ)은 임계각보다 큰 각도로 조정되었으며, 에버네센트 장의 두께(t)는 대체로 입사광의 파장과 동등하다. 따라서 여기 필터를 통과한 여기광의 파장이 500nm가 되도록 정하였을 때, 에버네센트 장의 두께(t)는 대략 약 500nm이다.

즉, 입사광은 경계면을 지나 에버네센트 장 안으로 일단 투과한다. 따라서 입사광은 DNA 칩(13)의 기판 위에 배열된 바이오 시편에 도달할 수 있다. 에버네센트 장의 두께인 500nm 는 시편 내의 DNA 사슬(DNA chain)보다는 상당히 크나, 도시된 먼지 입자(DS11및 DS12)의 두께(수 천 마이크론)보다는 매우 작다. 따라서 광은 먼지 입자보다는 시편에 많이 도달하게 되어, 먼지 입자의 영향을 줄여 바이오칩 측정 장치의 신호 대 잡음비를 향상시킬 수 있게 된다.

한편, 기판 위에는, 인듐-주석 산화물(indium-tin oxide, ITO)로 만들어진 투명 전극 막(TE11)이 구비되어, 반사되는 광이 배경 잡음(background noise)이 되는 것을 방지한다. 상기 종래 기술에서는 이러한 구성을 통해 측정의 신호 대 잡 음비(S/N비)가 향상될 수 있다고 기재되어 있다.

그러나 위 종래 기술에서 제안된, 에버네센트 장을 이용하여 바이오 시편에 광을 조사하는 방법은 실현하기가 매우 어렵다. 바이오칩(13)에서 바이오 시편이 있는 면(유리-공기 경계면)의 광 조사 각도를 전반사를 발생시키기 위해 임계각 이상으로 하면, 광원으로부터 바이오칩(13)의 그와 반대 면(공기-유리 경계면)을 통해 입사되는 광도 줄어들어 극히 작은 여기광 만이 기판 내부로 입사된다는 사실이 입증되어져 있다. 스넬의 법칙(Snell's law)에 의하면, 입사광이 바이오칩에 입사될 때 입사각이 전반사를 위한 임계값 이상이 되도록 하기 위해서는, 기판의 반대쪽 면으로부터 조사된 입사광은 바이오칩 기판의 내부를 투과하지 못하고, 기판의 반대쪽 면을 따라 진행되게 되어, 결국 바이오 시편에는 여기광이 도달하지 않게 되기 때문이다.

그러므로 상술한 종래 기술의 측정 장치에서는 여기광 자체의 양이 지나치게 작아져서 바이오칩으로부터 형광 영상을 측정하는 기능을 수행할 정도의 충분한 여기광을 시편에 조사하지 못하게 되고, 결국 신호 대 잡음비의 향상을 얻는 데에도 한계가 있게 된다.

진료소 등에서 실제로 광범위하게 사용될 수 있는 바이오칩 측정 장치로는, 높은 형광 측정 감도, 단순한 구조, 간편한 작동 등의 특성을 구현 가능한 것이어야 하며, 측정이 신속하게 이루어질 수 있는 것이어야 하므로, 이상의 문제점을 갖는 현재까지 제안된 바이오칩 형광 측정 장치로는 한계가 있게 된다.

본 발명은 이와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로, 일반적인 바이오칩, 즉, 현미경 슬라이드 유리로 제작된 기판에 바이오 시편이 제도된 바이오칩을 그대로 사용하여 측정하여도, 광학적 잡음을 현저히 감소시킨 바이오 시편 여기 형광을 얻을 수 있는 새로운 구조의 바이오칩 측정 장치 및 방법을 제안하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은, 일반적인 평행 육면체의 현미경 슬라이드의 측면으로 여기광을 입사시켜, 전내부반사를 통하여 발생된 에버네센트 광에 의해 바이오 시편에서 발생하는 형광을 측정하도록 함으로써, 저렴한 단가로 제작된 바이오칩을 신속하게 대량 측정할 수 있는 바이오칩 측정 장치 및 방법을 제안하기 위한 것이다.

