KR20050121751A

KR20050121751A - Ｎ-말단 개질된 화학주성 인자의 제조방법

Info

Publication number: KR20050121751A
Application number: KR1020057020762A
Authority: KR
Inventors: 로베르트 반들; 로만 네시나; 란돌프 자이들러; 마르틴 렌터; 헨리 도드스
Original assignee: 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하
Priority date: 2003-05-02
Filing date: 2004-04-13
Publication date: 2005-12-27
Also published as: EP1622936A1; DE502004007394D1; PT1622936E; UA83661C2; ATE398631T1; SI1622936T1; EP1473304A1; BRPI0410023A; RU2005137356A; CA2524270A1; ES2309528T3; ZA200507702B; MXPA05011700A; AU2004233964A1; CO5640145A2; EP1622936B1; WO2004096850A1; JP2007535891A; CN1784420A; PL1622936T3

Abstract

본 발명은 재조합되어 생성된 Gln-MCP-1로부터의 피로Glu-MCP-1의 제조방법에 관한 것이다. 당해 방법에 따르면, Gln-MCP-1을 염 농도가 10 내지 160mM의 범위이고, pH가 2 내지 7.5의 범위인 완충 용액에서 적어도 90%의 MCP-1이 피로Glu-MCP-1의 형태로 존재할 때까지 30 내지 80℃ 범위의 온도에서 항온처리한다.

Description

Ｎ-말단 개질된 화학주성 인자의 제조방법{Method for the production of an N-terminally modified chemotactic factor}

실시예 1: 본 발명에 따른 방법에 의한 피로Glu-MCP-1 제형의 제조

발효:

발효는 대장균(Escherichia coli) K12(W3110)의 균주에 의해 수행된다. 균주를 다음 요소를 포함하는 ColE1 플라스미드(pBR322 유도체)로 형질전환시킨다: 다목적의 포로모터(포스파타제, pPhoA)의 조절하에 hMCP-1의 유전자 서열, ColE1-복제 오리진 및 테트라실린에 대한 내성 유전자. 발효의 경우, 생성 균주를 테트라실린 함유 LB 배지 중 진탕되는 플라스크내에 예비배양시킨다. 항온처리를 OD 1이 성취될 때까지 37℃에서 수행한다. 예비배양액을 발효조로 이동시키고, 교반하고 공기를 공급하면서 37℃에서 추가로 배양한다. 당해 배지는 글루코스, 다양한 염, 미량 원소, 효모 추출물, 아미노산 및 테트라실린을 함유한다. pH는 암모니아를 사용하여 6.8로 유지한다. 주입된 글루코스가 모두 사용되자마자, 용해된 산소(pO₂)는 글루코스 공급에 의해 소정의 수준 40%으로 일정하게 유지된다. 배지 중 포스페이트가 소모되자마자 포스파타제 프로모터가 자동적으로 도입된다. 39시간 후, 바이오매스를 관 원심분리기(CEPA)에서 수거하고, -70℃에서 저장한다.

세포 용해 및 단백질 정제 단계:

냉동된 세포 펠릿을 울트라투랙스(Ultraturrax)를 사용하여 용해 완충액(200mM Tris, 55mM NaCl, 5mM EDTA, pH 7.5)으로 4회 정도 재현탁시킨다. 세포 용해는 균질화기로 460bar에서 2회 통과시켜 수행한다. 세포 단편을 CEPA 원심분리기로 제거한다. 상청액을 임의로 폴리셉(Polysep) II(1.2㎛) 필터(제조원: Millipore)로 임의로 여과한 다음, Q 세파로스 FF 및 SP 세파로스 FF로 이루어진 칼럼 배합물로 적재한다. 칼럼은 용해 완충액으로 평형을 유지한다.

적재를 완료한 후, 칼럼 배합물을 용해 완충액으로 세척하고, Q 세파로스 칼럼을 클램프에서 빼낸다. SP 세파로스를 용해 완충액, 이어서 5M 우레아(용해 완충액 중) 및 용해 완충액으로 다시 세척한다. 생성물을 선형 NaCl 구배로 용리한다.

용리액을 최종 농도 1.3mol/L로 황산암모늄으로 가염처리하고, 15분 동안 3200g에서 원심분리시킨다. 상청액을 1.3M 황산암모늄(용해 완충액 중)으로 평형을 유지하는 페닐 세파로스 칼럼에 적재한다.

페닐 세파로스의 유동을 용해 완충액으로 평형을 유지하는 소스(Source) 30 RPC 칼럼에 적용한다. 이어서, 세척을 용해 완충액, 물 및 완충액 A(5% EtOH, 0.1% TFA)로 수행한다. 생성물을 10개의 칼럼 용적중 20% 완충액 B(95% EtOH, 0.1% TFA)에서 70% 완충액으로의 선형 구배로 용리한다.

전환 단계:

용출액을 상이한 완충액, 예를 들면, 포스페이트 완충액, 10 내지 40mM, pH 6.0 내지 7.4으로 1:10으로 희석한다. 바람직한 양태에 따라서, 6.0 내지 6.5의 값이 전환 용액의 최종 pH로서 나타난다. 단백질 농도는 0.2 내지 1.0mg/mL이다.

용액을 여과 멸균하고, 35 내지 80℃의 온도에서 (상이한 배치에서) 온화하게 교반(60rpm)하면서 항온처리한다. 반응의 진행을 HPLC 분석으로 관찰한다.

최종 정제 단계:

반응이 종결되자마자, 전환 용액을 완충액 A(40mM 포스페이트, pH 6.0) 중에 평형을 유지시킨 SP 세파로스 HP 칼럼 상에 적재시킨다. 용리를 선형 NaCl 구배를 사용하여 수행한다. 용출액 중 NaCl 농도는 약 350mmol/L이고, 단백질 농도는 약 3mg/mL이다. 용출액은 완충액 A로 250mM NaCl과 상응하는 전도도로 희석된다. 이어서, 40mM 포스페이트, pH 6.0, 250mM NaCl으로 단백질 농도가 1mg/mL가 될 때까지 추가로 희석시킨다. 이에 따라, 형성된 벌크 용액을 여과 멸균시키고, 4℃ 또는 -70℃에서 제형화 준비가 될 때까지 저장한다.

분석:

상기한 논의된 전환 단계의 과정을 RP-HPLC로 관찰한다. 용리 프로파일의 크로마토그래프는 전환 반응의 시작전(t₀) 및 시간 t = 24h, t= 48h 및 t = 120h에 수행된다. 도 1에 나타난 4개의 크로마토그래프에서 볼 수 있는 바와 같이, 약 48시간 후, 단백질 90%가 35℃의 항온처리 온도에서 피로Glu-MCP-1으로 전환된다. HPLC 분석은 2개의 디설파이드 브릿지가 적합하게 형성됨을 나타낸다.

도 2는 기재된 조건하에 Gln-MCP-1에서 피로Glu-MCP-1로의 반응의 운동학을 보여준다. 반응 기간이 증가함에 따라 불순물이 나타나고, 이는 도 2에서 "변형체 2"로서 언급되고, 또한 특징을 나타내지 않는다.

유사한 반응 패턴이 0.1M 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.5, 또는 0.1M 나트륨 시트레이트 완충액, pH 3.5(데이타에 나타내지 않음)에서 전환 단계를 수행하는 경우 관찰된다.

상기한 반응을 반응 온도 35℃의 대신에 24℃, 60℃ 및 80℃에서 수행하는 것을 제외하고는 반복한다. 표 3에서 나타낸 데이타에서 명백한 것과 같이, 불만족스러운 피로Glu-MCP-1의 수율을 24℃에서 합당한 시간내에 수득된다. 한편, 60℃ 및 80℃에서 상당히 높은 반응 속도가 관찰된다. 반응 속도는 80℃에서 주위 온도의 반응 속도 보다 약 50배이다.

