KR20050109978A - 비활성화된 비브리오 콜레라 백신 타블렛 - Google Patents

Abstract

본 발명은 백신학의 분야, 보다 자세하게는 콜레라 감염에 대해 경구로 투여되는 백신에 적용되는 것이다. 본 발명의 목적은 비브리오 콜레라의 전 비활성화 세포로부터 유래된 타블렛 형태의 경구 투여용 백신을 개발하고, 이 백신 제제를 수득하기 위한 방법을 개시하기 위한 것이다.

Description

비활성화된 비브리오 콜레라 백신 타블렛{INACTIVATED VIBRIO CHOLERA VACCINE IN TABLETS}

본 발명은 백신학의 분야, 보다 자세하게는 콜레라 감염에 대해 경구로 투여되는 백신에 적용되는 것이다. 본 발명은 신규한 백신 제제 및 그 치료적 적용을 개시한다. 보다 자세하게는, 본 발명은 타블렛으로 경구로 투여될 수 있는 비브리오 콜레라( Vibrio cholerae)에 반응성인 비활성된 백신 제제를 구성한다.

콜레라는 그 대부분의 현저한 증상이 액체성 대변의 갑작스럽고 많은 배변으로 특징되는 급성 설사인 전염성 질병이다. 이 설사는 매우 심각할 수 있고 만일 환자가 적절한 의학적 치료를 받지 않으면 증상 발현 후 5시간 내에 사망하는 원인이 될 수도 있다. 이것은 오염된 음식이나 음료로부터 경구로 얻어진다. 일곱 가지 유행병(모두 사망률과 사망의 증가된 지수를 가져오는 것)이 오늘날 보고되었다. 감염은 열악한 위생조건을 초래하는 자연적인 재해, 전쟁 또는 다른 파괴적 사건에 영향을 받은 미개발 지역이나 국가에 거주하는 주민들 사이에 가장 보편적인 것이다. 따라서 영향 지역을 방문하는 여행자 또한 감염에 민감할 수 있다 (CDC/NCID. Organizaci n Panamericana de la Salud. M todos de laboratorio para el diagn stico de Vibrio cholerae. En: Programa especial de publicaciones. Ed. Washington, D.C., Estados Unidos 1994).

항생제와 수화 소금으로 치료가 비록 효과적이기는 하지만, 질환의 급속한 효과에 반응하기 위해서는 철저하고 지속적인 의료적 조치가 필요하다. 한편, 인간의 보호의 인디케이터로서, 감염이 혈청 내 비브리오사이드 항체의 존재와 결합된 특정 면역성 보호를 유도한다는 것이 관찰되어 왔다 (Glass, R.I., Svennerholm, A.M., Stoll, B.J.,Khan, M.R., Hossain, K.M., Huq, M.I., Holmgren, J. 1983. Protection against cholera in breast-fed children by antibodies in breast milk. N. Engl. J. Med. 308: 1389-1392 and Jertborn, M., Svennerholm, A. M., Holmgren, J. 1993. Evaluation of different immunization schedules for oral B subunit vaccine in Swedish volunteers. Vaccine. 10: 130-2). 이것은 전체 비활성화 세포 또는 생 희석 세포로부터 유래된 다른 부류의 콜레라 백신의 개발을 이끌어 왔다.

페놀로 비활성화된 전 세포로부터 유래된 비경구로 투여되는 백신은 이들의 짧은 생존(3 내지 6 개월) 및 낮은 보호율(30 내지 60%) 뿐 아니라 홍반, 국소적 통증, 경화, 발열 및 세팔리아를 일으키는 이들의 높은 반응성 생성 수준 때문에 시장에서 사라졌다 (OMS. 1991. Reuni n sobre la vacuna contra el c lera. Informe final. Washington, D.C.).

