KR20050107472A - 상피세포 뮤신 muc-1으로부터 유래된 백신 - Google Patents

Abstract

본 발명은 천연 MUC-1에 대한 동종성이 감소된 신규한 MUC-1 DNA 작제물을 제공한다. 이러한 MUC-1 작제물을 함유하는 약제 조성물을 제공한다.

Description

백신 {VACCINES}

본 발명은 MUC-1 발현 종양의 치료 및 예방을 위한 핵산 백신화 프로토콜에 유용한 신규한 핵산 작제물에 관한 것이다. 특히, 핵산은 DNA이며, DNA 작제물은 모든 완전 반복부가 선택적으로 결여된 MUC-1 유도체를 엔코딩하는 유전자를 포함한다. 더욱 특히, 핵산은 야생형 MUC-1에 대한 동종성이 최소화되도록 변형된다. 본 발명은 추가로 상기 작제물을 포함하는 약제 조성물, 특히 미립자 매개된 전달에 적합한 약제 조성물, 이들의 제조 방법 및 약물에서 이들의 용도를 제공한다.

상피세포 뮤신 MUC-1 (또한, 상피 또는 다형성 상피세포 뮤신, PEM으로 공지됨)은 많은 상피세포에서 발현되는 거대 분자량의 글리코단백질이다. 이러한 단백질은 세포질 테일(cytoplasmic tail), 트랜스멤브레인 도메인 및 고비율의 프롤린, 세린 및 트레오닌 잔기를 함유하는 20개 아미노산 모티프의 다양한 수의 직렬 반복부(본원에서는 VNTR 모노머로 칭함, 이는 또한 VNTR 에피토프 또는 VNTR 반복부로서 공지되어 있음)로 이루어져 있다. 반복부의 수는 MUC-1 로커스에서의 유전자 다형성으로 인해 일정하지 않으며, 가장 빈번하게는 30 내지 100개이다 (Swallow et al, 1987, Nature 328:82-84). 정상적인 담관상피에서, MUC-1 단백질은 담관 관강에 노출된 세포의 표면에서만 발견된다 (Graham et al, 1996, Cancer Immunol Immunother 42:71-80; Barratt-Boyes et al, 1996, Cancer Immunol Immunother 43:142-151). MUC-1 분자의 가장 두드러진 특징중 하나는 이의 과대하게 O-링크된 글리코실화이다. 각각의 MUC-1 VNTR 모노머내에 존재가능한 O-링크된 글리코실화 부위는 5개이다.

VNTR은 전형적인 또는 완전한 반복부 및 20개 아미노산에 걸쳐 2 내지 3개가 상이한 완전 반복부에 대해 약간 변형된 불완전(불규칙) 반복부에 의해 특성결정될 수 있다. 하기는 완전 반복부의 서열이다.

밑줄친 아미노산은 도시된 아미노산 잔기로 치환될 수 있다. 완전 반복부는 한정된 아미노산 치환 즉, 3번 위치에서 D에서 E로, 4번 위치에서 T에서 S로, 그리고, 14번 위치에서 P에서 T, A 또는 Q로의 치환을 제외하고는 동일하게 반복된 서열이다. 완전 반복부는 이들이 단일 MUC1 분자내에 여러번 나타날 수 있다는 점에 의해 특성결정될 수 있다.

불완전한 반복부는 55-90%의 동일한 아미노산 수준으로 상기 컨센서스 서열에 대한 상이한 아미노산 치환기를 갖는다. 4개의 불완전한 반복부는 하기에 도시되어 있으며, 치환부는 밑줄로 나타내었다:

APDTRPAPGSTAPPAHGVTS - 완전 반복부

APATEPASGSAATWGQDVTS - 불완전 반복부 1

VPVTRPALGSTTPPAHDVTS - 불완전 반복부 2

APDNKPAPGSTAPPAHGVTS - 불완전 반복부 3

APDNRPALGSTAPPVHNVTS - 불완전 반복부 4

야생형의 불완전 반복부 - Muc-1은 완전 반복부 영역을 플랭킹한다. 각각의 상이한 불완전 반복부는 일반적으로 MUC1 서열에서 단지 한번만 나타나며, 완전 반복부로부터 2 내지 9개 아미노산이 치환된다 (이는 55-90% 아미노산 동일성에 상응함).

이러한 상피 세포의 신생물 형질전환에 의해 발생하는 악성 암종에서, 여러 변화가 MUC-1의 발현에 영향을 끼친다. 단백질의 분극화된 발현이 상실되며, 이는 형질전환된 세포의 전체 표면으로 확장됨이 발견되었다. 또한, MUC-1의 전체 양이 종종 10배 이상 까지 증가한다 (Strous & Dekker, 1992, Crit Rev Biochem Mol Biol 27:57-92). 가장 중요하게는, O-결합된 탄수화물 사슬의 정량 및 정성이 현저하게 변한다. 더 적은 세린 및 트레오닌 잔기가 글리코실화된다. 발견되는 이러한 탄수화물 사슬은 비정상적으로 짧으며, 이는 종양 관련 탄수화물 항원 STn을 생성시킨다 (Lloyd et al, 1996, J Biol Chem, 271:33325-33334). 이들 글리코실화 변화 결과, 탄수화물 사슬에 의해 이전에 스크리닝된 MUC-1의 펩티드 사슬상의 다양한 에피토프가 접근가능하게 된다. 이러한 방식으로 접근가능하게 된 한 에피토프는 각각 20개 아미노산 VNTR 완전 모노머에 존재하는 서열 APDTR (Ala 8 - Arg 12)에 의해 형성된다 (Burchell et al, 1989, Int J Cancer 44:691-696).

MUC-1에서의 이러한 변화는 종양상에 발현된 MUC-1 형태에 대한 면역 시스템을 활성화시킬 수 있는 백신이 상피 세포 종양에 대해 효과적일 수 있다는 것을 의미하며, 실제로 MUC-1이 발견되는 기타 세포 유형 예컨대, T 세포 림프구가 발견되었다. 비정상 단백질을 발현하는 세포를 치사시키기 위한 면역 시스템에 의해 이용된 주요 이펙터 메카니즘중 하나는 세포독성 T 림프구 면역 반응 (CTL)이며, 이러한 반응은 종양을 치료하기 위한 백신 및 항체 반응에 바람직하다. 우수한 백신은 면역 반응의 모든 암(arm)을 활성화시킬 것이다. 그러나, 현재 탄수화물 및 펩티드 백신 예컨대, 테라토프(Theratope) 또는 BLP25 (Biomira Inc, Edmonton, Canada)는 우선적으로 면역반응- 체액성 및 세포성 반응 각각의 한 암을 활성화시키고, 우수한 백신 설계는 더욱 균형잡힌 반응을 생성시키는데 바람직하다.

핵산 백신은 이들이 대량으로 용이하게 생성될 수 있다는 점에서 통상적인 단백질 백신화에 비해 다수의 이점을 갖는다. 이들은 적은 용량으로도 우수한 면역 반응을 유도하는 것으로 보고되었으며, 세포독성 T 림프구 면역반응 및 항체 반응을 유도할 수 있다.

그러나, 전장 MUC-1은 고도로 반복적인 서열로 인해 재조합에 매우 민감하여 작업하기가 매우 까다로우며, 이러한 재조합은 개발을 매우 어렵게 한다. 또한, VNTR 영역의 GC 풍부 특성은 시퀀싱을 어렵게 한다. 조정적 이유로도 DNA 작제물을 완전히 특성 결정되어야 한다. 이러한 고도의 빈번한 반복 구조를 갖는 분자를 시퀀싱하는 것은 매우 불확실하다. 얼마나 많은 반복 유닛이 야생형 MUC-1에 존재하는지 정확하게 공지되어 있기 않아 전장 MUC-1을 정확히 특성결정할 수 없기 때문에, 조정 승인에 있어서도 용납되기 어렵다.

발명의 요약

본 발명은 MUC-1 발현 종양을 인식할 수 있는 생체내에서 면역 반응을 유도시킬 수 있는 MUC-1 유도체를 엔코딩하는 핵산 서열을 제공하며, 이러한 핵산은 비반복 영역이 0.6 이상의 RSCU를 갖도록 변형되고, 상응하는 비반복 영역에 대한 야생형 MUC-1 DNA에 있어서, 도 9에 도시된 MUC-1 VNR 누클레오티드 서열과 비교하여 85% 미만의 동일성 수준을 갖는다.

한 구체예에서, 핵산은 임의의 반복 (완전 및 불완전 둘 모두) 유닛이 결여된 것으로 상기 기술된 바와 같은 MUC-1 유도체를 엔코딩한다.

대안적인 구체예에서, 핵산 서열은 단지 완전 반복부만이 결여되어 있다. 추가의 구체예에서, 핵산 작제물은 1 내지 15개 완전 반복부 바람직하게는, 7개 완전 반복부를 함유한다. 완전 반복부는 야생형 MUC-1으로부터 변형될 수 있거나 없다.

더욱 바람직한 구체예에서 불완전 반복 영역은 0.65 이상의 RSCU (Relative synomons Codon useage (또한, Codon Index CI로도 공지됨))을 가지며, 불완전 반복부에 대해 80% 미만의 동일성을 갖는다.

이러한 작제물은 놀랍게도, MUC-1 발현 종양 세포를 인지하는 세포 반응 및 항체 반응 둘 모두를 유발시킬 수 있다.

작제물은 또한 변형된 반복부 (VNTR 유닛) 예컨대, 감소된 글리코실화 변이체를 함유할 수 있다. 혼입될 수 있는 외생성 T-세포 에피토프는 박테리아 단백질 및 독소로부터 유래되고 바이러스 공급원으로부터 유래된 바와 같은 T-헬퍼 에피토프 예를 들어, 디프테리아 또는 테타누스로부터의 T-헬퍼 에피토프, 예를 들어, P2 및 P30, 또는 Hep B 코어 항원으로부터의 에피토프를 포함한다. 이들은 본 발명의 MUC-1 작제물내에 또는 한쪽 말단에 혼입될 수 있다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 MUC-1 작제물의 N 또는 C 말단에서 이종성 단백질을 갖는 융합 단백질을 엔코딩하는 핵산을 고려하고 있다. 이러한 융합 파트너는 T-헬퍼 에피토프를 제공하거나, 리콜 반응을 유도해낼 수 있다.

이러한 예들로는 테타누스, 디프테리아, 투베르쿨로시스 또는 간염 단백질 예컨대, 테타누스 또는 디프테리아, 특히 P2 및/또는 P30 에피토프를 혼입시키는 테타누스 독소의 단편을 포함한다. 마이코박테리아 투베르쿨로시스 펩티드의 예로는 Mtb32a의 아미노산 192 내지 323에 상응하는 Ra12이다 (Skeiky et al Infection and Immunity (1999) 67:3998-4007). B형 간염 코어 항원은 또 다른 구체예에 기술되어 있다.

기타 바람직한 면역학적 융합 파트너는 스트렙토코커스 뉴모니애 (Biotechnology, 10: 795-798, 1992)로부터의 단백질 D, 전형적으로 N 말단 1/3 (예를 들어, N 말단 1-109); LYTA 또는 이의 일부 (바람직하게는, C-말단 부분)을 포함한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 핵산 서열은 플라스미드 형태의 DNA 서열이다. 바람직하게는, 플라스미드는 슈퍼-코일링되어 있다. 이러한 누클레오티드 서열에 의해 엔코딩된 단백질은 신규하며, 본 발명의 한 양태를 형성한다.