또한, 본 발명은, 바이오칩의 표면에 오염된 먼지 등에 의해 발생하는 광학적 잡음을 대폭 감소시키어 형광의 신호 대 잡음비를 개선시키고, 이를 통하여 형광 검출을 위해 설치된 검출기 앞에 고가의 간섭 필터를 사용할 필요가 없이 저렴한 유리 차폐 필터로 대치가 가능하도록 함으로써, 생산 단가를 더욱 낮출 수 있는 바이오칩 측정 장치 및 방법을 제안하기 위한 것이다.

이와 같은 목적을 달성하기 위한, 본 발명의 한 특징에 의한 바이오칩 측정 장치는, 얇은 평행 육면체 형태인 기판 상의 일면에 하나 이상의 바이오 시편이 배열된 바이오칩으로부터 방출되는 형광을 관측하기 위한 바이오칩 측정 장치이며, 상기 바이오칩을 지지하는 바이오칩 홀더; 상기 바이오칩의 상기 투명 기판 측면으로 광을 입사시켜, 입사된 광이 상기 기판 내부에서 전반사되어 상기 바이오 시편 부근에 도달하도록 하는 여기광 공급부; 및 상기 기판 내부에서 전반사된 광에 의 하여 상기 바이오 시편으로부터 발생되는 형광을 채집하여 검출하는 형광 검출부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 본 발명의 바이오칩 측정 장치는, 상기 여기광 공급부로부터 광이 입사되는 상기 기판의 옆면은 상기 바이오 시편이 배열된 면과 수직이며, 상기 입사광의 상기 기판의 옆면으로의 입사각이 φ인 경우, 상기 기판 내부에서 상기 바이오 시편이 배열된 면을 향하여 입사하는 광의 입사각 α는, α=90°-arcsin(sinφ/n)으로 나타내어지며, 여기서 상기 α는 arcsin(1/n) 이상인 것일 수 있다.

또한, 상기 여기광 공급부는, 레이저, LED 및 백색 광원의 어느 하나를 광원으로 포함하는 것임이 바람직하다.

나아가서, 상기 여기광 공급부는, 상기 광원으로부터 방출된 광을 평행광(collimated light)으로 변환시키기 위한 광학 수단을 더 포함하는 것일 수 있다.

바람직하게는, 상기 여기광 공급부는, 상기 광 전송관(light guide)을 더 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 여기광 공급부는, 둘 이상의 광원을 포함하는 것일 수 있다.

그리고, 상기 형광 검출부는, 상기 기판의 상기 바이오 시편이 배열된 면을 향하여 배치되는 것일 수 있으며, 그와는 달리, 상기 형광 검출부는, 상기 기판의 상기 바이오 시편이 배열된 면의 반대쪽 면을 향하여 배치되는 것일 수 있다.

또한, 상기 기판으로는, 일반적인 현미경 슬라이드 유리가 사용될 수 있다.

경우에 따라서는, 상기 기판 상단을 덮는 덮개 유리를 더 포함하며, 상기 바이오 시편은 상기 덮개 유리와 상기 기판의 사이에 위치하도록 할 수 있다.

여기서, 상기 형광 검출부는, 대칭형 대물렌즈, 잡음 제거용의 차폐 필터 및 광 검출기를 포함하는 것일 수 있다.

또한, 상기 기판 홀더는, 상기 기판의 탑재 시 상기 기판의 위치를 용이하게 설정할 수 있도록 하는 홀더 가이드, 상기 홀더 가이드 상의 상기 기판의 수평 방향의 이동을 제한하여 상시 바이오 시편이 상기 대물렌즈의 시야에 들어오도록 하는 고정대, 및 상기 기판이 상기 홀더 가이드의 상면에 정확히 위치하도록 하여 상기 대물렌즈의 초점면에 있도록 상기 기판을 지지하는 스프링 수단을 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 다른 한 측면에 따른 바이오칩 측정 방법은, 얇은 평행 육면체 형태인 기판 상의 일면에 하나 이상의 바이오 시편이 배열된 바이오칩으로부터 방출되는 형광을 관측하기 위한 바이오칩 측정 방법이며, 상기 기판의 상기 바이오 시편을 대물렌즈의 초점 위치 및 시야에 고정하는 단계; 상기 기판의 측면으로 여기광을 입사시켜 상기 기판 내부에서 전반사되어 진행하도록 하는 단계; 상기 내부 전반사된 여기광의 에버네센트 장에 존재하는 바이오 시편으로부터 방출된 형광을 검출하는 단계; 및 상기 검출된 형광에 의한 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.