담즙으로 비활성화된 전 세포가 대안으로 밝혀졌다(담즙백신). 이러한 경구로 투여되는 백신은 온화한 보호 수준을 제공하고 산업적으로 개발되지는 않았다 (Svennerholm, A. M. and Holmgren, J. 1986. Oral combined B subunit-whole cell cholera vaccine. In J. Holmgren A. Lindberg and R. Mollby (ed). Development of vaccines and drugs against diarrhea. 11^th Novel Conference, Stockholm, 1985. Student litteratur, Lund, Sweden. p.33-43).

콜레라 독소(B-WC)의 비-서브유닛(B-subunit)과 조합되어 열과 포름알데하이드로 비활성화된 전 세포가 투여되어진 후 3년에 완만한 수준의 보호(60%)를 제공한다는 것이 나타났지만 (Holmgren, J., Svennerholm, A., M., Lonroth, I., Fall-Persson, M., Markham, B. and Lundback, H. 1977. Development of improved cholera vaccine based on subunit toxoid. Nature 269:602-604); 콜레라 독소의 비-서브유닛을 수득하고 정제하는 것이 요구되기 때문에 이 백신의 생산은 아주 비싸고 복잡하다 (Tayot, J. L., Holmgren, J., Svennerholm, L., Lindblad, M., Tardy, M. 1981. Receptor-specific large scale purification of cholera toxin on silica beads derivatized with lyso-GMI gaglioside. Eur. J. Biochem. 113:249-258).

재조합 방법을 통해 수득된 콜레라 독소의 비-서브유닛(rB-WC)을 채용하는 상기 언급된 대안의 변형형이 신뢰할 만한 것으로 입증되지만, 여전히 투여되어진 후 3년에 60% 수준의 보호를 제공하고, 이것은 번거로운 제조공정을 포함한다. 이 백신은 두 개의 다층 외피로 제조되는데, 그 하나는 분말형의 염의 혼합물을 포함하고 다른 것은 동결 건조된 비브리오 콜레라 균주를 포함한다. 투여 시, 먼저 물에 그리고 두 번째로 물과 염의 용액에 재현탁되어야 하며; 그런 다음 염을 함유하는 용액이 경구로 투여되어야 하고, 균주를 포함하는 현탁액의 투여가 15분 후에 동일한 양식으로 투여된다 (S nchez, J. L., Holmgren, J. 1989. Recombinant system for overexpression of cholera toxin B Subunit in Vibrio cholerae as basis for vaccine development. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:481-485).

전 비활성화 세포로부터 유래된 다른 최첨단의 백신은 비브리오 콜레라 카리오(Cairo) 50 균주(Classic, Ogawa) 569B 균주(El Tor, Inaba)로 치환된 이 후자의 것에 유사하다. 이것은 투여된 후 8 내지 10개월까지 수긍할 수 있는 보호의 수준 (66%)을 제공한다. 이것은 비브리오 콜레라의 다른 세로타입(serotypes) 및 바이오타입(biotypes) 균주의 혼합물이고 현탁된 균주와 염의 혼합물을 함유하는 외피를 포함하는 병에서 제조된다 (Trach, D. D., Clemens, J.D., Ke, N.T., Thuy, H.T.,Son, N.D., Canh, D.G., Hang, P.V.D, Rao, M.R. 1997. Field trial of a locally produced, killed, oral cholera vaccine in Vietnam. Lancet. 349:231-235). 상술된 백신과 같이, 그의 적용은 염의 혼합물이 물에 용해되고 그리고 경구로 투여되고, 세포 균주를 포함하는 병의 내용물이 15분 후에 투여되는 것을 요하여, 느리고 조심스러운 절차로 시간뿐 아니라 자격을 갖춘 사람을 요하고, 이 과정은 모두 보다 많은 비용을 요하게 한다.