본 발명의 추가의 양태에서, 본원에 기술된 바와 같은 핵산 서열 또는 단백질 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 담체는 골드 비드이며, 약제 조성물은 입자 매개된 약물 전달에 의해 전달되도록 개질가능하다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 약물에 사용하기 위한 약제 조성물 및 핵산 작제물을 제공한다. 특히, MUC-1 발현 종양의 치료 또는 예방을 위한 약제의 제조에 사용되는 본 발명의 핵산 작제물을 제공한다.

본 발명은 추가로 본원에 기술된 바와 같은 조성물 또는 핵산을 안전하고 유효한 양으로 투여하므로써 MUC-1 발현 종양 특히, 유방 암종, 폐 암종, 전립선 암종 (특히 비소세포 폐 암종), 위 암종 및 기타 GI (위장) 암종으로부터 고통받거나 이에 민감한 환자를 치료하는 방법을 제공한다.

추가의 구체예에서, 본 발명은 본 발명의 핵산 작제물 또는 단백질을 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체와 혼합하므로써 본원에 기술된 바와 같은 약제 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.

야생형 MUC-1 분자는 시그널 서열, 리더 서열, 불완전 또는 불규칙 VNTR, 완전 VNTR 영역, 추가의 불규칙 VNTR, 비-VNTR 세포외 도메인, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포질 도메인을 함유한다.

비-VNTR 영역이 0.6 이상의 RSCU 및 상응하는 야생형 영역에 대해 85% 미만의 동일성을 갖도록 개질된 코돈인 작제물이 제공된다. 이러한 작제물은 동종성 재조합 가능성을 감소시키고, 발현을 증가시키며, 면역원성이며, MUC-1 발현 종양 세포를 인지하는 세포 반응 및 항체 반응 둘 모두를 유발시킬 수 있다는 점에서 유리하다.

더욱 바람직하게는, 개질된 코돈 영역은 0.65 이상의 RSCU 및 상응하는 야생형 영역에 대한 80% 미만의 동일성을 갖는다. 폴리누클레오티드 서열과 비교할 때, 하기 기술된 바와 같이 상응하도록 정렬할 경우 두 서열의 누클레오티드 서열이 동일하면, 두 서열은 "동일"한 것으로 불려진다.

두 서열간의 비교는 서열을 서열 유사성의 국소 영역을 확인하고 비교하기 위한 비교 윈도우와 비교함으로써 전형적으로 수행된다. 본원에 사용된 "비교 윈도우"는 약 20개 이상, 일반적으로 30개 내지 약 75개, 40개 내지 약 50개의 인접부 단편을 의미하며, 여기서 서열은 두 서열이 최적으로 정렬된 후, 동일한 수의 인접부의 기준 서열과 비교될 수 있다.

이와 같이, 본 발명에는, 코돈 변형된 비반복부 영역 및 비교를 위해 최적으로 정렬된 서열의 비반복부 영역이 국소적 동일성 알고리즘 (Smith and Waterman (1981) Add.APL.Math 2:482), 동일성 정렬 알고리즘 (Needleman and Wunsch (1970) J.Mol.Biol. 48:443), 유사성 탐색 (Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444), 이들 알고리즘의 컴퓨터링된 임플러멘테이션 (GAP, BESTFIT, BLAST, FASTA and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group (GCG), 575 Science Dr., Madison, WI) 또는 검사에 의해 유도될 수 있다.

서열 동일성 및 서열 유사성의 퍼센트를 측정하는데 적합한 알고리즘중 한 바람직한 예는 BLAST 및 BLAST 2.0 알고리즘이며, 이는 각각 문헌 [Altschul et al. (1977) Nucl. Acids Res. 25:3389-3402 and Altschul et al. (1990) J.Mol.Biol. 215:403-410]에 기술되어 있다. BLAST 및 BLAST 2.0은 예를 들어, 본원에 기술된 변수와 사용되어 본 발명의 폴리누클레오티드에 대한 서열 동일성 %를 측정할 수 있다. BLAST 검정을 수행하기 위한 소프트웨어는 생물공학 정보용 내셔널 센터(National Center for Biotechnology Information)로부터 입수가능하다.

DNA 코드는 4개의 문자(A, T, C 및 G)를 가지며, 이들을 사용하여 세 문자 "코돈"을 철자화시키며, 이는 유기체 유전자에서 단백질이 엔코딩하는 아미노산을 나타낸다. DNA 분자에 따른 코돈의 선형 서열은 이들 유전자에 의해 엔코딩되는 단백질에서 아미노산의 선형 서열로 번역된다. 코드는 20개의 천연 아미노산을 코딩하는 61개 코돈 및 "정지" 시그널을 나타내는 3개의 코돈으로 고도로 변질된다. 이와 같이, 대부분의 아미노산은 하나 초과로 코딩되며, 실제로 여러개의 아미노산은 4개 이상의 상이한 코돈에 의해 코딩된다.

하나 초과의 코돈이 제공된 아미노산을 코딩하는데 이용가능한 경우, 유기체의 코돈 사용 패턴은 고도로 비불규칙적이다. 상이한 종은 이들의 코돈 선택에 있어서 상이한 바이어스(bias)을 나타내며, 게다가, 코돈의 이용은 단일 종에서도 고도로 발현되는 유전자와 낮게 발현되는 유전자 사이에 현저한 차이가 있을 수 있다. 이러한 바이어스는 바이러스, 식물, 박테리아 및 포유동물 세포에서 상이하며, 일부 종은 다른 종보다 불규칙 코돈 선택과는 거리가 있는 더 강한 바이어스를 나타낸다. 예를 들어, 사람 및 기타 포유동물은 특정 박테리아 또는 바이러스 보다 덜 강하게 바이어싱된다. 이러한 이유로, 포유동물 세포에서 발현된 대장균 또는 바이러스 유전자에서 발현된 포유동물 유전자는 효과적인 발현에 부적당한 분포를 가질 것이다. 발현이 발생하는 숙주에서 거의 관찰되지 않는 코돈 클러스터의 이종성 DNA 서열의 존재는 이러한 숙주에서 낮은 이종성 발현 수준이 예견되는 것으로 여겨진다.

결론적으로, 특정 원핵생물 (예를 들어, 대장균 또는 효모) 또는 진행생물 숙주에 의해 선호되는 코돈은 동일한 단백질을 엔코딩하도록 변형될 수 있으나, 야생형 서열과는 상이하다. 코돈 변형 과정은 수동으로 또는 컴퓨터 소프트웨어에 의해 생성된 임의의 서열을 포함할 수 있으며, 여기서 천연 서열의 코돈의 일부 또는 모두가 변형된다. 이러한 여러 방법이 공개되어 있다 (Nkamura et al., Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215; WO 98/34640). 본 발명에 따른 한 바람직한 방법은 신젠 방법(Syngene method) 즉, 칼크젠 방법(Calcgene method)의 변형이다 (R.S. Hale and G Thompson (Protein Expression and Purification Vol. 12 pp. 185-188 (1998)).

코돈 변형의 이러한 방법은 하기 이점중 일부 또는 전부를 가질 수 있다: 1) 거의 사용되지 않는 코돈을 더욱 빈번하게 사용되는 코돈으로 대체하므로써 유전자 생성물의 발현을 개선시킴; 2) 제한 효소 부위를 제거하거나 포함시켜 다운스트림 클로닝을 용이하게 함; 3) DNA 벡터중의 삽입 서열과 게놈 서열 간의 동종성 재조합에 대한 가능성을 감소시킴; 및 4) 사람에서 면역 반응을 개선시킴. 본 발명의 서열은 유리하게는 재조합 가능성을 감소시키나, 야생형 서열과 동일하거나 이보다 높은 수준으로 발현시킨다. 코돈 변형된 서열을 생성시키기 위해 신젠 프로그램(SynGene programme)에 의해 사용된 알고리즘의 특성으로 인해, 매우 큰 수의 상이한 코돈 변형된 서열을 생성시키는 것이 가능하며, 이는 유사한 기능을 수행할 것이다. 간단하게는, 코돈은 통계적 방법을 이용하여 지정되어 고도로 발현된 사람 유전자 예컨대, β-악틴에서 자연적으로 발견되는 것과 근접한 코돈 빈번성을 갖는 합성 유전자를 제공한다.

본 발명의 폴리누클레오티드에서, 코돈 사용 패턴은 MUC-1의 전형적인 패턴으로부터 표적 유기체 예를 들어, 사람 β-악틴에서 고도로 발현된 유전자의 코돈 바이러스를 더욱 근접하게 나타내도록 변형된다. "코돈 사용계수(codon usage coefficient)"은 제공된 폴리누클레오티드 서열의 코돈 패턴이 표적 종의 코돈 패턴에 얼마나 근접한지의 측정치이다. 코돈 빈도는 많은 종의 고도로 발현된 유전자에 대한 문헌으로부터 유래될 수 있다 (Nakamura et al. Nucleic Acids Research 1996, 24:214-215). 61개 코돈 각각에 대한 코돈 빈도 (선택된 부류의 유전자의 1000개 코돈 당 발생 횟수로서 나타냄)는 각각의 20개 천연 아미노산에 대해 표준화되어, 각각의 아미노산에 대해 가장 빈번하게 사용된 코돈의 값을 1로 맞추고, 덜 보편적인 코돈의 빈도를 0 내지 1이 되도록 한다. 따라서, 61개 코돈 각각은 표적 종의 고도로 발현된 유전자에 대해 1 이하의 값으로 지정된다. 이러한 종의 고도로 발현된 유전자에 대한 특이적 폴리누클레오티드에 대한 코돈 사용계수를 계산하기 위해서는, 특이적 폴리누클레오티드의 각각의 코돈에 대한 스케일링된 값이 기록되며, 모든 이러한 값의 기하 평균이 취해진다 (이들 값의 자연 로그 값의 합을 코돈의 총 수로 나누고, 안티-로그로 취하므로써). 계수는 0 내지 1의 값을 가질 것이며, 계수값이 높을 수록, 코돈은 폴리누클레오티드중에 더 많이 빈번하게 사용된 코돈이다. 폴리누클레오티드 서열이 1의 코돈 사용계수를 갖는다면, 모든 코돈이 표적 종의 고도로 발현된 유전자에 대한 "가장 빈번한" 코돈이다.

본 발명에 있어서, 폴리누클레오티드의 코돈 사용 패턴은 바람직하게는, 특정 아미노산에 대해 사용된 코돈의 10% 미만을 나타내는 코돈을 배제할 것이다. RSCU 값은 관찰된 수의 코돈을 이러한 아미노산에 대한 모든 코돈이 동일하게 빈번히 사용되는 경우 예상되는 수로 나눈 값이다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 바람직하게는, 표적 유기체의 고도로 발현된 유전자에서 0.2 미만의 RSCU 값을 갖는 코돈을 배제할 것이다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 일반적으로 고도로 발현된 사람 유전자에 대한 코돈 사용계수가 0.6 초과, 바람직하게는 0.65 초과, 가장 바람직하게는 0.7 초과일 것이다. 사람에 대한 코돈 사용 표는 진뱅크에서 발견될 수 있다.

비교시, 고도로 발현된 베타 액틴 유전자는 0.747의 RSCU를 갖는다.