여기서, 상기 여기광이 입사되는 상기 기판의 측면은 상기 기판의 상기 바이오 시편이 배열된 면과 수직이며, 상기 입사광의 상기 기판의 옆면으로의 입사각이 φ인 경우, 상기 기판 내부에서 상기 바이오 시편이 배열된 면을 향하여 입사하는 광의 입사각 α는, α=90°-arcsin(sinφ/n)으로 나타내어지며, 여기서 상기 α는 arcsin(1/n) 이상인 것이 바람직하다.

이하에서는 도면을 참조하여 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명한다.

도 4에는 본 발명의 제1 실시예에 따른 바이오칩 측정 장치의 구성을 개략적으로 나타낸다. 광원(104)을 포함하는 여기광 공급부(120)로부터 평행하게 시준된 여기광(collimated excitation light)이 바이오칩(103) 기판(101)의 측면(117)을 통하여 입사된다.

바이오칩(103)은, 전체적으로 직각 육면체 형태의 얇고 투명한 기판(101)위에 바이오 시편(102) 들이 배열되어 있으며, 바이오 시편(102)들이 배열된 전면(114), 후면(116) 및 측면을 갖는다.

광원(104)으로부터 방사된 광은 기판(101)의 측면(117)을 통해 입사되는데, 기판(101) 내의 바이오 시편(102)이 배열된 면(114) 및 그 반대쪽 면(116)의 사이에서 내부 전반사를 통해 진행될 수 있는 각도로 입사된다.

이 때, 바이오 시편(102)이 배열된 기판 전면(114)에서 에버네센트 광에 의해 형광이 발생한다. 발생된 형광에 의한 영상은 형광 검출부(130)를 통해 관측되는데, 형광 검출부(130) 내의 대물렌즈(105)를 통해, 고감도 광 검출기(107)의 검출 면에 투사된다. 검출 면에 형광이 아닌 여기광이 도달하는 것을 방지하기 위해, 바이오 시편(102)과 광 검출기(107) 사이의 적절한 위치에 차폐 필터(106)가 설치될 수 있다.

도 5는 본 발명의 제2 실시예에 따른 바이오칩 측정 장치의 구성을 개략적으로 나타내었다. 도시된 제2 실시예에서는, 형광 검출부(130)가 기판(101) 상의 바이오 시편(102)이 배열된 면을 향하고 있는 제1 실시예와는 달리, 기판(101)의 후면(116)을 향하도록 배치되어 있다. 본 실시예에서는, 에버네센트 장 내에 존재하는 바이오 시편으로부터 방출된 형광이 기판을 통과하여 후면(116)으로 방출되고, 이러한 후면(116)을 통해 방출된 형광을 형광 검출부(130)를 통하여 관측하게 된다.

상술한 제1 및 제2 실시예의 바이오칩 측정 장치의, 여기광 공급부(120), 형광 검출부(130) 및 바이오 칩 홀더(도시하지 않음)는 공통의 받침대 또는 외함(case)에 고정되어 있다. 장치의 외함 측부로부터 바이오칩을 인입할 수 있도록 뚜껑을 설치한 시편 출입문을 구비할 수 있으며, 이 출입문은 외부로부터 빛이 들어오는 것을 차단하도록 자석 잠금 장치 등에 의해 닫히도록 할 수 있다.

도 6에서는 기판 지지용 홀더(118)의 바람직한 한 구조를 예시적으로 도시하였다. 신속한 대량 시편의 측정을 위해서 기판 지지용 홀더는, 기존의 현미경과 같이 초점을 맞추기 위해 바이오칩 위치를 변경하는 번거로운 작업을 수행하지 않으면서도, 정해진 위치에 정확히 시편이 고정되도록 하는 것이 바람직하다.

