JP5281039B2 - 単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸トランスポーター - Google Patents
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Description
中性アミノ酸輸送系Lは、もともとは、アミノ酸類似化合物2-Aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid (BCH)によって特異的に抑制されるアミノ酸輸送系として、腫瘍細胞株で始めて記載され、その後、培養細胞、膜小胞標本、摘出臓器標本もしくはin vivo標本を用いて検討されてきた [クリステンセン(Christensen)著、フィジオロジカル・レビュー(Physiological reviews)、1990年、第70巻、第1号、p.43−77]。中性アミノ酸輸送系Lは、ナトリウム非依存的な、すなわちその機能にナトリウムイオンを必要としないトランスポーターである。その輸送基質選択性や輸送特性は、細胞や組織により差異があることが知られていた。
しかし、従来の方法では、中性アミノ酸及びその類似物質の輸送の詳細や、細胞の生存もしくは増殖に対する中性アミノ酸輸送系Lの役割を解析することは困難であり、中性アミノ酸輸送系Lの機能を担う中性アミノ酸トランスポーターの遺伝子を単離して詳細な機能解析を可能とすることが望まれていた。
トランスポーター自体ではないが、アミノ酸トランスポーターの活性化因子であると考えられている膜貫通構造を1回しか持たない二型膜糖タンパク質であるrBAT及び4F2hcのcDNAがクローニングされており、それらをアフリカツメガエル卵母細胞に発現させると中性アミノ酸とともに塩基性アミノ酸の取り込みを活性化することが知られている[パラシン(Palacin)著、ザ・ジャーナル・オブ・エクスペリメンタル・バイオロジー(The Journal of experimental biology)、1994年、第196巻、p.123−137]。
既知の輸送系LトランスポーターLAT1及びLAT2は、SLC7ファミリーに属するヘテロ二量体型タンパク質であり、1回膜貫通型タンパク質である4F2hcと連結することにより機能性のトランスポーターを形成する。すでに公開されたマウスゲノム及びヒトゲノムデータベースにおいて、SLC7ファミリーの機能未同定のメンバーを探索したが、そのなかにはさらなる輸送系Lに相当する新規トランスポーターは見い出されなかった。従って、未同定の新たな輸送系Lトランスポーターは、SLC7ファミリー以外のタンパク質である可能性が想定されていた。
さらに、中性アミノ酸トランスポーターLAT1の類似蛋白質として、中性アミノ酸及び塩基性アミノ酸を輸送する輸送系y+Lの機能を有するy+LAT1とy+LAT2がクローニングされた[トレンツ(Torrents)その他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of biological chemistry)、1998年、第273巻、第49号、p.32437−32445]。また、y+LAT1、y+LAT2共に補助因子4F2hcと共存することによってのみ機能することが示された。y+LAT1とy+LAT2は、中性アミノ酸としてはグルタミン、ロイシン、イソロイシンを主に輸送し、中性アミノ酸に対する基質選択性は狭い。
さらに、芳香族アミノ酸を輸送する中性アミノ酸トランスポーターとして、輸送系Tに相当するアミノ酸トランスポーターTAT1[キムその他著、ザ・ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミストリー(The Journal of biological chemistry)、2001年、第276巻、第20号、p.17221−17228]がクローニングされている。TAT1は、トリプトファン、チロシン、フェニルアラニン等の芳香族アミノ酸をNa+非依存的に輸送するが、ロイシン、イソロイシン、バリン等の分枝アミノ酸は受け入れず、輸送系L特異的な抑制薬BCHによって抑制されず、アミノ酸輸送系Lとは異なっている。
(A)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(B)配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(C)配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(D)配列番号8で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質。
(E)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
(F)配列番号4で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
(G)配列番号6で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