호모 사피엔스에 대한 코돈 사용 표는 하기와 같다:

사람 (고도로 발현된) 유전자에 대한 코돈 사용 1/24/91 (human_high.cod)

비-VNTR 세포외 도메인은 VNTR 5'에서 약 80개 아미노산 및 VNTR 3'에서 190-200개 아미노산이다. 본 발명의 모든 작제물은 이들 영역으로부터의 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 에피토프는 전형적으로 7개 이상의 아미노산 서열로부터 형성된다. 따라서, 본 발명의 작제물은 비 VNTR 세포외 도메인으로부터 하나 이상의 에피토프를 포함한다. 바람직하게는, 실질적으로 모든 또는 많은 바람직하게는, 모든 비-VNTR 도메인이 포함된다. 특히 바람직하게는, 작제물은 서열 FLSFHISNL; NSSLEDPSTDYYQELQRDISE 또는 NLTISDVSV에 의해 포함된 에피토프를 함유한다. 더욱 바람직하게는, 2개, 바람직하게는 모든 3개의 에피토프 서열이 작제물에 혼입된다.

바람직한 구체예에서, 작제물은 N-말단 리더 서열을 포함한다. 시그널 서열, 트랜스멤브레인 도메인 및 세포질 도메인이 개밸적으로 모두 선택적으로 존재하거나 제거된다. 존재하는 경우, 바람직하게는 모든 이들 영역은 변형된다.

본 발명에 따른 바람직한 작제물은 다음과 같다:

1) 코돈 변형된 절두된 MUC-1 (즉, 완전 반복부가 없은 전장 MUC-1)

2) 코돈 변형된 절두된 MUC-1 △ss (시그널 서열이 결여된 것을 제외하고는 1과 같음)

3) 코돈 변형된 절두된 MUC-1 △TM△CYT (트랜스멤브레인 및 세포질 도메인이 결여된 것을 제외하고는 1과 같음)

4) 코돈 변형된 절두된 MUC-1 △ss△TM△CYT (시그널 서열이 결여된 것을 제외하고는 3과 같음)

MUC-1 불완전 반복 유닛이 결여된 것을 제외하고는 상기 1 내지 4와 동일한 작제물 또한 바람직하다. 이러한 작제물은 거팅된(gutted)-MUC-1로서 일컬어진다. 한 구체예에서, 하나 이상의 불완전 VNTR 유닛은 글리코실화 부위를 변형시키므로써 글리코실화에 대한 잠재성을 감소시키도록 변이된다. 변이는 바람직하게는, 치환되는 것이나, 삽입 또는 결실될 수 도 있다. 전형적으로, 하나 이상의 트레오닌 또는 세린은 발린, 이소류신, 알라닌 또는 아스파라긴으로 치환된다. 따라서, 하나 이상 바람직하게는 2 또는 3개 이상이 상기 기술된 아미노산으로 치환되는 것이 바람직하다.

기타 바람직한 작제물은 상기와 동일하나, 1-15개, 바람직하게는 2-8개, 가장 바람직하게는 7개의 VNTR (완전) 반복 유닛을 포함한다.

추가의 구체예에서, 거팅된 MUC-1 핵산에는 리더 서열과 세포외 도메인의 연접부에 제한 부위가 제공된다. 전형적으로, 이러한 제한 부위는 Nhel 부위이다. 이는 예를 들어, 글리코실화 변이 (즉, O-글리코실화 부위를 제거하도록 변이된 VNTR 영역), 또는 테타누스 독소로부터 P2 또는 P30과 같은 T-헬퍼 에피토프 또는 야생형 VNTR 유닛을 엔코딩하는 이종성 서열을 포함하는 기타 펩티를 엔코딩하는 서열을 삽입하기 위한 클로닝 부위로서 사용될 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본 발명에 따른 폴리누클레오티드 서열을 포함하고, 이러한 서열의 발현을 유도할 수 있는 발현 벡터가 제공된다. 이러한 벡터는 박테리아, 곤충 또는 포유동물 세포 특히 사람 세포에서 이종성 DNA의 발현을 유도하기에 적합할 수 있다.

본 발명의 추가의 양태에 따르면, 본 발명에 따른 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 숙주 세포, 또는 본 발명에 따른 발현 벡터가 제공된다. 숙주 세포는 박테리아 예를 들어, E.coli, 포유동물 예를 들어, 사람일 수 있거나, 곤충 세포일 수 있다. 본 발명에 따른 벡터를 포함하는 포유동물 세포는 포유동물에 벡터를 투여하므로써 생체내에서 트랜스펙션될 수 있거나 실험관내에서 트랜스펙션된 배양된 세포일 수 있다.

본 발명은 추가로, 본 발명에 따른 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 약제 조성물을 제공한다. 바람직하게는, 조성물 DNA 벡터를 포함한다. 바람직한 구체예에서, 조성물은 본원에 기술된 바와 같은 MUC-1 아미노산 서열을 엔코딩하는 본 발명의 폴리누클레오티드 서열을 엔코딩하는 벡터를 포함하는 DNA로 코팅된 다수의 입자, 바람직하게는 골드 입자를 포함한다. 대안적인 구체예에서, 조성물은 약제학적으로 허용되는 부형제 및 본 발명에 따른 DNA 벡터를 포함한다.

조성물은 또한 애주번트를 포함할 수 있거나, 애주번트 또는 면역-자극제와 동시에 또는 순차적으로 투여될 수 있다.

이와 같이, 본 발명의 구체예에서, 본 발명의 벡터는 면역자극제와 함께 사용된다. 바람직하게는, 면역자극제는 본 발명의 핵산 벡터와 동시에 투여되며, 바람직한 구체예에서는, 함께 제형화된다. 이러한 면역자극제는 합성 이미다조퀴놀린 예컨대, 이미퀴모드 [S-26308, R-837] (Harrison, et al. 'Reduction of recurrent HSV disease using imiquimod alone or combined with a glycoprotein vaccine', Vaccine 19:1820-1826 (2001)); 및 레시퀴모드 [S-28463, R-848] (Vasilakos, et al. 'Adjuvant activities of immune response modifier R-848: Comparison with CpG ODN', Cellular immunology 204:64-74 (2000))을 포함한다. 항원 제시 세포 및 T-세포 표면상에서 구조적으로 발현되는 투카레솔(tucaresol: Rhodes, J. et al. 'Therapeutic potentiation of the immune system by costimulatory Schiff-base-forming durgs', Nature 377:71-75 (1995)), 시토카인, 케모킨, 및 단백질 또는 펩티드로서의 공동-자극 분자와 같은 아민과 카르보닐의 쉬프 베이스(Schiff bases)는 전염증성 사이토카인 예컨대, 인터페론 특히, 인터페론 알파, GM-CSF, IL-1 알파, IL-1 베타, TGF-알파 및 TGF-베타, Th1 유도체 예컨대, 인터페론 감마, IL-2, IL-12, IL-15, IL-18 및 IL-21, Th2 유도체 예컨대, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 및 IL-13, 및 기타 케모카인 및 공동자극 유전자 예컨대, MCP-1, MIP-1 알파, MIP-1 베타, RANTES, TCA-3, CD80, CD86 및 CD40L, 기타 염증자극 표적 리간드 예컨대, CTLA-4 및 L-셀렉틴, 아폽토시스 자극 단백질 및 펩티드 예컨대, Fas, (49), 합성 리피드 기재 애주번트 예컨대, 박스펙틴(vaxfectin: Reyes et al., 'Vaxfectin enhances antigen specific antibody titres and maintains Th1 type immune responses to plasmid DNA immunization', Vaccine 19:3778-3786), 스쿠알렌, 알파-토코페롤, 폴리소르베이트 80, DOPC 및 콜레스테롤, 엔도톡신, [LPS], (Beutler, B., 'Endotoxin, 'Toll-like receptor 4, and the afferent limb of innate immunity', Current Opinion in Microbiology 3:23-30 (2000)); CpG 올리고- 및 디-누클레오시드 (Sato, Y. et al., 'Immunostimulatory DNA sequences necessary for effective intradermal gene immunization', Science 273 (5273): 352-354 (1996), Hemmi, H. et al., 'A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA', Nature 408:740-745, (2000), 및 Toll 수용체를 유발시켜 Th1-유도 사이토카인 예컨대, 합성 마이코박테리아 지질단백질, 마이코박테리아 단백질 p19, 펩티도글리칸, 테코산(teichoic acid) 및 지질 A를 생성하는 기타 잠재적 리간드를 포함할 것이다. 기타 박테리아 면역자극 단백질 예컨대, 콜레라 톡신, E.coli 톡신 및 이의 변이체 독소가 사용될 수 있다.

우세한 Th1-유형 반응을 유도하기 위한 바람직한 특정 애주번트는 예를 들어, 지질 A 유도체 예컨대, 모노포스포릴 지질 A, 또는 바람직하게는 3-데-O-아실화된 모노포스포릴 지질 A를 포함한다. MPL^® 애주번트는 코릭사 코포레이션(Corixa Corporation: Seattle, WA; 예를 들어, 미국특허 4,436,727; 4,877,611; 4,866,034 및 4,912,094 참조)으로부터 구입가능하다. CpG-함유 올리고누클레오티드 (여기서, CpG 디누클레오티드는 비메틸화됨)는 또한 우세한 Th1 반응을 유도한다. 이러한 올리고누클레오티드는 잘 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 96/02555, WO 99/33488 및 미국특허 6,008,200 및 5,865,462에 기술되어 있다. 자극면역 DNA 서열 또한 예를 들어, 문헌[Sato et al., Science 273:352, 1996]에 기술되어 있다. 또 다른 바람직한 애주번트는 사포닌 예컨대, Quil A 또는 이의 유사체 예컨대, QS21 및 QS7 (Aquila Biopharmaceuticals Inc., Framingham, MA); 에스신(Escin); 디지토닌(Digitonin); 또는 집소필라(Gypsophila) 또는 케노포듐 퀴노아 사포닌(Chenopodium quinoa saponins)을 포함한다.

또한, MUC-1 발현 종양 또는 전이의 치료 또는 예방에서 본 발명에 따른 폴리누클레오티드 또는 본 발명에 따른 벡터의 용도를 제공한다.

본 발명은 또한, 본 발명에 따른 폴리누클레오티드, 벡터 또는 약제 조성물을 유효량으로 투여하는 것을 포함하여, MUC-1 발현 종양, 전이를 포함하는 이와 관련된 증상 또는 질환을 치료하거나 예방하는 방법을 제공한다. 약제 조성물의 투여는 예를 들어, "프라임-자극(prime-boost)" 치료 백신접종 요법에서 하나 이상의 개별적 용량 형태로 취해질 수 있다. 특정 경우에, "프라임" 백신 접종은 바람직하게는, 플라스미드-유래된 벡터내로 혼입된 본 발명에 따른 폴리누클레오티드의 입자 매개된 DNA 전달, 및 동일한 폴리누클레오티드 서열을 포함하는 재조합 바이러스 벡터의 투여에 의한 "자극(boost)" 또는 애주번트중의 단백질로의 자극에 의해 수행된다. 반대로, 프라이밍은 바이러스 벡터 또는 단백질 제형으로, 전형적으로 애주번트중에 제형화된 단백질 및 본 발명의 DNA 백신의 자극으로 수행될 수 있다.

