KR20050118095A

KR20050118095A - 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로함유하는 면역증진제, 항암제 및 건강식품

Info

Publication number: KR20050118095A
Application number: KR1020040109805A
Authority: KR
Inventors: 김상희
Original assignee: 김상희
Priority date: 2004-04-24
Filing date: 2004-12-21
Publication date: 2005-12-15

Abstract

본 발명은 하기 화학식 1로 기재되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로 함유하는 면역증진제, 항암제 및 면역증진 또는 암 예방용 건강식품에 관한 것이다. 본 발명의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 면역 세포의 활성을 증가시키고 그 결과 암 유도된 동물에서 암의 발생을 지연시키며 면역 세포의 암세포에 대한 독성 활성을 증진시키므로, 상기 화합물을 유효성분으로 함유하는 면역증진제, 항암제 및 건강식품은 각각 면역증진, 암 치료 또는 예방을 위하여 유용하게 사용될 수 있다.

<화학식 1>

상기식에서, R1/R2는 9-옥타데세노일(올레오일)/헥사데카노일(팔미토일), 헥사데카노일(팔미토일)/9-옥타데세노일(올레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12-옥타데카디에노일(리놀레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12,15-옥타데카트리에노일(리놀레노일) 또는 헥사데카노일(팔미토일)/5,8,11,14-에이코사테트라에노일(아라키도노일)을 나타내며, R3는 아세틸을 나타낸다.

Description

아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로 함유하는 면역증진제, 항암제 및 건강식품{Immunity enhancing agent, anti-cancer agent, and health food containing acethyldiacylglycerole derivatives as an effective ingredient}

본 발명은 녹용으로부터 분리한 아세틸디아실글리세롤 화합물을 유효성분으로 함유하는 항암제, 면역증진제 및 암 예방 또는 면역증진용 건강식품에 관한 것이다.

녹용은 사슴과(Cornu cervi)에 속하는 사슴의 각화되지 않은 유각을 채취하여 건조한 것으로 인삼과 더불어 한방에서 가장 널리 사용되고 있는 생약중의 하나이며, 우리나라에서 사용되고 있는 녹용의 기원동물로는 사슴과에 속하는 매화록(Cervus nippon Temminick var. mantchuricus Swinhoe) 및 마록(Cervus elaphus L. Cornu Ceriv Pavum) 등이 있다.

녹용은 예로부터 강장작용, 생장, 발육촉진작용, 조혈작용, 신경쇠약 치료작용, 심부전증 치료작용, 오장육부의 기능항진작용 등 다양한 효능이 있는 것으로 동의보감에 수록되어 있으며, 이외에도 자양보신, 신체활력 증강 및 심근운동개선 효과, 피로회복, 신체 저항력 증진, 건뇌안신효과 등의 효과가 고대문헌에 기록되어 있다(신농본초경)..

녹용의 신비한 약효를 규명하기 위하여 그의 성분에 관한 다양한 연구가 이루어져 왔으며, 그 결과 녹용으로부터 유리아미노산과 미량원소, 육탄당 및 오탄당, 헥소사민, 우론산, 시알산, 산 뮤코다당류인 히알우론산과 황산콘드로이틴 A, 다양한 지방산, 프로스타글란딘류 등의 존재가 확인되었으며, 또한 당지질 및 인지질, 콜레스테롤, 히포크산틴, 콜레스트-5-엔-3β, 7α-디올, 콜레스테롤 에스테르, 폴리아민 등이 분리, 보고되었다. 이 밖에도, 녹용에는 에스트론, 에스트라디올 리셉터 등이 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(Report of NIH Korea,Vol.22, p359, 1985; Korean Biochem. J,Vol.9, No.3, p153, 1976; Korean Biochem. J ,Vol.9, NO.4; p215, 1976; Korean Biochem. J,Vol.10, NO.1, p1, 1977; Shoykugaku Zasshi, 43(2), p173, 1989).

면역이란 여러 가지 질병요인(pathogen)으로부터 생체를 방어하는 것으로 , 면역결핍이란 면역계의 일부 구성요소에 결함이 생겨 발생하는 것이다. 그 결과, 많은 종류의 항원에 대하여 면역반응이 일어나지 않게 되는데. 이러한 면역 결핍은 크게 선천적 면역결핍(congenital or primary immunodeficiency)과 후천적 면역결핍(acquired or secondary immunodeficiency)으로 나뉘어진다. 선천적 면역결핍은 B 세포, T 세포 등 면역세포가 원래부터 존재하지 않는 것으로 유전자 치료나 항체주입, 골수 이식 등의 치료법으로만이 가능한 치료법이다. 그에 반해, 후천적 면역결핍증은 면역 구성요소 자체는 원래 존재하나 이들에 의해 나타나는 면역반응 과정에 이상이 생긴 것이므로 면역 구성요소의 기능을 증진시킴으로써 면역결핍상태를 개선할 수 있다.

면역기능의 작용기작이 알려지면서 면역기능을 조절할 수 있는 면역조절 물질을 개발하려는 시도가 진행되고 있다. 이러한 시도는 면역조절물질을 통하여 비특이적으로 면역 세포들을 자극하여 생체의 면역기능을 증진시킴으로써, 질병요인으로부터 생체의 방어력을 증강시키려는 것이다. 이러한 면역조절 물질로는 화학 합성물질, 미생물 조성물, 생물제제 등이 주로 이용되어 왔다.

그러나 상기의 면역조절 물질의 대부분은 부작용 또는 독성으로 인하여 실제 생체에 적용하기에는 한계가 있으므로 이러한 문제점을 해결하기 위하여, 최근에는 면역조절물질에 대한 연구가 독성이 없는 식품소재 또는 천연물로부터 추출한 유효성분과 기존의 한방제의 이용 및 효능검증을 통해 수행되고 있다.

한편, 현재 우리나라에서 제 1위의 사망원인은 암질환으로 매년 증가추세인 것으로 알려져 있다. 그러나 항암치료를 목적으로 사용되는 화학요법, 방사선 치료요법 등은 암세포 뿐 아니라 일반 정상 골수세포, 특히 면역 및 조혈기능을 조절하는 조혈세포(hematopoietic cell)까지도 동시에 손상시킴으로써 인체의 조혈기관과 면역기능을 마비시키는 것이 심각한 문제점으로 지적되어 오고 있다(Korean J. BRM., 1, p23, 1993; Korean J. BRM., 4, p47, 1994; Crit Rev Oncol Hematol. 1, p227, 1984).

이에, 본 발명자들은 민간약으로 뛰어난 약효를 갖는 것으로 알려져 있는 녹용의 여러 성분들을 분리ㆍ연구한 결과, 이의 유효성분의 하나인 아세틸디아실글리세롤이 유의한 면역증진 및 항암 작용을 나타내며, 독성 실험에서도 체내 독성을 나타내지 않는 것을 관찰하고, 부작용이 없는 안전한 면역증진제 또는 항암제로 사용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로 함유하는 면역증진제, 항암제 및 면역증진 또는 암 예방용 건강식품을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 하기 화학식 1로 기재되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들을 유효성분으로 함유하는 면역증진제를 제공한다.

<화학식 1>

상기식에서,R1/R2는 9-옥타데세노일(올레오일)/헥사데카노일(팔미토일), 헥사데카노일(팔미토일)/9-옥타데세노일(올레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12-옥타데카디에노일(리놀레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12,15-옥타데카트리에노일(리놀레노일) 또는 헥사데카노일(팔미토일)/5,8,11,14-에이코사테트라에노일(아라키도노일)을 나타내며, R3는 아세틸을 나타낸다.