유행성 균주를 분화하기 위해 균주 내로 부가적으로 삽입되는 수은-내성 유전자에 의해 보충된, CVD103 균주에 기초된 CVD103 HgR 백신은 비록 이것이 실질적인 면역 반응을 얻기 위해서는 높은 복용량으로 투여되어야 하지만, 안전한 투여 방법을 포함하고 지원자에게 수행된 시험에서 양호한 수준의 보호를 나타냈다 (OMS. 1991. Reuni n sobre la vacuna contra el c lera. Informe final. Washington, D.C. and Holmgren, J., and Svennerholm, A. M. 1999. Vaccines against Diarrheal Diseases. In Perlmann, P. and Wigzell, H. [ed]. Vaccines. Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York. p:290-328). 이 균주의 생산은 완전히 밀폐된 시스템을 요하고 ( Cryz, S.J. and Gluck, R., 1997. Large-Scale production of live attenuated bacterial and viral vaccines. In New Generation Vaccine. Second Edition. Ed. Levine, M.M., Woodrow, G.C.,Kaper, J.B. and Cobon, G.S. Library of Congress. Cataloguing in Publication Data. New York. P: 1153-1163) 그리고 이것은 앞에서 기술된 백신과 동일한 양식으로 제조되어 투여시 동일한 어려움을 나타낸다.

생 희석 백신은 C7258 유행성 균주로부터 유래되어 CTXΦ독성 파아지를 제거하고 프로테아제 헤마글루티닌(protease hemaglutinins)을 코드하는 햅 유전자(hap gene)에 백신 마커(marker) celA를 포함하도록 처리된 638 균주에 기초하고 적용시 신뢰할 수 있는 것으로 입증되고 적절한 면역학적 반응을 가져온다 (Ben tez, J.A., Garc a L., Silva A., Garc a, H., Fando, R., Cedr , B., P rez, A., Campos, J., Rodr guez, B., P rez, J.L., Balmaseda, T., P rez, O., Ram rez, M., Led n, T., D az, M., Bravo, L. and Sierra, G. 1999. Preliminary assessment of the safety and immunogenicity of a new CTXf- negative, haemaglutinin/protease-defective El Tor strain as a cholera vaccine candidate. Infect. Immun. 67: 539-545). 그러나, 상기에 언급된 것에 유사한 제조과정에 기인하여 이미 고려된 백신과 관련된 모든 난제를 나타낸다.

Peru-3, Bah-3 및 Bang-3와 같은 균주를 사용하는 비브리오 콜레라 균주의 희석에 기한 백신은 비록 면역성 반응을 제공하지만, 허용될 수 없을 정도로 반응적이라고 입증되었다 (Taylor, D.N, Killen, K.P., Hack, D.C>, Kenner, J.R., Coster, T.S., Beatle, D.T., Ezzell, J., Hyman, T., Tropa, A., Sjogrem, M.H., Friedlander, A., Mekalanos, J.J., Sadoff, J.C. 1994. Development of a live, oral, attenuated vaccine against El Tor cholera. J. Infect. Dis. 170:1518-1523).

Peru-3 균주에 기초된 Peru15 균주를 채용하는 백신은 안전한 적용 방법을 가지고 지원자에게서 수행된 실험에서 양호한 수준의 보호를 얻었다 (Kener, J.R., Coster, T.S., Taylor, D.N., Troffa, A.F., Barrera-Oro, M., Hyman, T., Adams, J.M., Beattie, D.T., Killeen, K.P., Spriggs, D.R., Mekalanos, J.J., Sadoff, J.C. 1995. Peru-15, an improved and attenuated oral vaccine candidate for Vibrio cholerae O1. J. Infect. Dis. 72:1126-1129). 그러나 아직 아무런 임상적 연구가 수행되지 않았고, 이 백신은 상기 언급된 것과 같은 동일한 난제를 나타낸다.

본 발명은 비브리오 콜레라의 모든 비활성화 세포, 타블렛 형태의 최종 제제를 위해 사용되는 교착제, 윤활제, 도포, 충진 및 붕괴제를 포함하는 새로운 백신 제제를 포함하여 그의 각종 성분을 안정한 생태로 유지하고 이들이 상호 간섭되는 것을 방지한다. 최종 제품이 얻어지고 항원성 및 면역성의 효과는 제제의 활성적인 복합제를 구성하는 비활성화 세포에 의해 제공된 것에 유사하다는 것을 알아낸 것은 놀라운 것이다.

