KR20050105273A

KR20050105273A - 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산 트랜스포터

Info

Publication number: KR20050105273A
Application number: KR1020057016478A
Authority: KR
Inventors: 히토시 엔도; 요시카츠 카나이
Original assignee: 휴먼 셀 시스템즈, 인코퍼레이티드
Priority date: 2003-03-07
Filing date: 2004-03-05
Publication date: 2005-11-03
Also published as: JP2010252796A; KR101083385B1; ATE420952T1; JP5281039B2; JPWO2004078970A1; CN1756842A; CN100590196C; JP4660375B2; EP1609858A4; DE602004019062D1; US7553642B2; EP1609858A1; EP1609858B1; WO2004078970A1; US20060246538A1

Abstract

본 발명은 단일 분자로 기능하여 분지쇄 아미노산을 중심으로 하는 중성 아미노산을 수송하는 신규 아미노산 트랜스포터 및 그 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 나타낸 아미노산 서열로 되거나, 또는 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 되는, 분지쇄 아미노산을 중심으로 하는 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 나트륨 비의존적으로 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질을 제공한다. 본 발명은 또한, 서열번호 1, 3, 5, 또는 7로 나타낸 염기서열로 되는 DNA, 또는 그것과 하이브리다이즈할 수 있는 DNA로 되는 유전자로서, 분지쇄 아미노산을 나트륨 비의존적으로 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질을 코딩하는 유전자를 제공한다.

Description

단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산 트랜스포터{BRANCHED NEUTRAL AMINO ACID TRANSPORTERS ACTING AS SINGLE MOLECULE}

본 발명은 분지쇄(branched) 중성 아미노산 및 그 유사 물질의 나트륨 비의존적 수송에 관여하는 단백질, 및 그 단백질을 코딩하는 유전자에 관한 것이다.

세포는, 영양으로서 아미노산을 상시 수중에 넣는 것을 필요로 하며, 이 기능은 세포막에 존재하는 막단백질인 아미노산 트랜스포터가 담당하고 있다. 특히 중성 아미노산 수송계 L는, 많은 필수 아미노산의 세포에의 공급을 담당하는 것으로부터 세포 영양에 있어서 가장 중요한 수송기구의 하나인 것과 동시에, 장관으로부터의 흡수, 신장 요세관으로부터의 재흡수, 혈액·조직 관문의 통과에 대해서도 중요한 역할을 완수하고 있다. 또한, 중성 아미노산 수송계 L는, 기질 선택성이 넓은 것으로부터, 중성 아미노산 유사 물질이나 중성 아미노산과 유사한 구조를 갖는 약물이나 독물을 수송하는 것으로도 알려져 있다.

중성 아미노산 수송계 L는, 원래 아미노산 유사 화합물인 BCH(2-aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid)에 의해 특이적으로 억제되는 아미노산 수송계로서 종양 세포주로 처음 기재되었으며, 그 후 배양 세포, 막소포 표본, 적출장기 표본 또는 in vivo 표본을 이용해 검토되었다[Christensen, Physiological Reviews, 1990년, 제70권, 제1호, p. 43-77]. 중성 아미노산 수송계 L은, 나트륨 비의존적인, 즉 그 기능에 나트륨 이온을 필요로 하지 않는 트랜스포터이다. 그 수송 기질 선택성이나 수송 특성은, 세포나 조직에 의해 차이가 있는 것이 알려져 있다.

그러나, 종래의 방법으로는 중성 아미노산 및 그 유사 물질 수송의 상세한 것이나, 세포의 생존 또는 증식에 대한 중성 아미노산 수송계 L의 역할을 해석하는 것이 곤란하여, 중성 아미노산 수송계 L의 기능을 담당하는 중성 아미노산 트랜스포터의 유전자를 단리하여 상세한 기능 해석을 가능하도록 하는 것이 요망되고 있다.

중성 아미노산 트랜스포터로서는, 나트륨 의존적인 트랜스포터로서 ASCT1 및 ASCT2가 클로닝되어 있다[金井, Current Opinion in Cell Biology, 1997년, 제9권, 제4호, p. 565-572]. 그러나, 이들은 알라닌, 세린, 시스테인, 트레오닌, 글루타민을 주된 기질로 하는 것이고, 중성 아미노산 수송계 L과는 기질 선택성이 차이가 난다. 또한, 글리신 트랜스포터와 프롤린 트랜스포터가 클로닝되어 있지만, 중성 아미노산 수송계 L와는 다르다[Amara & Kuhar, Annual Review of Neuroscience, 1993년, 제16권, p. 73-93].

트랜스포터 자체는 아니지만, 아미노산 트랜스포터의 활성화 인자라고 생각되고 있는 막 관통 구조를 1 회밖에 가지지 않는 2형막 당단백질인 rBAT 및 4F2hc의 cDNA가 클로닝되어 있어, 이들을 아후리카트메가엘 난모세포에 발현시키면 중성 아미노산과 함께 알칼리성 아미노산의 수확을 활성화하는 것이 알려져 있다[Palacin, The Journal of Experimental Biology, 1994년, 제196권, p. 123-137].

수송계 L에 상당하는 트랜스포터로서 중성 아미노산 트랜스포터 LAT1[金井 외, The Journal of Biological Chemistry, 1999년, 제273권, 제37호, p. 23629-23632] 및 LAT2[瀨川 외, The Journal of Biological Chemistry, 1999년, 제274권, 제28호, p. 19745-19751]이 클로닝되어 있다. 양자는 4F2hc와 헤테로 이량체를 형성하는 것에 의해 기능하는 트랜스포터로, 양자 공히 Na⁺비의존적인 수송을 나타낸다. LAT1는 류신, 이소류신, 발린, 페닐알라닌, 타이로신, 트립토판, 메티오닌, 히스티딘 등 대형의 중성 아미노산을 수송하는 교환 수송 활성을 나타내고, LAT2는 대형의 중성 아미노산에 더하여 글리신, 알라닌, 세린, 시스테인, 트레오닌 등 소형의 중성 아미노산도 수송하는 넓은 기질 선택성을 가진다. 그러나, 이 2 종의 수송계 L 트랜스포터만으로는, 전신의 수송계 L을 설명할 수는 없고, 다른 미동정의 수송계 L 동형체(isoform)가 존재하는 것으로 상정되고 있다.

기존의 수송계 L 트랜스포터 LAT1 및 LAT2는 SLC7 패밀리에 속하는 헤테로 이량체형 단백질이고, 1회 막관통형 단백질인 4F2hc와 연결하는 것에 의해 기능성의 트랜스포터를 형성한다. 이미 공개된 마우스 게놈 및 인간 게놈 데이터베이스에서 SLC7 패밀리의 기능 미동정된 멤버를 탐색하였으나, 그 안에서 새로운 수송계 L에 상당하는 신규 트랜스포터는 발견되지 않았다. 따라서, 미동정의 새로운 수송계 L 트랜스포터는 SLC7 패밀리 이외의 단백질일 가능성이 상정되고 있다.

더우기, 중성 아미노산 트랜스포터 LAT1의 유사 단백질로서 중성 아미노산 및 알칼리성 아미노산을 수송하는 수송계 y^＋L의 기능을 갖는 y^＋LAT1과 y^＋LAT2가 클로닝되어 있다[Torrents 외, The Journal of Biological Chemistry, 1998년, 제273권, 제49호, p. 32437-32445]. 또한, y^＋LAT1, y^＋LAT2 모두 보조 인자 4F2hc와 공존하는 것에 의해서만 기능하는 것으로 나타났다. y^＋LAT1과 y^＋LAT2는 중성 아미노산으로서는 글루타민, 류신, 이소류신을 주로 수송하여, 중성 아미노산에 대한 기질 선택성은 좁다.

게다가, 방향족 아미노산을 수송하는 중성 아미노산 트랜스포터로서 수송계 T에 상당하는 아미노산 트랜스포터 TAT1[김 외, The Journal of Biological Chemistry, 2001년, 제276권, 제20호, p. 17221-17228]이 클로닝되어 있다. TAT1은 트립토판, 타이로신, 페닐알라닌 등의 방향족 아미노산을 Na^＋비의존적으로 수송하지만, 류신, 이소류신, 발린 등의 분지 아미노산은 받아들이지 않고, 수송계 L 특이적인 억제약 BCH에 의해 억제되지 않고, 아미노산 수송계 L과는 다르다.

본 출원 발명에 관련된 선행기술문헌정보는 다음과 같다.

1. Christensen, Physiological Reviews, 1990년, 제70권, 제1호, p. 43-77

2. 金井, Current Opinion in Cell Biology, 1997년, 제9권, 제4호, p. 565-572

3. Amara & Kuhar, Annual Review of Neuroscience, 1993년, 제16권, p. 73-93

4. Palacin, The Journal of Experimental Biology, 1994년, 제196권, p. 123-137

5. 金井 외, The Journal of Biological Chemistry, 1999년, 제273권, 제37호, p. 23629-23632

6. 瀨川 외, The Journal of Biological Chemistry, 1999년, 제274권, 제28호, p. 19745-19751

7. Torrents 외, The Journal of Biological Chemistry, 1998년, 제273권, 제49호, p. 32437-32445

8. 김 외, The Journal of Biological Chemistry, 2001년, 제276권, 제20호, p. 17221-17228

9. Cole 외, Genomics , 1998년, 제51권, 제2호, p. 282-287

도 1은 인간 FLC4 세포 유래 mRNA 및 그 크기 분획을 주입한 난모세포에 의한 류신의 수확 실험 결과를 나타낸다.

도 2는 인간 LAT3와 마우스 LAT3의 아미노산 서열의 비교를 나타낸다. 예상되는 막 관통 부위를 굵은선으로 나타냈다. 또한, 예상되는 당쇄 부가 부위를 ＃, 프로테인키나제 C 의존성의 인산화 부위를 *, 타이로신 인산화 부위를 ＆로 나타냈다.

도 3은 인간의 각 장기 조직에 있어서 LAT3 유전자 mRNA의 발현을 노던 블롯팅에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면에 대신하는 사진이다.

도 4는 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험의 결과를 나타낸다.

도 5는 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서 첨가하는 염의 영향을 조사한 결과를 나타낸다.

도 6은 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서 기질 류신의 농도의 영향을 조사한 결과를 나타내는 그래프. 삽입도는 그 Eadie-Hofstee 플롯.

도 7은 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, 계에 글리신 및 각종 L－아미노산을 첨가한 영향을 조사한 결과를 나타낸다.

도 8은 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, 계에 각종 D－아미노산을 첨가한 영향을 조사한 결과를 나타낸다.

도 9는 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, 계에 각종 아미노산 수송계 선택적 억제약을 첨가한 영향을 조사한 결과를 나타낸다.

도 10은 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, 계에 각종 아미노산 유도체를 첨가한 영향을 조사한 결과를 나타내는 그래프이다.

R¹－CH(NH₂)COOH, L-류신; R¹－CH(NH₂)CH₂OH, L-류신올; R¹－CH₂NH₂, 이소펜틸아민; R¹－CH₂COOH, 4-메틸발레르산; R¹－CH(NH₂)CH₃, 1,3-디메틸-n-부틸아민; R¹－CH(NH₂)CONH₂, L-류신아미드; R¹－CH(NH₂)COOCH₃, L-류신-메틸에스테르; R¹－CH(NHCOCH₃)COOH, N-아세틸-L-류신; R¹－CH(NHCH₃)COOH, N-메틸-L-류신; R²－CH(NH₂)COOH, L-발린; R²－CH(NH₂)CH₂OH, L-발린올; R²－CH₂NH₂, 이소부틸아민; R²－CH₂COOH, 이소발레르산; R³－CH(NH₂)COOH, L-페닐알라닌; R³－CH(NH₂)CH₂OH, L-페닐알라닌올; R³－CH₂NH₂, 2-페닐에틸아민; R³－CH₂COOH, 3-페닐프로피온산; R⁴－CH(NH₂)COOH, L-타이로신; R⁴－CH(NH₂)CH₂OH, L-타이로신올; R⁴－CH₂NH₂, 타이라민; R⁴－CH₂COOH, 3-(p-히드록시페닐)프로피온산.

도 11은 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, 계에 각종 음이온성 화합물을 첨가한 영향을 조사한 결과를 나타낸다.

도 12는 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 방사능 표지 L-아미노산 및 L-아미노산의 수확을 조사한 결과를 나타낸다.

도 13은 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서 pH의 영향을 조사한 결과를 나타낸다.

도 14는 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 ¹⁴C-류신의 방출 시간 경과를 조사한 결과를 나타내는 그래프. □: 대조로서 인간 LAT3 유전자의 cRNA 대신 물을 주입한 난모세포에 있어서 ¹⁴C-류신의 방출, Na^＋비함유 수확용 용액에 류신 미첨가한 경우. ■: 대조로서 인간 LAT3 유전자의 cRNA 대신 물을 주입한 난모세포에 있어서 ¹⁴C-류신의 방출, Na^＋비함유 수확용 용액에 류신 첨가한 경우. ○: 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 있어서 ¹⁴C-류신의 방출, Na^＋비함유 수확용 용액에 류신 미첨가한 경우. ●: 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 있어서 ¹⁴C-류신의 방출, Na^＋비함유 수확용 용액에 류신 첨가한 경우. 세로축은 방출된 방사활성을 난모세포에 주입한 방사활성에 대한 %로 나타낸 것이다.