본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물은 구체적으로 다음과 같은 5 가지 화합물들이 언급될 수 있다:

1) 1-올레오일-2-팔미토일-3-아세틸글리세롤(R1/R2=9-옥타데세노일/헥사데카노일, R3=아세틸; 이하 "화합물 1"이라함)

2) 1-팔미토일-2-올레오일-3-아세틸글리세롤(R1/R2=헥사데카노일/9-옥타데세노일, R3=아세틸; 이하 "화합물 2"라함)

3)1-팔미토일-2-리놀레일-3-아세틸글리세롤 또는 모노아세틸디글리세라이드-３(R1/R2=헥사데카노일/9,12-옥타데카디에노일, R3=아세틸; 이하 "화합물 3"이라함)

4) 1-팔미토일-2-리놀레닐-3-아세틸글리세롤(R1/R2=헥사데카노일/9,12,15-옥타데카트리에노일, R3=아세틸; 이하 "화합물 4"라함)

5)1-팔미토일-2-아라키도닐-3-아세틸글리세롤(R1/R2=헥사데카노일/5,8,11,14-에이코사테트라에노일, R3=아세틸; 이하 "화합물 5"라함)

상기 화학식 1로 기재되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 제한되지 않지만 특히 하기 화학식 1a로 기재되는 화합물 3의 모노아세틸디글리세라이드-３(Monoacethyldiglyceride-3; 이하, 'MADG-3'으로 약칭함)이 보다 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들을 유효성분으로 함유하는 항암제를 제공한다.

아울러, 본 발명은 상기 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들을 유효성분으로 함유하는 면역증진 또는 암 예방용 건강식품을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 상기 화학식 1로 기재되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들을 유효성분으로 함유하는 면역증진제를 제공한다. 상기 화학식 1로 기재되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 제한되지 않지만 특히 하기 화학식 1a로 기재되는 화합물 3의 모노아세틸디글리세라이드-３(Monoacethyldiglyceride-3; 이하, 'MADG-3'으로 약칭함)이 보다 바람직하다.

<화학식 1a>

모노아세틸디글리세라이드-3(분자량: 634)

상기 본 발명에 따른 화합물은 녹용으로부터 추출될 수 있다.

즉, 녹용을 헥산으로 추출하고, 그 추출잔사를 다시 클로로포름으로 추출하여 수득된 추출액을 감압증류하여 녹용의 클로로포름 추출물을 수득한다. 상기한 바와 같은 추출방법에서 사용되는 추출용매인 헥산 및 클로로포름의 양은 각각 사용된 녹용이 잠길 정도의 양이면 충분하며, 일반적으로는 녹용 1㎏에 대하여 헥산 및 클로로포름을 각각 4∼5ℓ정도의 비로 사용할 수 있다.

이러한 방법에 의해 수득되는 녹용의 클로로포름 추출물을 계속해서 일련의 실리카겔 칼럼 크로마토그래피 및 TLC 방법에 의해 더 분획화하고 정제한다. 즉, 녹용의 클로로포름 추출물의 후속 처리단계는 a)녹용의 클로로포름 추출물을 용리액으로, 클로로포름/메탄올을 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하고 여기서 수득되는 분획을 TLC로 처리하여 Rf값에 따라 녹용의 클로로포름 추출물 1 부터 7 까지의 7가지 엑기스를 얻는 단계: b) 상기 단계 a) 에서 수득한 엑기스 중 엑기스-2를 용리액으로 헥산/에틸아세테이트(10:1)를 사용하여 실리카겔 칼럼 크로마토그래피를 수행하고, 수득되는 분획을 TLC로 처리하여 Rf값에 따라 엑기스 2-A 부터 2-F 까지의 6가지 엑기스를 얻는 단계: c) 상기 단계 b) 에서 수득한 엑기스 중 엑기스 2-E를 용리액으로 헥산/에틸아세테이트/아세트산(20:1:0.5)을 사용하여 실리카겔 칼럼크로마토그래피를 수행하고 수득되는 분획을 TLC로 처리하여 Rf값에 따라 엑기스 2-E-a 및 2-E-b 의 2 가지 엑기스를 얻는 단계: 및 d) 상기의 단계 c) 에서 수득한 엑기스중 엑기스 2-E-a를 메탄올에 용해시켜 메탄올-가용성 분획 2-E-a-Ms와 메탄올-불용성 분획 2-E-a-Mi를 얻는 단계로 구성된다(2-E-a-Ms와 -Mi의 전개용매: 헥산/에틸아세테이트/아세트산 = 20:1:0.5).

상기와 같이 녹용의 클로로포름 추출물 중에 최종적으로 수득된 메탄올-불용성 분획인 2-E-a-Mi 에 대하여 질량분광분석(massspectrometry)을 수행하여 이 분획에서 화학식1 로 표시되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들이 함유되어 있음을 확인할 수 있다. 이들 각 화합물을 통상의 방법에 따라 순수하게 분리할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 상기 화학식 1의 화합물들은 공지되었거나 공지된 방법과 유사한 방법에 의해 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명자들은 본 발명의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 T-4 림파구 및 T-8 림파구에 처리한 결과, 이들 세포로부터 사이토카인의 일종인 IL-2 분비가 증가되는 것을 확인하였다(도 1 참조).

많은 종류의 사이토카인의 양을 한번에 측정할 수 있는 바이오-플렉스(Bio-plex)를 이용하여 본 발명의 화합물 3(MADG-3)을 처리하였을 때, T 세포의 사이토카인 분비 변화를 관찰하였다. 그 결과, 대조군에 비하여 MADG-3를 처리한 그룹에서 IL-2, IL-4 및 IL-5의 양이 현저히 늘어남을 확인하였다(도 2 참조).

세포와 세포의 상호작용은 다양한 조혈세포 및 면역세포를 자극한다고 알려져 있다. 본 발명자들은 MADG-3가 본 발명에서 분리ㆍ유도한 수상돌기세포의 상호작용에 어떠한 영향을 미치는지 알아보았다. 이를 위해, MADG-3 처리시 세포의 상호작용을 매개하는 부착 분자들의 발현 변화를 RT-PCR로 측정한 결과, Vcam-1, Icam-1, Icam-2, VLA-4, VLA-5 및 LFA-1과 같은 부착분자의 발현이 대조군에 비해 증가함을 확인하였다(도 5 참조).

이상의 결과로부터, 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 T 세포를 활성화시켜 사이토카인의 분비를 증가시키고, 세포 간 부착분자 발현을 증가시켜 조혈 세포 및 면역 세포의 증식 및 자극을 촉진하므로 면역력을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다.

또한, 본 발명은 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로 함유하는

항암제를 제공한다.

본 발명자들은 담도암 세포인 KIBG-5를 햄스터에 정맥주사 및 피하주사하여 암 발생을 유도하고 RPMI, BMSC, 아데노바이러스/ΔE1, 수상돌기 세포(DC), 종양 분해질, 아데노바이러스/IL-2를 각각 또는 혼합하여 주입한 결과, 4 주 후에 수상돌기세포 ＋ 종양 분해질 주입군, MADG-3 주입군 및 아데노바이러스/IL-2 주입군의 경우는 육안이나 현미경 상으로 모두 종양이 형성되지 않았음을 확인하였다(도 6).

또한, 종양을 정맥주사하고 8주 후에 관찰한 결과, 다른 군에서는 다발적 전이성(metastatic) 폐 병변(lung lesion)이 형성되었지만, BMSC ＋ 아데노바이러스/IL-2 주입군의 경우는 폐에서 어떠한 징후도 나타나지 않았으며 조직검사에서는 수상돌기세포와 종양분해질 주입군, MADG 주입군에서 미세한 병소가 한 부분 관찰되었다(도 7, 도 8a 및 도 8b 참조).

또한, 종양을 피하주입하고 12주 후에 관찰한 결과, 다른 군에서는 종양이 형성되었지만, BMSC+Ad/hIL-2 주입군 및 BMSC+Ad/hIL-2+MADG-3 주입군의 경우는 종양이 형성되지 않음을 확인하였다(도 9). MADG-3의 농도를 다르게 처리한 경우에는 처리한 MADG-3의 농도가 높을 수록 종양 형성이 줄어드는 것으로 관찰되었다(도 10 및 11 참조)

상기와 같이 햄스터에 담도암세포(KIBG)를 주입하여 암의 발생을 유도한 후 본 발명의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 투입한 결과, 암 발생이 유의하게 억제됨을 확인하였다.