이를 위하여, 도시된 기판 지지용 홀더(118)는, 바이오칩 기판(101)의 인입 시 정확한 위치로의 안내를 위한 홀더 가이드(115), 대물렌즈(105)에 정확한 초점을 맞출 수 있도록 바이오칩을 홀더 가이드 상면에 정확히 밀착시키는 스프링 수단(113) 및 바이오칩의 수평 이동을 제한하여 대물렌즈(105)의 시야에 바이오 시편이 들어오도록 하는 고정대(112)를 포함할 수 있다.

대물렌즈(105)는 나선형의 홈 등에 의해 대물렌즈의 위치를 조정 가능하도록 되어 형광 검출부(130)에 고정되며, 형광 검출부(130)에는 차폐 필터(106)가 설치될 수 있다. 광 검출기(107)로는 CCD 카메라나 CMOS 이미지 센서 등이 사용될 수 있으며, 나선형의 홈 등을 사용하여 대물렌즈와의 위치 조정 및 고정이 가능하도록 할 수 있다.

여기광 공급부(120) 내에는 반도체 레이저(LM6535MH, Lanics Inc., Korea, 658nm, 25mW) 등의 광원이 사용될 수 있으며, 바이오칩(103)에 조사되는 광의 입사 방향을 조절하기 위한 기계적 수단이 구비될 수 있다. 광원으로는 레이저뿐만이 아니라, 램프 등의 백색 광원이나 LED 등이 사용될 수도 있다.

도 7에서는, 평행 여기광(colliminated light)이 바이오칩(103) 기판의 측면으로 입사하여 기판(SU) 내부에서 진행될 때의 광 경로를 도시한다. 조사된 광이 기판(SU)의 옆면으로 각도 φ로 입사할 경우, 기판의 옆면은 바이오 시편이 놓여있는 기판 면과 대략 직각이므로, 기판의 후면에서 반사되어 바이오 시편이 있는 기판 면으로 입사하는 광의 입사각 α은 다음과 같다.

α=90°-arcsin(sinφ/n) (여기서, n은 기판의 굴절율)

여기서 상기 α가 임계각인 arcsin(1/n) 이상인 경우 내부 전반사가 일어나며, 바이오 시편이 배열된 기판의 면으로, 에버네센트 광(EW1, EW2, EW3)의 형태로 여기 광이 누설되어 바이오 시편(SE) 내의 분자들로부터 형광이 발생되게 한다. 기판(SU) 면에는, 형광이 표식된 바이오 시편들이 공간적으로 배열되어 있으므로 CCD 카메라 등에 의해 시편들로부터 방출되는 형광에 의한 영상을 측정 및 기록한다.

도 8에서는, 먼지(DS)가 기판 표면에 접촉되어 있는 상태를 도시하였는데, 기판 경계 면에서 기판 면에 접촉된 먼지 부분의 표면적이 작기 때문에 먼지 부분과 에버네센트 장(EW)의 상호 작용은 매우 작게 된다. 따라서 본 발명과 같이 바이오칩 기판 내부에서 광이 조사되도록 하는 경우에, 상술한 도 1의 종래 기술의 경우와 같이 외부로부터 바이오칩에 광이 조사되는 경우와 비교하여 먼지에 의한 잡음을 현저히 감소시킬 수 있다. 이러한 새로운 방식에 의하여 본질적으로 신호/잡음 비의 현저한 개선이 가능하며, 정밀한 차폐 필터 사용의 필요성을 현저히 줄일 수 있다.

본 발명에 의한 바이오칩 측정 장치를 사용하여 바이오칩 기판의 측면에서 조사되는 광의 입사 각도를 변화시키면서 바이오칩으로부터 획득되는 형광 영상(fluorescence image)의 품질을 비교하였다. 바이오칩은 결핵 치료를 위한 항생제에 내성을 갖는 결핵균 진단을 위한 올리고뉴클레오타이드 마이크로칩(Oligonucleotide Microchip)을 사용하였다. 사용된 바이오칩은 50개의 셀로 구성되며, 각 셀의 지름이 약 100um으로, 현미경 슬라이드 유리 위에 있는 겔에 형성되어 졌다. 각 셀 안에는 다양한 올리고뉴클레오타이드를 갖는 DNA 보합 결합(hybridization)에 의하여 만들어진 분자들이 위치하며, 형광 라벨이 부착되어 있다. 형광 마커로는 염료 Cy5가 사용되었다.