도 1은 비브리오 콜레라의 LPS를 평가하기 위해 ELISA 기술을 사용한 타블렛 부형제의 가능한 간섭의 연구이다. C01 내지 C09: 비활성화 세포와 부형제의 혼합물. C10 내지 C18: 부형제 단독. C19: 비활성화 세포 단독.

샘플의 각각에 사용된 부형제: C01 및 C10: 스타치; C02 및 C11: 소디움 카르복시메틸스타치; C03 및 C12: 크로스카라멜로스; C04 및 C13: 포비돈; C05 및 C14: 탈크; C06 및 C15: 마그네슘 스테아레이트; C07 및 C16 이산화 티타늄; C08 및 C17; 이산화 실리콘; C09 및 C18; 스타치 1500; C19: 비활성화 세포.

도 2는 백신의 활성 복합제의 항원성에 대한 부형제의 가능한 효과를 결정하는 것이다. 이 그래프는 30일 동안 배양된 샘플에 대한 평균 ELISA 시험 결과치를 4℃에서 배양된 것(도 2A) 및 26 내지 28℃ 사이에서 배양된 것(도 2B)의 0시간에서 평가된 동일한 샘플에 대한 ELISA 시험 결과치에 대해 백분율로 나타낸다. 이 실시예에서 평가된 부형제는:

1.- 락토스, 2.- 스타치, 3.- 소디움 카르복시메틸스타치, 4.- 크로스카라멜로스, 5.- 포비돈, 6.- 탈크, 7.- 마그네슘 스테아레이트, 8.- 이산화 티타늄, 9.- 비활성화 세포이다.

도 3은 ELISA 모노크로날 항체 항-LPS 저해 시험을 통해 최종 타블렛 제제에서 비브리오 콜레라의 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide; LPS)의 항원성을 결정하는 것이다.

도 4는 비활성화 세포 또는 타블렛 제제 백신으로 접종된 래빗의 혈청 역가이다. ELISA를 통해 검지된 V. 콜레라 Ｏ1, Ogawa의 항-리포폴리사카라이드 타이틀이 도 4A에 나타난다. 비브리오사이드의 타이틀은 도 4B에 나타난다.

본 발명은 혈청 군 Ｏ139 또는 혈청 군 Ｏ1, 그리고 고전적인 El Tor, Ogawa 또는 Inaba bio 및 혈청-타입에 속하는 야생 또는 희석된 균주를 채용하는 비브리오 콜레라 균주의 비활성화 세포로 구성된 백신을 제공한다.

여기에 나타난 백신 제제는 비브리오 콜레라의 비활성화된 세포를 포함하고, 바람직하기로는 타블렛 당 10⁹ 내지 10¹¹ 비활성화 박테리아를 포함한다. 이것은 교착제: 포비돈, 젤라틴, 카르복시메틸셀룰로스로, 타블렛의 전체 질량과의 관계에서 1 내지 5%의 농도로 되어야 함; 윤활제: 소디움 카르복시메틸스타치, 마그네슘 스테아레이트, 콜로이드 이산화 실리콘 및 탈크로, 타블렛의 전체 질량과의 관계에서 0.25 내지 1.5% 사이의 농도로 사용됨; 코팅제: 셀룰로스 아세토프탈레이트, 셀룰로스 디에틸프탈레이트, 락커로 10%의 농도, 및 타블렛의 전체 질량과의 관계에서 1 내지 2%의 농도로 사용된 이산화 티타늄; 충진제: 락토스 및 콘스타치로, 타블렛의 전체 질량과의 관계에서 65 내지 80%의 농도로 되어야 함; 그리고 붕괴제: 소디움 크로스카라멜로스, 콘스타치 및 마이크로-크리스탈린 셀룰로스로, 타블렛의 전체 질량과의 관계에서 5 내지 15% 사이의 농도로 사용됨; 를 포함하여 제조될 수 있다.