	온도[℃]	속도 상수[1/h]	반감기[h]	시간	순도[%]
비교 시험 1:20mM 포스페이트 pH 6.0	24	0.031	22.4	7.5 d	n.d.
20mM 포스페이트 pH 6.0	35	0.089	7.8	2.6 d	96.6
20mM 포스페이트 pH 6.0	60	0.660	1.1	8.8 h	95.0
20mM 포스페이트 pH 6.0	80	1.670	0.4	3.2 h	91.3
20mM 포스페이트 pH 6.0 150mM NaCl	35	0.041	16.9	5.6 d	n.d.
20mM 포스페이트 pH 6.0 5% EtOH	35	0.108	6.4	2.1 d	95
비교 시험 2:20mM 포스페이트 pH 8.5	35	0.037	18.7	6.2 d	n.d.
PBS Tween, 3.5% EtOH, 0.01% TFA pH 7.4	35	0.040	17.3	5.7 d	95

n.d. = 측정되지 않음, 반응의 종결이 특정 시간 후에도 도달되지 않음.

확실히, 보다 높은 반응 온도는 부산물 또는 분해 생성물을 촉진하고, 순도 수준을 감소시킨다-특히 당해 시험을 80℃에서 수행한다(표 3).

도 3은 높은 분해능에서 표 3에 요약된 조건하에서(20mM 포스페이트 완충액, 35℃, 60℃ 또는 80℃) 수득되는 피로Glu-MCP-1 제형의 용리 프로파일의 크로마토그래프를 나타낸다. 여기에서 볼 수 있는 바와 같이, 상당히 많은 불순물이, MCP-1 부산물 또는 분해 생성물로 5일간 35℃에서 항온처리하는 동안보다 짧은 항온처리 기간(예를 들면, 80℃에서 3시간)이라도 고온에서 생성된다.

에탄올(EtOH)의 함량(예를 들면, 5%)은, 당해 제조방법으로부터 수득한 제조의 임의의 양태에서, 다른 일정한 시험 조건하에서(20mM 포스페이트 완충액, pH 6.0) 반응 속도 또는 생성물의 순도에 부정적인 영향을 주지 않는다.

실시예 2: 본 발명에 따른 대안적인 방법에 의한 피로Glu-MCP-1 제형의 제조

발효, 세포 용해 및 단백질 정제 단계를 실시예 1에 설명한 바와 같이 수행한다.

전환 단계:

소스 30 RPC의 용출액을 PBS, 0.02% Tween 20으로 1:10으로 희석시킨다. 이어서, 단백질 농도는 약 0.2 내지 0.5mg/mL이고, pH는 약 7.4이다. 완충액 성분 이외에, 용액은 약 3.5% EtOH 및 0.01% TFA를 포함하고, 이는 이전 소스 30 RPC 단계의 용출액으로부터 유래된다. 용액을 밀리팩(Millipak) 20(0.2㎛, 제조원: Millipore)의 폴리프로필렌 플레이크로 여과 멸균시키고, 35℃에서 온화한 교반하에 항온처리한다. 반응의 과정을 HPLC 분석으로 관찰한다. 반응이 종결되자마자 전환 용액을 PBS, 0.02% Tween 20에 대하여 Pellikon 2 UDF 막(3k, Millipore)으로 투석한외여과(ultradiafiltering)하고, 단백질 농도를 0.1mg/mL로 조절한다. 제형을 1mL 배치에서 유리 용기로 밀리포어(Millipore) GV 필터(0.22㎛)를 통해 멸균 조건하에 경사여과한다.

분석:

전환 단계의 과정을 RP-HPLC로 관찰한다. 도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, 5일 후 90% 초과의 단백질이 피로Glu-MCP-1로 전환되고, 동시에 놀랍게도 장기간 항온처리에도 불구하고, 95%의 매우 고순도를 수득한다(표 3). 20mM 포스페이트 완충액을 함유하는 혼합물 및 20mM 포스페이트 완충액 + 150mM 염을 함유하는 혼합물(실시예 1, 표 3, 3 내지 6째줄)과 비교하여 명백한 것과 같이, 항온처리 용액으로서 PBS를 포함하는 혼합물 중 상대적으로 낮은 속도 상수는 보다 높은 염 농도, 이온 강도 또는 삼투압으로 간주될 수 있다.

실시예 3: 실시예 1 또는 실시예 2에 따라 제조된 MCP-1 제형을 기초로 한 약제학적 조성물의 제조

실시예 1 또는 실시예 2에서 수득된 피로Glu-MCP-1 제형을 PBS(염화나트륨, 인산수소이나트륨, 염화칼륨, 인산이수소칼륨; pH 7.0) 중 0.1mg/mL의 농도로 희석시키고, 또한 이는 0.02% Tween 20을 포함하고, 1mL들이 유리 용기로 이동시킨다. 최종 약제학적 용액은 투명하고 무색무취이고, 주사액 또는 주입물로 투여할 수 있다.

실시예 4: 피로Glu-MCP-1 및 Gln-MCP-1의 생물학적 활성 비교

측정 원리:

MCP-1은 MCP-1 수용체 CCR2b에 결합시키고 활성화시킨다. 수용체를 활성화시켜 칼슘을 시토졸로 유입되게 한다. 이를 형광 영상 플레이트 리더(Fluorescence Imaging Plate Reader; FLIPR; 제조원: Molecular Devices)를 사용하여 측정할 수 있다. 이를 수행하기 위해, 비활성 형광성 염료 에스테르 Fluo-4 AM을 표면에 hCCR2b가 발현되는 세포로 유동시키고, 이어서 이 에스테르는 세포간 에스테라제에 의해 분해된다. 이러한 형태에서, 형광성 염료는 Ca²⁺ 이온을 결합한다. 488nm의 파장으로 여기시키는 경우, 528nm에서 피크가 방출된다. 방출 강도는 시토졸에서의 칼슘 농도에 의존한다. 따라서, 방출된 광의 강도의 변화는 수용체의 활성 상태에 의존하는 시토졸에서의 칼슘 농도와 상관관계가 있다.

MCP-1을 가한 후 시작되는 측정 시그널인 고유 시간을 도 5에 나타낸다. MCP-1를 가한 후, 형광성의 급작스런 증가와 연관되어 칼슘이 신속하게 방출되는 것이 명백하다. 피크(b)에는 적용(a) 후 단 수초만에 도달한다. 적용(a)과 최대 자극(b) 사이의 간격은 대략 20 내지 30초이다.

다음의 시험에서, 평가는 최고값을 사용하여 수행되고, 이는, 예를 들면, 칼슘-유도된 칼슘 유입과 같은 2차 효과에 의해 덜 영향을 받기 때문이고, 이에 따라 보다 정확한 측정이 가능하다.

CHO/hCCR2B-K1 세포를 안정적으로 발현시키는 방법:

사람 CCR2b 수용체(진 뱅크 등록번호: D29984)의 코드화 영역은 PCR에 의해 증폭된다. 이어서, 1.08kb BamHI-XbaI 단편을 발현 벡터속으로 클로닝한다. CHO-K1 세포를 발현 벡터로서 작용하는 이러한 플라스미드로 전달감염시킨다.

세포를 Ham의 F12 배지계 배양 배지에서 배양시키고, 정기적으로 계대한다. 측정전 당일에 5000개의 세포를 40㎕의 배양 배지를 갖는 384-웰 검정 플레이트(제조원: Corning Costar)로 플레이팅하고, 37℃에서 5% CO₂ 중 95% 상대 습도에서 밤새 부착시켜 정치시킨다(약 24시간). 검정 전체에서, 측정은 4시간 동안 수행된다.

시험 당일에, 먼저 물질 플레이트를 제조한다. 0.1% BSA을 포함하는 한크스(Hanks) 완충액(프로테아제가 없음)을 다양한 MCP-1 제형에 대해 희석 완충액으로서 사용한다. 0.1% BSA를 포함하는 한크스 완충액을 블랭크 대조군으로서 사용한다. 이어서, Fluo-4 염료 배지의 40㎕/웰을 세포에 가하고, 당해 제형을 45분 동안 37℃에서 5% CO₂ 중에 95% 상대 습도로 항온처리한다. 이어서, 염색된 세포를 60㎕ 세정 완충액으로 4회 세척하면 각 웰에 세정 완충액의 잔류물 25㎕가 남는다. 이어서, 당해 세포를 세정 완충액으로 추가로 5분 동안 주위 온도에서 항온처리한다.