바이오칩으로 획득되는 형광 영상의 품질은, 바이오칩 자체 이외에도, 사용 된 측정 장치의 각 모듈 및 소자들 등 관련된 다른 많은 요소들에도 의존한다. 따라서 정확한 비교를 위해서는 동등한 실험 조건이 주어져야 한다. 따라서 동일한 바이오칩 측정 장치를 사용하고, 동일한 시편, 같은 모듈들 및 소자를 사용하여 단지 광이 조사되는 각도만을 변화시키며 비교 시험을 수행하였다.

도 9에서는, 본 발명에 의해 제작된 바이오칩 측정 장치를 이용하여 수행된 비교 시험 과정에서 사용된 장치의 광의 조사 방법이 도시되었다. 시험 조건은 다음의 표 1과 같이 요약된다.

<표 1. 각각의 광 조사 조건>

기판 윗면에 대한 광의 조사 각도	기판에 대한 바이오 시편의 위치	광이 입사되는 입사면	광조사 방향의 도식적인 표현	도 9에서의 위치
+ 11도	위 쪽	기판 윗면		Ua
+ 11도	위 쪽	기판 옆 면		Usa
0도	위 쪽	기판 옆 면		Sa
0도	아래 쪽	기판 옆 면		Sb
- 11도	아래 쪽	기판 옆 면		DSb
- 11도	아래 쪽	기판 아래 면		Db
- 11도	위 쪽	기판 아래 면		Da

기타 시험 조건이 이하의 표 2에 요약된다.

<표 2. 기타 시험조건>

항 목	시험조건 1	시험조건 2
시편	Wild, Cy5, Photobleaching	Leu511-His, Cy5, Photobleaching
차폐 필터	KS 19	KS 19
광원(Laser)	LM 6535MH, 6V	LM 6535MH, 5.3V
광 검출기	CCD Type (N=2, K=63)	CCD Type (N=2, K=63)

위의 시험조건 및 광 조사 조건에 따른 형광 강도 측정 실험 결과를 이하의 표 3에 나타내었다.

<표 3. 본 발명의 바이오칩 측정 장치를 사용하여 측정한 바이오칩의 형광 측정 실험 결과>

항목	1				2				평균
광조사조건	S	%	S/N	%	S	%	S/N	%	S%	(S/N)%
Ua	52	100	14.5	100	27	100	29	100	100	100
Usa	150	288	21	145	60	222	57	196	242	170
Sa	63	121	1.1	7.5	5.9	21	3.2	11	71	9.2
Sb	36	69	1.12	7.7	4.7	17	2.5	8.6	43	8.1
DSb	179	344	29.4	202	73	270	72	248	296	225
Db	42	80	11	75	35	130	33	113	105	96

표 3에서, S는 바이오칩의 측정 부위에 분포된 가장 밝은 점들로부터 획득된 유효 신호의 상대적 크기를 나타내며, 배경 잡음(background noise)을 뺀 신호 평균값을 나타낸다.

또한, N은 배경 잡음의 상대적 크기를 나타내며, 유효 신호를 측정한 점 바로 근처에서 측정하였으며 암 신호(dark noise)를 뺀 신호 평균값을 나타낸다.

그리고 S/N은 신호 대 잡음의 비를 나타내며, 시편의 최대 명암 대비(contrast)로부터 산출된 값이다.

측정치들 사이에 측정 방법의 양적인 비교를 위해 Ua의 광 조사 조건에 의해 획득된 결과를 100% 로 잡았다. 획득된 형광 상의 일부를 광 조사 조건에 따라 도 10에 도시하였다.