도 15는 인간 LAT3 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, N-에틸말레이미드(NEM) 처리의 영향을 조사한 결과를 나타내는 그래프.

도 16은 인간 전립선암(A 및 B) 및 인간 신장암(C 및 D)에 있어서 항LAT3 항체에 의한 LAT3의 면역조직화학적 해석의 결과를 나타낸 사진. A 및 C: 항LAT3 항체에 의한 염색상. B 및 D: 항원 펩티드에 의한 흡수 실험.

도 17은 인간 LAT3와 인간 LAT4의 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면.

도 18은 인간 LAT4와 마우스 LAT4의 아미노산 서열의 비교를 나타내는 도면. 예상되는 막 관통 부위를 굵은선으로 나타냈다. 또, 예상되는 당쇄 부가 부위를 ＃, cAMP 의존성 인산화 부위를 ＋, 프로테인키나제 C 의존성 인산화 부위를 *로 나타냈다.

도 19는 마우스 LAT4 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, 첨가하는 염의 영향을 조사한 결과를 나타내는 그래프.

도 20은 마우스 LAT4 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, 계에 글리신 및 각종 L-아미노산을 첨가한 영향을 조사한 결과를 나타내는 그래프.

도 21은 마우스 LAT4 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, 계에 각종 D-아미노산을 첨가한 영향을 조사한 결과를 나타내는 그래프.

도 22는 마우스 LAT4 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서, 계에 각종 아미노산 수송계 선택적 억제약을 첨가한 영향을 조사한 결과를 나타내는 그래프.

도 23은 마우스 LAT4 유전자의 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 방사능 표지 L-아미노산 및 L-아미노산의 수확을 조사한 결과를 나타내는 그래프.

도 24는 인간의 각 장기 조직에 있어서 LAT4 유전자 mRNA의 발현을 노던 블롯팅에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면에 대신하는 사진이다.

도 25는 마우스의 각 장기 조직에 있어서 LAT4 유전자 mRNA의 발현을 노던 블롯팅에 의해 해석한 결과를 나타낸 도면에 대신하는 사진이다.

본 발명의 목적은, 단일 분자로서 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산을 수송하는 수송계 L의 기능을 나타내는 트랜스포터 및 그 트랜스포터를 코딩하는 유전자를 제공하는 것에 있다. 그 외의 목적에 대해서는 이하의 기재에 의해 분명하게 될 것이다.

본 발명자들은, 인간 간세포 암세포주 FLC4로부터 추출한 폴리(A)^＋RNA를 재료로 해서 아후리카트메가엘 난모세포 발현계를 이용한 발현 클로닝을 실시하여, 단일 분자로 분지쇄 중성 아미노산을 수송하는 능력을 발휘하는 수송계 L의 성질을 나타내는 신규 트랜스포터의 유전자를 클로닝하였다. 게다가 그것과 유사한 서열을 갖는 다른 유전자를 EST(expressed sequence tag) 데이터베이스를 이용하여 동정하였다. 이들 유전자의 산물을 아후리카트메가엘의 난모세포에 발현시켜, 그 기능 특성을 분명히 해여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

즉, 본 발명은 이하의 (A) 내지 (H)로부터 선택되는 단백질로서, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질을 제공한다.

(A) 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열로 되는 단백질.

(B) 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열로 되는 단백질.

(C) 서열번호 6으로 나타낸 아미노산 서열로 되는 단백질.

(D) 서열번호 8로 나타낸 아미노산 서열로 되는 단백질.

(E) 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 되는 단백질.

(F) 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 되는 단백질.

(G) 서열번호 6으로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 되는 단백질.

(H) 서열번호 8로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 되는 단백질.

또한, 본 발명은 이하의 (a) 내지 (h)로부터 선택되는 DNA로서, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질을 코딩하는 DNA로 되는 유전자를 제공한다.

(a) 서열번호 1로 나타낸 염기서열로 되는 DNA.

(b) 서열번호 3으로 나타낸 염기서열로 되는 DNA.

(c) 서열번호 5로 나타낸 염기서열로 되는 DNA.

(d) 서열번호 7로 나타낸 염기서열로 되는 DNA.

(e) 서열번호 1로 나타낸 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.

(f) 서열번호 3으로 나타낸 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.

(g) 서열번호 5로 나타낸 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.

(h) 서열번호 7로 나타낸 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.

서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열은, 인간 간세포 암세포주 FLC4 유래의 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(인간 LAT3)의 아미노산 서열(559 아미노산)을 나타낸다. 그리고, 당해 트랜스포터를 코딩하는 cDNA의 염기서열은 서열번호 1에 나타낸다.

서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열은, 마우스 침샘 유래의 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(마우스 LAT3)의 아미노산 서열(564 아미노산)을 나타낸다. 그리고, 당해 트랜스포터를 코딩하는 cDNA의 염기서열은 서열번호 3에 나타낸다.

서열번호 6으로 나타낸 아미노산 서열은, 인간 태아 뇌 유래의 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(인간 LAT4)의 아미노산 서열(573 아미노산)을 나타낸다. 그리고, 당해 트랜스포터를 코딩하는 cDNA의 염기서열은 서열번호 5에 나타낸다.

서열번호 8로 나타낸 아미노산 서열은, 마우스 신장 유래의 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(마우스 LAT4)의 아미노산 서열(568 아미노산)을 나타낸다. 그리고, 당해 트랜스포터를 코딩하는 cDNA의 염기서열은 서열번호 7에 나타낸다.

본 발명에 따른, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질, 즉 아미노산 트랜스포터 LAT3(L-type amino acid transporter 3) 및 LAT4(L-type amino acid transporter 4)는, 류신, 이소류신, 발린 등의 분지쇄 아미노산 및 페닐알라닌을 중심으로 하는 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는(수확하는) 능력을 갖는다.

본 발명에 따른, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터 LAT3를 개입시킨 중성 아미노산의 수송은, 분지쇄 아미노산 알코올 및 페닐알라닌올에 의해 강하게 억제된다. 또한, LAT3를 개입시킨 중성 아미노산의 수송은 N－에틸말레이미드에 의해 억제된다.

본 발명에 따른, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터 LAT3는, 인간 체내에 있어서 췌장, 간장, 골격근, 심장, 골수 및 태아 간장에서 강하게 발현하며, 신장, 태반, 폐, 소장, 난소, 정소, 전립선 및 비장에서 약하게 발현하고 있다.

또한, 본 발명에 따른, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터 LAT4는, 인간 체내에 있어서 태반, 신장, 골격근, 뇌, 심장, 비장, 폐, 백혈구, 소장에서 강하게 발현하며, 간장 및 흉선에서 약하게 발현하고 있다.

본 발명은 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터 및 그것을 코딩하는 유전자를 이용하는 발명에 관한 것이다.

즉, 본 발명은 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터를 코딩하는 유전자 또는 당해 유전자 내의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터를 코딩하는 유전자의 염기서열에 있어서 연속하는 14 염기 이상의 부분 서열 또는 그 상보적 서열을 포함하는 뉴클레오티드, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터에 대한 항체를 제공한다.

본 발명은, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터를 이용하여, 당해 단백질이 갖는 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력에 대한 피검물질의 기질 또는 저해 물질로서의 작용을 검출하는 방법을 제공한다.

더우기 본 발명은, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터, 그 특이항체, 그 기능 촉진 물질 또는 기능 억제 물질, 또는 당해 트랜스포터를 코딩하는 유전자의 안티센스 뉴클레오티드를 이용하여, 당해 단백질이 갖는 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 변조시키는 것에 의해, 정상 세포 또는 종양 세포의 증식을 제어하여, 당해 단백질에 의해 수송되는 약물, 독물, 또는 외래성 이물체내 동태를 변경하거나, 또는 당해 단백질에 의해 수송되는 분지쇄 중성 아미노산의 체내 동태 또는 생체내 대사를 변경하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질로서는, 이하 서열목록의 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다.

서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질은 인간 간세포 암세포주 FLC4 유래의, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(인간 LAT3)이다.

서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질은 마우스 침샘 유래의, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(마우스 LAT3)이다.

서열번호 6으로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질은 인간 태아 뇌 유래의, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(인간 LAT4)이다.

서열번호 8로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질은 마우스 신장 유래의, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(마우스 LAT4)이다.

본 발명의 단백질로서는 그 밖에, 예를 들어 서열번호 2, 4, 6 또는 8로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산의 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 들 수 있다. 아미노산의 결실, 치환 또는 부가는, 아미노산 수송 활성이 없어지지 않는 정도이면 좋고, 서열번호 2에 있어서는 통상 1∼약 111개, 바람직하게는 1∼ 약 56개, 서열번호 4에 있어서는 통상 1∼ 약 113개, 바람직하게는 1∼ 약 57개, 서열번호 6에 있어서는 통상 1∼ 약 115개, 바람직하게는 1∼ 약 57개, 서열번호 8에 있어서는 통상 1∼ 약 114개, 바람직하게는 1∼ 약 57개이다. 이와 같은 단백질은, 서열번호 1 및 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열과 통상 1∼80 %, 바람직하게는 1∼90 %의 아미노산 서열의 상동성(homology)을 갖는다.

서열번호 2에 나타낸 아미노산 서열은, 인간 전립선암에 높게 발현하는 기능 미동정의 서열로서 보고된 POV1[Cole 외, Genomics , 1998년, 제51권, 제2호, p. 282-287]과 동일하였다. 서열번호 4, 6 및 8에 나타낸 아미노산 서열은 보고되어 있지 않은 신규의 것으로 생각된다.

본 발명의, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질을 코딩하는 유전자로는, 이하 서열목록의 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 나타낸 염기서열을 갖는 유전자를 들 수 있다.

서열번호 1로 나타낸 염기서열은, 인간 간세포 암세포주 FLC4 유래의, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(인간 LAT3) 유전자의 전체 길이 cDNA 염기서열(약 2.5 kbp)를 나타낸다.

서열번호 2로 나타낸 염기서열은, 마우스 침샘 유래의, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(마우스 LAT3) 유전자의 전체 길이 cDNA 염기서열(약 2.5 kbp)를 나타낸다.

서열번호 3으로 나타낸 염기서열은, 인간 태아 뇌 유래의, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(인간 LAT4) 유전자의 전체 길이 cDNA 염기서열(약 3.3 kbp)를 나타낸다.

서열번호 4로 나타낸 염기서열은, 마우스 신장 유래의, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 아미노산 트랜스포터(마우스 LAT4) 유전자의 전체 길이 cDNA 염기서열(약 3.2 kbp)를 나타낸다.

본 발명의 유전자로서는, 그 밖에 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 나타낸 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈할 수 있는 DNA를 포함하는 것을 들 수 있다. 이와 같이 하이브리다이즈할 수 있는 DNA는, 그 DNA에 코딩되는 단백질이 중성 아미노산을 수송하는 능력을 갖는 것이면 좋다. 이와 같은 DNA는 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 나타낸 염기서열과 통상 70 % 이상, 바람직하게는 80 % 이상의 염기서열의 상동성을 가진다. 이와 같은 DNA로는, 자연계에서 발견되는 변이형 유전자, 인위적으로 개변한 변이형 유전자, 이종 생물 유래의 상동 유전자 등이 포함된다.

본 발명에 있어서, 스트린젠트인 조건하에서의 하이브리다이제이션은, 통상 하이브리다이제이션을 5xSSC 또는 이와 동등한 염 농도의 하이브리다이제이션 용액 중, 37-42 ℃의 온도조건 하, 약 12 시간 행하고, 5xSSC 또는 이와 동등한 염 농도의 용액 등으로 필요에 따라 예비 세정을 행한 후, 1xSSC 또는 이와 동등한 염 농도의 용액 중에서 세정을 행하는 것에 의해 실시할 수 있다.

본 발명의 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 선택적으로 수송하는 기능을 단일 분자로 발휘하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터의 유전자는, 적당한 포유동물의 조직이나 세포를 유전자 근원으로 이용하여 스크리닝을 실시하는 것에 의해 단리 취득할 수 있다. 포유동물로서는 개, 소, 말, 염소, 양, 원숭이, 돼지, 토끼, 래트 및 마우스 등의 비인간 동물 외에, 인간을 들 수 있다.

유전자의 스크리닝 및 단리는, 발현 클로닝(expression cloning) 등에 의해 바람직하게 실시할 수 있다.