상기에서 논의된 바와 같이, 본 발명은 본 발명의 누클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터를 포함한다. 이러한 발현 벡터는 분자 생물학 분야에서 일정하게 작제되어 왔으며, 단백질 발현을 위해 예를 들어, 플라스미드 DNA 및 적합한 개시제, 프로모터, 인핸서 및 기타 엘리먼트 예컨대, 필요하며 정방향으로 위치한 폴리아데닐화 시그널을 포함한다. 기타 적합한 벡터는 당업자에게 자명할 것이다. 이와 관련하여 추가의 예로서, 본 발명자들은 문헌[Sambrook et al. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2^nd Edition. CSH Laboratory Press (1989)]을 참조하였다.

바람직하게는, 본 발명의 폴리누클레오티드 또는 본 발명에서의 사용을 위한 벡터중의 폴리누클레오티드는 작동적으로 조절 서열에 연결되며, 이는 숙주 세포에 의한 코딩 서열을 발현시킬 수 있으며, 즉 벡터는 발현 벡터이다. 용어 "작동적으로 연결된"은 기술된 성분이 이들의 의도된 방식으로 작용할 수 있는 관계에 있는 병치(juxtaposition)를 의미한다. 코딩 서열에 "작동적으로 연결된" 조정 서열 예컨대, 프로모터는 코딩 서열의 발현이 조정 서열과 양립가능한 조건하에 달성되는 위치로 존재한다.

벡터는 예를 들어, 복제 오리진, 선택적으로 폴리누클레오티드의 발현을 위한 프로모터 및 선택적으로 프로모터의 조정인자를 갖는 플라스미드, 인공 크로모좀 (예를 들어, BAC, PAC, YAC), 바이러스 또는 파아지 벡터일 수 있다. 벡터는 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자 예를 들어, 박테리아 플라스미드의 경우에 암피실린 또는 카나마이신 내성 유전자 또는 진균류 벡터의 경우에 내성 유전자를 함유할 수 있다. 벡터는 실험관내에서 예를 들어, DNA 또는 RNA의 생성을 위해 사용될 수 있거나, 예를 들어, 벡터에 의해 엔코딩된 단백질을 생성시키기 위해 숙주 세포 예를 들어, 포유동물 숙주 세포를 트랜스펙션시키거나 형질전환시키는데 사용될 수 있다. 이러한 벡터는 또한 생체내에서 예를 들어, DNA 백신접종법 또는 유전자 치료법에 적용될 수 있다.

프로모터 및 기타 발현 조정 시그널은 발현이 고안되는 숙주 세포와 양립가능하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 포유동물 프로모터는 메탈로티오네인 프로모터를 포함하며, 이는 중금속 예컨대, 카드뮴 및 β-악틴 프로모터에 대한 반응을 유도할 수 있다. 바이러스 프로모터 예컨대, SV40 거대 T 항원 프로모터, 사람 사이토메갈로바이러스 (CMV) 최전 (IE) 프로모터, 로우스 사르코마 바이러스 LTR 프로모터, 아데노바이러스 프로모터, 또는 HPV 프로모터, 특히 HPV 업스트립 조정 영역(URR)이 또한 사용될 수 있다. 모든 이러한 프로모터는 당해분야에 잘 기술되어 있으며, 용이하게 입수가능하다.

바람직한 프로모터 엘리먼트는 인트론 A는 결여되나 엑손 1은 포함하는 CMV 최전 프로모터이다. 따라서, HCMV IE 초기 프로모터의 조정하에 본 발명의 폴리누클레오티드를 포함하는 벡터가 제공된다.

적합한 바이러스 벡터의 예로는 헤르페스 단순포진 바이러스 벡터, 우두 또는 알파-바이러스 벡터 및 레트로바이러스 예컨대, 렌티바이러스, 아데노바이러스 및 아데노 관련 바이러스를 포함한다. 이러한 바이러스를 이용한 트랜스퍼 기법은 당업자에게 공지되어 있다. 예를 들어, 바람직하지는 않지만 레트로바이러스는 본 발명의 폴리누클레오티드를 숙주 게놈에 안정적으로 인테그레이팅시키는데 사용될 수 있다. 반대로 복제-결여 아데노바이러스 벡터는 에피솜을 보유하며, 따라서 일시 발현이 가능하다. 곤충 세포 (예를 들어, 바쿨로바이러스 벡터), 사람 세포 또는 박테리아에서 발현을 유도할 수 있는 벡터는 예를 들어, 서브유닛 백신 또는 면역학적 검법으로서 사용하기 위한 본 발명의 폴리누클레오티드에 의해 엔코딩된 정량적 HIV 단백질을 생성시키기 위해 사용될 수 있다. 전장 우두 작제물을 생성시키기 위한 이전의 시도들은 성공적이지 못하였기 때문에, 본 발명의 폴리누클레오티드는 바이러스 백신에서 특히 유용하다.

박테리아 벡터가 또한 사용될 수 있으며 예를 들어, 감약된 살모넬라 또는 리스테리아가 박테리아 벡터로서 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 폴리누클레오티드는 엔코딩된 단백질의 발현에 의한 생성에 유용하며, 상기 발현은 실험관내, 생체내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 따라서, 누클레오티드는 예를 들어, 수율을 증가시키기 위해 재조합 단백질 합성에 관련될 수 있거나, 실제로 DNA 백신화 기법에서 사용된 이들 자체의 치료학적 제제로서의 용도를 발견할 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드가 실험관내 또는 생체외에서 엔코딩된 단백질의 생성에 사용되는 경우, 예를 들어, 세포 배양물중의 세포는 발현되는 폴리누클레오티드를 포함하도록 변형될 것이다. 이러한 세포는 일시적으로 또는 바람직하게는 안정적으로 포유동물 세포주를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리펩티드를 엔코딩하는 벡터를 삽입시키므로써 변형될 수 있는 세포의 특정 예로는 포유동물 HEK293T, CHO, HeLa, 293 및 COS 세포를 포함한다. 바람직하게는, 선택된 세포주는 안정적이고, 성숙한 글리코실화 및 폴리펩티드의 세포 표면 발현을 가능하게 하는 세포주이다. 발현은 형질전환된 난모세포에서 획득될 수 있다. 폴리펩티드는 형질전환성 사람외 동물 바람직하게는, 마우스의 세포에서 본 발명의 폴리펩티드로부터 발현될 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드로부터의 폴리펩티드를 발현시키는 형질전환성 사람외 동물은 본 발명의 범위내에 포함된다.

본 발명은 유효량의 이러한 백신 또는 백신 조성물을 포유동물 피검체에 투여하는 것을 포함하여, 포유동물 피검체를 백신접종시키는 방법을 제공한다. 가장 바람직하게는, DNA 백신, 백신 조성물 및 면역치료제에 사용하기 위한 발현 벡터는 플라스미드 벡터이다.

DNA 백신은 예를 들어, 주사기 또는 고압 제트를 사용하여 투여되는 액제 제형중에 "네이키드 DNA" 형태 또는 리포좀 또는 자극성 트랜스펙션 인핸서와 제형화된 DNA 형태로 투여될 수 있거나, 입자 매개된 DNA 전달 (PMDD)에 의해 투여될 수 있다. 이러한 모든 전달 시스템은 당해분야에 널리 공지되어 있다. 벡터는 예를 들어, 바이러스 벡터 전달 시스템에 의해 포유동물에 유입될 수 있다.

본 발명의 조성물은 많은 경로 예컨대, 근내, 피하내, 복강내 또는 정맥내, 점막내 예컨대, 비내 경로에 의해 전달될 수 있다.

바람직한 구체예에서, 본 조성물은 피부내로 전달된다. 특히, 조성물은 유전자 건 (특히, 입자 폭발) 투여 기법에 의해 전달되며, 이러한 기법은 벡터를 비드상으로 코딩시킨 후, 고압하에 표피에 투여하는 것을 포함한다 (예를 들어, 문헌[Haynes et al, J Biotechnology 44:37-42 (1996)]에 기술됨).

한 실례적인 예에서, 가스-유도된 입자 촉진은 예컨대, 파우더젝트 파마슈티컬스 PLC (Powderject Pharmaceuticals PLC: Oxford, UK) 및 파우더젝트 백신스 인크. (Powderject Vaccines In.c: Madison, WI)에 의해 제조된 기기로 획득될 수 있으며, 이들의 일부 예는 미국특허 5,846,796; 6,010,478; 5,865,796; 5,584,807; 및 유럽특허 0500 799에 기술되어 있다. 이러한 방법은 바늘 불필요 전달 기법을 제공하며, 여기서 극소 입자 예컨대, 폴리누클레오티드의 건조 분말 제형은 손으로 고정된 장치에 의해 유도된 헬륨 가스 제트내에서 고압으로 가속되어, 입자를 대상의 표적 조직 특히 피부로 추진시킨다. 입자는 바람직하게는 0.4-4.0㎛, 더욱 바람직하게는 0.6-2.0㎛ 직경의 골드 비드이며, DNA 컨쥬게이트는 이러한 비드상으로 코팅되고, "유전자 건"에 위치시킬 카트리지 또는 카세트내로 넣어진다.

관련된 구체예에서, 본 발명의 조성물의 가스 유래된 바늘 불필요 주입에 유용할 수 있는 기타 장치 및 방법은 바이오젝트, 인크.(Bioject, Inc.: Portland, OR)에 의해 제공된 것들이 있으며, 이들의 일부 예는 미국특허 4,790,824; 5,064,413; 5,312,335; 5,383,851; 5,399,163; 5,520,639 및 5,993,412에 기술되어 있다.

대안적인 구체예에서, 본 발명의 누클레오티드는 미세 바늘에 의해 투여될 수 있으며, 이는 바늘상에 코팅된 DNA를 갖거나, 저장기로부터 조성물을 전달한다. 항원성 펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 벡터는 예방적 또는 치료적 유효량으로 투여된다. 투여될 정량은 일반적으로, 입자 매개된 전달에 있어서는 1 피코그램 내지 1 밀리그램, 바람직하게는 1 피코그램 내지 10 마이크로그램이며, 기타 경로의 1회용량당 누클레오티드는 10 마이크로그램 내지 1 밀리그램이다. 정확한 정량은 면역처리되는 환자의 체중 및 투여 경로에 따라 상당히 변화될 수 있다.

항원성 펩티드를 엔코딩하는 누클레오티드 서열을 포함하는 면역원 성분은 약 1일 내지 약 18개월의 간격을 두고 예를 들어, 1 내지 7회, 바람직하게는 1 내지 4회 반복적으로 투여되거나 한번에 편중되어 투여하는 것이 가능하다. 또한, 더 긴 기간 동안 일정하게 투여되면서, 질환의 진행을 모니터링하는 것이 가능하다. 예를 들어, 만선 암 또는 기타 만성 질환의 경우, 18개월 보다 더 긴 기간에 걸쳐 매달 투여하는 것이 요구될 수 있다. 일부 환자/질환 조건에 따라 환자의 생애 동안 일정한 투여가 요구될 수 있음을 고려가능하다. 그러나, 또한 이러한 처리 요법은 환자의 크기, 치료/예방될 질환, 투여될 누클레오티드 서열의 양, 투여 경로 및 숙련된 의사에게는 자명할 기타 요인에 따라 현저하게 변할 수 있다. 환자에 이들의 전반적인 치료 요법의 일부로서 하나 이상의 기타 항암제가 처리될 수 있다.