또한, 본 발명자들은 악성 흑색종을 생쥐의 꼬리 정맥으로 주입하여 암 발생을 유도한 뒤, RPMI, 수상돌기 세포(DC),종양 분해질 주입군, MADG-3를 각각 또는 혼합하여 주입하였다. 그 결과 대조군인 RPMI 주입군은 다발적 전이성 (metastic) 폐 병변 (leison)이 형성되었고, MADG-3 주입군과 수상돌기세포＋종양 분해질 주입군은 폐에서 어떠한 징후도 나타나지 않았다(도 12 및 13 참조). 또한 MADG-3 주입군과 수상돌기 세포＋종양 분해질 주입군은 종양세포주입 후 6 주간 관찰한 결과 90% 생존율을 나타내었다(도 14 참조).

이에, 본 발명자들은 MADG-3가 T 세포(T4 및 T8)를 활성화시켜 상기와 같은 항암효과를 나타내었다고 판단하고 이를 MADG-3로 활성화시킨 T-세포의 악성흑색종에 대한 세포독성 검사를 실시하였다. 그 결과, MADG-3를 T-세포에 처리하지 않았을 때보다 MADG-3를 T-세포에 처리하였을 때, 그리고 악성흑색종에 대한 T-세포의 비율이 높을수록 세포독성이 증가하는 것을 관찰하였다(도 15 참조).

이상의 결과로부터, 생쥐에 흑색종 세포를 주입하여 암의 발생을 유도한 후 본 발명의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 투입한 결과, 본 발명의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 암 발생을 억제시키며, T 세포를 활성화시켜 암세포에 대한 독성을 나타내므로 항암제로 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

본 발명의 항암제를 이용하여 치료할 수 있는 암의 종류는 제한되지 않지만 바람직하게는 담도암, 신장암 및 악성 흑색종으로부터 선택된다.

본 발명에서는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로 함유하는 연질 캅셀 및 정제를 제조함으로써 본 발명을 완성하였다(제조예 1 참조).

본 발명의 면역증진제 및 항암제는 상기와 같은 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 총중량에 대해 20 내지 35 중량% 함유하는 것이 바람직하며, 25 내지 30 중량%로 함유하는 것이 보다 바람직하다. 또한, 본 발명의 항암제 또는 면역증진제를 경구투여할 때에는 1일 1회 내지 3회, 25 내지 50 ㎎/㎏의 농도로 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명의 면역증진제 및 항암제는 본 발명의 화합물 이외의 다른 유효성분과 함께 추가로 약제학적으로 허용되는 1종 이상의 담체를 첨가하여 약제로 제조할 수 있다. 상기 담체로는 식염수, 완충 식염수, 물, 글리세롤 및 에탄올 등이 있으나 이에 한정되지 않으며, 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제(Remingtons's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA)를 모두 사용 가능하다.

본 발명의 제제는 임상 투여시에 경구로 투여가 가능하며 일반적인 의약품 제제의 형태로 사용될 수 있으며, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.

본 발명의 제제는 대상의 연령, 성별, 상태, 체내에서 활성 성분의 흡수도, 불활성율 및 배설속도, 병용되는 약물에 따라 달리 적용될 수 있으며, 예컨대 1일에 1 내지 1.5 g을 경구투여할 수 있으나 이에 한정되지는 않는다. 본 발명은 또한 투약 단위의 제형들을 포함한다. 제형은 개별 투약 형태, 예를 들면 정제, 피복 정제, 캡슐제, 환제, 좌약 및 앰플제로 존재하고, 약제 중 유효 화합물의 함량은 개별 투약량의 분율 또는 배수에 해당한다. 투약 단위는, 예를 들면 개별 투여량의 1, 2, 3 또는 4배로, 또는 1/2, 1/3 또는 1/4배를 함유할 수 있다. 개별 투여량은 바람직하기로는 유효 화합물이 1회에 투여되는 양을 함유하며, 이는 통상 1일 투여량의 전부, 1/2, 1/3 또는 1/4배에 해당한다.

경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드, 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다.

아울러, 본 발명은 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로 함유하는 면역증진 또는 암 예방용 건강식품을 제공한다.

본 발명의 조성물을 식품 또는 음료 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용하거나, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 그의 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우, 유효 성분은 독성 검사 결과 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 장기간 복용이 가능하다. 상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있다.

본 발명의 건강식품은 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 총중량에 대해 0.02 내지 1.0 중량% 포함하는 것이 바람직하며, 0.2 내지 0.6 중량%로 포함하는 것이 더욱 바람직하다.

상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명의 아세틸티아실글리세롤류의 화합물은 T 세포를 활성화시켜 사이토카인의 분비를 증가시키고, 세포 간 부착분자 발현을 증가시켜 조혈 세포 및 면역 세포를 자극을 촉진하여 면역력을 증가시킬 뿐만 아니라, 암 발생을 억제시키며, T 세포를 활성화시켜 암세포에 대한 독성을 나타내었다.

이에, 본 발명에서는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로 함유하는 면역 증진 또는 암 예방용 건강식품을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다(제조예 2 참조).

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 아세틸디아실글리세롤류의 화합물이 T 세포 증식 및 단핵구 세포 증식에 미치는 영향

<1-1> 아세틸디아실글리세롤류의 화합물이 T 세포 증식에 미치는 영향

C57BL/6 생쥐(아산생명과학연구소 동물실에서 제공) 비장으로부터 비장세포를 분리하였다. 비장세포는 흡인(aspiration)과 플러싱(flushing)을 통해 단일 세포로 만들었다. 암모늄 클로라이드(amomonium chloride)를 사용하여 적혈구 세포를 제거하였으며, 나일론 울을 통과시키면서 세포 찌꺼기(debris)와 응괴(clump)를 제거하였다. 다음으로 항-염소 IgG(Miltenyi Biotec, bergich gladbach, Germany), 항-생쥐 CD4(Miltenyi Biotec, bergich gladbach, Germany) 또는 항-생쥐 CD8 항체(Miltenyi Biotec, bergich gladbach, Germany)를 포함하는 자석 비드(MACS bead, Miltenvi Biotec, bergich gladbach, Germany)를 이용하여 T 세포를 분리하였다(Turner and Dockrell (1996) Immunology, 87: 339-342).

분리한 T 세포는 IMDM 배지(Isocove's modified dulbecco's medium)(Gibco, Grand Island, NY) 및 10% 우태아혈청(Fetal Bovine serum; 이하, 'FBS'라 약칭함)(Gibco, Grand Island, NY)을 포함하는 배지로 현탁한 뒤 94 웰 플레이트의 각 웰에 5 × 10⁴ 세포수로 접종하였으며, 접종된 세포에 1 ㎍/㎖의 화합물 1, 2, 4 및 5와 0.01, 0.1 및 1 ㎍/㎖ 농도의 화합물 3(MADG-３)(이상, 이화여자 대학교 화학과에서 합성하여 제공) 및 20 ng/㎖ 농도의 IL-2를 처리하여 배양하였다. 배양 6일째 3H-티미딘을 각 세포 배양 웰당 1 μCi 농도로 처리하여 24시간 동안 반응시켰다. 배양 7일째 세포를 수득한 뒤 3H-티미딘 인코퍼레이션(incorporation) 정도를 측정하여 하기 수학식 1의 계산법으로 자극 수치(Stimulation Index; 이하 'SI'라 약칭함)를 계산하였다.