오늘날까지, 본 타블렛 제제에 대한 최신의 백신학적 방법에서의 전례는 없었다. 또한, 제제에 의해 그 활성 복합체의 주요한 면역학적 특성에 영향을 미침이 없이 사용기술의 화학적 및 물리적인 스트레스 특성에 내성인 제제로 생물학적 물질, 특히 세포와 합성적 화합물을 조합하는 본 제제는 최초라는 것이 지적되어야만 한다.

본 발명의 목적은 다음의 실시예를 통하여 기술되어 질 것이다:

실시예 1: 비브리오 콜레라의 LPS 의 평가에 사용된 ELISA 시험 동안에 타블렛에서 발견된 부형제의 가능한 간섭에 대한 연구.

비활성화 세포와 각기 다른 부형제를 포함하는 이들의 혼합물뿐 아니라 별도의 부형제 용액이 이 실험에서 연구되었다. 비활성화 세포는 양성 대조군으로 사용되었다. 사용된 부형제는: 소디움 카르복시메틸스타치, 소디움 크로스카라멜로스, 포비돈, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 이산화 티타늄, 콜로이드 이산화 실리콘, 콘스타치 및 락토스였다.

ELISA 기술은 다음 단계로 구성된다:

1. PBS에 용해된 100㎕/hole의 세포 혼합물-부형제로 폴리스틸렌 플라크 (Maxisorp, Nunc, Denmark) 도말(cover). 웨트 챔버(wet chamber)에서 4℃에서 밤 세워 배양.

2. 면역효소학적 시험의 각 단계 사이에서 물 내에 0.05% 트윈 20으로 플라크를 수세.

3. PBS 내 1% 농도로 150㎕/hole의 스킴 밀크로 플라크 블럭. 웨트 챔버에서 37℃에서 1시간 동안 배양.

4. 100㎕/hole의 항-LPS 모노크로날 항체의 부가.

5. 1% 스킴 밀크 및 0.05% 트윈 20을 갖는 타입 PBS 내에 희석된 타입 VI 서양고추냉이 퍼옥사이드(horseradish peroxidase ; Sigma Chemical Co. Saint Louis MO)로 컨쥬게이트된, 마우스로부터 추출된 100㎕/hole의 항-IgG 항체의 부가. 웨트 챔버에서 실온에서 2시간 동안 배양.

6. 0.01%의 H₂0₂를 포함하는, 0.1 M 시트레이트 완충용액(pH 4.5) 내에 0.4 mg/mL의 농도로 100㎕/hole의 o-페닐렌디아민 용액 (Sigma Chemical Co. Saint Louis MO)으로 반응 전개(develop).

7. 2.5 M의 H₂SO₄ 50㎕/hole의 용액으로 기질의 적용 30분 후 반응을 종료하고 마이크로-플라크 판독기로 492nm의 파장에서 플라크를 판독.

그 결과는, 비록 혼합되지 않은 부형제가 유의적으로 낮은 값을 제공하였지만, 비활성화 세포와 부형제의 혼합물이 비활성화 세포 단독의 것이 유사한 값을 나타내는, 도 1에 도시된 바와 같이, 채용된 부형제와 분석 과정의 성분 간에 아무런 간섭이 일어나지 않는다는 것이 입증되었다.

실시예 2: 부형제와 백신의 활성적 복합체간의 가능한 간섭의 결정.

비활성화된 비브리오 콜레라 세포와 사용된 다른 부형제의 현탁액을 함유하는 혼합물의 항원성은 혼합물을 동일하게 두 개로 분할하고 하나는 4℃에서 다른 하나는 28℃에서 배양하는 ELISA 기술(실시예 1에서 기술된 바와 같은 것)을 사용하여 결정되었다. 이 연구는 배양의 0시 및 30일 후 수행되었다. 이 실시예에서 사용된 부형제는: 락토스, 스타치, 소디움 카르복시메틸스타치, 크로스카라멜로스, 포비돈, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 이산화 티타늄이었다. 그 결과는 비활성화 세포의 리포폴리사카라이드의 항원성은 다른 부형제의 존재에 의해 영향을 받지 않는다는 것을 나타낸다. ELISA 값은 4℃에서 수행된 시험 및 28℃에서 수행된 것 양자에서 배양 30일 내내 유지되었다(도 2).