환자에 네이키드 폴리누클레오티드 또는 벡터를 유입시키는데 적합한 기법은 또한, 적합한 비히클과의 국소적 도포를 포함한다. 핵산은 피부에 국소적으로 투여될 수 있거나, 비내, 경구, 질내 또는 직장내 투여에 의해 점막 표면으로 투여될 수 있다. 네이키드 폴리누클레오티드 또는 벡터는 약제학적으로 허용되는 부형제 예컨대, 포스페이트 완충된 염수 (PBS)와 함께 존재할 수 있다. DNA 흡수는 추가로 촉진제 예컨대, 부피바카인(bupivacaine)을 별도로 또는 DNA 제형중에 포함시켜 사용하므로써 촉진될 수 있다. 수령체에 직접적으로 핵산을 투여하는 기타 방법은 초음파, 전기 자극, 일렉트로포레이션 및 마이크로시딩을 포함하며, 이는 US-5,697,901에 기술되어 있다.

핵산 작제물의 흡수는 예를 들어, 트랜스펙션제를 사용하는 것을 포함하는 여러 공지된 트랜스펙션 기법에 의해 증진될 수 있다. 이러한 제의 예로는 양이온제 예를 들어, 칼슘 포스페이트 및 DEAE-덱스트란 및 리포펙탄트 예를 들어, 리포펙탐 및 트랜스펙탐을 포함한다. 투여될 핵산의 용량은 변할 수 있다.

본 발명의 핵산 서열은 형질전환된 세포에 의해 투여될 수 있다. 이러한 세포는 피검체로부터 채취된 세포를 포함한다. 본 발명의 네이키드 폴리누클레오티드 또는 벡터는 이러한 세포에 실험관내에서 유입될 수 있으며, 형질전환된 세포는 피검체로 다시 유입될 수 있다. 본 발명의 폴리누클레오티드는 동종성 재조합에 의해 세포내에 이미 존재하는 핵산으로 인테그레이팅될 수 있다. 형질전환된 세포는 필요에 따라 실험관내에서 성장할 수 있으며, 하나 이상의 생성된 세포는 본 발명에 사용될 수 있다. 세포는 공지된 외과적 기법 또는 미세외과적 기법 (예를 들어, 그라프링, 미세-주입 등)으로 환자의 적합한 부위에 제공될 수 있다.

1. MUC1 코돈 변형체 유입

접근법

MUC1이 0.535의 RSCU (다르게는, 코돈계수 (CI)로서 공지됨)를 갖는 사람 유전자이지만, 코돈 변형이 코돈 지수 및 발현을 개선시킬 것이다. 이는 투여량이 제한될 수 있는 임상적 셋팅에 특히 중요하다. 두번째 이점은 코돈 사용을 조작하여 게놈중의 MUC1 로커스와 MUC1 면역치료제 간의 재조합 가능성을 감소시킨다는 점이다. 이는 재조합이 플라스미드의 게놈으로의 인테그레이션을 유도할 수 있는 임상적 셋팅에서도 중요하다.

1.1 서열 디자인

MUC1의 변형체에 대한 출발 서열은 도 1에 도시되어 있다. 이는 플라스미드 JNW656으로부터 유래되며, 7개의 VNTR 반복 유닛을 함유하는 MUC1 발현 카세트의 전체 코딩 서열을 나타낸다. 코돈 변형 전에, 올리고누클레오티드로부터의 VNTR 반복 유닛의 조립의 어려움으로 인해, VNTR 반복부가 결여된 실질적인 MUC1 서열이 생성되었다 (도 2). 이러한 서열은 0.499의 CI 값을 갖는다. 방법은 MUC1의 비-VNTR 서열을 코돈 최적화시킨 후, 코돈 변형된 서열로 조작된 제한 효소 부위를 사용하여, 7x VNTR 단편을 재삽입시키는 것이다.

신젠 프로그램을 사용하여, 도 2의 실질적 MUC1 서열을 기초로 하여 실질적 코돈 변형된 서열을 선택하였다 (도 3). 표 1은 출발 MUC1 서열에 대한 CI 값의 비교 및 두개의 대표적인 코돈 변형된 서열을 나타낸다.

표 1. MUC1 변형된 서열에 대한 코돈 계수

서열	코돈 계수 (CI)
MUC1(7x VNTR 단편이 결여)	0.499
코돈 변형된 서열 1	0.711
코돈 변형된 서열 2	0.745

코돈 변형 이외에, 모든 서열을 또한 제한 효소 클로닝 부위에 대해 스크리닝하였다. 가장 높은 CI 값 및 적합한 제한 효소 부위 프로파일에 기초하여, 서열 2를 선택하였다. 클로닝 및 발현을 촉진하기 위해, 서열에 대해 하기 변화를 수행하였다 (도 4 참조).

1) 5' 및 3' 클로닝 부위를 첨가하였다 (Nhel, Xbal, Xhol, Notl 및 BamHl)

2) Kozak 서열 (GCCACC)을 초기 ATG 개시 코돈의 5'에 삽입하였다.

3) 두개의 부적합한 Blpl 부위를 코돈 64번 (AGC -> TCC) 및 209번 (AGC -> TCC)에서 침묵변이에 의해 제거하였다.

4) 드문 류신 코돈을 코돈 259번 (TTG -> CTG)에서 후속 변이시켜 제거하였다.

5) Bpu10l/BbvCl 부위를 재유입하여 (도 4 참조, 박스 영역) 7x VNTR 단편의 클로닝을 촉진시켰다.

6) Blpl 부위를 재유입시켜 (도 4 참조, 박스 영역) 7x VNTR 영역의 클로닝을 촉진시켰다.

이렇게 조작된 서열을 도 4에 도시하였으며, 이는 0.735의 CI 값을 갖는다. 신젠 프로그램을 사용하여 이러한 서열을 20개 염기가 최소로 중복되는 52-60-머 올리고누클레오티드로 단편화시켰다.

1.2 올리고 제작

2 단계 PCR 프로토콜을 사용하여, 중복된 프라이머를 하기 조건하에 먼저 어셈블링하였다. 다양한 군집의 단편을 생성시켰다. 이러한 전장 단편을 5' 및 3' 말단 프라이머를 사용하여 복구하고/증폭시켰다. 생성된 PCR 단편을 아게로스 겔로부터 절제하고, 정제하고, Nhel 및 Xhol로 제한하고, pVAC로 클로닝시켰다. 양성 클론을 제한 효소 분석에 의해 확인하고, 서열을 확인하였다. 확인된 벡터를 JNW749로 분류하였다. JNW749중의 MUC1의 코돈 변형된 서열은 올리고누클레오티드 제작의 에러-프론(error-prone)으로 인해 2개의 침묵 변이(도 5에 밝게 표시함)를 갖는다.

어셈블리 반응 - PCR 조건

반응 혼합물

1x Pfx 완충액

1㎕ 올리고 풀

0.5mM dNTP

Pfx 폴리머라아제 (5U)

1mM MgSO₄

총 용적 = 50㎕

1. 94℃ 30s

2. 40℃ 120s

3. 72℃ 10s

4. 94℃ 15s

5. 40℃ 30s

6. 72℃ 20s + 3s/순환

7. 4 단계까지 25회 순환

8. 4℃에서 고정

회수 반응 - PCR 조건

반응 혼합물:

1x Pfx 완충액

10㎕ 어셈블리 반응 혼합물

0.625mM dNTP

50pmol 5' 말단 프라이머

50pmol 3' 말단 프라이머

Pfx 폴리머라아제 (5U)

1mM MgSO₄

1x Pfx 인핸서

총 용적 = 50㎕

1. 94℃ 45s

2. 60℃ 30s

3. 72℃ 120s

4. 1 단계까지 25회 순환

5. 72℃ 240s

6. 4℃에서 고정

1.3 7x VNTR 단편의 재유입

JNW749는 7x VNTR 유닛이 결여된 코돈 변형된 MUC1 발현 카세트를 함유한다. 7x VNTR 카세트를 Blpl/BbvCl 카세트상의 JNW656으로부터 절제시켜 이미 Blpl 및 BbvCl로 절제된 JNW749로 리게이팅시켰다. 제한 효소 분석 및 서열 확인 후에, JNW758로 분류된 클론을 추가의 검정을 위해 선택하였다. JNW758의 MUC1 카세트 서열은 도 5에 도시되었다. JNW758의 MUC1 발현 카세트의 최종 CI 값은 0.699이며, 이는 0.535의 초기값에 비해 실질적인 증가를 나타낸다.

1.4 MUC1의 발현 비교

벡터 JNW656 (천연 MUC1) 및 JNW758 (코돈 변형된 MUC1)으로부터의 MUC1 발현을 CHO 세포로의 일시적 트랜스펙션 후에 비교하였다. 유식세포 분석법(FACS)에 따르면, 이들의 표면에서 MU1을 발현하는 세포의 %는 천연 카세트 (JNW656에 있어서 13.2%) 및 코돈 변형된 카세트 (JNW758에 있어서 18.1%) 간에 매우 유사하였다. 웨스턴 블롯으로 검정할 경우 (도 6), 결과는 코돈 변형된 MUC1의 발현이 천연 MUC1과 비교하여 적당하게 증진되었음을 암시한다. 웨스턴 블롯에 대한 MUC1 발현을 에어리어 덴서티 툴 (Area Density Tool: Labworks, UVP Ltd, UK)을 사용한 밀도계 검정에 의해 정량하였다 (Labworks, UVP Ltd, UK). JNW656 (천연 MUC1)으로부터 MUC1 발현은 48527의 임의의 스팟 밀도값을 제공하는 반면, 코돈 변형된 MUC1 (JNW758)은 94839의 값을 제공하며, 이는 코돈 변형된 MUC1의 발현이 천연 7x VNTR MUC1과 비교할 경우 약 2배 증진된다는 것을 시사한다.

1.5 DNA 유사성

MUC1 (JNW656으로부터)의 출발 서열 및 코돈 변형된 서열 (JNW758로부터)의 얼라이언트 클러스탈V (alignment ClustalV: Weighted)에 따른 쌍 간격은 코돈 변형된 서열이 원래의 MUC1 서열과 82.8% 유사하다는 것을 확인시켜준다. 얼라이언트 클러스탈V 후의 7x VNTR 영역이 결여된 동일한 서열에 대한 유사성은 추가로 75.1%로 감소된다.

1.6 7x VNTR MUC1 및 코돈 변형된 7x VNTR MUC1에 대한 세포 반응 비교

pVAC (빈 벡터), JNW656 (7x VNTR MUC1) 및 JNW758 (코돈 변형된 7x VNTR MUC1)으로 면역화시킨 후의 세포 반응을, 0일째에 일차 면역화시키고, 21일째에 자극시킨 후에 ELISPOT에 의해 평가하였다. 검정을 CD8 펩티드 SAPDNRPAL (SAP)를 사용하여 7일째에 후속 자극을 수행하였다. 도 7은 IL-2 및 SAP 펩티드와 비장세포의 재자극 후의 IFNγ 생성물이 7x VNTR MUC1 또는 코돈 변형된 7x VNTR MUC1으로 면역화된 군에서 동일하였음을 보여준다.