예를 들면, 인간 간세포 암세포주 FLC4를 유전자 근원으로 이용하여, 이로부터 mRNA(폴리(A)^＋RNA)를 조제한다. 이것을 크기 분획하여, 각 분획에 대해서 아후리카트메가엘 난모세포에 도입한다.

mRNA를 도입한 난모세포에 대해서, 예를 들어 류신 등을 기질로 하여 세포 내로의 기질의 수송(수확)을 측정하여, 높은 수확 활성을 나타낸 mRNA 분획을 선택하는 것에 의해 LAT3의 mRNA를 농축할 수 있다. 이 농축된 mRNA를 기초로 cDNA 라이브러리를 제작한다. 라이브러리의 cDNA로부터 약 500 클론을 1 그룹으로 cRNA(캡화된 것)를 조정하고, 각각의 그룹을 난모세포에 도입하여 기질의 수확 활성을 지표로 하여 양성 그룹을 선택한다. 양성 그룹을 찾아내면, 그것을 한층 더 소그룹으로 나누어 같은 조작을 반복하는 것에 의해, LAT3 유전자의 cDNA를 포함한 클론을 얻을 수 있다.

또한, LAT4의 cDNA 단리는 상동성 클로닝 등에 의해 매우 적합하게 실시할 수 있다.

예를 들어, 인간 태아 뇌 또는 마우스 신장을 유전자 근원으로 하여, 그 mRNA(폴리(A)^＋RNA)를 이용해서 cDNA 라이브러리를 제작한다. EST(expressed sequence tag) 데이터베이스 검색에 의해 얻을 수 있는 LAT3 유사 서열(예를 들어, GenBankTM/EBI/DDBJ accession No. AW162917)에 상당하는 프로브를 이용하여 cDNA 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해 LAT4 유전자의 cDNA를 포함한 클론을 얻을 수 있다.

얻어진 cDNA에 대해서는, 상법에 의해 염기서열을 결정하고, 번역 영역을 해석하여, 이것에 코딩되는 단백질, 즉, LAT3 또는 LAT4의 아미노산 서열을 결정할 수 있다.

얻어진 cDNA가, 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 단일 분자로 기능을 발휘하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 유전자의 cDNA인 것, 즉 cDNA에 코딩된 유전자 산물이 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 단일 분자로 기능하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터인 것은, 예를 들어 다음과 같이 검증할 수 있다. 즉, 얻어진 LAT3 유전자 또는 LAT4 유전자의 cDNA로부터 조정한, 이것에 상보적인 RNA(cRNA)(캡화된 것)를 난모세포 내에 도입하여 발현시켜 분지쇄 중성 아미노산을 세포 내로 수송하는(수확하는) 능력을, 적당한 분지쇄 중성 아미노산을 기질로 하는 통상의 수확 시험(Kanai and Hediger, Nature, 제360권, 467-471 페이지, 1992년)에 의해 세포 내로의 기질의 수확을 측정하는 것으로부터 확인할 수 있다.

얻어진 LAT3 유전자 또는 LAT4 유전자의 cDNA로부터 조정한, 이것에 상보적인 RNA(cRNA)를 이용하여, in vitro 번역법[Hediger 등, Biochim . Biophys . Acta , 제1064권, 360 페이지, 1991년]에 의해 LAT3 또는 LAT4　단백질을 합성하고, 전기 영동에 의해 단백질의 크기, 당 부가 유무 등을 검토할 수 있다.

또한, 발현 세포에 대해서는, 동일한 수확 실험을 응용하여 LAT3 또는 LAT4의 특성, 예를 들어, LAT3가 아미노산의 통과촉진 확산형의 수송을 실시한다는 특성이나, LAT3 또는 LAT4의 기질 선택성, pH 의존성 등을 조사할 수 있다.

얻어진 LAT3 유전자 또는 LAT4 유전자의 cDNA를 이용하여 다른 유전자 근원으로부터 제작된 적당한 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 라이브러리를 스크리닝하는 것에 의해, 다른 조직, 다른 생물 유래의 상동 유전자나 염색체 유전자 등을 단리할 수 있다.

또한, 개시된 본 발명 유전자의 염기서열(서열번호 1, 3, 5 또는 7에 나타낸 염기서열, 또는 그 일부)의 정보에 근거해서 설계된 합성 프라이머를 이용하여, 통상의 PCR(Polymerase Chain Reaction) 법에 의해 cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 라이브러리로부터 유전자를 단리할 수 있다.

cDNA 라이브러리 또는 게놈 DNA 라이브러리 등의 DNA 라이브러리는, 예를 들어, 「Molecular cloning」[Sambrook, J., Fritsh, E.F. 및 Manitis, T., Cold Spring Harbor Press에 의해 1989에 발간]에 기재된 방법에 의해 조제할 수 있다. 또는, 시판 라이브러리가 있는 경우는 이것을 이용할 수도 있다.

본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터(LAT3 또는 LAT4)는, 예를 들어, 그것을 코딩하는 cDNA를 이용하여 유전자 재조합 기술에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, LAT3 또는 LAT4를 코딩하는 DNA(cDNA 등)를 적당한 발현벡터에 넣어 얻어진 재조합 DNA를 적당한 숙주세포에 도입할 수 있다. 폴리펩티드를 생산하기 위한 발현계(숙주-벡터계)로서는, 예를 들어 세균, 효모, 곤충 세포 및 포유류 세포의 발현계 등을 들 수 있다. 이 중에서 기능 단백질을 얻기 위해서는 곤충 세포 및 포유류 세포를 이용하는 것이 바람직하다.

예를 들면, 폴리펩티드를 포유류 세포로 발현시키는 경우에는, 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3 또는 LAT4를 코딩하는 DNA를, 적당한 발현벡터(예를 들어, 아데노 바이러스계 벡터, RNA 종양 바이러스계 벡터, 파필로마 바이러스 벡터, 우크시니어 바이러스 벡터, SV40계 벡터 등) 중의 적당한 프로모터(예를 들어, 사이토메갈로 바이러스 프로모터, SV40 프로모터, LTR 프로모터, elongation 1a 프로모터 등)의 하류에 삽입해 발현벡터를 구축한다. 다음에, 얻어진 발현벡터로 적당한 동물세포를 형질전환하고 형질전환체를 적당한 배지에서 배양하는 것에 의해, 목적으로 하는 폴리펩티드가 생산된다. 숙주로 하는 포유동물 세포로서는, 원숭이 COS-7 세포, 차이니즈 햄스터 CHO 세포, 인간 HeLa 세포, 또는 마우스 S2 세포 등의 세포주 등을 들 수 있다.

단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3 또는 LAT4를 코딩하는 DNA로서는, 예를 들어, 서열번호 1, 3, 5 또는 7로 나타낸 염기서열을 갖는 cDNA를 이용할 수가 있으며, 이밖에 상기 cDNA 서열로 한정되지 않고 아미노산 서열에 대응하는 DNA를 설계하여 폴리펩티드를 코딩하는 DNA로서 이용할 수도 있다. 이 경우, 하나의 아미노산을 코딩하는 코돈은 각각 1∼6 종류 알려져 있어, 사용하는 코돈을 임의로 선택하여도 좋지만, 예를 들어 발현에 이용하는 숙주의 코돈 사용 빈도를 고려하여, 보다 발현 효율이 높은 서열을 설계할 수가 있다. 설계한 염기서열을 갖는 DNA는, DNA의 화학 합성, 상기 cDNA의 단편화와 결합, 염기서열의 일부 개변 등에 의해 취득할 수 있다. 인위적인 염기서열의 일부 개변, 변이 도입은, 원하는 개변을 코딩하는 합성 올리고 뉴클레오티드로부터 이루어지는 프라이머를 이용해 부위 특이적 변이 도입법(site specific mutagenesis)[Mark, D.F. et al., Proceedings of National Academy of Sciences, 제81권, 제5662페이지(1984년)] 등에 의해 실시할 수 있다.

본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 또는 이것과 면역학적 동등성을 갖는 폴리펩티드를 이용하여 그 항체를 취득할 수가 있다. 항체는 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터의 검출이나 정제 등에 이용할 수 있다. 항체는 본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터, 그 단편, 또는 그 부분 서열을 갖는 합성 펩티드 등을 항원으로 이용하여 제조할 수 있다. 폴리클로날 항체는 숙주 동물(예를 들어, 래트나 토끼 등)에 항원을 접종하고 면역 혈청을 회수하는 통상의 방법에 의해 제조할 수가 있고, 모노클로날 항체는 통상의 하이브리도마법 등의 기술에 의해 제조할 수 있다.

본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3 또는 LAT4, 그 유전자 및 그 발현 세포는 LAT3 또는 LAT4가 존재하는 세포막이나, LAT3 또는 LAT4가 존재한다고 예상되는 부위에서의 투과 효율에 대한 생체외 시험에 사용할 수 있다. 또한, 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3 또는 LAT4, 그 유전자 및 그 발현 세포는 LAT3 또는 LAT4가 존재하는 세포막이나, LAT3 또는 LAT4가 존재한다고 예상되는 부위를 효율 좋게 투과하는 화합물의 개발에 사용할 수 있다. 게다가, 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3 또는 LAT4, 그 유전자 및 그 발현 세포는 LAT3 또는 LAT4가 존재하는 세포막이나, LAT3 또는 LAT4가 존재한다고 예상되는 부위에서의 약물간 상호작용의 생체외 시험에 사용할 수 있다.

본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3 또는 LAT4를 억제하는 것에 의해, LAT3 또는 LAT4를 발현하는 세포막이나, LAT3 또는 LAT4가 존재한다고 예상되는 부위의 특정 화합물의 투과를 제한할 수가 있다. 또한, 본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3 또는 LAT4, 그 유전자 및 그 발현 세포는 LAT3 또는 LAT4에 의해 수송되는 화합물의 세포막 통과나, LAT3 또는 LAT4가 존재한다고 예상되는 부위의 투과를 제한하는 약물(LAT3 또는 LAT4의 특이적 저해제 등)의 개발에 사용할 수 있다.

본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존 트랜스포터 LAT3 또는 LAT4, 그 유전자 및 그 발현 세포는 LAT3 또는 LAT4를 억제하는 것에 의해, LAT3 또는 LAT4를 고레벨에 발현하는 세포의 증식 억제 효과의 생체외 시험에 사용할 수 있다. LAT3 또는 LAT4의 억제의 목적으로는, 그 억제약을 사용하거나, 또는 안티센스 올리고 DNA나 특이 항체를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존 트랜스포터 LAT3 또는 LAT4, 그 유전자 및 그 발현 세포를 이용하여, 종양 세포 등의 LAT3 또는 LAT4를 고레벨로 발현하는 세포의 증식을 억제하는 목적으로 사용하는 LAT3 또는 LAT4의 기능 억제약이나 기능 억제 작용을 갖는 모노클로날 항체를 개발할 수가 있다.

한편, 일본특허출원 2003－062379 명세서에 기재된 내용은 본 명세서에 모두 도입된다.

실시예

다음 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명이 이들 실시예만으로 한정되는 것은 아니다.

또한, 다음 실시예에 있어서, 각 조작은 특히 명시가 없는 한 「Molecular Cloning」[Sambrook, J., Fritsh, E.F. 및 Manitis, T., Cold Spring Harbor에서 1989년 발간]에 기재된 방법에 의해 실시하며, 시판 시약이나 키트를 이용하는 경우에는 시판품의 지시서에 따라서 사용하였다.

실시예 1:　단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3의 인간 cDNA의 클로닝

(1) 인간 간세포암 유래 세포주 FLC4로부터의 발현 클로닝

金井 등의 방법(Kanai and Hediger, Nature, 제360권, 467-471페이지, 1992년)에 준하여, 발현 클로닝법에 따라 다음과 같이 시행하였다.

겔 전기 영동에 의해 인간 간세포 암 세포주 FLC4 유래 폴리(A)^＋RNA 400 ㎍을 분획하였다.

분획에 의해 얻어진 각 분획을 아후리카트메가엘 난모세포에 주입하여 3 일간 배양하였다.

RNA 주입한 난모세포에 대하여, 기질로서 류신을 이용해서 기질의 수확 실험을 金井 등의 방법(Kanai and Hediger, Nature, 제360권, 467-471페이지, 1992년)에 준하여 다음과 같이 시행하였다. 기질로서 ¹⁴C-L-류신(100　μM)을 포함한 Na^＋비함유 수확용 용액[100 mM 염화콜린, 2 mM 염화칼륨, 1.8 mM 염화칼슘, 1 mM 염화마그네슘, 5 mM HEPES, pH 7.4] 중에서 30 분간 난모세포를 배양하고 세포 내에 도입된 방사능의 카운트로 기질의 수확율을 측정하였다. 이 계에 있어서, 인간 간세포종 유래 세포주 FLC4의 폴리(A)^＋RNA(mRNA)를 주입한 난모세포를 대조로 하여, 물을 주입한 난모세포와 비교하여 류신의 수확 항진을 볼 수 있었다(도 1).