<수학식 1>

SI = 실험군 웰에서 흡수한 3H-티미딘(실험군의 CPM) / 대조군의 웰에서 흡수한 3H-티미딘(대조군의 CPM)

그 결과, 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 처리한 그룹에서는 T 세포의 SI가 2.05로 나타나 IL-2를 처리한 그룹과 유사하였다(표 1).

처리군	SI
IL-2(20 ng/㎖)*	2.05 ± 0.24
화합물 1(1 ㎍㎖)*	2.01 ± 0.43
화합물 2(1 ㎍㎖)*	2.03 ± 0.54
화합물 3(0.01 ㎍/㎖)**	1.83 ± 0.32
화합물 3(0.1 ㎍/㎖)*	1.96 ± 0.18
화합물 3(1 ㎍㎖)*	2.05 ± 0.64
화합물 4(1 ㎍㎖)*	1.98 ± 0.26
화합물 5(1 ㎍㎖)*	2.02 ± 0.38

상기 표에서 *P<0.05, **P<0.005이고, 각 수치는 3회 수행한 실험 결과이다.

<1-2> 아세틸디아실글리세롤류의 화합물이 단핵구 세포 증식에 미치는 영향

히스토파크 1077을 사용하여 인간의 전혈(whole blood)로부터 단핵구를 분리하였다. 분리한 단핵구 세포를 5 × 10⁶ 세포수/㎖ 농도로 조직 배양 플라스크에 접종한 뒤 3시간 동안 5% CO₂배양기에서 배양하였다. 3시간 동안 배양하고 난 뒤 흡착된 세포를 수득하여 10% FBS을 포함하는 RPMI 1640 배지(GIBCO, Grand Island, NY)로 현탁하였다. 각 웰당 생존하는 세포 5 × 10⁴개를 1 ㎍/㎖ 농도의 화합물 1 내지 5 각각과 함께 96웰 플레이트에서 배양하였다. 배양 6일째에 각 배양 웰마다 1 μCi 3H-티미딘을 첨가하여 24시간 동안 배양하였다. 최종적으로 배양 7일째에 세포를 수득한 뒤 인코퍼레이션된 3H-티미딘을 정량하였다. 정량한 수치를 이용하여 SI를 하기 수학식 2에 따라 계산하였다.

<수학식 2>

SI = 샘플 웰에 있는 단핵구의 세포수 / 대조군 웰에 있는 단핵구의 세포수

그 결과, 화합물 1 내지 5 각각을 처리한 경우는 무처리 대조군에 비해 단핵구의 SI 수치가 10.86배나 증가하여 단핵구를 자극시킴을 알 수 있었다(표 2).

처리군	SI(± S.E)
무처리 대조군	1
화합물 1 (1 ㎍/㎖)*	9.97 ± 0.10
화합물 2 (1 ㎍/㎖)*	10.42 ± 0.15
화합물 3 (1 ㎍/㎖)*	10.68 ± 0.13
화합물 4 (1 ㎍/㎖)*	10.21 ± 0.18
화합물 5 (1 ㎍/㎖)*	9.75 ± 0.09

상기에서 *P<0.001이고, 각 수치는 2회 수행한 실험 결과이다.

<실시예 2> MADG-3이 T 세포 활성에 미치는 영향

<2-1> Elispot를 이용한 싸이토카인 측정

ELispot 분석은 ELispot(ESAT-6 enzyme-linked immunospot assay) 플레이트의 각 웰의 바닥에는 사이토카인에 특이적인 캡쳐 항체로 코팅되어 있으므로, 사이토카인을 정량할 수 있는 매우 민감한 분석방법이다. 이에, T 세포의 활성을 측정하기 위해 사이토카인 양을 보다 높은 감도로 정량할 수 있는 ELispot 분석을 수행하였다. T 세포를 24웰 멸균 조직 배양 플레이트(Nunc, Denmark)에 2 × 10⁶ 세포수/㎖ 농도로 접종하고, MADG-3을 0.01, 0.1, 1 ㎍/㎖ 농도로 처리하거나 또는 IL-2를 20 ng/㎖ 농도로 처리하여 배양하였다. 배양 7일째 세포를 수득한 뒤 생쥐 IL-2를 일차 항체로 코팅된 멀티 테스트 플레이트(Elispot system kit, AID, Straberg, Germany)에 5 × 10⁵ 세포수/㎖ 농도로 접종하였다. 상기 플레이트를 24시간 동안 5% CO₂배양기에서 배양한 뒤 T 세포에 의해 분비되는 IL-2의 양을 IL-2 ELispot 킷트를 사용하여 제조사의 지침에 따라 분석하였다. 각 샘플에 대해서 두 번 실험을 하였고, Elispot 판독기(AID ELispot Reader System)를 이용하여 ELispot 분석에 의해 세포가 생산하는 IL-2의 양을 측정하였다.

그 결과, MADG-3을 처리한 그룹에서는 T 세포의 활성이 무처리한 대조군에 비해 1.5배 증가하였다(도 1).

<2-2> Bio-plex를 이용한 싸이토카인 측정

Bio-plex의 분석은 하나의 웰(well)에서 많은 종류의 사이토카인의 양을 한번에 측정할 수 있다는 장점을 가지고 있다. 이에 T세포가 활성화 되었을 때 분비되는 Th1/Th2 경로의 8가지의 사이토카인을 한번에 정량하여 분석하기 위하여 bio-plex kit를 이용하였다.

24웰 멸균 조직 배양 플레이트(Nunc, Denmark)에 anti-CD3, anti-CD28를 처리한 후, T 세포를 2 × 10⁶ 세포수/㎖ 농도로 접종하고, T 세포를 활성화시키기 위해서 0.1, 1 ug/ml MADG-3를 처리하여 5일간 배양하였다.

배양한지 5일째, 각 조건별로 배양액을 회수하여 원심분리한 후 조심스럽게 상층액만을 모아 분비된 사이토카인의 양을 Bio-plex 킷트를 사용하여 제조사(Bio-rad)의 지침에 따라 분석하였다.

그 결과 MADG-3를 처리한 그룹에서 8가지 사이토카인(IL-2, IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, INF-γ,GM-CSF, TNF-α)중 3가지의 사이토카인(IL-2, IL-4, IL-5)이 MADG-3를 처리하지 않은 대조군에 비해 많은 양이 분비되었다(도 2)

<실시예 3> 화합물 3(MADG-3)이 수상돌기(Dendritic) 세포의 부착 분자 발현에 미치는 영향

<3-1> 수상돌기 세포 배양

골수(bone marrow) 세포는 C57BL/6 생쥐의 대퇴골과 정강이뼈로부터 공지된 방법으로 분리하였다(Park, J. et al. (2003) J. Korean Med. Sci., 18: 372-380). 분리한 세포를 RPMI 배지로 3회 세척한 뒤, 단핵구 세포(mononuclear cell)만을 분리하였으며, 분리한 단핵구 세포를 RPMI 배지와 10% FBS를 포함하는 배지를 이용하여 조직 배양 플라스크에 접종하여 3시간 동안 배양하면서 부착배양할 수 있도록 하였다. 배양하고 난 뒤, 부착배양한 단핵세포(monocyte)를 제거한 뒤 부착하지 않은 세포를 100 mm 조직 배양 디쉬에 접종하였다. 접종시 세포 농도는 1 × 10⁵ 세포수/㎖로 하였으며, RPMI 배지에 10% FBS를 첨가하고, 여기에 추가로 생쥐 rGM-CSF(R＆D systems, minneapolis, MN, USA) 20 ng/㎖, 생쥐 IL-4(R＆D systems) 10 ng/㎖ 및 생쥐 TNF-α(R＆D systems) 2.5 ng/㎖을 첨가한 배지를 사용하였다. 배양 디쉬의 배지는 매 3일마다 교환해주었다. 배양 6일째 되는날 TNF-α를 첨가해 주었으며, 그로부터 11일이 될 때까지 3일마다 첨가해 주었다. 성숙 수상돌기 세포는 부착 분자 연구를 위한 RT-PCR 분석에 사용하였다.