(H)配列番号8で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。
(a)配列番号1で示される塩基配列からなるDNA。
(b)配列番号3で示される塩基配列からなるDNA。
(c)配列番号5で示される塩基配列からなるDNA。
(d)配列番号7で示される塩基配列からなるDNA。
(e)配列番号1で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(f)配列番号3で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(g)配列番号5で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
(h)配列番号7で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。
配列番号4で示されるアミノ酸配列は、マウス唾液腺由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(マウスLAT3)のアミノ酸配列(564アミノ酸)を表す。そして、該トランスポーターをコードするcDNAの塩基配列は配列番号3に示される。
配列番号6で示されるアミノ酸配列は、ヒト胎児脳由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(ヒトLAT4)のアミノ酸配列(573アミノ酸)を表す。そして、該トランスポーターをコードするcDNAの塩基配列は配列番号5に示される。
配列番号8で示されるアミノ酸配列は、マウス腎由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(マウスLAT4)のアミノ酸配列(568アミノ酸)を表す。そして、該トランスポーターをコードするcDNAの塩基配列は配列番号7に示される。
本発明のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターLAT3を介する中性アミノ酸の輸送は、分枝鎖アミノ酸アルコール及びフェニルアラニノールによって強く抑制される。また、LAT3を介する中性アミノ酸の輸送は、N−エチルマレイミドによって抑制される。
また、本発明のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターLAT4は、ヒト体内においては胎盤、腎臓、骨格筋、脳、心臓、脾臓、肺、白血球、小腸において強く発現し、肝臓及び胸腺に弱く発現している。
すなわち、本発明は、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子もしくは該遺伝子の中のタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミド、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列において連続する14塩基以上の部分配列もしくはその相補配列を含むヌクレオチド、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターに対する抗体を提供する。
本発明は、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーターを用いて、該タンパク質の有するナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力に対する被検物質の基質あるいは阻害物質としての作用を検出する方法を提供する。
さらに本発明は、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター、その特異抗体、その機能促進物質もしくは機能抑制物質、又は該トランスポーターをコードする遺伝子のアンチセンスヌクレオチドを用いて、該タンパク質の有する分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を変調させることにより、正常細胞もしくは腫瘍細胞の増殖を制御し、該タンパク質によって輸送される薬物、毒物、もしくは外来性異物体内動態を変更し、又は該タンパク質によって輸送される分枝鎖中性アミノ酸の体内動態もしくは生体内代謝を変更する方法を提供する。
配列番号2で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒト肝細胞癌細胞株FLC4由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(ヒトLAT3)である。
配列番号4で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、マウス唾液腺由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(マウスLAT3)である。
配列番号6で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、ヒト胎児脳由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(ヒトLAT4)である。