형광성을 측정하기 위해, FLIPR 측정 장치를 조절하여 염색된 웰과 염색되지 않은 웰이 적어도 인자 1:5로 차이가 나게 하고, 염색된 웰은 약 11,000 형광 계수이다. 또다른 FLIPR 설정은 다음과 같다:

여기: 488nm

방출: 510 내지 570nm[주파수폭(band pass)]

네가티브 수정: 한크스/BSA(= 블랭크 대조군과의 비교)

바이어스 공제: 6(= 물질을 가하기 전에 모든 웰을 0으로 고르게 함)

팁(tip)의 예비침지: 물질 플레이트로부터 상대 물질 용액 25㎕를 사용함(= 인공적인 부착은 최소로 함)

당해 측정 방법은 다음 단계를 포함한다:

5초 사이클에서 6 간격

가한 물질 15㎕

1초 사이클에서 60 간격

5초 사이클에서 18 간격

평가하기 위해, 물질을 가한 후 78 간격의 최대 시그널을 사용한다. 사용된 대조 혼합물은 다음과 같다:

블랭크 대조군: 네가티브 수정용

포지티브 대조군(ATP): 염색 체크용

참조 대조군(표준): - 세포상 수용체 발현을 기록함

- 공지되지 않은 샘플의 활성을 측정하기 위한 계산 기준

시험된 샘플을 동일한 희석 단계에서 참조 대조군으로 같은 방법으로 피펫팅한다. 시험에 사용할 농도를 선택하여 참조 대조군의 EC50 영역으로 한다.

본 발명에 따른 MCP-1 제형 및 본 발명에 따르지 않은 MCP-1 제형의 비교:

본 발명에 따른 방법에 의해 제조된 2개의 피로Glu-MCP-1 제형("배치 071100kh" 및 "Batch 0141921") 및 재조합 방법에 의해 제조된 MCP-1 제형[이의 N-말단 글루타민 그룹은 상기한 본 발명에 따른 방법 단계에서 피로글루타메이트 그룹으로 전환되지 않았다(Peprotech로부터 수득한 MCP-1 제형)]을 시험하고, 상기한 시험 시스템을 사용하여 비교한다. EC₅₀은 상기한 바와 같이 기록된 측정치 곡선으로부터 측정된다(도 6 참조).

실질적으로 동일한 EC₅₀ 값을 2개의 피로Glu-MCP-1 제형에서 수득하는 반면, 본 발명에 따르지 않고 N-말단이 개질되지 않은 MCP-1 제형의 값은 상당히 상이하다(도 6). 후자의 제형의 EC₅₀ 값은 인자 2 내지 3에 의해 열등한 것으로 증명된다(피로Glu-MCP-1: EC₅₀ = 7.82nM; Peprotech로부터의 MCP-1 제형: EC₅₀ = 20.76nM).

2개의 제형의 생물학적 활성도는 다음과 같이 계산된다:

먼저, 포지티브 수정(positive correction)은 피로Glu MCP-1 농도 1e-8M로 하고, 즉, 10nM 피로Glu-MCP-1의 농도에서 수득된 값을 100%로 설정한다. 이는 곡선의 상승되는 거의 직선 부분이다. 이러한 퍼센트 시그널을 사용하여, 다른 제형, 예를 들면, Peprotech MCP-1의 활성을 다음 식에 따라 계산한다.

활성도_(샘플)(%) = RFU_{(1e-8M에서의 샘플)} x 100% / RFU_{(1e-8M에서의 표준)}

상기 실시예에서, 표 4에 나타낸 바와 같이, 이는 피로Glu-MCP-1 제형을 기본으로 하는 비-N-말단 개질된 MCP-1 제형에 대해 48%의 활성도가 수득된다.

측정치[네가티브 수정(neg. corr.): 한크스/BSA; 바이어스 공제(bias substraction): 6]

	값 1	값 2	값 3	값 4
1e-8M에서의 피로Glu MCP-1(071100kh)	12137.63	13919.36	12286.6	13249.68
1e-8M에서의 MCP-1(Peprotech)	6216.81	6125.89	6836.11	5425.31

	평균	SD
1e-8M에서의 피로Glu MCP-1(071100kh)	12898.3	727.8
1e-8M에서의 MCP-1(Peprotech)	6151.0	500.2

활성도(%)_{(Mcp-1(Peprotech))} = 6151 x 100%/12898.3 = 48%

실시예 5: 피로Glu-MCP1의 온도 민감성

피로Glu-MCP-1을 1 또는 2시간 동안 56℃ 또는 95℃에서 항온처리한다. 생물학적 활성은 실시예 4의 시험 시스템을 사용하여 측정한 이후에도 존재한다.

피로Glu-MCP-1 제형을 56℃에서 1시간 또는 2시간 동안 항온처리하는 경우 변성이 일어나지 않는다는 것을 발견하였다. 그러나, 도 7에서 나타낸 바와 같이, 95℃에서의 항온처리는 매우 놀랄만한 변성 효과를 수득한다.

실시예 6: 동맥 폐쇄 질환으로 고통받는 환자의 치료:

PAOD 환자를 치료하기 위해, 상기 제조된 피로Glu-MCP-1 제형을 1.2 내지 120㎍/ml의 농도로 조절한다. 사용하기 직전에, 이 용액을 최종 농도 0.1 내지 10㎍/ml로 조절하고, 환자에게 유동 속도 2 내지 12ml/min으로 1 내지 6시간 동안 혈관 폐쇄에 의해 영향을 받는 영역에 근접한 동맥내 경로로 주입한다. 주입을 1 내지 7일 후에 반복할 수 있다.

본 발명은 재조합되어 생성된 Gln-MCP-1로부터의 피로Glu-MCP-1의 제조방법 및 피로Glu-MCP-1 제형을 함유하는 조성물에 관한 것이다.

MCP-1(단핵 세포 화학 유인물질 단백질-1; 또는 단핵 세포 화학주성 및 활성 인자 'MCAF', 대식세포 화학주성 인자 'MCF', 종양 괴사 인자 자극된 유전자-8 'TSG-8', 'HC-11', 평활근 세포 화학주성 인자 'SMC-CF', 림프구 유도된 화학주성 인자 'LDCF' 뿐만 아니라 신경아교종 유도된 화학주성 인자 'GDCF'로서 공지됨)은 CC-케모킨 과의 원이다. 사람 MCP-1 단백질은 원래 미국 특허 제5,714,578호에 기재되어 있다. 자연 조건하에서 바디(선천성)에서 전구체 단백질 99 아미노산으로서 오랜 동안 합성되고, 이어서 76 아미노산 그룹을 갖는 펩타이드를 형성하여 가공된다. 성숙 사람 MCP-1(hMCP-1)은 분자량 14kDa의 글리코단백질이고, 세포, 예를 들면, 평활근 혈관 세포 및 내피 세포의 다수 형태로 분비된다[참조: Leonard and Yoshimura (1990), Immunology Today 11, 97-101]. 2개의 분자간 디설파이드 브릿지를 포함하고, 선천적으로 발현되는 경우 O-글리코실화되고 시알릴화된다[참조: J. Yan Ling et al. (1990), Journal of Biological Chemistry, 265, 18318-18321].

단백질은 염색체 위치 17q11.2-q21.1의 JE 유전자의 생성물이다. 이 유전자 자리는 또한 SCY A2(소 사이토킨 A2)로서 공지되어 있다. 사람 유전자는 처음으로 미국 특허 제5,212,073호에 기술되었다. 이 유전자의 발현은 다수의 사이토킨, 예를 들면, 종양 괴사 인자 알파 뿐만 아니라, 예를 들면, 면역글로불린 G에 의해 유도될 수 있다. 유전자 서열 및 추가의 유전자 및 유전자 생성물의 정보는 NCBI 데이타 뱅크의 등록번호 M37719하에 이용가능하다(참조: 표 1).