그 결과, 둥근형태의 과립세포를 3일 동안 배양하였을 때 상기 세포가 클러스터를 형성하고, 세포배양 웰의 바닥에 부착하여 배양된 형태를 나타내었으며, 배양 6 내지 7일째 성숙 수상돌기 세포가 군집하여 자라나는 형태를 나타내었으며, 배양 9일째에 수상돌기 세포가 특이적으로 길고 작은 전골(protrusion)의 형태를 나타냄을 확인하였다(도 3).

<3-2> 수상돌기 세포의 표현형 결정

트리판 블루 염색에 대해 음성이고, 크기가 큰 세포를 살아있는 세포로 계수하였고, 이들의 각각의 형태를 확인하였다. 1 × 10⁶개의 세포를 배양한 뒤, 세척하고 1% 파라포름알데히드 용액으로 고정하였다. 고정된 세포는 FACScan(Beckton Dickinson, Mountain View, CA, U.S.A)을 이용하여 유세포 분석(Flow cytometric analysis)함으로써 하기 마커에 대한 항체로 표현형을 결정하였다; 햄스터 IgG에 대한 동종형(isotype) 대조군, 쥐 IgG 2a, DC 마커:DEC 205(NLDC-145) 및 CD 11C, 동시-촉진/흡착(Co-stimutatory/adhesion) 분자: CD 80(B7-1) 및 CD 86(B7-2), 대식세포 마커: CD 14 및 F4/80, 과립백혈구(Granulocyte) 마커: Gr-1(Pharmingen, Hamburg, Germany).

그 결과, 공동자극 특이적 분자 마커인 CD80 및 CD86이 높은 수치로 나타났고, 수상돌기 세포 특이적 마커인 CD11c 및 DEC-205가 높은 수치로 나타났다. 그러나, 단핵구 특이적 마커인 CD14 및 F4/80과 과립구 특이적 마커인 Gr-1에 대해서는 낮은 수치를 나타내어 본 발명에서 분리한 수상돌기 세포는 수상돌기 세포의 표현형을 정확히 나타내고, 97 내지 98%의 순도를 나타냄을 알 수 있었다(도 4).

<3-3> MADG-3의 처리 및 부착 분자의 발현 분석

세포와 세포의 상호작용은 다양한 조혈 세포 및 면역 세포를 자극한다고 알려져 있다. 이에, MADG-3이 상기 세포의 다양한 부착 분자에 영향을 미치는지 확인하고자 하였다. 구체적으로 상기 실시예에서 배양한 수상돌기 세포에 MADG-3을 1 ㎍/㎖ 농도로 처리한 뒤 세포를 수득하여 RT-PCR을 수행하였다.

구체적으로, RT-PCR에 사용한 프라이머로는 Icam-1(서열번호 1 및 서열번호 2), Icam-2(서열번호 3 및 서열번호 4), Vcam-1(서열번호 5 및 서열번호 6), VLA-4(서열번호 7 및 서열번호 8), VLA-5(서열번호 9 및 서열번호 10), LFA-1(서열번호 11 및 서열번호 12) 및 GAPDH(서열번호 13 및 서열번호 14)를 사용하였고, 프라이머 세트는 2 ㎕의 DNA, 10× 완충액, 1.5 ㎕의 MgCl₂, 2 ㎕의 dNTP, 0.5 ㎕의 정방향(forward) 프라이머, 0.5 ㎕의 역방향(reverse) 프라이머, 0.2 ㎕의 폴리머라제(polymerase) 및 15.8 ㎕의 증류수로 구성되는 혼합액을 이용하였다.

올리고(dt)-프라이머를 이용하여 배양된 낮은 밀도 세포인 MS-5 및 수상돌기 세포로부터 분리된 전체 RNA를 역전사시키고, 94℃에서 30초, 65℃에서 30초 및 72℃에서 50초 반응시킴으로써 PCR을 수행하였다. PCR 실행 횟수는 총 34회를 실행하고, PCR 수행당 2배씩 증가하는 산물의 생성을 확인하였다. RT-PCR 수행시 부착 분자로는 Vcam-1, Icam-1, Icam-2, VLA-4, VLA-5, LFA-1 분자의 발현을 확인하였고, 비교 정량하기 위해 GAPDH에 대한 PCR 반응을 수행하여 상응하는 cDNA의 존재를 확인하였다.

그 결과, MADG-3을 처리한 수상돌기 세포는 무처리한 대조군에 비해 부착 분자 Icam-2, VLA-5, LFA-1의 발현이 증가하였다(도 5).

<실시예 4> 피하 종양 이식법(국소 모델) 및 정맥주사 종양 주입법(전신 모델)을 통한 항암 효과 분석

<4-1> 담도암(KIGB) 햄스터 모델

6주령의 암컷 시리안 골든 햄스터(Syrian golden hamster)(Harlan, Indianapolis, India, USA)를 특정 병원균 부재 사육장에서 사육하였다. 담도암 세포인 KIBG-5 세포(Molcular therapy, Vol.3, No4, pp431-437) 5 × 10⁵개를 무혈청 RPMI 1640 배지 100 ㎕에 현탁한 뒤 곧바로 대퇴부 혈관으로 정맥주사(intravenously inject, I.V)하였다. 또한, KIGB-5 세포 1 × 10⁵개를 무혈청 RPMI 1640 배지 100 ㎕에 현탁한 뒤 측복부에 피하주사(subcutaneously inject, S.C)하였다. 이때 KIBG-5 세포를 주입한 햄스터는 하기의 7개 그룹으로 나누었다; 1) RPMI 배지를 처치한 대조군, 2) 변형되지 않은 BMSC 세포(2.5 × 10⁶개)(Leukemia & Lymphoma, Vol.44, No11, pp1973-1978) 처치군, 3) Ad/ΔE1 100 MOI로 변형한 BMSC 세포처치군(Leukemia & Lymphoma, Vol.44, No11, pp1973-1978), 4) DC ＋ 종양 분해질(5 × 10⁶개) 처치군, 5) Ad/hIL-2 100 MOI로 변형한 BMSC 세포처치군 (Leukemia & Lymphoma, Vol.44, No11, pp1973-1978), 6) Ad/hIL-2 100 MOI로 변형한 BMSC 세포처치군 ＋ MADG-3(10㎎/kg/일) 처치군 및 7) MADG-3 10㎎/kg/일 처치군. BMSC 세포 주입군의 경우 일주일의 종양 세포 주입 후 또는 피하이식 후에 햄스터 마리당 2.5 × 10⁶개의 BMSC를 단 1회 주입하였다. DC ＋ 종양 분해질 처치군의 경우 국소적 이식 그룹 또는 정맥주사 주입그룹에서 모두 1, 2, 3, 4, 6, 8주마다 햄스터당 5 × 10⁶개 DC ＋ 종양 분해질을 주입하고 12주 동안 관찰하였다. MADG-3 처치군은 햄스터당 10 ㎎/㎏을 주입하였으며, -7일부터 7일까지 매주 2회로 8주 동안 처치하였다.

그 결과, 종양을 주입한지 4주째에 대조군인 RPMI 주입군, BMSC 세포 단독 주입군 및 BMSC ＋ Ad/ΔE1 주입군의 경우는 종양이 형성되었지만(도 6), DC ＋ 종양 분해질 주입군, MADG-3 주입군 및 BMSC ＋ Ad/IL-2 주입군의 경우는 종양이 관찰되지 않았다.

또한, 종양을 주입한지 8주 후에 대조군인 RPMI 주입군, BMSC 세포 단독 주입군 및 BMSC ＋ Ad/ΔE1 주입군에서는 다발적 전이성(metastatic) 폐 병변(lung lesion)이 형성되었고, BMSC ＋ Ad/IL-2 주입군의 경우는 폐에서 어떠한 징후도 나타나지 않았고, DC + 종양 분해질 주입군, MADG-3 주입군의 경우는 폐 조직검사에서 미세한 병소 하나가 각각 관찰되었다.(도 7, 도 8a 및 도 8b).