웨스턴 블롯으로부터의 결과와 관련하여, 이들 데이타는 코돈 변형된 7x VNTR MUC1을 유리하게는 천연 7x VNTR MUC1 발현 및 면역원성과 비교하여, 게놈성 MUC1 서열과의 재조합에 대한 감소된 가능성에 있어서 현저한 이점을 갖는다는 것을 암시한다.

1.7 추가 방법

일시적 트랜스펙션 검정을 수행하기 위한 방법

다양한 DNA 작제물로부터의 MUC1 발현은 플라스미드의 CHO (차이니즈 햄스너 난소) 세포로의 일시적 트랜스펙션 후, 총 세포 단백질에 대한 웨스턴 블롯팅에 의해 또는 MUC1을 발현시키는 세포막의 유식세포 분석법에 의해 검정될 수 있다. 일시적 트랜스펙션은 제작자의 안내에 따라 트랜스펙탐 시제 (Transfectam reagent: Promega)로 수행될 수 있다. 간단하게는, 24-웰 조직 배양 플레이트를 1ml의 DMEM 완전 배지 (DMEM, 10% FCS, 2mM L-글루타민, 페니실린, 100IU/ml, 스트렙토마이신 100㎍/ml)중에서 웰당 5x10⁴ CHO 세포로 시딩하고, 37℃에서 16시간 동안 인큐베이팅시킬 수 있다. 0.5㎍ DNA를 25㎕의 0.3M NaCl (하나의 웰에 충분함)에 첨가하고, 2㎕의 트렌스펙탐을 25㎕의 밀리-Q(Milli-Q)에 첨가하였다. DNA 및 트랜스펙탐 용액을 완만하게 혼합하고, 실온에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 이러한 인큐베이션 단계 동안, 세포는 PBS로 1회 세척되고, 150㎕의 혈청 비함유 배지 (DMEM, 2mM L-글루타민)로 커버링하였다. 그 후, DNA-트랜스펙탐 용액을 세포에 적가하고, 플레이트를 완만하게 쉐이킹 한 후, 37℃에서 4-6시간 동안 인큐베이션하였다. 그 후, 500㎕의 DMEM 완전 배지를 첨가하고, 세포를 추가로 48 내지 72시간 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다.

1.8 MUC1 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션된 CHO 세포의 유식세포 검정

일시적 트랜스펙션 후, CHO 세포를 PBS로 1회 세척하고, 베르센 (Versene; 1:5000)/0.025% 트립신 용액으로 처리하여 세포를 현탁액으로 이동시켰다. 트립신화시킨 후, CHO 세포를 펠렛팅하고, FACS 완충액 (PBS, 4% FCS, 0.01% 나트륨 아지드)중에 재현탁시켰다. 일차 항체 ATR1을 15㎍/ml의 최종 농도로 첨가하고, 샘플을 얼음에서 15분 동안 인큐베이션시켰다. 대조군 세포를 ATR1의 부재하에 FACS 완충액으로 인큐베이션시켰다. 세포를 FACS 완충액으로 3회 세척하고, 이차 항체 염소 항-마우스 면역글로불린 FITC 컨쥬게이팅된 F(ab')₂ (Dako, F0479) 10㎕를 함유하는 100㎕ FACS 완충액중에 재현탁시키고, 15분 동안 얼음에서 인큐베이션시켰다. 2차 항체 염색 후, 세포를 FACS 완충액중에 3회 세척하였다. FACS 검정을 FACScan (Becton Dickinson)을 사용하여 수행하였다. 샘플당 1000-10000 세포를 FSC (전방 각 광 스캐터; forward angle light scatter) 및 SSC (인테그레이팅된 광 스캐터; integrated light scatter)와 그린 (FL1) 형광 (인테그레이팅된 형광의 로그로서 나타냄)에 대해 동시에 측정하였다. 기록은 FCS가 범위를 벗어난 응집물을 제외하고 수행하였다. 데이타는 세포 수 (Y-축) 대 형광 밀도 (X-축)로서 플로팅된 막대그래프로서 나타내었다.

1.9 MUC1 플라스미드로 일시적으로 트랜스펙션된 CHO 세포의 웨스턴 블롯 검정

일시적으로 트랜스펙션된 CHO 세포를 PBS로 세척하고, 베르센 (1:5000)/0.025% 트립신 용액으로 처리하여 세포를 현탁액으로 이동시켰다. 트립신화시킨 후, CHO 세포를 펠렛팅하고, 50㎕의 PBS중에 재현탁시켰다. 50mM DTT를 함유하는 동일 용적의 2x TRIS-글리신 SDS 샘플 완충액 (Invitrogen)을 첨가하고, 용액을 95℃로 5분 동안 가열시켰다. 1-20㎕의 샘플을 4-20% TRIS-글리신 겔 1.5mm (Invitrogen)에 로딩시키고, 동일한 전압 (125V)하에 90분 동안 1x TRIS-글리신 완충액 (Invitrogen)중에서 전기영동시켰다. 미리 염색된 넓은 범위의 마커 (New England Biolabs, #P7708S)를 사용하여 샘플 크기를 측정하였다. 전기 영동 후, 샘플을 메탄올중에 미리 습식된 인모빌론-P PVDF 막 (Immobilon-P PVDF membrane; Millipore)으로 Xcell III 블롯 모듈 (Blot Module) 및 20% 메탄올을 함유하는 1x 트랜스퍼 완충액 (Transfer buffer: Invitrogen)을 사용하여 25V의 일정 전압하에서 90분 동안 트랜스퍼시켰다. 막을 3% 건조된 스키밍된(skimmed) 밀크 (Marvel)를 함유하는 TBS-트윈 (Tris-완충액 염수, 0.05%의 트윈 20 함유, pH 7.4)중에서 4℃에서 밤새 차단하였다. 일차 항체 (ATR1)를 1:100으로 희석시키고, 실온하에서 1시간 동안 막과 인큐베이션시켰다. TBS-트윈중에 광범위하게 세척한 후, 2차 항체를 3% 건조된 스키밍된 밀크를 함유하는 TBS-트윈중에서 1:2000으로 희석시키고, 1시간 동안 실온에서 막과 함께 인큐베이션 시켰다. 광범위하게 세척한 후, 막을 5분 동안 슈퍼시그널 웨스트 피코 케미루미너선트 서브스트레이트 (Supersignal West Pico Chemiluminescent substrate: Pierce)와 함께 인큐베이션하였다. 과량의 액체를 제거하고, 2장의 고착 필름 사이로 밀봉시키고, 1 내지 30분 동안 하이퍼필름 ECL 필름 (Hyperfilm ECL film; AmershamPharmaciaBiotech)에 노출시켰다.

실시예 2

7 VNTR-MUC-1-PADRE-C 및 코돈 변형된 7VNTR-MUC-1-PADRE-C에 대한 세포 반응 비교

2.1 코돈 최적화된 MUC-1 PADRE의 작제

PADRE 헬퍼 에피토프에 융합된 MUC1 발현 카세트의 작제

PADRE 헬퍼 에피토프 (Immunity (1994) 1(9):751-761)를 함유하는 3개의 MUC1을 작제하였다. PADRE는 T 세포 수용체에 접근가능한 위치에서 큰/하전된 잔여 치환기를 갖는 폴리아닐린 백존을 함유하는 pan-DR 결합 에피토프이다. C-말단 융합은 pVAC1에 짧은 링커를 먼저 삽입하므로써 유도하였다. 링커는 두개의 프라이머 PADREFOR 및 PADREREV를 어닐링시키므로써 생성시키고, 이러한 링커를 Nhel 및 Xhol 부위를 통해 pVAC1으로 클로닝시켜 벡터 JNW800을 생성시켰다. JNW800에, JNW656 (7x VNTR MUC1) 및 JNW758 (코돈 최적화된 7x VNTR MUC1)으로부터의 7x VNTR MUC1 발현 카세트를 Xbal 단편상의 MUC1 카세트를 절제하고, Xbal 부위로 클로닝하므로써 삽입시켜, 하기 두 벡터를 생성시켰다.

7x VNTR MUC1 C-말단 PADRE: JNW810

7x VNTR MUC1 (코돈 최적화된) C-말단 PADRE: JNW812

JNW810 및 JNW812로부터의 MUC1 발현 카세트 및 PADRE 에피토프의 시퀀싱

PADRE 서열이 맨끝의 C-말단 및 MUC1의 시그널 서열 직후의 제 2 위치에 삽입된 제 3 벡터를 작제하였다. 시그널 서열의 N-말단 PADRE 에피토프 다운스트림을 삽입하는 근본적 이유는 에피토프가 MUC1 펩티드의 자연적인 후번역 프로세싱의 일부로서 절단되는 것을 방지하기 위한 것이다 (MUC1에서의 절단 부위에 대한 자세한 사항은 문헌 [Biochem, Biophys. Res. Comm (2001) 283:715-720]을 참조). 벡터를 2-단계 공정으로 작제하였다. 먼저, N-말단 및 C-말단 PADRE 에피토프를 함유하는 MUC1의 N-말단 서열을 인실리코(in silico)로 생성시킨 후, 중복 올리고를 사용하여 PCR에 의해 제작하였다 (상기 기술된 바와 같이). PCR 단편을 Nhel-Xhol 부위를 통해 pVAC1에 삽입시키고, 서열을 확인하여, 플라스미드 JNW802를 생성시켰다. 코돈 최적화된 7x VNTR MUC1의 C-말단부를 BbcVI-Xbal 단편에서 JNW758로부터 분리하고, JNW802로 클로닝하여 2개의 PADRE 에피토프를 함유하는 7x VNTR MUC1 발현 카세트를 재생성시켰다. 이러한 벡터를 7x VNTR MUC1 (코돈 최적화된) C/N' PADRE 또는 JNW814로 분류하였다.

2.2 30 C57 마우스를 5개의 군으로 평가하였다 (6마리/1 군)

A. PVac 7 VNTR JNW656

B. pVac 7 VNTR PADRE C (코돈 최적화된 ) JNW812

C. pVac 7 VNTR PADRE C (야생형) JNW810

D. pVav 7 VNTR PADRE C/N' (코돈 최적화된) JNW814

E. 빈 pVAC

각각의 동물을 0, 12 및 42일째에 발현 플라스미드 (1㎍ MUC-1 DNA + 0.5㎍ IL-2)로 입자 매개된 면역화에 의해 면역화시킨 후, 세포 면역 반응을 28일 및 49일째에 평가하였다.

결과는 도 8A 및 B에 도시되어 있다.

결과

PVAC 7VNTR, PVAC 7VNTR-PADRE-C 코돈 최적화된 서열, PVAC 7VNTR-PADRE-C wt 서열, PVAC 7VNTR-PADRE C/N' 코돈 최적화된 서열로 면역화시킨 후 세포 반응을 ELISPOT에 의해 평가한 후, 0일째에 일차 면역화시키고, 21일 및 42일째에 두번 자극하였다. MUC1 CD8 펩티드 (SAP), MUC1 CD4 펩티드 (298/9) 및 PADRE 펩티드를 사용하여 자극후 7일째에 검정을 시작하였다. 결과는 CD4 및 CD8 T 세포 MUC1 특이적 반응 둘 모두가 28일 및 49일째에 wt 마우스에서 보다 코돈 최적화된 작제물에서 유사하였고 (또는 약간 우수하였고), 동종 재조합이 회피되었음을 보여준다.