실시예 3: 백신의 항원성.

백신의 항원성은 타블렛에서 비브리오 콜레라의 리포폴리사카라이드(LPS)를 검지할 목적인 ELISA 저해 시험을 통하여 결정되었다.

타블렛의 용액, V. 콜레라의 LPS Ogawa, V. 콜레라의 LPS Ｏ139, El Tor 및 Ogawa 균주의 살아있는 V. 콜레라 세포의 현탁액, 및 비활성화 세포의 현탁액이 시험용 샘플로 사용되었다.

ELISA 시험은 다음 단계로 구성된다:

인산완충액(PBS)에 용해된, 25㎍/mL의 농도로 100㎕/hole의 V. 콜레라의 LPS Ogawa로 폴리스틸렌 플라크 (Maxisorp, Nunc, Denmark) 도말. 웨트 챔버에서 4℃에서 밤새워 배양.

면역효소학적 시험의 각 단계 사이에서 물 내에 0.05% 트윈 20으로 플라크를 수세. PBS 내 1% 농도로 150㎕/hole의 스킴 밀크로 플라크 블럭. 웨트 챔버에서 37℃에서 1시간 동안 배양.

각각 PBS 0.05% 트윈 20에 25 ug/ml의 최종 농도가 되도록 용해된 샘플 및 항-LPS Ogawa 모노크로날 항체에 대해 1:2의 농도 비율의 용액에 실온에서 1시간 동안 미리 배양된 100㎕의 샘플 부가. 웨트 챔버에서 실온에서 2시간 동안 배양.

1%의 농도의 스킴 밀크를 갖는 PBS 0.05% 트윈 20에 희석된 타입 VI 서양고추냉이 퍼옥사이드(Sigma Chemical Co. Saint Louis MO)로 컨쥬게이트된 종-특이적 항-IgG 항체 100㎕/hole의 부가. 웨트 챔버에서 실온에서 2시간 동안 배양.

0.01%의 H₂0₂를 포함하는, 0.1 M 시트레이트 완충용액(pH 4.5) 내에 0.4 mg/mL의 최종 농도로 100㎕/hole의 o-페닐렌디아민 용액 (Sigma Chemical Co. Saint Louis MO)으로 반응 전개.

30분 후 반응 종료. 2.5 M의 H₂SO₄ 50㎕/hole의 용액으로 기질의 부가 후, Titerkek Multiskan Plus 마이크로-플라크 판독기(Flow Laboratories, USA)로 492nm의 파장에서 플라크를 판독함.

그 결과는 생 세포, 비활성화 세포 및 LPS Ogawa가 사용될 때 얻어진 것에 유사한 값으로, 타블렛 현탁액이 이용될 때 높은 수준의 저해를 보였다. LPS Ｏ139를 포함하는 경우에 아무런 저해가 관찰되지 않았다 (도 3). 이는 비활성화 세포의 항원 활성이 최종 타블렛 제제에 영향을 미치지 않는다는 것을 입증한다.

실시예 4: 백신의 면역성

백신의 면역성은 문제의 샘플로 래빗의 십이지장 내 접종을 통해 연구되었다. 세릭(seric) 항체 운동성은 ELISA 및 비브리오사이드 기술을 이용하여 평가되었다. El Tor 및 Ogawa 균주 V. 콜레라의 비활성화 세포 및 타블렛 제형을 포함하는 현탁액이 문제 샘플로 채용되었다.

십이지장을 노출하고 십이지장 관에 재현탁된 타블렛, 백신 균주의 비활성화 배양 또는 식염수 용액으로 접종하기 위해 절개가 실행되었다. 항체의 세릭 운동성은 ELISA 및 비브리오사이드 기술을 이용하여 평가되었다.