또한, 종양을 피하주입한지 12 주후에 대조군인 RPMI 주입군, BMSC 세포 단독 주입군, BMSC ＋ Ad/ΔE1 주입군 및 DC ＋ 종양 분해질 주입군, MADG-3 주입군은 주입 부위에서 종양이 형성되었지만, BMSC+Ad/hIL-2 주입군 및 BMSC+Ad/hIL-2+MADG-3 주입군의 경우는 종양이 형성되지 않았다(도 9).

<4-2> 악성 흑색종 생쥐 모델

6 주령의 암컷 C57BL/6(아산생명과학연구소, 서울, 한국)를 무균 사육장에서 사육하였다. 악성흑색종 B16F10(2 x 10⁴)을 무혈청 RPMI 1640 배지 100 ul에 현탁하여 꼬리 정맥으로 주입하였다.

암세포 주입 1 주 전에 3군으로 나누어 각각 다음의 처치를 하였다.

1)RPMI 주입군,

2)수상돌기세포(DC)(5 × 10⁵ 세포수/일) ＋ 종양 분해질 주입군 ,

3) MADG-3(50 mg /Kg/일) 주입군.

수상돌기세포＋종양 분해질 주입군의 경우, 악성 흑색종세포 주입 1주일 전부터 1 주 간격으로 5 × 10⁵ 세포수를 복강에 접종하였다. MADG-3 주입군은 악성 흑색종세포 주입 7일 전부터 2주간 처치하고 1주간 휴식의 형식으로 종양세포 주입 후 6주 동안 (총 7주) 처치하였다. 그 결과, 종양을 주입한지 4주 후에 대조군인 RPMI 주입군의 경우는 다발적 전이성 (metastic) 폐 병변 (leison)이 형성되었다. MADG-3 주입군과 수상돌기세포＋종양 분해질 주입군은 폐에서 어떠한 징후도 나타나지 않았고(도 12 및 13) 종양세포 주입 후 6 주간 관찰한 결과 90% 생존율을 나타내었다(도 14).

이러한 항암효과가 MADG-3의 T 세포의 활성화로 인한 것으로 추정하여 MADG-3로 활성화 시킨 T 세포가 악성흑색종에 대한 세포독성 검사를 실시하였다. 그 결과 MADG-3군에서 활성화시킨 T 세포와 흑색종세포의 비율이 100:1 일때 42% 세포독성이 증가하는 것을 관찰할 수 있었다(도 15).

<실시예 5> MADG-3의 독성실험

유기 화학적으로 합성한 MADG-3 시료를 에탄올 5% 용액으로 녹여 사용하였으며, 체중 20 g당 0.1 ㎖ 용량으로 경구 투여(p.o.)하였다. 대조군은 에탄올 5% 용액을 투여하였다. SPF 조건하에서 분양, 사육되고 있는 ICR 생쥐를 사용하였다. 시료를 경구투여하기 시작한 1일 전날 밤에 절식(fasting)시켰으며 물과 사료는 자유로이 섭취하게 하였다.

실험동물은 체중 25-30 g 내외의 ICR 생쥐 수컷 8-10 마리를 한 군으로 하였고, 용량은 62.5 ㎎/㎏, 125 ㎎/㎏, 250 ㎎/㎏, 500 ㎎/㎏, 1 g/㎏, 2 g/㎏의 용량으로 1회 경구투여 하고 죽는 마우스의 수 및 육안적인 이상여부를 투여 후 14일간 관찰하였다. LD₅₀은 리치필드-윌콕손(Lichfield-Wilcoxon)법으로 계산하였으며(白須, 泰彦, 吐山, 豊秋 : 新毒性試驗法 - 方法と評價 - 급성독성 시험, Realize Inc., Tokyo, 1988), 체중 증가율은 다음의 수학식에 따라 산출하였다.

<수학식 3>

체중 증가율(%)= 14일째 체중 - 0일째 체중 ÷ 0일째 체중 × 100

그 결과, 표 3에서 보는 바와 같이 생쥐에 MADG-3을 62.5 ㎎/㎏ 내지 2 g/㎏의 용량으로 경구 투여하여도 전혀 독성이 없었으며, 이를 통해 LD₅₀은 모두 2 g/㎏ 이상임을 알 수 있었다. 또한, 약물 투여 후 14일간 관찰했을 때 육안 이상여부는 관찰되지 않았다. 시료를 투여한 동물의 체중은 투여하지 않은 동물 군과 같이 대체적으로 꾸준히 증가하였으며, 표 4에서 보는 바와 같이 특별한 체중증가 혹은 체중감소효과는 관찰되지 않았다.

MADG-3 투여량에 따른 사망률(%)

MADG-3 투여량(㎎/㎏)	0	62.5	125	250	500	1000	2000
사망생쥐수/경구투여 생쥐수	0/10	1/8	0/8	1/8	2/9	0/9	0/9
LD₅₀	0	12.5	30	12.5	22.2	0	0

MADG-3 경구 투여 14일 후의 체중 증가

MADG-3 투여량(㎎/㎏)	0	63	125	250	500	1000	2000
투여 14일 후체중(g)	38.7±1.1	34.3±0.1	38.1±1.3	35.6±1.4	36.5±1.9	35.5±1.1	35.9±2.7
체중 증가율(%)	16.9	11.9	17.3	11.2	10.1	9.5	14.4

MADG-3 100 mg/Kg/day를 쥐에 4 주간 경구한 투여한 후 간기능검사, 혈중지질검사, 싸이토크롬 C-450 활성도 및 간조직 검사 등으로 간독성 유무를 검사하였으나 특이한 독성은 관찰 되지 않았다.

<제조예 1> 화합물 3(MADG-3)을 유효성분으로 함유하는 항암제(면역증진제)의 제조

본 발명자들은 상기 실험예를 통해 MADG-3이 항암 활성이 뛰어남을 확인하여 이를 유효성분으로 함유하는 항암제(면역증진제)를 하기와 같이 제조하였다. 또한, 하기 치료제의 제조예는 치료제 뿐만 아니라 건강식품의 제조에도 응용하여 사용될 수 있다.

<1-1> 연질캅셀(soft gelatin capsules)의 제조

MADG-3 30%

비타민 C 4.5%

비타민 D3 0.001%

황산망간 0.1%

밀납 10%

팜유 25%

홍화씨유 30.399%

<1-2> 정제(tablet)의 제조

MADG-3 30%

비타민 C 10%

비타민 D3 0.001%

황산망간 0.1%

결정셀룰로오즈 25.0%

유당 32.999%

스테아린산마그네슘 2%

<제조예 2> 화합물 1, 2, 4 및 5를 유효성분으로 함유하는 항암제(면역증진제)의 제조

상기 제조예 1에서 화합물 3(MADG-3)대신에 각각 화합물 1, 2, 4 및 5를 동일 비율로 부가하는 외에 상기 제조예 1과 동일한 조성으로 각 연질캅셀 및 정제를 제조하였다.

<제조예 3> 화합물 3(MADG-3)을 유효성분으로 함유하는 건강 식품의 제조

본 발명자들은 상기 실험예를 통해 화합물 3(MADG-3)이 항암 활성이 뛰어남을 확인하여 이를 유효성분으로 함유하는 건강 식품을 하기와 같이 제조하였다.

<2-1> 음료의 제조

꿀 522 ㎎

치옥토산아미드 5 ㎎

니코틴산아미드 10 ㎎

염산리보플라빈나트륨 3 ㎎

염산피리독신 2 ㎎

이노시톨 30 ㎎

오르트산 50 ㎎

MADG-3 0.48 ∼ 1.28 ㎎

물 200 ㎖

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 음료를 제조하였다.