크기 분획에 의해 얻어진 각 RNA 분획 중, RNA를 주입한 난모세포가 가장 높은 류신의 수확율을 나타낸 분획을 선택하였다(도 1). 이 분획의 폴리(A)^＋RNA(2.2∼2.7 kb)에 대하여, cDNA 합성 및 핵외 유전자 클로닝용 키트(상품명: Superscript Plasmid System, Gibco사)을 사용해서 cDNA 라이브러리를 작성하였다. 이들 DNA는 플라스미드 pSPORT1(Gibco사)의 제한효소 SalI 및 NotI 인식 부위에 도입하고, 얻어진 재조합 플라스미드 DNA를 대장균 DH10B 주의 competent cell(상품명: Electro Max DH10B Competent Cell, Gibco사)에 도입하였다. 얻어진 형질전환체를 니트로셀룰로스막 상에서 배양하여 1 플레이트 당 약 500 개의 콜로니를 얻을 수 있었다. 이들 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 조제하고, 이들을 제한효소 NotI로 절단하였다. 얻어진 DNA를 이용하여, in vitro 전사에 의해 캡화된 cRNA를 합성하였다.

얻어진 cRNA(약 50 ng)를 난모세포에 주입하였다. 이들 난모세포에 대하여 상기와 같이 하여 류신 수확 실험을 행하는 것에 의해 양성 클론의 스크리닝을 실시하였다. 스크리닝의 경우에는, 복수의 클론으로부터 추출한 DNA를 풀한 그룹에 대하여 조사하고, 어느 그룹에서 류신 수확이 확인될 경우 그것을 복수의 그룹으로 더욱 분할하여 한층 더 스크리닝을 실시하였다.

얻어진 클론, 즉 인간 분지쇄 중성 아미노산 트랜스포터 LAT3의 cDNA를 포함하는 클론에 대해서, 염기서열 결정을 위한 합성 프라이머를 이용하여 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱법(Applied Biosystems사)에 의해 cDNA의 염기서열을 결정하였다.

이에 의해, 인간 LAT3 유전자의 염기서열을 얻을 수 있었다. 또한, cDNA의 염기서열을 상법에 의해 해석하여 cDNA의 번역 영역과 그곳에 코딩된 LAT3의 아미노산 서열을 결정하였다.

이 서열을, 서열목록의 서열번호 2로 나타냈다.

인간 LAT3는 인간 전립선암에 고발현하는 기능 미동정의 서열로서 보고된 POV1[Cole 외, Genomics, 1998년, 제51권, 제2호, p. 282-287]과 동일한 아미노산 서열을 나타냈다.

TopPred2 알고리즘［Gunnar von Heijne, J. Mol . Biol . 225, 487-494 (1992)]에 의해 LAT3의 아미노산 서열을 해석한 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 12 개의 막관통 영역(membrane-spanning domain)이 예상되었다. 또한, 제 1 막관통 부위와 제 2 막관통 부위 사이의 세포외 루프에는 당 부가 부위, 제 6 막관통 부위와 제 7 막관통 부위 사이의 긴 세포내 루프에는 2 개의 프로테인키나제 C 의존성 인산화 부위 및 1 개의 타이로신 인산화 부위, 제 8 막관통 부위와 제 9 막관통 부위 사이의 세포내 루프에는 1 개의 프로테인키나제 C 의존성 인산화 부위라고 생각되는 부위가 있었다(도 2).

(2) 인간의 여러 조직에서의 LAT3 유전자의 발현(노던 블롯팅에 의한 해석)

인간 LAT3 유전자의 제1790-1936번째 염기에 상당하는 cDNA 단편을 ³²P-dCTP로 표지하고 이것을 프로브로서 이용하여, 인간의 여러 조직으로부터 추출한 폴리(A)^＋RNA를 포함한 Multiple Tissue Northern Blots(Human, Clontech사)에 대하여, 노던 하이브리다이제이션을 이하와 같이 행하였다. 이 필터막을 42 ℃에서 ³²P-dCTP로 표지한 LAT3 cDNA 단편을 포함하는 하이브리다이제이션액으로 하룻밤 하이브리다이제이션을 실시하였다. 필터를 65 ℃에서 0.1% SDS를 포함하는 0.1xSSC로 세정하였다.

노던 블롯팅의 결과(도 3), 췌장, 간장, 골격근, 심장, 골수, 및 태아 간장에서 강하게 발현하고, 신장, 태반, 폐, 소장, 난소, 정소, 전립선, 및 비장에서 약하게 발현하고 있는 것으로 나타났다.

실시예 2:　단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3의 마우스 cDNA의 동정

인간 LAT3 번역 영역의 염기서열을 이용한 EST(expressed sequence tag) 데이터베이스 검색에 의해 얻어진 인간 LAT3와 유사한 마우스 침샘 유래의 염기서열(GenBankTM/EBI/DDBJ accession No. BG865268)에 상당하는 cDNA 클론을 IMAGE (Integrated and Molecular Analysis of Genomes and their Expression)에서 구입하고(IMAGE clone I.D.: 4910149), 염기서열 결정을 위한 합성 프라이머를 이용하여 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱법(Applied Biosystems사)에 의해 cDNA 전체 길이의 염기서열을 결정하였다. 또한, cDNA의 염기서열을 상법에 의해 해석하여 cDNA의 번역 영역과 그곳에 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 결정하였다.

이 서열을, 서열목록의 서열번호 4로 나타냈다.

마우스 LAT3와 인간 LAT3의 아미노산 서열의 비교를 도 2에 나타냈다. 마우스 LAT3와 인간 LAT3의 아미노산 서열은 82%의 상동성을 가지고 있었다.

실시예 3:　단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3의 특징

(1) 인간 LAT3의 메가엘 난모세포에의 기능 발현

인간 LAT3의 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드 벡터 pSPORT1를 제한효소 NotI로 절단하고, T7RNA 폴리머라제를 이용하여 cRNA(cDNA에 상보적인 RNA)를 조제하였다.

인간 LAT3 유전자 cRNA 25 ng을 난모세포에 주입하는 것에 의해 발현시켜 3 일간 배양하였다.

류신의 수확 실험은, 상기 실시예 1(1) 기재 방법에 준하여 다음과 같이 행하였다. 즉, 인간 LAT3 유전자 cRNA, 또는 대조로서 물을 주입한 난모세포를, ¹⁴C-L-류신(100 μM)을 포함하는 Na^＋비함유 수확용 용액(실시예 1(1) 참조) 중에서 10 분 배양하고 세포 내로의 방사능의 수확을 측정하였다.

그 결과(도 4), 대조로서 물을 주입한 난모세포에 비해, LAT3를 발현시킨 난모세포에서 류신의 큰 수확을 얻을 수 있었다. 이미 보고되어 있는 수송계 L 트랜스포터 LAT1 및 LAT2는, 그 기능 발현에 1회 막관통형 보조인자 4F2hc와 공존할 것이 요구되지만, LAT3는 4F2hc를 필요로 하지 않고 단독으로 기능을 발휘하였다.

(2) 인간 LAT3의 수송 활성의 염 의존성

인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에서 배지에 첨가하는 염의 영향을 조사하였다. 류신의 수확 실험은, 인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포를 이용하여 상기 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 실시하였다.

수확용 용액은, 나트륨 이온의 영향을 보는 경우 표준 수확용 용액 대신 Na^＋비함유 수확용 용액을 이용하였다. 염소 이온의 영향을 보는 경우는 표준 수확용 용액 대신 Cl^-비함유 수확용 용액(표준 수확용 용액의 Cl^-을 글루코네이트로 대체한 것)을 이용하였다.

그 결과(도 5), 세포외 나트륨을 콜린으로 대신하여도, 세포외 염소 이온을 글루코네이트로 바꾸어도, 류신 수확에 어떤 영향을 주지 않았다. 이것으로부터, LAT3는 나트륨 이온 및 염소 이온에 비의존적으로 작용하는 트랜스포터인 것으로 나타났다.

(3) 인간 LAT3의 동력학 시험

분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT3의 동력학 시험을 실시하였다. 기질 류신의 농도의 차이에 의한 류신 수확율의 변화를 조사하는 것에 의해, LAT3의 동력학 시험을 실시하였다.

류신의 수확 실험은, 류신 농도 1, 3, 10, 30, 60, 100, 200, 400, 1000, 2000, 3000 μM에서, 인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포를 이용하여 상기 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 실시하였다. 그 결과(도 6), 류신의 수확은 농도 의존적인 포화성의 수확을 나타내어, 트랜스포터를 개입시키는 수송인 것이 확인되었다. 더우기, LAT3를 개입시키는 류신의 수송은 고친화성 성분과 저친화성 성분으로 되는 것으로 밝혀졌다(도 6 삽입도).

(4) 인간 LAT3의 기질 선택성(아미노산 및 그 유사 물질 첨가에 의한 저해 실험)

인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신의 수확 실험에서, 계로의 각종 아미노산 및 그 유사 물질 첨가의 영향을 조사하였다.

류신의 수확 실험은, 인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포를 이용하여 상기 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 실시하였다. 단, Na^＋비함유 수확용 용액을 이용하여 10 mM의 각종 화합물(비표지) 존재하 및 비존재하에서 ¹⁴C-류신(100 μM)의 도입을 측정하였다.

그 결과(도 7), 이소류신, 발린, 페닐알라닌, 메티오닌에서 강한 cis-저해 효과가 관찰되었다. 산성 아미노산(아스파라긴산, 글루타민산), 염기성 아미노산(리진, 아르기닌) 및 프롤린은 LAT3를 개입시키는 ¹⁴C-류신의 수확에 영향을 주지 않았다.

D-아미노산 가운데 D-류신에 의해, LAT3를 개입시키는 ¹⁴C-류신의 수확의 비교적 강한 억제 효과를 얻을 수 있었다(도 8).

수송계 특이적 억제약인 BCH(2-aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid), AIB(α-aminoisobutyric acid), MeAIB(α-(aminomethyl)isobutyric acid)의 효과를 조사하였고, LAT3를 개입시키는 ¹⁴C-류신의 수확은 수송계 L 특이적 억제약 BCH 보다 강하게 억제되어 LAT3가 수송계 L 트랜스포터인 것으로 나타났다(도 9).

LAT3를 개입시키는 ¹⁴C-류신의 수확은, 류신올로 강하게 억제되었다(도 10). 또, 발린올, 페닐알라닌올도 비교적 강한 ¹⁴C-류신의 수확 억제 효과를 나타냈다(도 10). 이소펜틸아민, 1,3-디메틸-n-부틸아민, 류신-메틸에스테르, N-아세틸류신, 이소부틸아민, 페닐에틸아민도 유의적인 억제 효과를 나타냈다(도 10).

LAT3를 개입시키는 ¹⁴C－류신의 수확에 대한 각종 음이온성 화합물의 영향을 검토하였다. 그 결과(도 11), 오크라톡신 A, 인도메타신에 의한 강한 억제 효과가 관찰되었다. 또한, 프로베네시드 및 살리실산도 약하면서 유의적인 억제 효과를 나타내었다.

(5) 인간 LAT3의 기질 선택성(각종 아미노산 및 그 유사 물질을 기질로 하는 수확 시험)

각종 아미노산 및 그 유사 물질을 기질로 하여 LAT3에 의한 수확을 조사하였다.

각종 아미노산 및 그 유사 물질의 수확 실험은, 인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포를 이용하여 상기 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 실시하였다. 단, 기질로서는 ¹⁴C-류신으로 바꾸어 방사능 표지된 각종의 화합물을 이용하였다.

그 결과(도 12), L-류신(¹⁴C 화합물), L-이소류신(¹⁴C 화합물), L-발린(¹⁴C 화합물), L-페닐알라닌(¹⁴C 화합물)을 기질로 하였을 경우에, 난모세포로의 큰 수확이 인정되었다. 또한, L-메티오닌(¹⁴C 화합물), L-타이로신(¹⁴C 화합물), L-프롤린(¹⁴C 화합물)을 기질로 하였을 경우, 난모세포로의 작으면서 유의적인 수확이 인정되었다. D-류신(¹⁴C 화합물)을 기질로 하였을 경우에도, 난모세포로의 유의적인 수확이 인정되었다. 오크라톡신 A는 LAT3를 개입시키는 ¹⁴C-류신의 수확을 강력하게 억제하였지만, 오크라톡신 A(¹⁴C 화합물)는 LAT3에 의해 수송되지 않았다.

(6) 인간 LAT3의 수송 활성의 pH 의존성

인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에 있어서 pH의 영향을 조사하였다.

류신의 수확 실험은 인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포를 이용하여 상기 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 실시하였다.

그 결과, 류신 수확에는 pH 7.0∼8.5로 안정된 값을 나타내는 생리학적 pH가 본 트랜스포터의 적정 pH로 생각되었다(도 13).

(7) 인간 LAT3를 개입시키는 아미노산의 방출 시험

인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포에 있어서, 전 부하된 ¹⁴C-류신의 LAT3를 개입시키는 방출을 조사하였다.

인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포에 100 nℓ의 400 μM ¹⁴C-류신(2 nCi)을 주입하고, 빙냉의 류신을 포함하지 않는 Na^＋비함유 수확용 용액으로 세정한 후, 실온(18∼22 ℃)의 류신(1 mM) 첨가 또는 미첨가의 Na^＋비함유 수확용 용액으로 옮겨, 세포외로 방출되는 ¹⁴C-류신의 양을 측정하였다. 또한, 대조로서 인간 LAT3 유전자 cRNA 대신 물을 주입한 난모세포에도 마찬가지로 100 nℓ의 400 μM ¹⁴C-류신(2 nCi)을 주입하고, 동일하게 시행하여 세포외로 방출되는 ¹⁴C-류신의 양을 측정하였다.