위의 실험을 통하여 가장 우수한 형광 영상은 본 발명에서 제안한 새로운 광 조사 조건인 USa 및 DSb의 광 조사 조건을 적용한 경우에서 획득되었다. 기존 광 조사 방식인 Ua 및 Db와 비교하여 새로운 방식은 형광 신호 강도에 있어 2.4 ~ 3배 이득을 주며, 신호/잡음 비에 있어 1.7 ~ 2.2배 만큼의 이득을 준다. 또한 도 10에서 알 수 있는 것처럼, 기존 방식과는 달리 먼지 등에 의해 바이오칩 표면이 오염된 경우에도 본 발명에서 제안한 새로운 방식에 의한 광 조사 방식을 적용한 경우에는 거의 먼지의 영상이 나타나지 않아, 바이오 시편으로부터 형광 신호를 획득하는 것이 용이하다는 것을 알 수 있다.

특히, Sa 및 Sb의 광 조사 방식에 의해 바이오칩 슬라이드 유리 측면으로 유리 상면과 평행하게 광을 조사하는 경우에는 신호 대 잡음 비에 있어 가장 나쁜 결과를 얻었다. 그 이유는, 여기광이 유리 표면에 도달하여 바이오 시편을 여기시키기 위해 사용되지 않고, 여기광의 대부분이 직접적으로 유리면을 따라 지나가기 때문이다. 이와 같이 유리면을 따라 입사되는 경우 시편을 여기시키는 작용은 줄어들고, 반대로 배경 잡음은 급격하게 증가한다.

한편, 위의 종래 기술 2(미국 특허 공개공보 US2002/123132)에서 제안된 방식은 광조사 조건 Da의 경우와 같은 것인데, 이 경우 위 종래 기술에서 제안한 바와 같은 기판 면에서 내부 전반사는 일어나지 않는 것이 확인되었다. 그 이유는 위에서 언급한 바와 같이, 스넬의 법칙(Snell's law)에 따라, 기판의 한쪽 면에 -11도의 각도를 가지고 입사된 광은 -11도의 동일한 출사 각도를 유지하며 기판의 반대 면을 통과하여 나가 버리게 되고, 내부 전반사가 일어날 수 없기 때문이다. 이러한 광 경로에 의해서는, 바이오 시편의 형광뿐만 아니라 먼지 등에 의한 광의 산란 및 부가적인 형광이 발생한다. 따라서 이러한 방식에 의해 획득된 영상은 Ua 및 Db 방식에 의해 획득된 형광 영상과 같은 문제점을 갖게 된다.

도 11에서는. 본 발명의 바이오칩 측정 장치에서, 다양한 차폐 필터들을 사용한 배경 잡음(background noise) 감쇄 효과에 대한 비교 실험 결과를 나타내었다. 우선 도 11의 (a)에서는, 간섭 필터 Xf3095를 사용한 결과를 나타내었다. 이러한 필터는 5계 차수까지 필터의 파장 경계면 뒤에 있는 신호의 감쇄효과를 제공하도록 설계된 고가의 필터이며, 투과 파장 범위가 매우 엄격하여 투과 파장 범위는 가파른 경계면을 갖도록 특수 제작된 것이다. 도 11의 (b)에서는, 일반적인 광학 유리 제작 공정에 의해 제작된 칼라 유리 KS19가 필터로 사용되었다.

도 11에서는 위의 광 조사 조건 Ua를 사용하여 칼라 유리 필터인 KS19와 간섭 필터인 Xf3095의 성능을 비교하였는데, 기존의 광 조사 조건과 동일한 조건인 이 경우에는 간섭 필터를 사용한 (a)의 경우가 성능이 탁월하였다.

그러나 본 발명에 의해 제안된 새로운 광 조사 방식인 USa 및 DSb가 적용된 경우에는 형광 영상의 품질 차이는 매우 미미하다는 사실이 관측되었다. 이러한 사실로부터 본 발명의 바이오칩 측정 장치를 적용할 경우, 특수한 간섭 필터를 사용하는 대신에 간단하고 저렴한 광학 유리 필터를 사용하는 것이 허용됨을 의미한다.