[표 1]

사람 단핵 세포 화학주성 단백질 유전자, 완전한 cds

자리 HUMMCHEMP 2776 bp DNA 선형 PRI 1994년5월13일

정의 단핵 세포 화학주성 단백질 유전자, 완전한 cds.

승인 M37719

버전 M37719.1 GI:187447

주제어 단핵 세포 화학주성 단백질.

근원 호모 사피엔스(사람)

유기체 호모 사피엔스

진핵생물군; 후생동물; 척색동물문; 유두류; 척추 동물문; 골 척 추동물(Euteleostomi); 포유류; 진수 아강; 영장류; 협비류;

사람과; 사람속.

참조 1(염기 1 내지 2776)

저자 Shyy, Y.J., Li, Y.S. and Kolattukudy, P.E.

제목 사람 단핵 세포 화학주성 단백질 유전자의 구조 및 이의 TPA에

의한 조절

저널 Biochem. Biophys. Res. Commun. 169 (2), 346-351 (1990)

의학 문헌 검색 시스템(MEDLINE) 90290466

비평 원본 소스 텍스트: 사람 DNA.

특징 위치/한정자

소스 1..2776

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유전자 598..2080

/유전자="SCYA2"

CDS join(598..673,1472..1589,1975..2080)

/유전자="SCYA2"

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번역= "MKVSAALLCLLLIAATFIPQGLAQPDAINAPVTCCYNFTNRKISVQRLA SYRRITSSKCPKEAVIFKTIVAKEICADPKQKWVQDSMDHLDKQTQTPKT"

엑손 <598..673

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엑손 598..673

/유전자="SCYA2"

/기록="단핵 세포 화학주성 단백질"

/수치=1

인트론 674..1471

/유전자="SCYA2"

/기록="단핵 세포 화학주성 단백질 인트론 A"

엑손 1472..1589

/유전자="SCYA2"

/기록="단핵 세포 화학주성 단백질"

/수치=2

인트론 1590..1974

/유전자="SCYA2"

/기록="단핵 세포 화학주성 단백질 인트론 B"

엑손 1975..2080

/유전자="SCYA2"

/기록="단핵 세포 화학주성 단백질"

/수치=3

엑손 1975..>2080

/유전자="SCYA2"

/기록="단핵 세포 화학주성 단백질"

/수치=3

염기 계수 700 a 727 c 565 g 781 t 3 기타

오리진

1 cagttcaatg tttacacaat cctacagttc tgctaggctt ctatgatgct actattctgc

61 atttgaatga gcaaatggat ttaatgcatt gtcagggagc cggccaaagc ttgagagctc

121 cttcctggct gggaggcccc ttggaatgtg gcctgaaggt aagctggcag cgagcctgac

181 atgctttcat ctagtttcct cgcttccttc cttttcctgc agttttcgct tcagagaaag

241 cagaatcctt aaaaataacc ctcttagttc acatctgtgg tcagtctggg cttaatggca

301 ccccatcctc cccatttgcg tcatttggtc tcagcagtga atggaaaaaa gtgctcgtcc

361 tcacccccct gcttcccttt cctacttcct ggaaatccac aggatgctgc atttgctcag

421 cagatttaac agcccactta tcactcatgg aagatccctc ctcctgcttg actccgccct

481 ctctccctct gcccgctttc aataagaggc agagacagca gccagaggaa ccgagaggct

541 gagactaacc cagaaacatc caattctcaa actgaagctc gcactctcgc ctccagcatg

601 aaagtctctg ccgcccttct gtgcctgctg ctcatagcag ccaccttcat tccccaaggg

661 ctcgctcagc caggtaaggc cccctcttct tctccttgaa ccacattgtc ttctctctga

721 gttatcatgg accatccaag cagacgtggt acccacagtc ttgctttaac gctacttttc

781 caagataagg tgactcagaa aaggacaagg ggtgagcccc aaccacacag ctgctgctcg

841 gcagagcctg aactagaatt ccagctgtga acccaaatcc agctccttcc aggattcagg

901 atccagctct gggaacacac tcagcagtta ctcccccagc tgcttccagc agagtttggg

961 gatcagggta atcaaagaga agggtgggtg tgtaggctgt ttccagacac gctggagacc

1021 cagaatctgg tctgtgcttc attcacctta gcttccagag accggtgact ctgcaggtaa

1081 tgagtatcag ggaaactcat gaccaggcat agctattcag agtctaaaag gaggctcata

1141 gtggggctcc cagctgatct tccctggtgc tgatcatctg gattattggt ccgtcttaat

1201 gacacttgta ggcattatct agctttaaca gctcctcctt ctctctgtcc attatcaatg

1261 ttatataccc cattttacag cataggaaac tgagtcattg ggtcaaagat cacattctag

1321 ctctgaggta taggcagaag cactgggatt taatgagctc tttctcttct cctgcctgcc

1381 ttttgttttt tcctcatgac tcttttctgc tcttaagatc agaataatcc agttcatcct

1441 aaaatgcttt tctttgtggt ttattttcca gatgcaatca atgccccagt cacctgctgc

1501 tataacttca ccaataggaa gatctcagtg cagaggctcg cgagctatag aagaatcacc

1561 agcagcaagt gtcccaaaga agctgtgatg tgagttcagc acaccaacct tccctggcct

1621 gaagttcttc cttgtggagc aagggacaag cctcataaac ctagagtcag agagtgcact

1681 atttaactta atgtacaaag gttcccaatg ggaaaactga ggcaccaagg gaaaaagtga

1741 accccaacat cactctccac ctgggtgcct attcagaaca ccccaatttc tttagcttga

1801 agtcaggatg gctccacctg gacacctata ggagcagttt gccctgggtt ccctccttcc

1861 acctgcgtcc tcctagtctc catggcagct cgcttttggt gcagaatggg ctgcacttct

1921 agaccaaaac tgcaaaggaa cttcatctaa ctctgtctcc tcccttcccc acagcttcaa

1981 gaccattgtg gccaaggaga tctgtgctga ccccaagcag aagtgggttc aggattccat

2041 ggaccacctg gacaagcaaa cccaaactcc gaagacttga acactcactc cacaacccaa

2101 gaatctgcag ctaacttatt ttcccctagc tttccccaga caccctgttt tattttatta

2161 taatgaattt tgtttgttga tgtgaaacat tatgccttaa gtaatgttaa ttcttattta

2221 agttattgat gttttaagtt tatctttcat ggtactagtg ttttttagat acagagactt

2281 ggggaaattg cttttcctct tgaaccacag ttctacccct gggatgtttt gagggtcttt

2341 gcaagaatca ttaatacaaa gaattttttt taacattcca atgcattgct aaaatattat

2401 tgtggaaatg aatattttgt aactattaca ccaaataaat atatttttgt acaaaacctg

2461 acttccagtg ttttcttgaa ggaaattaca aagctgagag tatgagcttg gtggtgacaa

2521 aggaacatga tttcagaggg tggggcttac attttgaagg aatgggaaag tggattggcc

2581 cnntntcttc ctccactggg tggtctcctc tgagtctccg gtagaagaat ctttatggca

2641 ggccagttag gcattaaagc accacccttc cagtcttcaa cataagcagc ccagagtcca

2701 atgaccctgg tcacccattt gcaagagccc acccccattt cttttgctct cacgaccctg

2761 accctgcatg caattt

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___________________________________________________________________

상기한 미국 특허 제5,714,578호에는 선천성 근원으로부터 분리된 MCP-1 단백질의 경우 N 말단이 차단되는 것이 이미 설명되어 있다. 이후에 성숙 단백질의 N 말단에서 리터 서열의 분열후 노출된 글루타민은 환형이고, 하나의 NH₃ 분자를 손실하여 피로글루타메이트 그룹을 형성하는 후-번역 개질 때문인 것으로 밝혀졌다.