그 결과, 인간 LAT3에 있어서는 세포외에 류신을 첨가하지 않은 경우에도 ¹⁴C-류신의 유의적인 방출이 관찰되고, 그 방출은 세포외에 류신을 첨가하는 것에 의해 약간 상승하였지만, 큰 변화는 없었다(도 14). 이에 대하여, 대조로서 인간 LAT3 유전자 cRNA 대신 물을 주입한 난모세포에 있어서는, 세포외 류신 첨가 유무에 관계없이 ¹⁴C-류신의 유의적인 방출은 관찰되지 않았다(도 14). 따라서, LAT3는 약간의 교환수송 모드를 포함할 가능성을 남기며, 대부분 통과촉진 확산형 수송을 매개하는 트랜스포터인 것으로 결론내렸다.

(8) N-에틸말레이미드의 영향

인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포에 있어서, ¹⁴C-류신의 수확에 대한 N-에틸말레이미드의 영향을 검토하였다.

인간 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포, 인간 LAT3 유전자 cRNA와 4F2hc 유전자 cRNA를 주입한 난모세포, 또는 대조로서 물을 주입한 난모세포를, ¹⁴C-L-류신(100 μM)을 포함한 Na^＋비함유 수확용 용액(실시예 3(2) 참조) 중에서 10 분간 배양하고, 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 세포내로의 방사능의 수확을 측정하였다. 이 경우, 5 mM의 N-에틸말레이미드의 15 분간 전처리, 및 수확용 용액중 5 mM N-에틸말레이미드 함유 유무가, ¹⁴C-L-류신 수확량에 미치는 영향을 검토하였다.

그 결과, N-에틸말레이미드 전처치에 의해, LAT3에 의한 ¹⁴C-L-류신의 수확은 거의 완전하게 억제되었다(도 15). 이 N-에틸말레이미드의 효과는 수확용 용액 중 N-에틸말레이미드 존재의 유무에 의한 것이 아니었다. 이에 대하여, LAT1에 의한 ¹⁴C-L-류신 수확은 N-에틸말레이미드에 의해 영향을 받지 않았다(도 15).

(9) 인간 전립선암 및 인간 신암에 있어서의 LAT3의 발현.

상법에 따라 인간 전립선암 및 인간 신암의 외과수술 적출 표본의 파라핀 절편을 친화성(affinity) 정제 항LAT3 항혈청(2 ㎍/㎖)으로 처리한 후, 디아미노벤지딘으로 발색시켰다. 또한, 염색의 특이성을 검토하는 목적으로, 200 ㎍/㎖의 항원 펩티드 존재하에서 친화성 정제 항LAT3 항혈청(2 ㎍/㎖)으로 처리하는 실험도 행하였다.

그 결과, 인간 전립선암(도 16a) 및 인간 신암(도 16c)에서는, 종양 세포에 일치하여 LAT3의 염색을 볼 수 있었다. 이 염색은, 항원 펩티드의 존재하에서 항LAT3 항체를 작용시켰을 경우에는 검출되지 않고, 염색의 특이성이 나타났다(도 16b 및 d).

(10) 마우스 LAT3의 기능 확인

실시예 2에 의해 얻어진 마우스 LAT3의 cDNA를 NotI로 절단하고 SP6RNA 폴리머라제를 이용하여 cRNA를 조제하였다. 마우스 LAT3 유전자 cRNA를 난모세포에 발현시켜 ¹⁴C-류신의 수확을 측정하였다.

마우스 LAT3 유전자 cRNA 25 ng를 난모세포에 주입하는 것에 의해 발현시키고 3 일간 배양하였다. 마우스 LAT3 유전자 cRNA를 주입한 난모세포에 대해서, 기질로서 류신을 이용하여 기질의 수확 실험을 실시예 3(1)에 준하여 행하였다.

그 결과, 류신의 수확은 인간 LAT3와 같이, 마우스 LAT3를 발현시킨 난모세포에서는 대조로서 물을 주입한 난모세포에 비해 큰 류신의 수확이 관찰되었다. 게다가, 마우스 LAT3도 인간 LAT3와 같은 기질 선택성을 나타내는 것으로 나타났다.

실시예 4:　단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT4의 인간 및 마우스 cDNA의 동정

(1) LAT4 cDNA 의 동정

인간 LAT3의 번역 영역의 염기서열을 이용한 EST(expressed sequence tag) 데이터베이스의 검색에 의해 얻어진, 인간 LAT3와 유사한 인간 태아 뇌 유래의 염기서열(GenBankTM/EBI/DDBJ accession No. AW162917)에 상당하는 cDNA 클론(IMAGE clone I.D.: 2783525), 및 인간 LAT3와 유사한 마우스 신장 유래의 염기서열(GenBankTM/EBI/DDBJ accession No. AW106550)에 상당하는 cDNA 클론(IMAGE clone I.D.: 2235970)을 IMAGE(Integrated and Molecular Analysis of Genomes and their Expression)으로부터 구입하고, 염기서열 결정을 위한 합성 프라이머를 이용하여 다이 터미네이터 사이클 시퀀싱법(Applied Biosystems사)에 의해, cDNA 전체 길이의 염기서열을 결정하였다. 또한, cDNA의 염기서열을 상법에 의해 해석하여 cDNA의 번역 영역과 그곳에 코딩되는 단백질의 아미노산 서열을 결정하였다.

이 인간 서열을 서열목록의 서열번호 3으로, 마우스 서열을 서열목록의 서열번호 4로 나타냈다.

인간 LAT3와 인간 LAT4의 아미노산 서열의 비교를 도 17에 나타냈다. 인간 LAT3와 인간 LAT4의 아미노산 서열은 58 %의 상동성을 가지고 있었다.

인간 LAT3와 마우스 LAT4의 아미노산 서열의 비교를 도 18에 나타냈다. 인간 LAT3와 마우스 LAT4의 아미노산 서열은 90 %의 상동성을 가지고 있었다.

(2) 인간 및 마우스의 여러 조직에 있어서 LAT4 유전자의 발현(노던 블롯팅에 의한 해석)

인간 LAT4 유전자의 제307-1012번째의 염기에 상당하는 cDNA 단편을 ³²P-dCTP로 표지하고 이것을 프로브로 이용하여, 인간의 여러 조직으로부터 추출한 폴리(A)^＋RNA를 포함하는 Multiple Tissue Northern Blots(Human, Clontech사)에 대하여, 노던 하이브리다이제이션을 다음과 같이 행하였다. 이 필터막을 42 ℃에서 ³²P-dCTP로 표지한 LAT4 cDNA 단편을 포함하는 하이브리다이제이션액으로 하룻밤 하이브리다이제이션을 실시하였다. 필터를 65 ℃에서 0.1% SDS를 포함하는 0.1xSSC로 세정하였다.

노던 블롯팅의 결과(도 24), 태반, 신장, 및 골격근에서 강하게 발현하고, 백혈구, 뇌, 심장, 비장, 소장, 폐, 및 대장에서 약하게 발현하며, 흉선, 및 간장에서 한층 더 약하게 발현하고 있는 것으로 나타났다.

마우스 LAT4 유전자의 제122-525번째 염기에 상당하는 cDNA 단편을 ³²P-dCTP로 표지하고 이것을 프로브로 이용하여, 마우스의 여러 조직으로부터 추출한 RNA에 대해서 노던 블롯팅을 다음과 같이 행하였다. 3 ㎍의 폴리(A)^＋RNA를 1% 아가로스/포름알데히드 겔로 전기영동한 후, 니트로셀룰로스 필터에 옮겼다. 이 필터를 42 ℃에서 ³²P-dCTP로 표지한 마우스 LAT4 cDNA 단편을 포함하는 하이브리다이제이션액으로 하룻밤 하이브리다이제이션을 실시하였다. 필터를 65 ℃에서 0.1% SDS를 포함하는 0.1xSSC로 세정하였다.

노던 블롯팅 결과(도 25), 신장, 태반, 뇌, 소장에서 강하게 발현하는 것으로 나타났다.

실시예 5:　단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT4의 특징

(1) 마우스 LAT4의 메가엘 난모세포에서의 기능 발현

마우스 LAT4의 cDNA를 포함하는 발현 플라스미드 벡터 pcDNA3.1(＋)을 제한효소 XbaI로 절단하고, T7 RNA 폴리머라제를 이용하여 cRNA(cDNA에 상보적인 RNA)를 조제하였다.

마우스 LAT4 유전자 cRNA 25 ng을 난모세포에 주입하는 것에 의해 발현시키고 3 일간 배양하였다.

류신의 수확 실험은 상기 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 다음과 같이 행하였다. 즉, 마우스 LAT4 유전자 cRNA, 또는 대조로서 물을 주입한 난모세포를 ¹⁴C-L-류신(100 μM)을 포함하는 Na^＋비함유 수확용 용액(실시예 3(1) 참조) 중에서 10 분간 배양하여 세포내 방사능의 수확을 측정하였다.

그 결과, 대조로서 물을 주입한 난모세포에 비해 LAT4를 발현시킨 난모세포에서 류신의 큰 수확을 얻을 수 있었다. LAT3와 마찬가지로, 또한 벌써 보고되어 있는 수송계 L 트랜스포터 LAT1 및 LAT2와 달리, LAT4는 4F2hc를 필요로 하지 않고 단독으로 기능을 발휘하였다.

(2) 마우스 LAT4의 수송 활성의 염 의존성

마우스 LAT4 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신 수확 실험에서 배지에 첨가하는 염의 영향을 조사하였다. 류신의 수확 실험은, 마우스 LAT4 유전자 cRNA를 주입한 난모세포를 이용하여 상기 실시예 3(1) 기재 방법에 준해 실시하였다.

수확용 용액은, 나트륨 이온의 영향을 보는 경우, 표준 수확용 용액 대신 Na^＋비함유 수확용 용액을 이용하였다. 염소 이온의 영향을 보는 경우는, 표준 수확용 용액 대신 Cl^-비함유 수확용 용액(표준 수확용 용액의 Cl^-를 글루코네이트로 대체한 것)을 이용하였다.

그 결과(도 19), 세포외 나트륨을 콜린으로 대체하여도, 세포외 염소 이온을 글루코네이트로 바꾸어도, 류신 수확에 어떤 영향을 주지 않았다. 이로부터, LAT4는 나트륨 이온 및 염소 이온에 비의존적으로 작용하는 트랜스포터인 것으로 나타났다.

(3) 마우스 LAT4의 동력학 시험

분지쇄 중성 아미노산을 선택적으로 수송하는 나트륨 비의존성 아미노산 트랜스포터 LAT4의 동력학 시험을 실시하였다. 기질 류신의 농도 차이에 의한 류신 수확율의 변화를 조사하는 것에 의해 LAT3의 동력학 시험을 실시하였다.

류신의 수확 실험은, 류신 농도 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3, 10 mM에서, 마우스 LAT4 cRNA를 주입한 난모세포를 이용하여 상기 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 실시하였다. 그 결과, 류신의 수확은 농도 의존적인 포화성 수확을 나타내어, 트랜스포터를 개입시키는 수송인 것으로 확인되었다. 더우기, LAT4를 개입시키는 류신의 수송은 LAT3를 개입시키는 류신의 수송과 마찬가지로, 고친화성 성분과 저친화성 성분으로 되는 것으로 밝혀졌다.

(4) 마우스 LAT4의 기질 선택성(아미노산 및 그 유사 물질 첨가에 의한 저해 실험)

마우스 LAT4 유전자 cRNA를 주입한 난모세포에 의한 류신의 수확 실험에서, 계에 각종 아미노산 및 그 유사 물질을 첨가하는 영향을 조사하였다.

류신의 수확 실험은, 마우스 LAT4 유전자 cRNA를 주입한 난모세포를 이용하여 전기 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 실시하였다. 단, Na^＋비함유 수확용 용액을 이용하여 10 mM의 각종 화합물(비표지)의 존재하 및 비존재하에서, ¹⁴C-류신(100 μM)의 수확을 측정하였다.

그 결과(도 20), 이소류신, 발린, 페닐알라닌, 메티오닌에서 강한 cis-저해 효과가 관찰되었다. 산성 아미노산(아스파라긴산, 글루타민산), 염기성 아미노산(리진, 아르기닌) 및 프롤린은 LAT4를 개입시키는 ¹⁴C-류신의 수확에 영향을 주지 않았다.

D-아미노산 중 D-류신, D-히스티딘, D-메티오닌에 의해, LAT4를 개입시키는 ¹⁴C-류신 수확의 비교적 강한 억제 효과를 얻을 수 있었다(도 21).

수송계 특이적 억제약인 BCH(2-aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid), AIB(α-aminoisobutyric acid), MeAIB(α-(aminomethyl)isobutyric acid)의 효과를 조사한 결과, LAT4를 개입시키는 ¹⁴C-류신의 수확은 수송계 L 특이적 억제약 BCH보다 강하게 억제되어 LAT4가 수송계 L 트랜스포터인 것으로 나타났다(도 22).