광학 유리 필터 사용의 또 다른 장점은 수렴되는(convergent) 광의 빔에서 색 필터 작업이 가능하다는 점이며, 반면 간섭 필터는 단지 평행 빔에서만 필터 작업이 용이하도록 설계된다. 따라서 본 발명에 의해 제작된 바이오칩 측정 장치에서는 광학 유리 필터를 사용하여 평행 광이 아닌 광의 처리가 가능하게 되어 대물렌즈 바로 뒤에도 필터 KS19의 설치가 가능하며, 그에 따라서 장치 구조는 더욱 간 단해 질 수 있게 된다.

도 12는 본 발명의 다른 한 측면에 따른 바이오칩 측정 방법의 흐름을 도시한다. 도시된 바와 같이 본 발명의 바이오칩 측정 방법은, 바이오칩 기판의 바이오 시편을 대물렌즈의 초점 위치 및 시야에 고정하는 단계(S10)와, 기판의 측면으로 여기광을 입사시켜 기판 내부에서 전반사되어 진행하도록 하는 단계(S20)와, 내부 전반사된 여기광의 에버네센트 장에 존재하는 바이오 시편으로부터 방출된 형광을 검출하는 단계(S30)와, 검출된 형광에 의한 이미지를 분석하는 단계(S40)를 포함한다. 각 단계의 구체적인 작동은 상술한 바와 같으므로 더 이상의 설명을 생략한다.

본 발명에 의한 바이오칩 측정 장치 및 방법은 본 발명의 기술적 사상의 범위 내에서 다양한 형태로 변형, 응용 가능하며 상기 바람직한 실시예에 한정되지 않는다. 또한, 상기 실시예와 도면은 발명의 내용을 상세히 설명하기 위한 목적일 뿐, 발명의 기술적 사상의 범위를 한정하고자 하는 목적이 아니며, 이상에서 설명한 본 발명은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 있어 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위 내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하므로 상기 실시예 및 첨부된 도면에 한정되는 것은 아님은 물론이며, 후술하는 청구범위뿐만이 아니라 청구범위와 균등 범위를 포함하여 판단되어야 한다.

본 발명을 적용하여, 일반적인 바이오칩, 즉, 현미경 슬라이드 유리로 제작된 기판에 바이오 시편이 제도된 바이오칩을 그대로 사용하여 측정하여도, 광학적 잡음을 현저히 감소시킨 바이오 시편 여기 형광을 얻을 수 있는 것이 가능하다.

또한, 본 발명을 적용하여, 일반적인 평행 육면체의 현미경 슬라이드의 측면으로 여기광을 입사시켜, 전내부반사를 통하여 발생된 에버네센트 광에 의해 바이오 시편에서 발생하는 형광을 측정하도록 함으로써, 저렴한 단가로 제작된 바이오칩을 신속하게 대량 측정할 수 있는 바이오칩 측정 장치 및 방법이 제공될 수 있다.

또한, 본 발명을 적용하여, 바이오칩의 표면에 오염된 먼지 등에 의해 발생하는 광학적 잡음을 대폭 감소시키어 형광의 신호 대 잡음비를 개선시키고, 이를 통하여 형광 검출을 위해 설치된 검출기 앞에 고가의 간섭 필터를 사용할 필요가 없이 저렴한 유리 차폐 필터로 대치가 가능하도록 함으로써, 바이오칩 측정 장치의 생산 단가를 더욱 낮출 수 있다.

그에 의하여, 진료소 등에서 실제적으로 광범위하게 저렴한 바이오칩을 사용하여 진단을 할 수 있게 되며, 종래의 먼지 등에 오염되지 않게 하기 위해 매우 청결한 환경에서 바이오칩을 보관하기 위해 필요하였던 부대 설비 비용도 절약할 수 있다.