MCP-1에 대한 해독 틀 코드화의 확인은 미국 특허 제5,212,073호에서 단백질의 재조합형 발현이 되도록 한다. 재조합 방법, 예를 들면, E. coli에 의해 제조된 MCP-1은 선천성 MCP-1의 통상적인 N- 또는 O-글리코실화 패턴을 갖지 않는다. 이러한 방법으로 제조된 MCP-1 제형은 또한 선천성 물질로부터 수득된 제형에서와 동일한 방법으로 에드만 분해(Edman decomposition)를 방해하지 않는다. 즉, 차단되지 않은 N 말단(글루타민)을 포함한다. 대식세포에서의 화학주성 효과를 기초로 하는 세포 검정에서, 선천성 MCP-1 제형의 생물학적 활성과 재조합 방법에 의해 수득한 제형의 생물학적 활성은 본래부터 차이가 없다는 것을 알 수 있다.

생리학적 조건하에서, MCP-1은 베타-케모킨 수용체 CCR2 및 CCR4에서 작용제로서 작용하고, 이들 둘 다는 단핵 세포에서 주로 발현되고, 또한 호염기성 세포에서 및 T-림프구와 B-림프구에서 둘 다 발견된다. MCP-1은 나노몰 이하의 농도에서도 단핵 세포 화학주성을 유도한다. 수용체 CCR2 및 CCR4는 단핵 세포의 활성 및 인테그린의 부착 증가를 야기하는 G-단백질-결합된 7개-막 도메인 수용체이다. 이 방법은 궁극적으로 단핵 세포의 내피 세포로의 도킹(docking) 및 혈관 시스템으로부터의 단핵 세포의 후속적인 출발을 야기한다.

국제 특허공개공보 제98/44953호에는 동맥 형성, 즉 존재하는 세동맥 연결부로부터의 곁 동맥 및/또는 기타 동맥의 성장에 대한 MCP-1의 영향이 기재되어 있다. 이러한 발견을 근간으로 하여, 상기한 국제 특허공개공보에는 치료학적 목적, 즉 신규한 혈관의 형성을 자극하여 완화시킬 수 있는 혈관 폐쇄 질환을 치료하기 위한 목적으로 MCP-1을 사용할 것을 제안한다. 이러한 혈관 폐쇄 질환은 특히 관상 동맥 질환(CAD), 말초 동맥 폐쇄 질환(PAOD), 대뇌 및 격막 동맥 폐쇄 질환 등이다. 당해 공보는 MCP-1-중화제, 예를 들면, 특히 종양 성장을 억제하기 위해 신규한 혈관 형성을 방지하기 위한 항-MCP-1-항체의 사용을 제안하고, 특히 이는 충분한 혈액 공급 및 이에 따른 종양 조직의 적합한 혈관신생에 의존한다.

조직의 혈관신생을 촉진하기 위한 치료학적 접근에서 상기 설명한 바와 같은 MCP-1 단백질을 사용 가능하게 하기 위해, 이러한 단백질을 충분한 양으로 사용하여 약제학적 목적을 위해 충분한 순도로 이용가능하여야 한다. 사람 MCP-1은 원래 사람 신경아교종 세포 주 U105MG의 배양으로부터 또는 말초 혈액의 사람 단핵 백혈구로부터 선천성 형태로 수득된다. 치료학적 목적으로 의도된 단백질은 이들 근원으로부터 분리될 수 없는데 이는 충분히 다량의 제조에서 노동 및/또는 물질에 대한 허용되지 않은 고 비용이 들 수 있기 때문이고, 이로서 목적하는 양의 사람 백혈구를 수득할 수 없다. 신경아교종 세포는 사실상 실질적으로 제한되지 않은 양으로 복제될 수 있지만, 생물공학 발효조에서 배양에서는 부적합하고, 이의 배양용 소태아 혈청이 필요하고, 이는 많은 부수적인 문제점을 갖는다.

따라서, 본 발명에서 바람직하게 기대되는 것은 MCP-1의 선천성 발현 대신에 재조합 방법에 의해 MCP-1을 제조하는 것이다. 사실상, 재조합형 사람 MCP-1은 이미 시판되고 있다[제조원: Messrs R&D Systems(카탈로그 번호 279-MC) 및 Peprotech(카탈로그 번호 300-04; 표 2참조; 인용된 카탈로그 번호는 2003년 1월에 적용된 것이다). 시판되는 재조합형 MCP-1 제형의 제품 설명서에 따라, 이에 존재하는 MCP-1 단백질은 아미노산 글루타민(Q)을 N 말단에 포함한다. 제품 기술은 또한 이 단백질 제형이 특히 개조된 액체 형태(추천되는 최대 보관 기간: 4℃에서 1주)로 매우 민감성임을 나타낸다. 사실상, 발명자들(국내 선행 기술)에 의한 시험은 통상적인 MCP-1 단백질 제형이 용해된 형태로 보관되는 경우, 당해 생물학적 활성-단백질 제형이 분해 생성물에 의한 오염의 표시를 매우 신속하게 특히 4℃ 초과의 온도에서 나타난다는 것을 보여준다(HPLC 크로마토그래프에서 2차 밴드의 출현).

[표 2]

(Messrs Peprotech의 인터넷 웹사이트, http//www.peprotech.com/content/details.htm?results=1&prod=1392에서 발췌)

재조합형 사람 MCAF (사람 MCP-1)

기술:	대식세포/단핵 세포 화학주성 및 활성 인자(MCAF)로 공지된 사람 단핵 세포 화학주성 단백질-1(MCP-1)은 76 아미노산 잔기를 포함하는 8.6 kDa 단백질이다. 혈액 단핵 세포 및 조직 대식세포의 염증 반응에서 중요한 역할을 한다.
카탈로그 번호:	300-04
소스:	E.coli
형성:	멸균 여과 용액을 첨가제 없이 동결건조시킨다.
안정성:	동결건조시킨 단백질은 실온에서 수주 동안 안정하지만, -20℃에서 가장 우수하게 보관된다. 개조된 사람 MCAF는 -20℃에서 실질 분취량으로 보관하여야 한다.
순도:	SDS-PAGE 및 HPLC 분석에 의해 99% 초과. 내독소 수준은 0.1ng/㎍(1EU/㎍) 미만이다.
개조:	본 발명자들은 신속하게 회전시키고 0.1 내지 1.0mg/ml의 농도로 물중에 개조시킬 것을 추천한다. 이어서, 이 용액을 다른 수성 완충액으로 희석시키고, 4℃에서 1주 동안 또는 향후 사용하기 위해 -20℃에서 보관할 수 있다.
생물학적 활성:	5.0 내지 20.0ng/ml이 농도 범위를 사용하는 화학유인 사람 단핵 세포의 이의 가능성에 의해 측정함.
AA 서열:	QPDAINAPVT CCYNFTNRKI SVQRLASYRR ITSSKCPKEA VIFKTIVAKE ICADPKQKWV QDSMDHLDKQ TQTPKT
원산 국가:	미국

재조합되어 생성되는 사람 MCP-1 단백질의 통상적인 방법은 용융 단백질로서 단백질의 온도-유도된 발현, 후속적으로 형성된 봉입체의 정제, 단백질의 용해 및 다시접힘(refolding), 및 용융 단백질로부터 hMCP-1 단백질의 후속적인 효소 방출에 의한다.

사람 MCP-1 단백질의 재조합 방법의 통상적인 방법에서, 하나 이상의 아미노산에 의해 N-말단의 단쇄된 단백질이 종종 부산물로서 수득되는 문제가 있다. 이들 부산물은 생물학적 시스템에서 MCP-1 수용체에 대한 길항제로서 거동할 수 있다.

문헌[참조: Van Coillie et al. (1998), Biochemistry 37: 12672, 12673 a.E]에 기재된 방법은 MCP-2의 생물학적 활성에 대한 N-말단 개질의 효과에 관한 실험과 연관지어 기술되어 있고, 여기서, 재조합 방법에 의해 수득된 MCP-2 제형은 0.01M Na₂HPO₄, pH 8.0에서 24시간 동안 37℃에서 항온처리된다. MCP-2는 아미노산 서열의 수준에서 MCP-1과의 균질도는 62%이고, 또한 N-말단 비개질된 MCP-1은 MCP-2와 달리 생물학적으로 활성인 범위까지 상이하다(참조: 표 2의 "생물학적 활성" 줄). 당해 저술자는 N-말단 글루타민 그룹에서 상기한 조건하에서 생성되는 피로글루타메이트 그룹으로 전환의 정도를 결정하지 못했다. 본 발명자들은 (국내 선행 기술에서) MCP-1에 필적하는 조건을 적용하여 임의의 경우 N-말단 아미노산의 부분 환화만을 수득할 수 있다는 것을 발견하였다(참조: 표 3, 비교 시험 2).