(5) 마우스 LAT4의 기질 선택성(각종 아미노산 및 그 유사 물질을 기질로 하는 수확 시험)

각종 아미노산 및 그 유사 물질을 기질로하여 LAT4에 의한 수확을 조사하였다.

각종 아미노산 및 그 유사 물질의 수확 실험은, 마우스 LAT4 유전자 cRNA를 주입한 난모세포를 이용하여 전기 실시예 3(1) 기재 방법에 준하여 실시하였다. 단, 기질은 ¹⁴C-류신으로 바꾸어 방사능 표지된 각종 화합물을 이용하였다.

그 결과(도 23), L-류신(¹⁴C 화합물), L-이소류신(¹⁴C 화합물), L-발린(¹⁴C 화합물), L-페닐알라닌(¹⁴C 화합물), L-메티오닌(¹⁴C 화합물)을 기질로 하였을 경우, 난모세포로의 큰 수확이 인정되었다. D-류신(¹⁴C 화합물)을 기질로 하였을 경우도, 난모세포로의 유의적인 수확이 인정되었다.

(6) 인간 LAT4의 기능의 확인

실시예 4에서 얻어진 인간 LAT4의 cDNA를 XhoI로 절단하고, T3 RNA 폴리머라제를 이용하여 cRNA를 조제하였다. 인간 LAT4 유전자 cRNA를 난모세포에 발현시키고 ¹⁴C-류신의 수확을 측정하였다.

인간 LAT4 유전자 cRNA 25 ng를 난모세포에 주입하는 것에 의해 발현시키고 3 일간 배양하였다. 인간 LAT4 유전자 cRNA를 주입한 난모세포에 대해서, 기질로 류신을 이용하여 기질의 수확 실험을 실시예 3(1)에 준하여 행하였다.

그 결과, 류신의 수확은 마우스 LAT4와 마찬가지로, 인간 LAT4를 발현시킨 난모세포에서 대조로서 물을 주입한 난모세포에 비해 큰 류신의 수확이 관찰되었다. 게다가, 인간 LAT4도 마우스 LAT4와 같은 기질 선택성을 나타내는 것으로 나타났다.

본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산 트랜스포터는, 해당 트랜스포터의 발현장소에서 분지쇄 중성 아미노산 및 약물이나 외래성 이물도 포함하는 아미노산 유사 화합물 수송의 생체외에서의 검토, 또는 이를 기본으로 하는 이들 화합물의 체내 동태의 생체외에서의 예측을 가능하게 한다. 게다가 해당 트랜스포터의 발현장소를 효율 좋게 투과하는 약물의 개발에 유용한 것으로 생각된다. 또한, 본 발명의 단일 분자로 기능하는 분지쇄 중성 아미노산 트랜스포터는, 해당 트랜스포터가 갖는 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 변조시키는 것에 의해, 아미노산 대사를 변조시키는 방법, 정상세포 및 종양세포의 세포증식을 제어하는 방법의 개발에 이용할 수 있다. 또한, 해당 트랜스포터는 종양 항원으로서, 종양세포와 정상세포를 구별하는 수단으로서 이용할 수 있다.