IgG 항-리포폴리사카라이드 항체의 운동성을 결정하기 위한 ELISA 기술:

1. 25㎍/mL의 농도로 순수 LPS로 Nunc 또는 Maxisorp 96-홀 폴리스틸렌 플라크 도말. 4℃에서 밤 세워 또는 37℃에서 2시간 동안 배양.

2. 0.05% 농도의 물 내에 트윈 20으로 삼회 수세.

3. PBS 내 2% 농도로 150㎕/hole의 스킴 밀크 용액으로, 37℃에서 1시간 동안 블럭.

4. 삼회 수세.

5. PBS 트윈 0.05% 내에 문제 혈청의 일련의 용액을 제조. 실온에서 2시간 동안 배양.

6. 삼회 수세.

7. PBS-T 내에 1% 밀크에 컨쥬게이트된 희석된 항 IgG-HRP 종을 부가하여 실온에서 1시간 동안 배양.

8. 6회 수세.

9. pH 4.5의 시트레이트 완충용액에 30%의 농도로 H₂0₂와 1mg/mL의 농도의 o-페닐렌디아민으로 전개.

10. 492nm의 파장에서 흡광도를 판독함.

살균제의 항체를 시험하기 위한 비브리오사이드의 기술:

평판 바닥 멸균 플라크가 사용된다.

1. 제일 홀에 문제의 혈청 50㎕ 부가. 나머지 홀에 식염수 용액 25㎕ 부가.

2. 일련의 용액을 만들고 마지막 25㎕는 버림.

3. 25㎕의 보충-박테리아 혼합물(플라크 당 2.5ml)을 부가하고 37℃에서 1시간 동안 배양함.

4. BHI 배양 배지 부가 (125㎕의 브롬크레졸 펄프(Bromcresol purple) 및 10ml의 글루코스를 사용하여 100ml의 배지를 만듬. 10ml의 글루코스는 배지로부터 제거되어야 함).

5. 플라크를 손으로 균질화하고 37℃에서 3시간 동안 배양.

6. 역가는 박테리아의 성장을 저해할 수 있는 혈청의 최고 희석으로 정의되어, 배지의 색상에서 변화의 결여에 의해 결정된다.

보충-박테리아 혼합물의 제조:

1. BHI 아가의 두 웨지 또는 플라크에 보존된 V. 콜레라 균주가 접종되고 두 개의 비접종 웨지와 같이 37℃의 온도에서 18 내지 24 시간 동안 배양됨.

2. 플라크에서 분리된 콜로니, 또는 웨지에서 처리된 다수의 것들을 취하여 미리 가열된 웨지에 배치함. 이들을 37℃에서 4시간 동안 배양함.

3. 웨지에서 발견된 성장을 pH 7의 멸균 식염수 용액으로 수세하고 수세를 D.O = 0.90 ~ 0.95로 조정함.

4. 조정된 비활성화 세포는 1:10 비율로 희석됨.

5. 보충-박테리아 혼합물이 제조되고, 여기서:

-보충물(기니 피그 또는 인간 혈청으로, 비브리오사이드 항체 없음)은 냉 멸균 식염수 용액에 대해 1:5 비율로 희석됨.

-동등한 부피의 비활성화 세포 및 희석된 보충물이 혼합됨.

이 결과는 래빗에서 항-리포폴리사카라이드를 유도하는 면역원성의 능력에 있어서, ELISA 기술(도 4A)과 비브리오사이드의 항체(도 4B)를 사용하여 평가한 비활성화 세포와 본 타블렛 제제 사이에 차이가 없는 것을 나타낸다. 실시예 1, 2 및 3은 본 발명에서 기술된 타블렛 제제는 제제에 함유되기 전의 비활성화 세포 그 자체만큼 동물 모델에 있어서 항원적 및 면역원성이고; 이는 최종 타블렛 제제에 항원의 존재와 비브리오사이드 항체를 유도하는 그의 능력 양자에 의해 입증된다 것을 입증한다.