<2-2> 츄잉껌의 제조

껌베이스 20 %

설탕 76.36 ∼ 76.76 %

MADG-3 0.24 ∼ 0.64 %

후르츠향 1 %

물 2 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 츄잉껌을 제조하였다.

<2-3> 캔디의 제조

설탕 50 ∼ 60 %

물엿 39.26 ∼ 49.66 %

MADG-3 0.24 ∼ 0.64 %

오렌지향 0.1 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 캔디를 제조하였다.

<2-4> 비스켓의 제조

박력1급 88 ㎏

중력1급 76.4 ㎏

정백당 16.5 ㎏

식염 2.5 ㎏

포도당 2.7 ㎏

팜쇼트닝 40.5 ㎏

암모 5.3 ㎏

중조 0.6 ㎏

중아황산나트륨 0.55 ㎏

쌀가루 5.0 ㎏

비타민 B1 0.003 ㎏

비타민 B2 0.003 ㎏

밀크향 0.16 ㎏

물 71.1 ㎏

전지분유 4 ㎏

대용분유 1 ㎏

제일인산칼슘 0.1 ㎏

살포염 1 ㎏

분무유 25 ㎏

MADG-3 0.2 ∼ 0.5 ㎏

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 비스켓을 제조하였다.

<2-5> 아이스크림의 제조

유지방 10.0 %

무지유고형분 10.8 %

설탕 12.0 %

물엿 3.0 %

유화안정제(스팬,span) 0.5 %

향료(스트로베리) 0.15 %

물 63.31 ∼ 62.91 %

MADG-3 0.24 ∼ 0.64 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 아이스크림을 제조하였다.

<2-6> 쵸코렛의 제조

설탕 34.36 ∼ 34.76 %

코코아 버터 34 %

코코아 매스 15 %

코코아 파우다 15 %

레시틴 0.5 %

바닐라향 0.5 %

MADG-3 0.24 ∼ 0.64 %

상기 조성 및 함량으로 하여 통상적인 방법을 사용하여 초코렛을 제조하였다.

<제조예 4> 화합물 1, 2, 4 및 5를 유효성분으로 함유하는 건강식품의 제조

상기 제조예 3에서 화합물 3(MADG-3)대신에 각각 화합물 1, 2, 4 및 5를 동일 비율로 부가하는 외에 상기 제조예 1과 동일한 조성으로 각각 음료, 츄잉검, 캔디, 비스켓, 아이스크림 및 쵸코렛을 제조하였다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 암세포를 주입하여 암의 발생을 유도한 햄스터에 녹용으로부터 분리한 유효성분인 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 주입한 경우, 면역증진에 중요한 림파구, 단핵구 및 수상돌기 세포가 활성화 되고 암의 발생이 지연되며 면역 세포의 암세포에 대한 독성 활성을 증진시키므로 이를 유효성분으로 함유하는 면역증진제, 항암제 및 건강식품은 면역력을 강화시키고 암을 치료하고 예방하는데 유용하게 사용될 수 있다.

도 1은 비처리 대조군, IL-2 처리군(20 ng/㎖ 처리), MADG-3 처리군(1 ㎍/㎖ 처리)의 T 세포 활성을 나타낸 사진이고( 도면에서 각 숫자는 IL-2 특이적인 항체를 포획한 스팟의 개수를 나타낸다),

도 2는 MADG-3로 T 림프세포를 활성화 시켰을때 분비되는 사이토카인을 측정한 실험 결과를 나타낸 그래프이고,

① 대조군 : anti-CD3, anti-CD28 처리군

② 실험군 : anti-CD3, anti-CD28 과 MADG-3(0.1,1 ug/ml)처리군

도 3은 생쥐 골수 세포로부터 수상돌기 세포(DC)를 분리하고, GM-CSF, IL-4 및 TNF-α를 처리하여 배양한 뒤의 각 단계별 세포 형태를 나타낸 사진이고,

A : 생쥐 골수 세포를 2 ×10⁶세포수/100 mm 디쉬 농도로 접종한 직후의 사진(100× 확대한 현미경 사진),

B : 둥근 형태의 수상돌기 과립세포를 3일 동안 배양하였을 때, 상기 세포가 클러스터를 형성하고 세포배양 웰(well)의 바닥에 부착하여 성장함을 나타낸 사진(400× 확대한 현미경 사진),

C : 배양 6 내지 7일째 성숙 수상돌기 세포가 군집하여 자라나는 형태를 나타낸 사진(400× 확대한 현미경 사진), 작은 도면의 사진은 특정세포만 컴퓨터 상에서 약 2배정도 확대한 사진,

D : 배양 9일째에 수상돌기 세포가 특이적으로 길고 작은 전골(protrusion)의 형태를 나타냄을 확인한 사진(1000× 확대한 현미경 사진), 작은 도면의 사진은 특정세포만 컴퓨터 상에서 약 2배 정도 확대한 사진,

도 4은 Balb/c AnN 생쥐로부터 분리한 골수 수상돌기 세포(bone marrow dendritic cell)를 배양한 지 11일째에 수상돌기 세포 특이적 마커, 단핵구 특이적 마커 및 과립구 특이적 마커의 발현을 분석한 FACS 분석 그래프이고(이때, 햄스터 IgG 및 래트 IgG2a에 대한 이성체 대조군 염색이 세팅 마커 라인(직선)으로 사용되었다),

CD80 및 CD86 : 공동자극 특이적 분자 마커,

CD11c 및 DEC-205 : 수상돌기 세포 특이적 마커,

CD14 및 F4/80 : 단핵구/대식세포 특이적 마커,

Gr-1 : 과립구 특이적 마커,

도 5는 MADG-3을 수상돌기 세포에 처리하였을 때, 부착 분자의 발현에 영향을 미치는지 여부를 확인한 RT-PCR 전기영동 결과를 나타낸 사진이고,

레인 1 : Vcam-1, 레인 2 : Icam-1, 레인 3 : Icam-2,

레인 4 : VLA-4, 레인 5 : VLA-5, 레인 6 : LFA-1,

레인 7 : GAPDH, (+) : MADG-3 처리군, (-) : 무처리 대조군,

도 6는 종양세포 KIGB-5를 정맥주사하고, 각각 다른 조건으로 처리를 하여 4주 후 종양세포 주입부위에서의 종양 형성을 확인한 결과를 나타낸 사진이고,

A : RPMI 주입군, B : BMSC 주입군,

C : BMSC ＋ Ad/ΔE1 주입군,

도 7은 종양세포 KIGB-5를 정맥주사로 주입하고, 각각 다른 조건으로 처리를 하여 8주 후 폐에서의 종양형성을 확인한 결과를 나타낸 사진이고,

A : RPMI 주입군, B : BMSC(2.5 × 10⁶ 세포수/일) 주입군,

C : BMSC(2.5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ Ad/ΔE1(50 MOI) 주입군,

D : DC(5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ 종양 분해질 주입군,

E : BMSC(2.5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ Ad/IL-2(50 MOI) 주입군,

F : MADG-3(50 ㎎/㎏/일) 주입군,

도 8a 및 도 8b는 종양세포 KIGB-5를 정맥주사로 주입하고, 각각 다른 조건으로 처리를 하여 8주 후 폐에서의 종양형성을 조직학적으로 염색한 결과를 나타낸 사진이고,

도 8a에서,

A : RPMI 주입군,

B : BMSC(2.5 × 10⁶세포수/일) 주입군,

C : BMSC(2.5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ Ad/ΔE1(50 MOI) 주입군,

D : DC(5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ Ad/IL-2(50 MOI) 주입군.