<110> HUMAN CELL SYSTEMS, INC. <120> BRANCHED NEUTRAL AMINO ACID TRANSPORTERS ACTING AS SINGLE MOLECULE <130> PI051274/PCT/JP <150> JP2003-062379 <151> 2003-03-07 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2525 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (257)..(1933) <400> 1 gcttcgcaga cctctggcgc ccggcgggtt cccagttccc ccgcttcttc cgaggagaca 60 gcggaggcga ggccaccggg ctgtcaggct gaagctccgt ggcggccggg tcctgcacgc 120 agagaagacc ccagcgccgg cgcggctcag ggctgggccc acgggactcc ggacgcgccg 180 cgaaagcgtt gcgctcccgg aggcgtccgc agctgctggc tgctcatttg ccggtgaccg 240 gaggctcggg gccagc atg gcc ccc acg ctg caa cag gcg tac cgg agg 289 Met Ala Pro Thr Leu Gln Gln Ala Tyr Arg Arg 1 5 10 cgc tgg tgg atg gcc tgc acg gct gtg ctg gag aac ctc ttc ttc tct 337 Arg Trp Trp Met Ala Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Phe Phe Ser 15 20 25 gct gta ctc ctg ggc tgg ggc tcc ctg ttg atc att ctg aag aac gag 385 Ala Val Leu Leu Gly Trp Gly Ser Leu Leu Ile Ile Leu Lys Asn Glu 30 35 40 ggc ttc tat tcc agc acg tgc cca gct gag agc agc acc aac acc acc 433 Gly Phe Tyr Ser Ser Thr Cys Pro Ala Glu Ser Ser Thr Asn Thr Thr 45 50 55 cag gat gag cag cgc agg tgg cca ggc tgt gac cag cag gac gag atg 481 Gln Asp Glu Gln Arg Arg Trp Pro Gly Cys Asp Gln Gln Asp Glu Met 60 65 70 75 ctc aac ctg ggc ttc acc att ggt tcc ttc gtg ctc agc gcc acc acc 529 Leu Asn Leu Gly Phe Thr Ile Gly Ser Phe Val Leu Ser Ala Thr Thr 80 85 90 ctg cca ctg ggg atc ctc atg gac cgc ttt ggc ccc cga ccc gtg cgg 577 Leu Pro Leu Gly Ile Leu Met Asp Arg Phe Gly Pro Arg Pro Val Arg 95 100 105 ctg gtt ggc agt gcc tgc ttc act gcg tcc tgc acc ctc atg gcc ctg 625 Leu Val Gly Ser Ala Cys Phe Thr Ala Ser Cys Thr Leu Met Ala Leu 110 115 120 gcc tcc cgg gac gtg gaa gct ctg tct ccg ttg ata ttc ctg gcg ctg 673 Ala Ser Arg Asp Val Glu Ala Leu Ser Pro Leu Ile Phe Leu Ala Leu 125 130 135 tcc ctg aat ggc ttt ggt ggc atc tgc cta acg ttc act tca ctc acg 721 Ser Leu Asn Gly Phe Gly Gly Ile Cys Leu Thr Phe Thr Ser Leu Thr 140 145 150 155 ctg ccc aac atg ttt ggg aac ctg cgc tcc acg tta atg gcc ctc atg 769 Leu Pro Asn Met Phe Gly Asn Leu Arg Ser Thr Leu Met Ala Leu Met 160 165 170 att ggc tct tac gcc tct tct gcc att acg ttc cca gga atc aag ctg 817 Ile Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu 175 180 185 atc tac gat gcc ggt gtg gcc ttc gtg gtc atc atg ttc acc tgg tct 865 Ile Tyr Asp Ala Gly Val Ala Phe Val Val Ile Met Phe Thr Trp Ser 190 195 200 ggc ctg gcc tgc ctt atc ttt ctg aac tgc acc ctc aac tgg ccc atc 913 Gly Leu Ala Cys Leu Ile Phe Leu Asn Cys Thr Leu Asn Trp Pro Ile 205 210 215 gaa gcc ttt cct gcc cct gag gaa gtc aat tac acg aag aag atc aag 961 Glu Ala Phe Pro Ala Pro Glu Glu Val Asn Tyr Thr Lys Lys Ile Lys 220 225 230 235 ctg agt ggg ctg gcc ctg gac cac aag gtg aca ggt gac ctc ttc tac 1009 Leu Ser Gly Leu Ala Leu Asp His Lys Val Thr Gly Asp Leu Phe Tyr 240 245 250 acc cat gtg acc acc atg ggc cag agg ctc agc cag aag gcc ccc agc 1057 Thr His Val Thr Thr Met Gly Gln Arg Leu Ser Gln Lys Ala Pro Ser 255 260 265 ctg gag gac ggt tcg gat gcc ttc atg tca ccc cag gat gtt cgg ggc 1105 Leu Glu Asp Gly Ser Asp Ala Phe Met Ser Pro Gln Asp Val Arg Gly 270 275 280 acc tca gaa aac ctt cct gag agg tct gtc ccc tta cgc aag agc ctc 1153 Thr Ser Glu Asn Leu Pro Glu Arg Ser Val Pro Leu Arg Lys Ser Leu 285 290 295 tgc tcc ccc act ttc ctg tgg agc ctc ctc acc atg ggc atg acc cag 1201 Cys Ser Pro Thr Phe Leu Trp Ser Leu Leu Thr Met Gly Met Thr Gln 300 305 310 315 ctg cgg atc atc ttc tac atg gct gct gtg aac aag atg ctg gag tac 1249 Leu Arg Ile Ile Phe Tyr Met Ala Ala Val Asn Lys Met Leu Glu Tyr 320 325 330 ctt gtg act ggt ggc cag gag cat gag aca aat gaa cag caa caa aag 1297 Leu Val Thr Gly Gly Gln Glu His Glu Thr Asn Glu Gln Gln Gln Lys 335 340 345 gtg gca gag aca gtt ggg ttc tac tcc tcc gtc ttc ggg gcc atg cag 1345 Val Ala Glu Thr Val Gly Phe Tyr Ser Ser Val Phe Gly Ala Met Gln 350 355 360 ctg ttg tgc ctt ctc acc tgc ccc ctc att ggc tac atc atg gac tgg 1393 Leu Leu Cys Leu Leu Thr Cys Pro Leu Ile Gly Tyr Ile Met Asp Trp 365 370 375 cgg atc aag gac tgc gtg gac gcc cca act cag ggc act gtc ctc gga 1441 Arg Ile Lys Asp Cys Val Asp Ala Pro Thr Gln Gly Thr Val Leu Gly 380 385 390 395 gat gcc agg gac ggg gtt gct acc aaa tcc atc aga cca cgc tac tgc 1489 Asp Ala Arg Asp Gly Val Ala Thr Lys Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Cys 400 405 410 aag atc caa aag ctc acc aat gcc atc agt gcc ttc acc ctg acc aac 1537 Lys Ile Gln Lys Leu Thr Asn Ala Ile Ser Ala Phe Thr Leu Thr Asn 415 420 425 ctg ctg ctt gtg ggt ttt ggc atc acc tgt ctc atc aac aac tta cac 1585 Leu Leu Leu Val Gly Phe Gly Ile Thr Cys Leu Ile Asn Asn Leu His 430 435 440 ctc cag ttt gtg acc ttt gtc ctg cac acc att gtt cga ggt ttc ttc 1633 Leu Gln Phe Val Thr Phe Val Leu His Thr Ile Val Arg Gly Phe Phe 445 450 455 cac tca gcc tgt ggg agt ctc tat gct gca gtg ttc cca tcc aac cac 1681 His Ser Ala Cys Gly Ser Leu Tyr Ala Ala Val Phe Pro Ser Asn His 460 465 470 475 ttt ggg acg ctg aca ggc ctg cag tcc ctc atc agt gct gtg ttc gcc 1729 Phe Gly Thr Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu Ile Ser Ala Val Phe Ala 480 485 490 ttg ctt cag cag cca ctt ttc atg gcg atg gtg gga ccc ctg aaa gga 1777 Leu Leu Gln Gln Pro Leu Phe Met Ala Met Val Gly Pro Leu Lys Gly 495 500 505 gag ccc ttc tgg gtg aat ctg ggc ctc ctg cta ttc tca ctc ctg gga 1825 Glu Pro Phe Trp Val Asn Leu Gly Leu Leu Leu Phe Ser Leu Leu Gly 510 515 520 ttc ctg ttg cct tcc tac ctc ttc tat tac cgt gcc cgg ctc cag cag 1873 Phe Leu Leu Pro Ser Tyr Leu Phe Tyr Tyr Arg Ala Arg Leu Gln Gln 525 530 535 gag tac gcc gcc aat ggg atg ggc cca ctg aag gtg ctt agc ggc tct 1921 Glu Tyr Ala Ala Asn Gly Met Gly Pro Leu Lys Val Leu Ser Gly Ser 540 545 550 555 gag gtg acc gca tagactt ctcagaccaa gggacctgga tgacaggcaa 1970 Glu Val Thr Ala tcaaggcctg agcaaccaaa aggagtgccc catatggctt ttctacctgt aacatgcaca 2030 tagagccatg gccgtagatt tataaatacc aagagaagtt ctatttttgt aaagactgca 2090 aaaaggagga aaaaaaacct tcaaaaacgc cccctaagtc aacgctccat tgactgaaga 2150 cagtccctat cctagagggg ttgagctttc ttcctccttg ggttggagga gaccagggtg 2210 cctcttatct ccttctagcg gtctgcctcc tggtacctct tggggggatc ggcaaacagg 2270 ctacccctga ggtcccatgt gccatgagtg tgcacacatg catgtgtctg tgtatgtgtg 2330 aatgtgagag agacacagcc ctcctttcag aaggaaaggg gcctgaggtg ccagctgtgt 2390 cctgggttag gggttggggg tcggcccctt ccagggccag gagggcaggt tccctctctg 2450 gtgctgctgc ttgcaagtct tagaggaaat aaaaagggaa gtgagagaaa aaaaaaaaaa 2510 aaaaaaaaaa aaaaa 2525 <210> 2 <211> 559 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Ala Pro Thr Leu Gln Gln Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Trp Met Ala 1 5 10 15 Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Phe Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly 20 25 30 Trp Gly Ser Leu Leu Ile Ile Leu Lys Asn Glu Gly Phe Tyr Ser Ser 35 40 45 Thr Cys Pro Ala Glu Ser Ser Thr Asn Thr Thr Gln Asp Glu Gln Arg 50 55 60 Arg Trp Pro Gly Cys Asp Gln Gln Asp Glu Met Leu Asn Leu Gly Phe 65 70 75 80 Thr Ile Gly Ser Phe Val Leu Ser Ala Thr Thr Leu Pro Leu Gly Ile 85 90 95 Leu Met Asp Arg Phe Gly Pro Arg Pro Val Arg Leu Val Gly Ser Ala 100 105 110 Cys Phe Thr Ala Ser Cys Thr Leu Met Ala Leu Ala Ser Arg Asp Val 115 120 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335 Gln Glu His Glu Thr Asn Glu Gln Gln Gln Lys Val Ala Glu Thr Val 340 345 350 Gly Phe Tyr Ser Ser Val Phe Gly Ala Met Gln Leu Leu Cys Leu Leu 355 360 365 Thr Cys Pro Leu Ile Gly Tyr Ile Met Asp Trp Arg Ile Lys Asp Cys 370 375 380 Val Asp Ala Pro Thr Gln Gly Thr Val Leu Gly Asp Ala Arg Asp Gly 385 390 395 400 Val Ala Thr Lys Ser Ile Arg Pro Arg Tyr Cys Lys Ile Gln Lys Leu 405 410 415 Thr Asn Ala Ile Ser Ala Phe Thr Leu Thr Asn Leu Leu Leu Val Gly 420 425 430 Phe Gly Ile Thr Cys Leu Ile Asn Asn Leu His Leu Gln Phe Val Thr 435 440 445 Phe Val Leu His Thr Ile Val Arg Gly Phe Phe His Ser Ala Cys Gly 450 455 460 Ser Leu Tyr Ala Ala Val Phe Pro Ser Asn His Phe Gly Thr Leu Thr 465 470 475 480 Gly Leu Gln Ser Leu Ile Ser Ala Val Phe Ala Leu Leu Gln Gln Pro 485 490 495 Leu Phe Met Ala Met Val Gly Pro Leu Lys Gly Glu Pro Phe Trp Val 500 505 510 Asn Leu Gly Leu Leu Leu Phe Ser Leu Leu Gly Phe Leu Leu Pro Ser 515 520 525 Tyr Leu Phe Tyr Tyr Arg Ala Arg Leu Gln Gln Glu Tyr Ala Ala Asn 530 535 540 Gly Met Gly Pro Leu Lys Val Leu Ser Gly Ser Glu Val Thr Ala 545 550 555 <210> 3 <211> 2519 <212> DNA <213> mouse <220> <221> CDS <222> (257)..(1948) <400> 3 ggcttcacct atctgtggcg ccaggacggt tcccagatcc actgcttctt tcgagggcgc 60 agacgaggtg agaccggcgg ttccgaggcc cgctgggtct ggcacgcagg gaagacaccc 120 cgcgtggatg cgatttggaa ttgggatcct gggtctcagg agatccggag tgtggaagcg 180 ccggggagac tctgtgttac tccgggtgtc aacagctgcg ggaggcaagt ttgtcgggga 240 cagagtctcg gccacc atg gct ccc acg ctg aag cag gcg tac cgc agg 289 Met Ala Pro Thr Leu Lys Gln Ala Tyr Arg Arg 1 5 10 cgc tgg tgg atg gct tgc acc gct gtg gtg gag aac ctc ttc ttc tcc 337 Arg Trp Trp Met Ala Cys Thr Ala Val Val Glu Asn Leu Phe Phe Ser 15 20 25 gcg gtg ctc ctg ggc tgg gcc tcc ctg ctg atc atg ctc aag aag gaa 385 Ala Val Leu Leu Gly Trp Ala Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Lys Glu 30 35 40 ggc ttc tat tcc agc ctg tgc cca gct gag aac agg acc aat acc acc 433 Gly Phe Tyr Ser Ser Leu Cys Pro Ala Glu Asn Arg Thr Asn Thr Thr 45 50 55 caa gat gaa cag cat cag tgg aca agc tgt gac cag cag gaa aag atg 481 Gln Asp Glu Gln His Gln Trp Thr Ser Cys Asp Gln Gln Glu Lys Met 60 65 70 75 ctc aac ctg ggt ttc acc att ggc tcc ttc ctg ctg agt gct acc aca 529 Leu Asn Leu Gly Phe Thr Ile Gly Ser Phe Leu Leu Ser Ala Thr Thr 80 85 90 ctg cct ctg gga att ctc atg gac cgc ttt ggg ccc agg cct ctt cga 577 Leu Pro Leu Gly Ile Leu Met Asp Arg Phe Gly Pro Arg Pro Leu Arg 95 100 105 ctg gtg ggc agt gcc tgc ttt gcc gca tcc tgc act cta atg gcc ttg 625 Leu Val Gly Ser Ala Cys Phe Ala Ala Ser Cys Thr Leu Met Ala Leu 110 115 120 gcc tcc agg gac act gaa gtt ttg tct cca ttg ata ttc ctg gca ctg 673 Ala Ser Arg Asp Thr Glu Val Leu Ser Pro Leu Ile Phe Leu Ala Leu 125 130 135 tcc ttg aat gga ttt gct ggc atc tgc tta acg ttt acc tca ctc acg 721 Ser Leu Asn Gly Phe Ala Gly Ile Cys Leu Thr Phe Thr Ser Leu Thr 140 145 150 155 ctg ccc aac atg ttt ggg aat ttg cga tcc act ttc atg gcc ctc atg 769 Leu Pro Asn Met Phe Gly Asn Leu Arg Ser Thr Phe Met Ala Leu Met 160 165 170 att ggc tcc tat gcg tct tct gcc atc acg ttc cct gga atc aag ctg 817 Ile Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Ile Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu 175 180 185 atc tac gat gcc gga gtc ccc ttc act gtc atc atg ttc aca tgg tct 865 Ile Tyr Asp Ala Gly Val Pro Phe Thr Val Ile Met Phe Thr Trp Ser 190 195 200 ggc ctg gcc tgt ctc atc ttt ttg aac tgt gct ctc aac tgg cct gca 913 Gly Leu Ala Cys Leu Ile Phe Leu Asn Cys Ala Leu Asn Trp Pro Ala 205 210 215 gaa gcc ttt cct gcc cct gag gaa gtt gac tac acg aag aag atc aaa 961 Glu Ala Phe Pro Ala Pro Glu Glu Val Asp Tyr Thr Lys Lys Ile Lys 220 225 230 235 ctc att ggg tta gcc ttg gac cac aag gtc aca ggt gac cgc ttc tac 1009 Leu Ile Gly Leu Ala Leu Asp His Lys Val Thr Gly Asp Arg Phe Tyr 240 245 250 acc cat gta acc att gtg ggt cag cgg ctg agt cag aag tcc ccc agc 1057 Thr His Val Thr Ile Val Gly Gln Arg Leu Ser Gln Lys Ser Pro Ser 255 260 265 ctg gag gag ggc gct gac gcc ttt att tca tcc ccg gat atc cct ggt 1105 Leu Glu Glu Gly Ala Asp Ala Phe Ile Ser Ser Pro Asp Ile Pro Gly 270 275 280 acc tca gag gag act cct gaa aag tct gtc cct ttt cgc aag agc ctc 1153 Thr Ser Glu Glu Thr Pro Glu Lys Ser Val Pro Phe Arg Lys Ser Leu 285 290 295 tgc tcc ccc att ttc ctg tgg agc ctt gtc acc atg ggc atg acc cag 1201 Cys Ser Pro Ile Phe Leu Trp Ser Leu Val Thr Met Gly Met Thr Gln 300 305 310 315 ctt cgg gtc atc ttc tat atg ggt gct atg aac aag atc ctg gag ttc 1249 Leu Arg Val Ile Phe Tyr Met Gly Ala Met Asn Lys Ile Leu Glu Phe 320 325 330 att gtg act ggt ggc aag gaa cgt gag aca aat gag cag aga cag aag 1297 Ile Val Thr Gly Gly Lys Glu Arg Glu Thr Asn Glu Gln Arg Gln Lys 335 340 345 gtg gag gag aca gtt gag ttc tac tct tcc atc ttt gga gtc atg cag 1345 Val Glu Glu Thr Val Glu Phe Tyr Ser Ser Ile Phe Gly Val Met Gln 350 355 360 ctg ttg tgt ctt ctc acc tgc ccc ctc att ggc tac atc atg gac tgg 1393 Leu Leu Cys Leu Leu Thr Cys Pro Leu Ile Gly Tyr Ile Met Asp Trp 365 370 375 cgc atc aag gac tgt gtg gat gct cca acg gag ggc acc ctg aat gag 1441 Arg Ile Lys Asp Cys Val Asp Ala Pro Thr Glu Gly Thr Leu Asn Glu 380 385 390 395 aat gct tcc ttt gga gat gcc aga gat ggg gct agc acc aag ttc act 1489 Asn Ala Ser Phe Gly Asp Ala Arg Asp Gly Ala Ser Thr Lys Phe Thr 400 405 410 aga cca cgc tac cgc aag gta caa aag ctc acc aat gcc atc aat gcc 1537 Arg Pro Arg Tyr Arg Lys Val Gln Lys Leu Thr Asn Ala Ile Asn Ala 415 420 425 ttc acc ctg acc aac atc ctg ctt gtg ggt ttc ggc atc gcc tgc ctc 1585 Phe Thr Leu Thr Asn Ile Leu Leu Val Gly Phe Gly Ile Ala Cys Leu 430 435 440 atc aag aac tta cac ctg cag ttg ctg gcc ttt gtc ctg cat acc ata 1633 Ile Lys Asn Leu His Leu Gln Leu Leu Ala Phe Val Leu His Thr Ile 445 450 455 gtt cgc ggt ttc ttc cac tca gcc tgt gga ggt ctc tac gct gct gtg 1681 Val Arg Gly Phe Phe His Ser Ala Cys Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Val 460 465 470 475 ttc ccg tcc aat cat ttt ggg aca ctg aca ggt ctt cag tct ctc atc 1729 Phe Pro Ser Asn His Phe Gly Thr Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu Ile 480 485 490 agt gcc gtg ttt gct ctg ctg caa cag cta ctc ttc atg gcc atg gtg 1777 Ser Ala Val Phe Ala Leu Leu Gln Gln Leu Leu Phe Met Ala Met Val 495 500 505 gga ccc ctg cat gga gat ccc ttc tgg gtg aac ctg ggc ctc cta ctt 1825 Gly Pro Leu His Gly Asp Pro Phe Trp Val Asn Leu Gly Leu Leu Leu 510 515 520 ctc tcg ttc ctg gga ttt ctc cta cct tcc tac ctc tac tac tac cgg 1873 Leu Ser Phe Leu Gly Phe Leu Leu Pro Ser Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Arg 525 530 535 tct cgc ctg cag aga gag tat gcc acc aat ttg gta gac cca cag aag 1921 Ser Arg Leu Gln Arg Glu Tyr Ala Thr Asn Leu Val Asp Pro Gln Lys 540 545 550 555 gtg ctc aat act tcg aag gtg gct aca ta gactcctgag gccaagagac 1970 Val Leu Asn Thr Ser Lys Val Ala Thr 560 ttggaggaca ggcagtcaag gcctgataaa ccgaagggaa tggcctgtgg ctttctacct 2030 gcatcgtgtt catagagccg ggttctgtgg atttataaat actaagagtt ctatttttgt 2090 agggacttgc aaaaaaggaa acaaacagaa caaaaccccc aaaccaaaaa cagcccttaa 2150 aaaactcccc ccaaccaagc tatccatcaa ctgaagacag tgcccgttcc agtggtattg 2210 ggccatcgtc tttgaaaaga aagtgtgggg ctgccctttc tccacacttg gcctaggagc 2270 ctctgtggag ttgccttctg aaaactcatg ggatcagtga acagaccaca ctaagattcc 2330 agccgccaag tgtgcacaca tatatgttac gcacatgcat attgcatcct ttcctgcagg 2390 agaaggactg aggggctggc tgtatccagg atggggtgtg ggggctggag ggcgggttcc 2450 ctccctgatg ctgtttctta caggtcttag aggaaataaa aagggaaatg aaaaaaaaaa 2510 aaaaaaaaa 2519 <210> 4 <211> 564 <212> PRT <213> mouse <400> 4 Met Ala Pro Thr Leu Lys Gln Ala Tyr Arg Arg Arg Trp Trp Met Ala 1 5 10 15 Cys Thr Ala Val Val Glu Asn Leu Phe Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly 20 25 30 Trp Ala Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Lys Glu Gly Phe Tyr Ser Ser 35 40 45 Leu Cys Pro Ala Glu Asn Arg Thr Asn Thr Thr Gln Asp Glu Gln His 50 55 60 Gln Trp Thr Ser Cys Asp Gln Gln Glu Lys Met Leu Asn Leu Gly Phe 65 70 75 80 Thr Ile Gly Ser Phe Leu Leu Ser Ala Thr Thr Leu Pro Leu Gly Ile 85 90 95 Leu Met Asp Arg Phe Gly Pro Arg Pro Leu Arg Leu Val Gly Ser Ala 100 105 110 Cys Phe Ala Ala Ser Cys Thr Leu Met Ala Leu Ala Ser Arg Asp Thr 115 120 125 Glu Val Leu Ser Pro Leu Ile Phe Leu Ala Leu Ser Leu Asn Gly Phe 130 135 140 Ala Gly Ile Cys Leu Thr Phe Thr Ser 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tttattagac ttctttttta taaagcaata aatccatttt cctccgggta 3230 agggatgccc cttctggcat atcaaaaaaa aaaaaaaaaa a 3271 <210> 6 <211> 573 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Met Ala Pro Thr Leu Ala Thr Ala His Arg Arg Arg Trp Trp Met Ala 1 5 10 15 Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Leu Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly 20 25 30 Trp Gly Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Ser Glu Gly Phe Tyr Ser Tyr 35 40 45 Leu Cys Thr Glu Pro Glu Asn Val Thr Asn Gly Thr Val Gly Gly Thr 50 55 60 Ala Glu Pro Gly His Glu Glu Val Ser Trp Met Asn Gly Trp Leu Ser 65 70 75 80 Cys Gln Ala Gln Asp Glu Met Leu Asn Leu Ala Phe Thr Val Gly Ser 85 90 95 Phe Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Pro Leu Gly Ile Val Met Asp Lys 100 105 110 Tyr Gly Pro Arg Lys Leu Arg Leu Leu Gly Ser Ala Cys Phe Ala Val 115 120 125 Ser Cys Leu Leu Ile Ala Tyr Gly Ala Ser Lys Pro Asn Ala Leu Ser 130 135 140 Val Leu Ile Phe Ile Ala Leu Ala Leu Asn Gly Phe Gly Gly Met Cys 145 150 155 160 Met Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu Pro Asn Met Phe Gly Asp Leu Arg 165 170 175 Ser Thr 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2440 gaaagcctga gaagaagccc cccctgtctc aggctgggga aggagtggag ggcagactat 2500 ttacacaaag cctcaagagc cctgggccag gcttcttcct ccggagccag agcagtgtct 2560 ctctgctggc acgctttgtt ccagtctgca acctgaaggg aactaagggg acaccacaag 2620 ggcaccctcc catccaccca cagctgtttt tctggggtgg aaataaggct gtgactagac 2680 atgaggagcc aagcctaaat agggaagagg attagtgagt aacccgaggg gtgtgtgttt 2740 atgtggtacg tgtgtgtgca tgtgtgtata tggtaggagg ctagccccag gggctgcttt 2800 tatcagagtg gaccagacca gaagccagcc agccctacag caggctcaaa ataggagtca 2860 gccttgcttt atgatgggga cctgtgtgta tcggtgtgat cacagtgccc cctgctggca 2920 gactcacatc aggggactgg aacggttcat gtagtagaag cctagccggc ctgcctggct 2980 cactaaccca ccttgccttg acaaccccta gaaaccctgc ctgagacctc ttggggtgcc 3040 aagaggggta cattggtttt taagtttatg gttttctctt gttttatcat gattcttttt 3100 atgaagcaat aaatccattt ccctgttggt aatggatgcc cctcctcacg tatcagctaa 3160 ttactgtatg tgcctatttt atatttgaga ggagagacag ggcaaaaggg tctgccagga 3220 aaaaaaaaaa aaaaaa 3236 <210> 8 <211> 568 <212> PRT <213> mouse <400> 8 Met Ala Pro Thr Leu Ala Thr Ala His Arg Arg Arg Trp Trp Met Ala 1 5 10 15 Cys Thr Ala Val Leu Glu Asn Leu Leu Phe Ser Ala Val Leu Leu Gly 20 25 30 Trp Gly Ser Leu Leu Ile Met Leu Lys Ser Glu Gly Phe Tyr Ser Tyr 35 40 45 Leu Cys Thr Lys Pro Glu Asn Val Thr Asn Ser Thr Val Gly Gly Ser 50 55 60 Ala Glu Pro Glu Pro Glu Glu Leu Ser Leu Val Asn Gly Trp Leu Ser 65 70 75 80 Cys Lys Ala Gln Asp Glu Ile Leu Asn Leu Ala Phe Thr Val Gly Ser 85 90 95 Phe Leu Leu Ser Ala Ile Thr Leu Pro Leu Gly Ile Ile Met Asp Lys 100 105 110 Tyr Gly Pro Arg Lys Leu Arg Leu Leu Gly Ser Ala Cys Phe Ala Val 115 120 125 Ser Cys Leu Leu Ile Ala Tyr Gly Ala Ser Asn Pro Asp Ser Leu Ser 130 135 140 Val Leu Ile Phe Ile Ala Leu Ala Leu Asn Gly Phe Gly Gly Met Cys 145 150 155 160 Met Thr Phe Thr Ser Leu Thr Leu Pro Asn Met Phe Gly Asp Leu Arg 165 170 175 Ser Thr Phe Ile Ala Leu Met Ile Gly Ser Tyr Ala Ser Ser Ala Val 180 185 190 Thr Phe Pro Gly Ile Lys Leu Ile Tyr Asp Ala Gly Ala Ser Phe Ile 195 200 205 Gly Ile Leu Val Val Trp Ala Gly Cys Ser Gly Leu Val Phe Phe Asn 210 215 220 Cys Phe Phe Asn Trp Pro Leu Glu Pro Phe Pro Gly Ser Glu Asp Met 225 230 235 240 Asp Tyr Ser Val Lys Ile Lys Phe Ser Trp Leu Gly Phe Asp His Lys 245 250 255 Ile Thr Gly Lys Gln Phe Tyr Lys Gln Val Thr Thr Val Gly Arg Arg 260 265 270 Leu Ser Val Gly Ser Ser Met Arg Thr Ala Lys Glu Gln Ala Ala Leu 275 280 285 Gln Glu Gly His Lys Leu Cys Leu Ser Thr Val Asp Leu Glu Val Lys 290 295 300 Cys Gln Pro Asp Ala Ala Ala Ala Pro Ser Phe Met His Ser Val Phe 305 310 315 320 Ser Pro Leu Leu Val Leu Ser Leu Val Thr Met Cys Val Thr Gln Leu 325 330 335 Arg Leu Ile Phe Tyr Met Gly Ala Met Asn Ser Ile Leu Glu Phe Leu 340 345 350 Val Arg Gly Asp Gln Lys Thr Val Ala Leu Tyr Thr Ser Ile Phe Gly 355 360 365 Ala Leu Gln Leu Leu Cys Leu Leu Thr Ala Pro Val Ile Gly Tyr Ile 370 375 380 Met Asp Trp Lys Leu Lys Glu Cys Glu Asp Thr Ser Glu Glu Pro Glu 385 390 395 400 Glu Glu Glu Gly Thr Gln Gly Glu Lys Lys Gln Lys Arg Asp Arg Gln 405 410 415 Ile Gln Lys Val Thr Asn Ala Met Arg Ala Phe Ala Phe Thr Asn Val 420 425 430 Leu Leu Val Gly Phe Gly Val Thr Cys Leu Ile Pro Asn Leu Pro Leu 435 440 445 Gln Ile Phe Ser Phe Val Leu His Thr Ile Val Arg Gly Phe Ile His 450 455 460 Ser Ala Val Gly Gly Leu Tyr Ala Ala Val Tyr Pro Ser Thr Gln Phe 465 470 475 480 Gly Ser Leu Thr Gly Leu Gln Ser Leu Val Ser Ala Leu Phe Ala Leu 485 490 495 Leu Gln Gln Pro Leu Tyr Leu Ala Met Met Gly Pro Leu Gly Gly Asp 500 505 510 Pro Leu Trp Val Asn Val Gly Leu Leu Ala Met Ser Met Leu Gly Phe 515 520 525 Cys Leu Pro Leu Tyr Leu Ile Cys Tyr Arg Arg Gln Leu Glu Arg Gln 530 535 540 Leu Gln Gln Lys Arg Glu Asp Ser Lys Leu Phe Leu Lys Ile Asn Gly 545 550 555 560 Ser Ser Asn Arg Glu Ala Phe Val 565