따라서, 본 발명의 하나의 목적은, 상기 논의한 관점에서, MCP-1-제형(MCP-1 조성물)이 (a) 이의 생물학적 활성의 관점에서 치료학적 목적에 적합하고, (b) 약물 허가 절차의 조건에 유리하고, 생약제의 경우, 약제학적 조성물 생성의 순도 및 재생에 관해 수행되기에 극도로 어려운 요구 조건을 포함하고, 특히 (c) 우수한 저장 수명을 갖도록 제조될 수 있는 방법을 제공하는 것이다. 또다른 관련된 목적은 재조합 방법에 의해 생성된 MCP-1을 포함하고, 상기한 목적에 적합하고 상기한 이점을 갖는 조성물 또는 제형을 제공하는 것이다.

이러한 목적은 청구의 범위에 언급된 MCP-1 함유 조성물 및 방법에 의해 성취된다.

따라서, 본 발명에 따른 재조합되어 생성된 Gln-MCP-1로부터 피로Glu-MCP-1의 제조방법을 제공하고, 여기서, Gln-MCP-1은 30 내지 80℃ 범위, 바람직하게는 30 내지 70℃ 범위, 보다 바람직하게는 35 내지 60℃ 범위의 온도에서 염 농도가 10 내지 160mM의 범위, 바람직하게는 10 내지 100mM의 범위이고, 이의 pH가 2 내지 7.5, 바람직하게는 3.5 내지 7.5, 보다 바람직하게는 3.5 내지 6.5, 보다 바람직하게는 5 내지 6.5, 보다 바람직하게는 5.5 내지 6.5의 범위이고, 보다 바람직하게는 약 6인 완충 용액 중에서 항온처리된다. 항온처리는 항온처리된 완충 용액에 포함되는 MCP-1이 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%로 피로Glu-MCP-1의 형태로 존재할 때까지 수행된다.

"MCP-1"은 본원에서 당해 기술 범위내에서 N-말단 글루타민 그룹("Gln-MCP-1" 참조: 표 1 및 표 2에 나타낸 아미노산 서열) 또는 피로글루타메이트 그룹("피로Glu-MCP-1")으로 이미 전환/환화된 N 말단을 갖는 MCP-1 단백질(프리프로서열 없음)을 의미한다. 그러나, 이의 생물학적 기능(특히, 단핵 세포-유인물질 활성 또는 CCR 수용체에서의 효과)에 영향을 주지 않고 구조를 변경시키지 않아서 더이상 상기한 반응 파라미터가 목적하는 결과(즉, 당해 단백질은 더 이상 본 발명에 따른 방법에 의해 피로Glu-변형체로 전환될 수 없다)를 더 이상 제공하지 않는 MCP-1-단백질의 개질은 본원의 보호 범위내에 속하지 않는다는 것이 명백하다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 또한 자연적으로 MCP-1에 적용가능하고, 여기서, 통상적인 아미노산 교환, 예를 들면, 세린에서 트레오닐 또는 류신에서 이소류신으로의 교환이 일어나고, 단 이는 생물학적 기능 또는 수득한 단백질의 활성에 영향을 주지 않고, 상기한 방법에 따른 N-말단 글루타민의 피로글루타메이트로의 전환가능성에 영향을 주지 않는다. 따라서, 본 발명에 따른 방법은 또한 다른 포유동물, 예를 들면, 래트, 마이스, 기니 피그, 래빗 및 페릿(및 수종의 다른 포유동물)의 MCP-1 단백질에 적용될 수 있다.

상기한 방법으로 수행되는 완충 용액은 낮은 또는 생리학적 몰농도, 즉 10 내지 160mM, 10 내지 80mM, 10 내지 50mM, 20 내지 40mM 또는 약 20 또는 40mM의 범위의 바람직하게는 인산염-완충된(인산나트륨 및/또는 인산칼륨-완충된) 수용액이다. 보다 장시간의 항온처리가 허용되는 경우, 본 발명의 하나의 구체적인 양태에 따라서, 당해 작업은 또한 생리학적 몰농도, 예를 들면, 약 150mM의 식염수 농도에서 수행될 수 있고, 이 몰농도는 바람직하게는 포스페이트-완충된 식염수 또는 "PBS"를 사용하여 성취된다. 보다 장기간의 항온처리의 단점-및 분해, 2차 또는 산화 물질의 증가되는 양의 부수적인 위험-은 이러한 구체적인 양태에서 생리학적 염 농도를 갖는 용액 형태로 바로 단백질 제형을 수득할 수 있는 이점에 의해 보완된다.

개질 단계가 수행된 완충 용액은 또한, 예를 들면, (마일드) 세정제, 항산화제, 보존제, 착화제, 안정화제, 항균제 등을 포함할 수 있다.

항온처리 온도는 30 내지 80℃, 즉 주위 온도 초과의 범위에서 선택된다. 보다 낮은 온도에서, 전환 단계는 매우 느리게 진행된다. 실질적인 전체 전환율을 성취하기 위해, 항온처리 기간은 실질적으로 1주일 초과로 증가시킬 수 있다. 이는 생물공학 방법에서 허용되지 않은 시간을 정치시켜야 하고, 또한 실질적으로 단백질 용액이 오염되는 다른 형태의 위험을 증가시킬 수 있다(분해 또는 산화 생성물, 박테리아, 바이러스 또는 다른 병원균). 한편, 항온처리 온도를 80℃초과로 증가시키는 것이 사실상 전환반응을 보다 신속하게 하지만, 또한 바람직하지 않은 부산물 및 분해 생성물의 형성을 증가시킨다(참조: 실시예 1 및 2). 6일 이하의 정치 시간이 허용되는 경우, 35 내지 40℃의 항온처리 온도가 특히 바람직하다. 항온처리가 가능한 상당히 단시간인 경우, 항온처리는 또한, 예를 들면, 50 내지 60℃, 70℃ 또는 80℃ 범위로 수행할 수 있다. 40 내지 50℃의 온도에서 또한 당연히 목적하는 결과물을 생성할 수 있다.

항온처리되는 완충 용액의 pH는 2 내지 7.5의 범위, 즉 중성 내지 산성 범위일 수 있다. 이는 바람직하게는 3.5 내지 7.5의 범위, 보다 바람직하게는 3.5 내지 6.5의 범위, 보다 바람직하게는 5 내지 6.5의 범위, 보다 바람직하게는 5.5 내지 6.5의 범위이고, 보다 바람직하게는 약 6의 pH를 선택한다.

예를 들면, 실시예에 기재된 바와 같은 상기 파라미터의 적합한 선택에서, 피로Glu-MCP-1 변형물을 임의의 경우에서 90%의 순도로 수득할 수 있고, 보다 높은 순도, 예를 들면, 95%, 96% 또는 98%도 가능하고, 이러한 퍼센트는, 용액(즉, Gln-MCP-1의 잔여 양 및 가능한 산화 생성물 및 다른 부산물 또는 분해 생성물을 포함함)에 존재하는 전체 MCP-1의 양을 기준으로 하여, 피로Glu-MCP-1(예를 들면, HPLC 용리 프로파일에서 곡선 아래 면적으로 측정됨)의 양을 나타낸다.

본 발명의 다른 양태에 따라서,

- 숙주 세포에서 MCP-1에 대한 유전자 구조 코드화의 발현에 의해 제조합 방법으로 Gln-MCP-1 제형을 제조하는 단계,

- Gln-MCP-1 제형에 포함된 Gln-MCP-1을 임의로 농축시키거나/시키고 정제하는 단계 및

- 최종적으로 Gln-MCP-1 제형에 포함되거나 농축 및/또는 정제하기 전에 포함된 Gln-MCP-1을 단백질 분자 종 피로Glu-MCP-1을 포함하는 피로Glu-MCP-1 제형으로 전환시키는 단계(이 단계는 상기한 "재조합되어 생성된 Gln-MCP-1로부터의 피로Glu-MCP-1의 제조방법에 따라 수행됨)를 최소한의 단계로 포함하는 피로Glu-MCP-1 제형의 제조방법을 제공한다.