配列番号8で示されるアミノ酸配列を有するタンパク質は、マウス腎由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(マウスLAT4)である。
配列番号1で示される塩基配列は、ヒト肝細胞癌細胞株FLC4由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(ヒトLAT3)の遺伝子の全長cDNA塩基配列(約2.5kbp)を表す。
配列番号2で示される塩基配列は、マウス唾液腺由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(マウスLAT3)の遺伝子の全長cDNA塩基配列(約2.5kbp)を表す。
配列番号3で示される塩基配列は、ヒト胎児脳由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(ヒトLAT4)の遺伝子の全長cDNA塩基配列(約3.3kbp)を表す。
配列番号4で示される塩基配列は、マウス腎由来のナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するアミノ酸トランスポーター(マウスLAT4)の遺伝子の全長cDNA塩基配列(約3.2kbp)を表す。
例えば、ヒト肝細胞癌細胞株FLC4を遺伝子源として用い、これからmRNA(ポリ(A)+RNA)を調製する。これをサイズ分画し、各画分についてアフリカツメガエル卵母細胞に導入する。
mRNAを導入した卵母細胞について、例えば、ロイシンなどを基質として、細胞内への基質の輸送(取り込み)を測定し、高い取り込み活性を示したmRNA画分を選択することにより、LAT3のmRNAを濃縮できる。この濃縮されたmRNAをもとにcDNAライブラリーを作製する。ライブラリーのcDNAから、約500クローンを一グループとして、cRNA(キャップ化されたもの)を調整し、各々のグループについて、卵母細胞に導入し、基質の取り込み活性を指標として、陽性グループを選択する。陽性グループが見い出せたら、それをさらにサブグループに分け、同様の操作を繰り返すことにより、LAT3遺伝子のcDNAを含むクローンを得ることができる。
例えば、ヒト胎児脳あるいはマウス腎を遺伝子源として用い、そのmRNA(ポリ(A)+RNA)を用いて、cDNAライブライーを作製する。EST(expressed sequence tag)データベースの検索によって得られるLAT3類似配列(例えば、GenBankTM/EBI/DDBJ accession No.AW162917)に相当するプローブを用いてcDNAライブラリーをスクリーニングすることによってLAT4遺伝子のcDNAを含むクローンを得ることができる。
得られたcDNAについては、常法により塩基配列を決定し、翻訳領域を解析して、これにコードされるタンパク質、すなわち、LAT3あるいはLAT4のアミノ酸配列を決定することができる。
また、発現細胞について、同様の取り込み実験を応用して、LAT3あるいはLAT4の特性、例えば、LAT3がアミノ酸の促通拡散型の輸送を行っているという特性や、LAT3あるいはLAT4の基質選択性、pH依存性などを調べることができる。
また、開示された本発明の遺伝子の塩基配列(配列番号1、3、5又は7に示された塩基配列、もしくはその一部)の情報に基づいて設計された合成プライマーを用い、通常のPCR(Polymerase Chain Reaction)法によりcDNAライブラリー又はゲノミックDNAライブラリーから遺伝子を単離することができる。
cDNAライブラリー又はゲノミックDNAライブラリー等のDNAライブラリーは、例えば、「Molecular cloning」[Sambrook, J., Fritsh, E.F.及びManitis, T.著、Cold Spring Harbor Pressより1989に発刊]に記載の方法により調製することができる。あるいは、市販のライブラリーがある場合はこれを用いてもよい。
例えば、ポリペプチドを哺乳類細胞で発現させる場合には、単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターLAT3あるいはLAT4をコードするDNAを、適当な発現ベクター(例えば、アデノウイルス系ベクター、レトロウイルス系ベクター、パピローマウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、SV40系ベクター等)中の適当なプロモーター(例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーター、LTRプロモーター、エロンゲーション1aプロモーター等)の下流に挿入して発現ベクターを構築する。次に、得られた発現ベクターで適当な動物細胞を形質転換し、形質転換体を適当な培地で培養することによって、目的とするポリペプチドが生産される。宿主とする哺乳動物細胞としては、サルCOS−7細胞、チャイニーズハムスターCHO細胞、ヒトHeLa細胞、又はマウスS2細胞などの細胞株などが挙げられる。