Claims

이하의 (A) 내지 (H)로부터 선택되는 단백질로서, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질.

(A) 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열로 되는 단백질.

(B) 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열로 되는 단백질.

(C) 서열번호 6으로 나타낸 아미노산 서열로 되는 단백질.

(D) 서열번호 8로 나타낸 아미노산 서열로 되는 단백질.

(E) 서열번호 2로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 되는 단백질.

(F) 서열번호 4로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 되는 단백질.

(G) 서열번호 6으로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 되는 단백질.

(H) 서열번호 8로 나타낸 아미노산 서열에서 1 또는 몇 개의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 되는 단백질.
제 1 항에 있어서, 인간 또는 마우스 유래인 단백질.
제 1 항에 있어서, 장기, 조직, 또는 배양세포 유래인 단백질.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항의 단백질을 코딩하는 유전자.
이하의 (a) 내지 (h)로부터 선택되는 DNA로서, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질을 코딩하는 DNA로 되는 유전자.

(a) 서열번호 1로 나타낸 염기서열로 되는 DNA.

(b) 서열번호 3으로 나타낸 염기서열로 되는 DNA.

(c) 서열번호 5로 나타낸 염기서열로 되는 DNA.

(d) 서열번호 7로 나타낸 염기서열로 되는 DNA.

(e) 서열번호 1로 나타낸 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.

(f) 서열번호 3으로 나타낸 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.

(g) 서열번호 5로 나타낸 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.

(h) 서열번호 7로 나타낸 염기서열로 되는 DNA와 스트린젠트인 조건하에서 하이브리다이즈하는 DNA.
제 5 항에 있어서, 인간 또는 마우스 유래인 유전자.
제 5 항에 있어서, 장기, 조직, 또는 배양세포 유래인 유전자.
제 4 항 내지 제 7 항의 어느 한 항의 유전자 또는 당해 유전자 중의 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 플라스미드.
제 8 항에 있어서, 발현 플라스미드.
제 8 항 또는 제 9 항의 플라스미드로 형질전환된 숙주 세포.
서열번호 1, 3, 5 또는 7로 나타낸 염기서열 중의 연속하는 14 염기 이상의 부분 서열 또는 그 상보적인 서열을 포함하는 뉴클레오티드.
제 11 항에 있어서, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질을 코딩하는 유전자를 검출하기 위한 프로브로서 사용되는 뉴클레오티드.
제 11 항에 있어서, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 변조시키기 위하여 사용되는 뉴클레오티드.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항의 단백질에 대한 항체.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항의 단백질을 이용하여, 당해 단백질이 갖는, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력에 대한 피검물질의 기질 또는 저해 물질로서의 작용을 검출하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항의 단백질, 그 특이 항체, 그 기능 촉진 물질 또는 기능 억제 물질을 이용하여, 당해 단백질이 갖는, 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 변조시키는 것에 의해, 정상세포 또는 종양세포의 증식을 제어하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항의 단백질, 그 특이 항체, 그 기능 촉진 물질 또는 기능 억제 물질을 이용하여, 당해 단백질이 갖는, 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 변조시키는 것에 의해, 당해 단백질에 의해 수송되는 약물, 독물, 또는 외래성 이물의 체내 동태를 변경하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항의 단백질, 그 특이 항체, 그 기능 촉진 물질 또는 기능 억제 물질을 이용하여, 당해 단백질을 특정의 세포에 과잉 발현시키거나, 또는 이미 세포에 존재하는 당해 단백질이 갖는 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 변조시키는 것에 의해, 당해 단백질에 의해 수송되는 분지쇄 중성 아미노산의 체내 동태 또는 생체내 대사를 변경하는 방법.
제 13 항의 뉴클레오티드를 이용하여, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질의 발현을 변조시키는 것에 의해, 정상세포 또는 종양세포의 증식을 제어하는 방법.
제 13 항의 뉴클레오티드를 이용하여, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질의 발현을 변조시키는 것에 의해, 당해 단백질에 의해 수송되는 약물, 독물, 또는 외래성 이물의 체내 동태를 변경하는 방법.
제 13 항의 뉴클레오티드를 이용하여, 나트륨 비의존적으로 분지쇄 중성 아미노산 및 그 유사 물질을 수송하는 능력을 단일 분자로 발휘하는 단백질의 발현을 변조시키는 것에 의해, 당해 단백질에 의해 수송되는 분지쇄 중성 아미노산의 체내 동태 또는 생체내 대사를 변경하는 방법.
제 1 항 내지 제 3 항의 어느 한 항의 단백질에 대한 특이 항체, 또는 제 11 항 및 제 12 항의 뉴클레오티드를 이용하여 종양세포와 정상세포를 구별하는 방법.