이러한 방법은 임의로 또한, 예를 들면, 칼럼 크로마토그래피, 투석, 한외여과 등의 후속적인 단계에 의해 피로Glu-MCP-1 제형을 완충하거나 추가 정제함을 포함할 수 있다.

생물공학에 의한 재조합형 단백질의 제조방법이 공지되어 있다. 이들은 특히, 발효, 정제, 농도 및 다른 단계를 포함한다. 상기된 전환 단계는 "다단계 방법"에서 여러지점에 포함될 수 있고, 즉 거의 정제되지 않거나 완전히 정제된 MCP-1 단백질 용액을 출발 용액으로서 포함한다. 특히, 다소 또는 실질적으로 완전히 정제된 형태의 아직 (완전히) 전환되지 않은 Gln-MCP-1을 동결건조시켜 이의 저장 수명을 전환되지 않은 형태로서 개선시키고, 적합한 방법으로 용액으로 되돌린 다음, 상기한 방법에 따라서 피로Glu-MCP-1로 전환시키는 방법을 또한 생각할 수 있다. 자연적으로, 피로Glu-MCP-1로 전화한 후 수득한 단백질 용액을 또한 동결건조시킬 수 있다.

당해 방법의 제품, 즉 N-말단 개질(전환)이 수행된 피로Glu-MCP-1 제형은 본 발명에 따라, MCP-1(예를 들면, 산화에 의해 형성되는 전환된 단백질 + 진환되지 않은 단백질 + 부산물)의 전체 함량을 기준으로 하여, 적어도 90%, 바람직하게는 적어도 95%, 보다 바람직하게는 적어도 96%의 피로Glu-MCP-1의 양을 포함한다.

용어 (Gln- 또는 피로Glu-MCP-1-) 제형은 당해 방법의 다양한 단계에서, MCP-1 단백질이 (완충액) 용액으로 용해된 형태로 존재하고, 이에 따라 다른 성분은 MCP-1 이외에, 임의의 경우, 사용된 완충액 염의 이온 및 가능한 경우 다른 염, 항산화제, 안정화제, 항균제, 세정제, 보존제, 착화제 등이 존재할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에 따라서, 조성물은 피로Glu-MCP-1 또는 상기한 과정에 의해 수득되는 피로Glu-MCP-1 제형을 포함하여 제조되고, 여기서 조성물에 포함된 MCP-1(전환된 단백질 + 진환되지 않은 단백질 + 부산물; 즉 예를 들면, HPLC 용리 크로마토그래프에서 "곡선 아래 영역") 적어도 90%가 피로Glu-MCP-1 형태로 존재한다.

따라서, 본 발명은 또한 원핵생물 및 특히 바람직하게는 E. coli에서 재조합 방법에 의해 생성된 MCPO-1 제형에 관한 것이고, 여기서, 적어도 90%의 MCP-1 단백질이 피로Glu-MCP-1로서 존재한다. 통상의 발현 세포로 제조되는 경우, 단백질은 선천성 생성에서와 달리 종종 천연 글리코실화 패턴을 나타나지 않는다. 원핵생물, 예를 들면, E. coli에서 제조하는 경우, 특히, 수득된 피로Glu-MCP-1 또는 사람 바디에서 선천적으로 발현되는 형태와 상이하게 수득되는 피로Glu-MCP-1 제형은 글리코실화 및/또는 시아릴화될 수 없고, 이에 따라 이러한 종류의 선천성 단백질 또는 선천성 근원으로부터 수득되는 단백질 제형과는 상이하다.

본 발명에 따른 이러한 종류의 조성물은 특히 전체 MCP-1 함량(전환된 단백질 + 전환되지 않은 단백질 + 부산물) 90% 초과, 95% 또는 96%로 이루어진 피로Glu-MCP-1의 양 이외에 통상적인 부형제 및 담체, 염, 항산화제, 안정화제, 항균제, 세정제, 보존제, 착화제 등을 포함하는 약제 또는 약제학적 조성물일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 동맥 폐쇄 질환, 예를 들면, 특히 PAOD 또는 CAD로부터 고통받는 환자를 치료하는데 사용될 수 있다. 치료는 치료학적 유효량의 이러한 조성물을 적합한 경로, 예를 들면, 동맥내 주입 또는 동맥주위로 부착되는 겔 형태로 투여함을 포함하고, MCP-1 단백질은 상당히 장기간 동안 방출된다.

놀랍게도, 예상되는 것과는 달리, 수용액 중 및 승온에서 재조합형으로 제조된 MCP-1 단백질 제형의 항온처리는 이의 분해 및 생물학적 비활성을 야기하지 않는다; 반면, 다수의 파라미터를 적합하게 선택하여, 생물공학적 관점에서 매우 드물고, 보통 본래부터 바람직하지 않은 이러한 단계는 놀랍게도 균질하고 생물학적으로 완전히 활성인 피로Glu-MCP-1 제형을 수득하고, 장기간의 저장 동안에도 균질하게 남아 있고, 즉 Gln-MCP-1 (출발) 제형에서 보다 안정하다.

미국 식약청(Food and Drug Administration) 또는 유럽의 EMEA과 같은 조직은 환자를 보호하는 궁극적인 목적으로 약물 제조자에게 부과하는 다수의 충족 조건에 의존하는 약물의 시판 승인을 허가한다. 따라서, 당해 제조자는, 예를 들면, 약제학적 제품의 순도, 이의 저장 수명 및 이의 제품으로의 재생을 예시하는 증명서를 제공해야 한다. 이러한 3가지 관점은 단지 적은 선택사항이지만, 생약제, 즉 천연 물질 또는 이로부터 유도된 물질(단백질, 핵산, 프로테글리칸, 폴리삭카라이드 등)로 이루어진 거대 분자 활성 물질을 포함하는 약물의 허가에서 중요한 요소가 된다. 종종, 이러한 승인 체재내에 (생)약제에 요구되는 이러한 요구사항은 충족시키기가 매우 어렵다. 예를 들면, 단백질을 기본으로 하는 활성 물질은 다소 복잡한 세포 유기체로 이의 제조후에 집약적이고 복잡한 다단계 정제를 수행해야 하고, 예를 들면, 산화 또는 다른 자발적인 화학적 반응에 의해 구조가 제어할 수 없을 정도로 변경되어서는 안된다. 또한, 최종 생성물은 합리적인 보관 수명을 가져서 제품-특히 단백질에서, 올바른 2차 구조(접힘)을 유지하는 것이 중요한 경우, 일반적으로 단지 큰 난점을 만족시키는 요구조건-을 사용하는 제조자와 처방 의사 또는 환자 또는 진료소 사이의 복잡하고 비싼 공급 네트워크가 필요없다.

MCP-1 단백질의 경우, 시판되는 제형의 품질은, 예를 들면, 시험관내 시험에서 다수의 경우에 종종 적합하다. 그러나, 본 발명자들은 동일한 제형은 승인될 수 있는 약물을 제조하는데 적합한 방법이 없다는 것을 이러한 연구 중에 발견하였다. 환자에게 투여하기 전에 용액 중에 주위 온도에서 단시간 동안이라도 정치시키는 것은 의사의 외과 병원에서 불가능한데, 예를 들면, 이는 본 발명자들의 경험상, 오염물로서 본래 관찰되는 MCP-1 제형 중 "분해" 생성물을 야기한다. 본래 활성 물질로서 제조된 Gln-MCP-1 보다 강력한 정제는 간단히 높은 수준의 순도로 저장되지만, 이러한 제형도 간단히 용액중에 주위 온도에서 보관하는 경우 다시 불안정하다. 이러한 불안정한 활성 물질 제형을 기본으로 하는 약물의 승인 절차 과정은, 전부 다 바람직하지 않는 경우, 심각한 문제가 된다.