本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターLAT3あるいはLAT4を抑制することにより、LAT3あるいはLAT4を発現する細胞膜や、LAT3あるいはLAT4が存在すると予想される部位の特定の化合物の透過を制限することができる。また、本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターLAT3あるいはLAT4、その遺伝子およびその発現細胞は、LAT3あるいはLAT4により輸送される化合物の、細胞膜通過や、LAT3あるいはLAT4が存在すると予想される部位の透過を制限する薬物(LAT3あるいはLAT4の特異的なインヒビター等)の開発に使用できる。
また、本発明の単一分子で機能する分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存トランスポーターLAT3あるいはLAT4、その遺伝子およびその発現細胞を用いて、腫瘍細胞などのLAT3あるいはLAT4を高レベルに発現する細胞の増殖を抑制する目的で使用する、LAT3あるいはLAT4の機能抑制薬や機能抑制作用を持つモノクロナル抗体を開発することができる。
なお、特願2003−062379明細書に記載された内容を、本明細書にすべて取り込む。
なお、下記実施例において、各操作は特に明示がない限り、「Molecular cloning」[Sambrook, J., Fritsh, E.F.及びManitis, T.著、Cold Spring Harbor Pressより1989に発刊]に記載の方法により行うか、または、市販の試薬やキットを用いる場合には市販品の指示書に従って使用した。
(1)ヒト肝細胞癌由来細胞株FLC4からの発現クローニング
金井らの方法(Kanai and Hediger、Nature、第360巻、467-471頁、1992年)に準じて、発現クローニング法により、以下のようにして行った。
ゲル電気泳動によりヒト肝細胞癌細胞株FLC4由来ポリ(A)+RNA400μgを分画した。
分画により得られた各画分を、アフリカツメガエル卵母細胞に注入し、3日間培養した。
RNA注入した卵母細胞について、基質としてロイシンを用い、基質の取り込み実験を金井らの方法(Kanai and Hediger、Nature、第360巻、467-471頁、1992年)に準じて、以下のように行った。基質として14C−L−ロイシン(100 μM)を含むNa+非含有取り込み用溶液[100mM塩化コリン、2mM塩化カリウム、1.8mM塩化カルシウム、1mM塩化マグネシウム、5mM HEPES、pH7.4]中にて30分卵母細胞を培養して、細胞内に取り込まれた放射能のカウントで基質の取り込み率を測定した。なお、この系において、ヒト肝細胞腫由来細胞株FLC4のポリ(A)+RNA(mRNA)を注入した卵母細胞は、対照として水を注入した卵母細胞に比し、ロイシンの取り込み亢進が見られた(図1)。
得られたcRNA(約50ng)を卵母細胞へ注入した。これら卵母細胞について、前記と同様にして、ロイシン取り込み実験を行うことにより陽性クローンのスクリーニングを行った。スクリーニングに際しては、複数のクローンから抽出したDNAをプールしたグループについて調べ、あるグループでロイシン取り込みが確認された場合、さらにそれを複数のグループに分割し、さらにスクリーニングを行った。
得られたクローン、すなわち、ヒト分枝鎖中性アミノ酸トランスポーターLAT3のcDNAを含むクローンについて、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法(Applied Biosystems社)により、cDNAの塩基配列を決定した。
これにより、ヒトLAT3遺伝子の塩基配列が得られた。また、cDNAの塩基配列を常法により解析して、cDNAの翻訳領域とそこにコードされるLAT3のアミノ酸配列を決定した。
この配列を、後記配列表の配列番号2に示した。
ヒトLAT3は、ヒト前立腺癌に高発現する機能未同定の配列として報告されたPOV1[コール(Cole)その他著、ゲノミクス(Genomics)、1998年、第51巻、第2号、p.282−287]と同一のアミノ酸配列を示した。
TopPred2アルゴリズム[Gunnar von Heijne, J. Mol. Biol. 225, 487-494 (1992)]により、LAT3のアミノ酸配列を解析した結果、図2に示したように、12個の膜貫通領域(membrane-spanning domain)が予想された。また、第1膜貫通部位と第2膜貫通部位の間の細胞外ループには糖付加部位、第6膜貫通部位と第7膜貫通部位の間の長い細胞内ループには、2つのプロテインキナーゼC依存性リン酸化部位及び1つのチロシンリン酸化部位、第8膜貫通部位と第9膜貫通部位の間の細胞内ループには、1つのプロテインキナーゼC依存性リン酸化部位と考えられる部位があった(図2)。