결론적으로, MUC1 항원내의 코돈 최적화된 서열의 삽입은 단백질 발현을 증진시키고, 생체내에서 사용될 경우 유사하거나 약간 우수한 면역 반응을 생성시키고, 이들은 사람 임상 백신에 사용하는데 더욱 안정한 프로파일을 갖는 것으로 예상된다.

SEQUENCE LISTING <110> Glaxo Group Limited HAMBLIN, Paul Andrew ROCHA DEL CURA, Maria de los Angeles <120> Vaccines <130> VB60033 <140> PCT/EP2004/002007 <141> 2004-02-26 <150> GB0304634.9 <151> 2004-02-28 <160> 16 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 1 5 10 15 Gly Val Thr Ser 20 <210> 2 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp Gly Gln 1 5 10 15 Asp Val Thr Ser 20 <210> 3 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Thr Pro Pro Ala His 1 5 10 15 Asp Val Thr Ser 20 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Ala Pro Asp Asn Lys Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His 1 5 10 15 Gly Val Thr Ser 20 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Ala Pro Asp Asn Arg Pro Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His 1 5 10 15 Asn Val Thr Ser 20 <210> 6 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tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 540 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 600 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgccccccca 660 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgcgcccgca 720 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccaa 780 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 840 gcccatggtg tcacctcggc cccggacaac aggcccgcct tgggctccac cgcccctcca 900 gtccacaatg tcacctcggc ctcaggctct gcatcaggct cagcttctac tctggtgcac 960 aacggcacct ctgccagggc taccacaacc ccagccagca agagcactcc attctcaatt 1020 cccagccacc actctgatac tcctaccacc cttgccagcc atagcaccaa gactgatgcc 1080 agtagcactc accatagcac ggtacctcct ctcacctcct ccaatcacag cacttctccc 1140 cagttgtcta ctggggtctc tttctttttc ctgtcttttc acatttcaaa cctccagttt 1200 aattcctctc tggaagatcc cagcaccgac tactaccaag agctgcagag agacatttct 1260 gaaatgtttt tgcagattta taaacaaggg ggttttctgg gcctctccaa tattaagttc 1320 aggccaggat ctgtggtggt 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taccccacct accacaccca tgggcgctat gtgcccccta gcagtaccga tcgtagcccc 1200 tatgagaagg tttctgcagg taatggtggc agcagcctct cttacacaaa cccagcagtg 1260 gcagccactt ctgccaactt gtctagatag 1290 <210> 11 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon modified DNA <400> 11 atgagccgga cccctggcac ccagtctcca ttcttcctgc tcctgctgct caccgtgctg 60 accgtggtga cgggaagcgg ccacgcttcg tccacgcccg gcggcgagaa ggaaaccagt 120 gcaacccagc gcagctccgt gcccagctcc accgagaaaa acgctgtgag catgacgtcc 180 agtgtcctct ctagccatag ccccggctct gggagcagta ccacccaggg ccaggacgtg 240 actctcgccc ccgctacgga gcccgcttct ggctccgccg ccacctgggg ccaggacgtg 300 acctctgtgc cggtcacacg ccctgctctg ggctctacca ctcctcctgc ccatgacgtg 360 acctcggctc cggacaataa gcccaacgtg acgagtgcca gcgggagcgc ctcggggtcc 420 gccagtaccc tggtgcataa cgggaccagt gctagggcca ccaccacccc cgcgtcgaag 480 agcaccccct tctctatccc gtctcatcat agcgacacac ctacaaccct ggcgagccac 540 agcaccaaga ccgacgcttc ttccacacat catagcaccg tgccaccact caccagctcc 600 aaccattcca ccagccccca gctgagcacc ggagtgtcct tcttcttcct gagcttccat 660 atcagtaacc tccagttcaa ctccagcctc gaggacccct ctaccgacta ctatcaggag 720 ctgcagcggg acatcagcga gatgtttctg cagatctaca agcagggggg cttcctcggc 780 ctgtctaaca tcaagttccg ccccggcagc gtcgtggtgc agttgaccct ggccttccgg 840 gagggcacca tcaacgtgca cgacgtggag acccagttca accagtacaa gaccgaggcc 900 gccagcaggt ataacctgac catctccgac gtctctgtga gcgacgtccc cttccctttc 960 tccgcccaga gcggcgctgg ggtgcccggc tggggcatcg ccttgctcgt gctggtgtgc 1020 gtgctggtgg ccctggccat cgtgtacctg atcgccctgg ccgtctgtca atgcaggcgc 1080 aagaactacg gccagctcga catcttccca gctcgggata cctatcatcc catgagcgag 1140 taccccacct accacaccca tggccgctac gttcctccct ccagcaccga ccgcagccct 1200 tacgagaagg tgagcgccgg gaatgggggg agttctctct cttacacaaa ccccgccgtg 1260 gccgccacga gcgccaacct ctccaggtga 1290 <210> 12 <211> 1290 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon modified DNA <400> 12 atgtcccgca cccctggcac ccagtccccc ttctttctcc tgctgctgct caccgtgctg 60 accgtcgtga ccggcagtgg gcatgcgtcc tcgacgcccg gcggcgagaa ggagaccagt 120 gctacccagc gcagctctgt gccttccagc acggagaaga acgctgtgag tatgacttcc 180 tccgtgctga gctcccatag ccccggctcg ggcagctcca ccacccaggg gcaggacgtg 240 acactggctc ccgcaaccga gcccgcctct ggctctgccg ccacctgggg ccaggacgtg 300 acatccgtgc ccgtgacccg ccccgccctg ggcagcacca ccccccctgc tcatgacgtc 360 acctctgcgc ctgacaacaa gcctaacgtg acgtccgctt ccggcagcgc ctccgggtcc 420 gcctccacac tggtgcataa cggaacctcc gcgcgcgcca ccaccacccc agcgagcaag 480 agcaccccct tctctatccc ctcccatcat agcgacacac ccaccacgct ggccagccat 540 agcaccaaaa ccgacgcctc tagcacccac cactccacgg tgccccccct gacctccagc 600 aaccattcta cctcccccca gctgagcacg ggggtgagct ttttcttcct gtccttccat 660 atcagcaacc tccagttcaa ttcctctctg gaggacccca gcaccgacta ctaccaagag 720 ctgcagcggg acatctccga gatgttcctg cagatctaca aacagggcgg cttcttggga 780 ttgagcaaca tcaagttccg ccccgggtcc gtggtggtgc agctcaccct ggccttcagg 840 gagggcacca tcaacgtgca tgacgtcgag acccagttca atcagtataa gaccgaggcc 900 gcctcccggt acaacctgac gatcagcgac gtgtctgtgt ccgacgtgcc cttccccttc 960 tccgcacagt ccggcgccgg cgtgccgggc tggggcatcg ccctgctcgt gttggtgtgc 1020 gtgctcgtgg ccctcgccat cgtgtacctg atcgccctgg ccgtctgtca gtgcaggaga 1080 aagaactatg ggcagttgga tatcttcccc gccagggaca cctaccaccc catgtccgag 1140 taccccacct accacaccca cggccgctat gtccctccct cctcgaccga ccgctcccct 1200 tacgagaagg tgagcgccgg caacggaggc agctccctgt cctacaccaa ccctgccgtg 1260 gccgccacaa gcgccaacct gagccgctga 1290 <210> 13 <211> 1330 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon modified DNA <400> 13 gcaggcggcc gcgctagcgc caccatgtct agaacccctg gcacccagtc ccccttcttt 60 ctcctgctgc tgctcaccgt gctgaccgtc gtgaccggca gtgggcatgc gtcctcgacg 120 cccggcggcg agaaggagac cagtgctacc cagcgcagct ctgtgccttc cagcacggag 180 aagaacgctg tgagtatgac ttcctccgtg ctgtcctccc atagccccgg ctcgggcagc 240 tccaccaccc aggggcagga cgtgacactg gctcccgcaa ccgagcccgc ctctggctct 300 gccgccacct ggggccagga cgtgacatcc gtgcccgtga cccgccccgc cctgggcagc 360 accacccccc ctgctcatga cgtcacctca gcgcctgaca acaagcctaa cgtgacgtcc 420 gcttccggca gcgcctccgg ctcagcctcc acactggtgc ataacggaac ctccgcgcgc 480 gccaccacca ccccagcgag caagagcacc cccttctcta tcccctccca tcatagcgac 540 acacccacca cgctggccag ccatagcacc aaaaccgacg cctctagcac ccaccactcc 600 acggtgcccc ccctgacctc cagcaaccat tctacctccc cccagctgtc cacgggggtg 660 agctttttct tcctgtcctt ccatatcagc aacctccagt tcaattcctc tctggaggac 720 cccagcaccg actactacca agagctgcag cgggacatct ccgagatgtt cctgcagatc 780 tacaaacagg gcggcttcct gggattgagc aacatcaagt tccgccccgg gtccgtggtg 840 gtgcagctca ccctggcctt cagggagggc accatcaacg tgcatgacgt cgagacccag 900 ttcaatcagt ataagaccga ggccgcctcc cggtacaacc tgacgatcag cgacgtgtct 960 gtgtccgacg tgcccttccc cttctccgca cagtccggcg ccggcgtgcc gggctggggc 1020 atcgccctgc tcgtgttggt gtgcgtgctc gtggccctcg ccatcgtgta cctgatcgcc 1080 ctggccgtct gtcagtgcag gagaaagaac tatgggcagt tggatatctt ccccgccagg 1140 gacacctacc accccatgtc cgagtacccc acctaccaca cccacggccg ctatgtccct 1200 ccctcctcga ccgaccgctc cccttacgag aaggtgagcg ccggcaacgg aggcagctcc 1260 ctgtcctaca ccaaccctgc cgtggccgcc acaagcgcca acctgtctag atgactcgag 1320 ggatccgcag 1330 <210> 14 <211> 1818 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon modified DNA <400> 14 gctagcgcca ccatgtctag aacccctggc acccagtccc ccttctttct cctgctgctg 60 ctcaccgtgc tgaccgtcgt gaccggcagt gggcatgcgt cctcgacgcc cggcggcgag 120 aaggagacca gtgctaccca gcgcagctct gtgccttcca gcacggagaa gaacgctgtg 180 agtatgactt cctccgtgct gtcctcccat agccccggct cgggcagctc caccacccag 240 gggcaggacg tgacactggc tcccgcaacc gagcccgcct ctggctctgc cgccacctgg 300 ggccaggacg tgacatccgt gcccgtgacc cgccccgccc tgggcagcac caccccccct 360 gctcatgacg tcacctcagc cccggacaac aagccagccc cgggctccac cgccccccca 420 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 480 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 540 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 600 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgccccccca 660 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggcccgccc cgggctccac cgcgcccgca 720 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccaa 780 gcccacggtg tcacctcggc cccggacacc aggccggccc cgggctccac cgccccccca 840 gcccatggtg tcacctcggc cccggacaac aggcccgcct tgggctccac cgcccctcca 900 gtccacaatg tcacctcggc ctcaggctct gcatcaggct cagcctccac actggtgcat 960 aacggaacct ccgcgcgcgc caccaccacc ccagcgagca agagcacccc cttctctatc 1020 ccctcccatc atagcgacac acccaccacg ctggccagcc atagcaccaa aaccgacgcc 1080 tctagcaccc accactccac ggtgcccccc ctgacctcca gcaaccattc tacctccccc 1140 cagctgtcca cgggggtgag ctttttcttc ctgtccttcc atatcagcaa cctccagttc 1200 aattcctctc tggaggaccc cagcaccgac tactaccaag agttgcagcg ggacatctcc 1260 gagatgttcc tgcagatcta caaacagggc ggcttcctgg gattgagcaa catcaagttc 1320 cgccccgggt ccgtggtggt gcagctcacc ctggccttca gggagggcac catcaacgtg 1380 catgacgtcg agacccagtt caatcagtat aagaccgagg ccgcctcccg gtacaacctg 1440 acgatcagcg acgtgtctgt gtccgacgtg cccttcccct tctccgcaca gtccggcgcc 1500 ggcgtgcctg gctggggcat cgccctgctc gtgttggtgt gcgtgctcgt ggccctcgcc 1560 atcgtgtacc tgatcgccct ggccgtctgt cagtgcagga gaaagaacta tgggcagttg 1620 gatatcttcc ccgccaggga cacctaccac cccatgtccg agtaccccac ctaccacacc 1680 cacggccgct atgtccctcc ctcctcgacc gaccgctccc cttacgagaa ggtgagcgcc 1740 ggcaacggag gcagctccct gtcctacacc aaccctgccg tggccgccac aagcgccaac 1800 ctgtctagat gactcgag 1818 <210> 15 <211> 599 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> 7VNTR MUC-1 (plasmid JNW656) <400> 15 Met Ser Arg Thr Pro Gly Thr Gln Ser Pro Phe Phe Leu Leu Leu Leu 1 5 10 15 Leu Thr Val Leu Thr Val Val Thr Gly Ser Gly His Ala Ser Ser Thr 20 25 30 Pro Gly Gly Glu Lys Glu Thr Ser Ala Thr Gln Arg Ser Ser Val Pro 35 40 45 Ser Ser Thr Glu Lys Asn Ala Val Ser Met Thr Ser Ser Val Leu Ser 50 55 60 Ser His Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ser Thr Thr Gln Gly Gln Asp Val 65 70 75 80 Thr Leu Ala Pro Ala Thr Glu Pro Ala Ser Gly Ser Ala Ala Thr Trp 85 90 95 Gly Gln Asp Val Thr Ser Val Pro Val Thr Arg Pro Ala Leu Gly Ser 100 105 110 Thr Thr Pro Pro Ala His Asp Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Lys Pro 115 120 125 Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro 130 135 140 Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val 145 150 155 160 Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro 165 170 175 Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser 180 185 190 Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro 195 200 205 Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro 210 215 220 Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Ala Ala His Gly Val 225 230 235 240 Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Gln 245 250 255 Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser 260 265 270 Thr Ala Pro Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Asn Arg Pro 275 280 285 Ala Leu Gly Ser Thr Ala Pro Pro Val His Asn Val Thr Ser Ala Ser 290 295 300 Gly Ser Ala Ser Gly Ser Ala Ser Thr Leu Val His Asn Gly Thr Ser 305 310 315 320 Ala Arg Ala Thr Thr Thr Pro Ala Ser Lys Ser Thr Pro Phe Ser Ile 325 330 335 Pro Ser His His Ser Asp Thr Pro Thr Thr Leu Ala Ser His Ser Thr 340 345 350 Lys Thr Asp Ala Ser Ser Thr His His Ser Thr Val Pro Pro Leu Thr 355 360 365 Ser Ser Asn His Ser Thr Ser Pro Gln Leu Ser Thr Gly Val Ser Phe 370 375 380 Phe Phe Leu Ser Phe His Ile Ser Asn Leu Gln Phe Asn Ser Ser Leu 385 390 395 400 Glu Asp Pro Ser Thr Asp Tyr Tyr Gln Glu Leu Gln Arg Asp Ile Ser 405 410 415 Glu Met Phe Leu Gln Ile Tyr Lys Gln Gly Gly Phe Leu Gly Leu Ser 420 425 430 Asn Ile Lys Phe Arg Pro Gly Ser Val Val Val Gln Leu Thr Leu Ala 435 440 445 Phe Arg Glu Gly Thr Ile Asn Val His Asp Val Glu Thr Gln Phe Asn 450 455 460 Gln Tyr Lys Thr Glu Ala Ala Ser Arg Tyr Asn Leu Thr Ile Ser Asp 465 470 475 480 Val Ser Val Ser Asp Val Pro Phe Pro Phe Ser Ala Gln Ser Gly Ala 485 490 495 Gly Val Pro Gly Trp Gly Ile Ala Leu Leu Val Leu Val Cys Val Leu 500 505 510 Val Ala Leu Ala Ile Val Tyr Leu Ile Ala Leu Ala Val Cys Gln Cys 515 520 525 Arg Arg Lys Asn Tyr Gly Gln Leu Asp Ile Phe Pro Ala Arg Asp Thr 530 535 540 Tyr His Pro Met Ser Glu Tyr Pro Thr Tyr His Thr His Gly Arg Tyr 545 550 555 560 Val Pro Pro Ser Ser Thr Asp Arg Ser Pro Tyr Glu Lys Val Ser Ala 565 570 575 Gly Asn Gly Gly Ser Ser Leu Ser Tyr Thr Asn Pro Ala Val Ala Ala 580 585 590 Thr Ser Ala Asn Leu Ser Arg 595 <210> 16 <211> 1800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> codon modified DNA <400> 16 atgtctagaa caccgggcac ccagtctcct ttcttcctgc tgctgctcct cacagtgctt 60 acagttgtta caggttctgg tcatgcaagc tctaccccag gtggagaaaa ggagacttcg 120 gctacccaga gaagttcagt gcccagctct actgagaaga atgctgtgag tatgaccagc 180 agcgtactct ccagccacag ccccggttca ggctcctcca ccactcaggg acaggatgtc 240 actctggccc cggccacgga accagcttca ggttcagctg ccacctgggg acaggatgtc 300 acctcggtcc cagtcaccag gccagccctg ggctccacca ccccgccagc ccacgatgtc 360 acctcagccc cggacaacaa gccagccccg ggctccaccg cccccccagc ccacggtgtc 420 acctcggccc cggacaccag gccggccccg ggctccaccg cccccccagc ccacggtgtc 480 acctcggccc cggacaccag gccggccccg ggctccaccg cccccccagc ccacggtgtc 540 acctcggccc cggacaccag gccggccccg ggctccaccg cccccccagc ccacggtgtc 600 acctcggccc cggacaccag gcccgccccg ggctccaccg cccccccagc ccacggtgtc 660 acctcggccc cggacaccag gcccgccccg ggctccaccg cgcccgcagc ccacggtgtc 720 acctcggccc cggacaccag gccggccccg ggctccaccg ccccccaagc ccacggtgtc 780 acctcggccc cggacaccag gccggccccg ggctccaccg cccccccagc ccatggtgtc 840 acctcggccc cggacaacag gcccgccttg ggctccaccg cccctccagt ccacaatgtc 900 acctcggcct caggctctgc atcaggctca gcttctactc tggtgcacaa cggcacctct 960 gccagggcta ccacaacccc agccagcaag agcactccat tctcaattcc cagccaccac 1020 tctgatactc ctaccaccct tgccagccat agcaccaaga ctgatgccag tagcactcac 1080 catagcacgg tacctcctct cacctcctcc aatcacagca cttctcccca gttgtctact 1140 ggggtctctt tctttttcct gtcttttcac atttcaaacc tccagtttaa ttcctctctg 1200 gaagatccca gcaccgacta ctaccaagag ctgcagagag acatttctga aatgtttttg 1260 cagatttata aacaaggggg ttttctgggc ctctccaata ttaagttcag gccaggatct 1320 gtggtggtac aattgactct ggccttccga gaaggtacca tcaatgtcca cgacgtggag 1380 acacagttca atcagtataa aacggaagca gcctctcgat ataacctgac gatctcagac 1440 gtcagcgtga gtgatgtgcc atttcctttc tctgcccagt ctggggctgg ggtgccaggc 1500 tggggcatcg cgctgctggt gctggtctgt gttctggttg cgctggccat tgtctatctc 1560 attgccttgg ctgtctgtca gtgccgccga aagaactacg ggcagctgga catctttcca 1620 gcccgggata cctaccatcc tatgagcgag taccccacct accacaccca tgggcgctat 1680 gtgcccccta gcagtaccga tcgtagcccc tatgagaagg tttctgcagg taatggtggc 1740 agcagcctct cttacacaaa cccagcagtg gcagccactt ctgccaactt gtctagatag 1800