또한 본 발명의 바이오칩 측정 장치를 사용할 경우 차폐 필터로써 고가의 간섭 필터를 사용하지 않고 저렴한 광학 유리 색 필터를 사용할 수 있게 됨으로써 장치의 광학계가 간단해지는 장점도 얻을 수 있다

Claims

얇은 평행 육면체 형태인 기판 상의 일면에 하나 이상의 바이오 시편이 배열된 바이오칩으로부터 방출되는 형광을 관측하기 위한 바이오칩 측정 장치에 있어서,

상기 바이오칩을 지지하는 바이오칩 홀더;

상기 바이오칩의 상기 투명 기판 측면으로 광을 입사시켜, 입사된 광이 상기 기판 내부에서 전반사되어 상기 바이오 시편 부근에 도달하도록 하는 여기광 공급부; 및

상기 기판 내부에서 전반사된 광에 의하여 상기 바이오 시편으로부터 발생되는 형광을 채집하여 검출하는 형광 검출부를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제1항에 있어서,

상기 여기광 공급부로부터 광이 입사되는 상기 기판의 옆면은 상기 바이오 시편이 배열된 면과 수직이며,

상기 입사광의 상기 기판의 옆면으로의 입사각이 φ인 경우, 상기 기판 내부에서 상기 바이오 시편이 배열된 면을 향하여 입사하는 광의 입사각 α는, α=90°-arcsin(sinφ/n)으로 나타내어지며,

여기서 상기 α는 arcsin(1/n) 이상인 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장 치.
제1항에 있어서,

상기 여기광 공급부는,

레이저, LED 및 백색 광원의 어느 하나를 광원으로 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제3항에 있어서,

상기 여기광 공급부는,

상기 광원으로부터 방출된 광을 평행광(collimated light)으로 변환시키기 위한 광학 수단을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제3항에 있어서,

상기 여기광 공급부는,

상기 광 전송관(light guide)을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제1항에 있어서,

상기 여기광 공급부는,

둘 이상의 광원을 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제1항에 있어서,

상기 형광 검출부는,

상기 기판의 상기 바이오 시편이 배열된 면을 향하여 배치되는 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제1항에 있어서,

상기 형광 검출부는,

상기 기판의 상기 바이오 시편이 배열된 면의 반대쪽 면을 향하여 배치되는 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제1항에 있어서,

상기 기판은,

일반적인 현미경 슬라이드 유리인 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제1항에 있어서,

상기 기판 상단을 덮는 덮개 유리를 더 포함하며,

상기 바이오 시편은 상기 덮개 유리와 상기 기판의 사이에 위치하는 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제1항에 있어서,

상기 형광 검출부는,

대칭형 대물렌즈, 잡음 제거용의 차폐 필터 및 광 검출기를 포함하는 것임을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
제11항에 있어서,

상기 기판 홀더는,

상기 기판의 탑재 시 상기 기판의 위치를 용이하게 설정할 수 있도록 하는 홀더 가이드,

상기 홀더 가이드 상의 상기 기판의 수평 방향의 이동을 제한하여 상시 바이오 시편이 상기 대물렌즈의 시야에 들어오도록 하는 고정대, 및

상기 기판이 상기 홀더 가이드의 상면에 정확히 위치하도록 하여 상기 대물렌즈의 초점면에 있도록 상기 기판을 지지하는 스프링 수단을 포함하는 것임을 특징으로 하는 바이오칩 측정 장치.
얇은 평행 육면체 형태인 기판 상의 일면에 하나 이상의 바이오 시편이 배열된 바이오칩으로부터 방출되는 형광을 관측하기 위한 바이오칩 측정 방법에 있어서,

상기 기판의 상기 바이오 시편을 대물렌즈의 초점 위치 및 시야에 고정하는 단계;

상기 기판의 측면으로 여기광을 입사시켜 상기 기판 내부에서 전반사되어 진행하도록 하는 단계;

상기 내부 전반사된 여기광의 에버네센트 장에 존재하는 바이오 시편으로부터 방출된 형광을 검출하는 단계; 및

상기 검출된 형광에 의한 이미지를 분석하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 방법.
제13항에 있어서,

상기 여기광이 입사되는 상기 기판의 측면은 상기 기판의 상기 바이오 시편이 배열된 면과 수직이며,

상기 입사광의 상기 기판의 옆면으로의 입사각이 φ인 경우, 상기 기판 내부에서 상기 바이오 시편이 배열된 면을 향하여 입사하는 광의 입사각 α는, α=90°-arcsin(sinφ/n)으로 나타내어지며,

여기서 상기 α는 arcsin(1/n) 이상인 것을 특징으로 하는 바이오칩 측정 방법.