ヒトLAT3遺伝子の第1790−1936番目の塩基に相当するcDNA断片を32P−dCTPでラベルし、これをプローブとして用いて、ヒトの種々の組織から抽出したポリ(A)+RNAを含んだMultiple Tissue Northern Blots(Human、Clontech社製)に対して、ノーザンブハイブリダイゼーションを以下のようにして行った。このフィルター膜を42℃で、32P−dCTPでラベルしたLAT3cDNA断片を含んだハイブリダイゼーション液で1晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、65℃にて、0.1%SDSを含む0.1xSSCで洗浄した。
ノーザンブロッティングの結果(図3)、膵臓、肝臓、骨格筋、心臓、骨髄、及び胎児肝臓において強く発現し、腎臓、胎盤、肺、小腸、卵巣、精巣、前立腺、及び脾臓に弱く発現していることが示された。
ヒトLAT3の翻訳領域の塩基配列を用いたEST(expressed sequence tag)データベースの検索によって得られた、ヒトLAT3と類似のマウス唾液腺由来の塩基配列(GenBankTM/EBI/DDBJ accession No.BG865268)に相当するcDNAクローンをIMAGE(Integrated and Molecular Analysis of Genomes and their Expression)より購入し(IMAGE clone I.D.:4910149)、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法(Applied Biosystems社)により、cDNAの全長の塩基配列を決定した。また、cDNAの塩基配列を常法により解析して、cDNAの翻訳領域とそこにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定した。
この配列を、後記配列表の配列番号4に示した。
マウスLAT3とヒトLAT3のアミノ酸配列の比較を図2に示した。マウスLAT3とヒトLAT3のアミノ酸配列は、82%の相同性を有していた。
(1)ヒトLAT3のツメガエル卵母細胞への機能発現
ヒトLAT3のcDNAを含む発現プラスミドベクターpSPORT1を制限酵素NotIで切断し、T7RNAポリメラーゼを用いてcRNA(cDNAに相補的なRNA)を調製した。
ヒトLAT3遺伝子cRNA 25ngを卵母細胞に注入することによって発現させ、3日間培養した。
ロイシンの取り込み実験は、前記実施例1(1)記載方法に準じ、以下のように行った。すなわち、ヒトLAT3遺伝子cRNA、もしくは対照として水を注入した卵母細胞を、14C−L−ロイシン(100μM)を含むNa+非含有取り込み用溶液(実施例1(1)参照)中にて10分培養して、細胞内への放射能の取り込みを測定した。
その結果(図4)、対照として水を注入した卵母細胞に比べて、LAT3を発現させた卵母細胞においてロイシンのおおきな取り込みが得られた。すでに報告されている輸送系LトランスポーターLAT1及びLAT2は、その機能発現には1回膜貫通型補助因子4F2hcと共存することが要求されるが、LAT3は、4F2hcを必要とせず、単独で機能を発揮した。
ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において培地に添加する塩の影響を調べた。ロイシンの取り込み実験は、ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記実施例3(1)記載方法に準じて実施した。
取り込み用溶液は、ナトリウムイオンの影響をみる場合は、標準取り込み用溶液に代え、Na+非含有取り込み用溶液を用いた。塩素イオンの影響をみる場合は、標準取り込み用溶液にかえて、Cl−非含有取り込み用溶液(標準取り込み用溶液のCl−をグルコネートに代えたもの)を用いた。
その結果(図5)、細胞外のナトリウムをコリンに代えても、細胞外の塩素イオンをグルコネートに変えても、ロイシン取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、LAT3はナトリウムイオン及び塩素イオンに非依存的に働くトランスポーターであることが示された。
分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターLAT3の動力学試験を行った。基質ロイシンの濃度の違いによるロイシン取り込み率の変化を調べることにより、LAT3の動力学試験を行った。
ロイシンの取り込み実験は、ロイシン濃度1、3、10、30、60、100、200、400、1000、2000、3000μMにおいて、ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記実施例3(1)記載方法に準じて実施した。その結果(図6)、ロイシンの取り込みは濃度依存的な飽和性の取り込みを示し、トランスポーターを介する輸送であることが確認された。加えて、LAT3を介するロイシンの輸送は、高親和性成分と低親和性成分からなることが明らかになった(図6挿図)。
ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞によるロイシンの取り込み実験において、系への各種アミノ酸及びその類似物質添加の影響を調べた。