Claims (17)

1. MUC-1 발현 종양을 인지할 수 있는 생체내 면역 반응을 유발시킬 수 있는 MUC-1 유도체를 엔코딩하는 핵산 분자로서, 비반복부에 대한 RSCU 값이 0.6 이상이며, 야생형 MUC-1의 상응하는 비반복부에 대해 도 9에 도시된 MUC-1 VNTR 누클레오티드 서열과 비교하여 85% 미만의 동일성을 갖는 핵산 분자.
2. 제 1항에 있어서, RSCU가 0.65 이상임을 특징으로 하는 핵산 분자.
3. 제 1항에 있어서, 동일성이 80% 미만임을 특징으로 하는 핵산 분자.
4. 제 1항에 있어서, 완전 반복 유닛이 15개 미만임을 특징으로 하는, MUC-1 유도체를 엔코딩하는 핵산 분자.
5. 제 4항에 있어서, 완전 반복 유닛을 함유하지 않음을 특징으로 하는 핵산 분자.
6. 제 1항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, 시그널 서열이 결여됨을 특징으로 하는 핵산 분자.
7. 제 1항 내지 제 6항중의 어느 한 항에 있어서, FLSFHISNL; NSSLEDPSTDYYQELQRDISE; 및 NLTISDVSV로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 서열을 엔코딩함을 특징으로 하는 핵산 분자.
8. 제 1항 내지 제 7항중의 어느 한 항에 있어서, T-헬퍼 에피토프를 엔코딩하는 이종성 서열을 추가로 포함함을 특징으로 하는 핵산 분자.
9. 제 1항 내지 제 8항중의 어느 한 항에 있어서, DNA 분자임을 특징으로 하는 핵산 분자.
10. 제 1항 내지 제 9항중의 어느 한 항에 따른 DNA 분자를 포함하는 플라스미드.
11. 제 1항 내지 제 9항중의 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 10항에 따른 플라스미드 및 약제학적으로 허용되는 부형제, 희석제 또는 담체를 포함하는 약제 조성물.
12. 제 11항에 있어서, 담체가 미세입자임을 특징으로 하는 약제 조성물.
13. 제 12항에 있어서, 미세입자가 골드임을 특징으로 하는 약제 조성물.
14. 제 11항 내지 제 13항중의 어느 한 항에 있어서, 애주번트를 추가로 포함함을 특징으로 하는 약제 조성물.
15. 약물에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 9항중의 어느 한 항에 따른 핵산, 제 10항에 따른 플라스미드, 또는 제 11항 내지 제 14항중의 어느 한 항에 따른 약제 조성물.
16. MUC-1 발현 종양을 치료하거나 예방하기 위한 약제의 제조에 있어서 제 1항 내지 제 9항중의 어느 한 항에 따른 핵산의 용도.
17. 제 1항 내지 제 9항중의 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제 10항에 따른 플라스미드를 안전하고 유효한 양으로 투여하는 것을 포함하여, 종양을 치료하거나 예방하는 방법.