놀랍게도, 이러한 문제는 본 발명의 교시에 의해 극복될 수 있고, 여기서, 특이하고 처음 시도되는 관점의 고도의 역-생성 단계, 즉 (명확히 비균질성을 촉진시키는 것으로 이미 알려진) 승온에서의 항온처리는 실제 제형 및 정제 방법에 포함된다. 사실상, 본 발명자들에 의해 상세하게 분석되고 완성된 조건하에서 수행하는 경우, 이러한 항온처리는 본래 활성 물질 Gln-MCP-1에서 본래 오염물로서 언급되는 피로Glu-MCP-1 형태로의 실질적으로 정량적인 전환을 야기할 수 있다. 이어서, 이러한 후자의 형태는 놀랍게도 단백질-변성 효과, 예를 들면, 승온에서의 항온처리 등에 대해서는 안정하다. 따라서, 고순도 및 균질도, 예상되는 재생가능한 제조 및 보관 안정성에 의해 수득되는 MCP-1 제형은 용이하게 언급되는 상응하는 허가 절차의 엄격한 요구조건에 부합하는 바람직하게 가능한 약제학적 활성 물질로서 사용하기에 적합하고, 이에 따라 MCP-1의 활성을 기초로 하는 신규한 치료학적 방법을 실시할 수 있게 된다.

본 발명의 부분 양태에 따라서, 상기한 방법 및 청구의 범위에 의해 제조되는 피로Glu-MCP-1 제형은

- 혈관 폐쇄 질환, 예를 들면, 특히 관상 동맥 질환(CAD), 말초 동맥 폐쇄 질환(PAOD), 대뇌 및 격막 동맥 폐쇄 질환의 치료학적 치료용 또는

- 혈관 폐쇄 질환, 예를 들면, 특히 관상 동맥 질환(CAD), 말초 동맥 폐쇄 질환(PAOD), 대뇌 및 격막 동맥 폐쇄 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물의 제조용으로 사용된다.

따라서, 본 발명은 또한 상기한 혈관 폐쇄 질환으로 고통받는 환자를 치료하는 방법을 수행할 수 있게 하고, 여기서, 전환에 의해 제조되는 피로Glu-MCP-1 제형 또는 이러한 종류의 피로Glu-MCP-1 제형을 사용하는 약제학적 조성물을, 예를 들면. 주사 또는 주입으로 투여한다.

개별적으로 최적화된 공정 파라미터에 관해서, 생물공학자는 이들이 단백질 제형을 상당히 장시간 동안, 몇몇의 경우, 수일 동안 승온에서, 예를 들면, 60℃에서 항온처리해야 하는 것으로 용이하게 확신할 수 없다는 것을 인지할 수 있다. 이미 최적화된 것으로 공지된 항온처리 용액의 중성 내지 산성 pH에 대해서, 이는 화학적 논리에 반대된다: 글루타민에서 사이클릭 피로글루타메이트로의 전환은 유리 전자 쌍이 글루타메이트의 C-알파-아미노 그룹의 공격하는 질소원자가 C-감마-아미드 그룹의 C원자에서 작용을 하는 친핵성 치환 반응이다. 산성 pH는 본래 C-알파-아미노 그룹의 양자화를 증가시킬 수 있고, 이에 따라 반응 속도에 나쁜 영향을 줄 수 있다. 그러나, 이는 본 발명자들이 밝혀낸 것에 따라서 이 경우에서는 정확하지 않다. 각각의 설명되지 않은 하나의 가능한 설명은 접힌 MCP-1 단백질이 N 말단에 대해 미세 환경을 형성하고, 여기서, 주위 수용액이 산성 pH임에도 불구하고, 아미노 그룹은 비양자화된 형태로 존재하고, 즉 유리 전자의 쌍은 친핵성 공격에 적용될 수 있다는 것이다.

Claims

Gln-MCP-1을

- 30 내지 80℃ 범위의 온도에서

- 염 농도가 10 내지 160mM 범위이고, pH가 2 내지 7.5 범위인 완충 용액에서 적어도 90%의 MCP-1이 피로Glu-MCP-1 형태로 존재할 때까지 항온처리하는, 재조합되어 생성된 Gln-MCP-1로부터의 피로Glu-MCP-1의 제조방법.
제1항에 있어서, 완충 용액이 농도가 20 내지 50mM 범위이고 pH가 3.5 내지 6.5인 포스페이트 완충액인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 완충 용액이 추가로 세정제, 항산화제, 보존제, 안정화제, 항균제 및/또는 착화제를 포함하는 방법.
- 숙주 세포에서 MCP-1에 대한 유전자 구조 코드화의 발현에 의해 Gln-MCP-1 제형을 제조하는 단계,

- Gln-MCP-1 제형에 포함된 Gln-MCP-1을 임의로 농축시키거나/시키고 정제하는 단계,

- 방법 1 내지 3 중의 어느 하나에 따라 Gln-MCP-1 제형의 Gln-MCP-1을 피로Glu-MCP-1을 포함하는 피로Glu-MCP-1 제형으로 전환시키는 단계 및

- 피로Glu-MCP-1 제형을 임의로 완충시키거나/시키고, 추가로 정제하는 단계를 최소한의 단계로 포함하며, 수득한 피로Glu-MCP-1 제형 중의 MCP-1의 전체 함량을 기준으로 하여 피로Glu-MCP-1의 비가 적어도 90%인 피로Glu-MCP-1 제형의 제조방법.
피로Glu-MCP-1 제형 중에 포함된 MCP-1의 적어도 90%가 피로Glu-MCP-1의 형태로 존재하는, 제4항에 따라 제조된 피로Glu-MCP-1 제형을 함유하는 조성물.
제4항에 따라 제조된 피로Glu-MCP-1 제형이 사용되는, 피로Glu-MCP-1을 함유하는 약제학적 조성물의 제조방법.
피로Glu-MCP-1 제형 중에 포함된 MCP-1의 적어도 90%가 피로Glu-MCP-1의 형태로 존재하는, 제4항에 따라 제조된 피로Glu-MCP-1 제형을 함유하는 약제 또는 악제학적 조성물.
제7항에 있어서, 포스페이트 완충액 중의 피로Glu-MCP-1과 염화나트륨 및 임의의 부가제로서 세정제를 포함하는 약제 또는 악제학적 조성물.
혈관 폐쇄 질환, 예를 들면, 특히 관상 동맥 질환(CAD), 말초 동맥 폐쇄 질환(PAOD), 대뇌 및 격막 동맥 폐쇄 질환의 치료용 약제학적 조성물을 제조하기 위한 피로Glu-MCP-1 또는 제4항에 따라 제조된 피로Glu-MCP-1 제형의 용도.
제1항에 따른 방법에 따라 수행되지 않은 재조합되어 생성된 MCP-1 제형(N-말단 비개질된 MCP-1 제형)에 대해, 생물학적 활성의 비가 100:48 또는 그 이상인, 제4항에 따른 방법에 의해 제조된 재조합형 MCP-1 제형.
적어도 90%의 MCP-1 단백질이 피로Glu-MCP-1로서 존재하는 재조합되어 생성된 MCP-1 제형.
제11항에 있어서, 피로Glu-MCP-1이 비-글리코실화된 형태로 존재하는 MCP-1 제형.
제5항에 따른 조성물, 제7항에 따른 약제학적 조성물 또는 제10항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따른 제형을 세포, 조직 또는 기관에 생물학적 또는 생리학적 활성을 유발하는데 적합한 양으로 가하는 것을 특징으로 하는, 내인 선천성 MCP-1-단백질의 생물학적 또는 생리학적 활성을 대용하거나 증진시키는 생물학적 또는 생리학적 반응을 유도하는 방법.
제13항에 있어서, 세포, 조직 또는 기관이 CCR-2 및/또는 CCR-4-수용체인 방법.
제14항에 있어서, 세포가 MCP-1 수용체 서브타입 CCR2, 특히 CCR2b를 선천적으로 또는 재조합되어 발현되는 포유동물의 세포인 방법.