제시된 용액은 이것이 살아있는 유전적으로 조작된 백신과 연관된 잠재적인 위험을 포함하지 않을 뿐 아니라 종래의 비활성화 백신에 존재하는 제품의 투여에 포함되는 어려움도 없이 용이하게 투여될 수 있는 아주 면역원성인 제품(항-리포폴리사카라이드와 비브리오사이드 항체를 유도하는 그 능력에서)이기 때문에 이전의 백신 제제에 비하여 월등하다.

Claims (22)

1. a. 비브리오 콜레라의 비활성화된 세포,

   b. 교착제,

   c. 윤활제,

   d. 코팅제,

   e. 충진제,

   f. 붕괴제로 구성된 콜레라용 백신 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 비활성화된 세포는 비브리오 콜레라의 희석 균주로 이루어진 백신 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 비활성화된 세포는 혈청 그룹 Ｏ139에 속하는 백신 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 상기 비활성화된 세포는 혈청 그룹 Ｏ1에 속하는 백신 조성물.
5. 제 4항에 있어서, El Tor 또는 클래식 타입 세포를 갖는 백신 조성물.
6. 제 5항에 있어서, 상기 비활성화된 세포는 Ogawa 또는 Inaba 혈청 타입에 속하는 백신 조성물.
7. 제 2항에 있어서, 상기 비활성화된 세포는 비브리오 콜레라( Vibrio cholerae)의 야생균주로 구성된 백신 조성물.
8. 제 7항에 있어서, 상기 비활성화된 세포는 혈청 그룹 Ｏ139에 속하는 백신 조성물.
9. 제 8항에 있어서, 상기 비활성화된 세포는 혈청 그룹 Ｏ1에 속하는 백신 조성물.
10. 제 9항에 있어서, El Tor 또는 클래식 바이오-타입 세포를 갖는 백신 조성물.
11. 제 10항에 있어서, 상기 비활성화된 세포는 Ogawa 또는 Inaba 혈청 타입에 속하는 백신 조성물.
12. 제 1항 내지 제 11항 중 어느 한 항에 있어서, 타블렛 당 5 x 10⁹ 내지 10¹¹ 사이의 세포를 포함하는 백신 조성물.
13. 제 1항에 있어서, 교착제로 포비돈, 젤라틴, 또는 카르복시메틸셀룰로스를 갖는 백신 조성물.
14. 제 13항에 있어서, 교착제는 타블렛의 전체 질량의 1 내지 5% 사이의 농도로 포함되는 백신 조성물.
15. 제 1항에 있어서, 윤활제로 소디움 카르복시메틸스타치, 마그네슘 스테아레이트, 이산화 실리콘 및 탈크를 갖는 백신 조성물.
16. 제 1항에 있어서, 윤활제는 타블렛의 전체 질량의 0.25 내지 1.5% 사이의 농도로 포함되는 백신 조성물.
17. 제 1항에 있어서, 코팅제로 셀룰로스 아세토프탈레이트, 셀룰로스 디에틸프탈레이트, 10%의 락커, 및 이산화 티타늄을 갖는 백신 조성물.
18. 제 17항에 있어서, 코팅제는 타블렛의 전체 질량의 1 내지 2% 사이의 농도로 포함되는 백신 조성물.
19. 제 1항에 있어서, 충진제로 락토스 및 콘스타치를 갖는 백신 조성물.
20. 제 19항에 있어서, 충진제는 타블렛의 전체 질량의 65 내지 80% 사이의 농도로 포함되는 백신 조성물
21. 제 1항에 있어서, 붕괴제로 소디움 크로스카라멜로스, 콘스타치 또는 마이크로-크리스탈린 셀룰로스를 갖는 백신 조성물.
22. 제 21항에 있어서, 붕괴제는 타블렛의 전체 질량의 1 내지 6% 사이의 농도로 포함되는 백신 조성물.