도 8b에서,

A : RPMI 주입군,

B : DC(5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ 종양 분해질 주입군,

C : MADG-3(50 ㎎/㎏/일) 주입군,

도 9는 종양세포 KIGB-5를 피하이식하고(1 ×10⁵ 세포), 각각 다른 조건으로 처리를 하여 12주 후 형성된 종양 및 이의 크기를 측정한 결과를 나타낸 사진이고,

A : RPMI 주입군,

B : BMSC(2.5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ Ad/ΔE1(100 MOI) 주입군,

C : BMSC(2.5 × 10⁶ 세포수/일) 주입군,

D : DC(5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ 종양 분해질 주입군,

E : BMSC(2.5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ Ad/IL-2(100 MOI) 주입군,

F : BMSC(2.5 × 10⁶ 세포수/일) ＋ Ad/IL-2(100 MOI) ＋ MADG-3(10 ㎎/㎏/일) 주입군,

G: MADG-3(10 ㎎/㎏/일) 주입군.

도 10은 햄스터에 담도암을 유발시킨 후 MADG-3의 여러 용량을 투여한 후 8주에 폐에서의 종양형성을 육안으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이고,

A: 인산완충용액 주입군,

B: MADG-3(10 mg/Kg/일) 주입군,

C: MADG-3(25 mg/Kg/일) 주입군,

D: MADG-3(50 mg/Kg/일) 주입군.

도 11은 햄스터에 담도암을 유발시킨 후 MADG-3의 여러 용량을 투여한 후 8주의 폐조직을 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이고,

A: 인산완충용액 주입군,

B: MADG-3(10 mg/Kg/일) 주입군,

C: MADG-3(25 mg/Kg/일) 주입군,

D: MADG-3(50 mg/Kg/일) 주입군.

도 12는 생쥐에 악성 흑색종을 정맥으로 주입하고 각각 다른 조건으로 치료하여 4주 후에 폐에 생긴 병소를 육안으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이고,

A: RPMI 배양배지 주입군,

B: 수상돌기세포(DC)(5 × 10⁵ 세포수/일) ＋ 종양 분해질 주입군,

C: MADG-3(50 mg/Kg/일) 주입군.

도 13은 상기(도 11)의 실험 결과를 현미경으로 관찰한 결과를 나타낸 사진이고,

A: RPMI 배양배지 주입군,

C: MADG-3(50 mg/Kg/일) 주입군.

도 14는 생쥐에 악성 흑색종을 정맥으로 주입하고 각각 다른 조건으로 치료하여 6주간 관찰한 생존율 검사결과를 나타낸 그래프이고,

① RPMI 배양배지 주입군,

② 수상돌기세포(DC)(5 × 10⁵ 세포수/일) ＋ 종양 분해질 주입군,

③ MADG-3(50 mg/Kg/일) 주입군.

도 15는 MADG-3로 활성화된 T 림프세포의 악성 흑색종에 대한 세포독성검사 결과를 나타낸 그래프이다.

① 대조군 1: anti-CD3, anti-CD28 처리군

② 대조군 2: anti-CD3, anti-CD28 과 IL-2(20mg/ml)처리군

③ 실험군 : anti-CD3, anti-CD28 과 MADG-3(1 ug/ml) 처리군

<110> KIM, SANG-HEE <120> Immunity enhancing agent, anti-cancer agent, and health food containing acethyldiacylglycerole derivatives as an effective ingredient <160> 14 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM-1 forward primer <400> 1 ccaactggaa gctgtttgag ct 22 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM-1 reverse primer <400> 2 ttctgtcgaa ctccacagtc a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM-2 forward primer <400> 3 catatggtcc gagaagcaga t 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ICAM-2 reverse primer <400> 4 aagcatagca ggacagatgt c 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCAM-1 forward primer <400> 5 ggttgggaag ccggtcacag tcaa 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCAM-1 reverse primer <400> 6 gcacacgtca gaacaaccga atcc 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VLA-4 forward primer <400> 7 ctcagatctc cttgttggag cagc 24 <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VLA-4 reverse primer <400> 8 tgaatgcctg gtgtgtccta c 21 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VLA-5 forward primer <400> 9 cagtggtgat gacactgatg a 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VLA-5 reverse primer <400> 10 agaagctaag gttgatgcag g 21 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LFA-1 forward primer <400> 11 tgacacttta cttgcgacca 20 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LFA-1 reverse primer <400> 12 gatgggtagt cgaactcatt g 21 <210> 13 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH forward primer <400> 13 accacagtcc atgccatcac 20 <210> 14 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH reverse primer <400> 14 tccaccaccc tgttgctgta 20

Claims

하기 화학식 1로 기재되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들을 유효성분으로 함유하는 면역증진제.

<화학식 1>

상기식에서, R1/R2는 9-옥타데세노일(올레오일)/헥사데카노일(팔미토일), 헥사데카노일(팔미토일)/9-옥타데세노일(올레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12-옥타데카디에노일(리놀레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12,15-옥타데카트리에노일(리놀레노일) 또는 헥사데카노일(팔미토일)/5,8,11,14-에이코사테트라에노일(아라키도노일)을 나타내며, R3는 아세틸을 나타냄.
제 1항에 있어서, 상기 화학식 1의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 다음 화학식 1a로 기재되는 모노아세틸디글리세라이드-3(Monoacethyldiglyceride-3, MADG-3)임을 특징으로 하는 면역증진제.

<화학식 1a>
제 1항에 있어서, 상기 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 면역 세포의 사이토카인 분비를 증진시키는 것을 특징으로 하는 면역증진제.
제 1항에 있어서, 상기 면역증진제는 조혈 세포 및 면역세포 자극을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 면역증진제.
하기 화학식 1로 기재되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물들을 유효성분으로 함유하는 항암제.

<화학식 1>

상기식에서, R1/R2는 9-옥타데세노일(올레오일)/헥사데카노일(팔미토일), 헥사데카노일(팔미토일)/9-옥타데세노일(올레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12-옥타데카디에노일(리놀레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12,15-옥타데카트리에노일(리놀레노일) 또는 헥사데카노일(팔미토일)/5,8,11,14-에이코사테트라에노일(아라키도노일)을 나타내며, R3는 아세틸을 나타냄.
제 5항에 있어서, 상기 화학식 1의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 다음 화학식 1a로 기재되는 모노아세틸디글리세라이드-3(Monoacethyldiglyceride-3, MADG-3)임을 특징으로 하는 항암제.

<화학식 1a>
제 5항에 있어서, 상기 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 항암제 총중량에 대해 20 내지 35 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 항암제.
제 5항에 있어서, 상기 항암제는 체중 1 ㎏당 25 내지 50 ㎎으로 투여되는 것을 특징으로 하는 항암제.
제 5항에 있어서, 상기 항암제는 담도암, 신장암 또는 악성흑색종을 치료하는 것을 특징으로 하는 항암제.
제 5항에 있어서, 상기 항암제는 면역세포를 활성화시켜 암 세포를 억제하는 것을 특징으로 하는 항암제.
하기 화학식 1로 기재되는 아세틸디아실글리세롤류의 화합물을 유효성분으로 함유하는 면역증진 또는 암 예방용 건강식품.

<화학식 1>

상기식에서, R1/R2는 9-옥타데세노일(올레오일)/헥사데카노일(팔미토일), 헥사데카노일(팔미토일)/9-옥타데세노일(올레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12-옥타데카디에노일(리놀레오일), 헥사데카노일(팔미토일)/9,12,15-옥타데카트리에노일(리놀레노일) 또는 헥사데카노일(팔미토일)/5,8,11,14-에이코사테트라에노일(아라키도노일)을 나타내며, R3는 아세틸을 나타냄.
제 11항에 있어서, 상기 화학식 1의 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 다음 화학식 1a로 기재되는 모노아세틸디글리세라이드-3(Monoacethyldiglyceride-3, MADG-3)임을 특징으로 하는 면역증진 또는 암 예방용 건강식품.

<화학식 1a>
제 11항에 있어서, 상기 아세틸디아실글리세롤류의 화합물은 건강식품 총중량에 대해 0.02 내지 1.0 중량%로 포함되는 것을 특징으로 하는 면역증진 및 암 예방용 건강식품.