ロイシンの取り込み実験は、ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記実施例3(1)記載方法に準じて実施した。但し、Na+非含有取り込み用溶液を用い、10mMの各種化合物(非標識)の存在下及び非存在下で、14C−ロイシン(100μM)の取り込みを測定した。
その結果(図7)、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニンで、強いcis−阻害効果が観察された。酸性アミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性アミノ酸(リジン、アルギニン)及びプロリンは、LAT3を介する14C−ロイシンの取り込みに影響しなかった。
D−アミノ酸のうち、D−ロイシンにより、LAT3を介する14C−ロイシンの取り込みの比較的強い抑制効果が得られた(図8)。
輸送系特異的な抑制薬であるBCH(2-aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid)、AIB(α-aminoisobutyric acid)、MeAIB(α-(aminomethyl)isobutyric acid)の効果を調べたが、LAT3を介する14C−ロイシンの取り込みは、輸送系L特異的抑制薬BCHより強く抑制され、LAT3が輸送系Lトランスポーターであることが示された(図9)。
LAT3を介する14C−ロイシンの取り込みは、ロイシノールで強く抑制された(図10)。また、バリノール、フェニルアラニノールも比較的強い14C−ロイシンの取り込み抑制効果を示した(図10)。イソペンチラミン、1,3−ジメチル−n−ブチラミン、ロイシン-メチルエステル、N−アセチルロイシン、イソブチラミン、フェニルエチラミンも有意な抑制効果を示した(図10)。
LAT3を介する14C−ロイシンの取り込みに対する、各種アニオン性化合物の影響を検討した。その結果(図11)、オクラトキシンA、インドメタシンにより強い抑制効果が観察された。また、プロベネシド及びサリチル酸も弱いながら有意な抑制効果を示した。
各種アミノ酸及びその類似物質を基質として、LAT3による取り込みを調べた。
各種アミノ酸及びその類似物質の取り込み実験は、ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記実施例3(1)記載方法に準じて実施した。但し、基質としては、14C−ロイシンに変えて、放射能ラベルされた各種の化合物を用いた。
その結果(図12)、L−ロイシン(14C化合物)、L−イソロイシン(14C化合物)、L−バリン(14C化合物)、L−フェニルアラニン(14C化合物)を基質とした場合に、卵母細胞への大きな取り込みが認められた。また、L−メチオニン(14C化合物)、L−チロシン(14C化合物)、L−プロリン(14C化合物)を基質とした場合に、卵母細胞への小さいながら有意な取り込みが認められた。D−ロイシン(14C化合物)を基質とした場合にも、卵母細胞への有意な取り込みが認められた。オクラトキシンAは、LAT3を介する14C−ロイシンの取り込みを強力に抑制したが、オクラトキシンA(14C化合物)はLAT3により輸送されなかった。
ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験においてpHの影響を調べた。
ロイシンの取り込み実験は、ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記実施例3(1)記載方法に準じて実施した。
その結果、ロイシン取り込みには、pH7.0〜8.5で安定した値を示し、生理学的pHが、本トランスポーターの至適pHと考えられた(図13)。
ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞において、前負荷した14C−ロイシンのLAT3を介する放出を調べた。
ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞に100nlの400μM14C−ロイシン(2nCi)を注入し、氷冷のロイシンを含まないNa+非含有取り込み用溶液で洗浄した後、室温(18℃〜22℃)のロイシン(1mM)添加あるいは未添加のNa+非含有取り込み用溶液に移し、細胞外に放出される14C−ロイシンの量を測定した。また、対照としてヒトLAT3遺伝子cRNAの代わりに水を注入した卵母細胞にも同様に100nlの400μM14C−ロイシン(2nCi)を注入し、同様にして細胞外に放出される14C−ロイシンの量を測定した。
その結果、ヒトLAT3においては細胞外にロイシンを添加しない場合においても、14C−ロイシンの有意な放出が観察され、その放出は細胞外にロイシンを添加することによって僅かに上昇したものの、大きな変化はなかった(図14)。これに対して、対照としてヒトLAT3遺伝子cRNAの代わりに水を注入した卵母細胞においては、細胞外へのロイシン添加の有無にかかわらず、14C−ロイシンの有意な放出は観察されなかった(図14)。従って、LAT3は僅かな交換輸送モードを含む可能性を残しつつ、大方は促通拡散型輸送を媒介するトランスポーターであると結論された。
ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞において、14C−ロイシンの取り込みに対するN−エチルマレイミドの影響を検討した。
ヒトLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞、ヒトLAT3遺伝子cRNAと4F2hc遺伝子cRNAを注入した卵母細胞、もしくは対照として水を注入した卵母細胞を、14C−L−ロイシン(100μM)を含むNa+非含有取り込み用溶液(実施例3(2)参照)中にて10分培養して、実施例3(1)記載方法に準じて細胞内への放射能の取り込みを測定した。その際、5mMのN−エチルマレイミドの15分間前の処理、及び取り込み用溶液への5mMのN−エチルマレイミド含有の有無の、14C−L−ロイシン取り込み量への影響を検討した。
その結果、N−エチルマレイミド前処置により、LAT3による14C−L−ロイシンの取り込みは、ほぼ完全に抑制された(図15)。このN−エチルマレイミドの効果は、取り込み用溶液中でのN−エチルマレイミドの存在の有無によらなかった。これに対して、LAT1による14C−L−ロイシン取り込みは、N−エチルマレイミドにより影響を受けなかった(図15)。
常法に従い、ヒト前立腺癌及びヒト腎癌の外科手術摘出標本のパラフィン切片をアフィニティー精製抗LAT3抗血清(2μg/ml)で処理後、ジアミノベンチジンで発色した。また、染色の特異性を検討する目的で、200μg/mlの抗原ペプチドの存在下でアフィニティー精製抗LAT3抗血清(2μg/ml)で処理する実験も行った。
その結果、ヒト前立腺癌(図16A)及びヒト腎癌(図16C)では、腫瘍細胞に一致してLAT3の染色が見られた。この染色は、抗原ペプチドの存在下で抗LAT3抗体を作用させた場合には検出されず、染色の特異性が示された(図16B及びD)。
実施例2により得られたマウスLAT3のcDNAを、NotIで切断して、SP6RNAポリメラーゼを用いてcRNAを調製した。マウスLAT3遺伝子cRNAを卵母細胞に発現させ14C−ロイシンの取り込みを測定した。
マウスLAT3遺伝子cRNA25ngを卵母細胞に注入することによって発現させ3日間培養した。マウスLAT3遺伝子cRNAを注入した卵母細胞について、基質としてロイシンを用い、基質の取り込み実験を実施例3(1)に準じて行った。
その結果、ロイシンの取り込みは、ヒトLAT3と同様、マウスLAT3を発現させた卵母細胞では、対照として水を注入した卵母細胞に比べて大きなロイシンの取り込みが観察された。さらに、マウスLAT3もヒトLAT3と同様な基質選択性を示すことが示された。
(1)LAT4 cDNA の同定
ヒトLAT3の翻訳領域の塩基配列を用いたEST(expressed sequence tag)データベースの検索によって得られた、ヒトLAT3と類似のヒト胎児脳由来の塩基配列(GenBankTM/EBI/DDBJ accession No.AW162917)に相当するcDNAクローン(IMAGE clone I.D.:2783525)、及びヒトLAT3と類似のマウス腎由来の塩基配列(GenBankTM/EBI/DDBJ accession No.AW106550)に相当するcDNAクローン(IMAGE clone I.D.: 2235970)をIMAGE(Integrated and Molecular Analysis of Genomes and their Expression)より購入し、塩基配列決定のための合成プライマーを用いてダイターミネーターサイクルシーケンシング法(Applied Biosystems社)により、cDNAの全長の塩基配列を決定した。また、cDNAの塩基配列を常法により解析して、cDNAの翻訳領域とそこにコードされるタンパク質のアミノ酸配列を決定した。
このヒト配列を後記配列表の配列番号3に、マウス配列を後記配列表の配列番号4に示した。
ヒトLAT3とヒトLAT4のアミノ酸配列の比較を図17に示した。ヒトLAT3とヒトLAT4のアミノ酸配列は、58%の相同性を有していた。
ヒトLAT3とマウスLAT4のアミノ酸配列の比較を図18に示した。ヒトLAT3とマウスLAT4のアミノ酸配列は、90%の相同性を有していた。
ヒトLAT4遺伝子の第307−1012番目の塩基に相当するcDNA断片を32P−dCTPでラベルし、これをプローブとして用いて、ヒトの種々の組織から抽出したポリ(A)+RNAを含んだMultiple Tissue Northern Blots(Human、 Clontech社製)に対して、ノーザンブハイブリダイゼーションを以下のようにして行った。このフィルター膜を42℃で、32P−dCTPでラベルしたLAT4 cDNA断片を含んだハイブリダイゼーション液で1晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、65℃にて、0.1%SDSを含む0.1xSSCで洗浄した。
ノーザンブロッティングの結果(図24)、胎盤、腎臓、及び骨格筋において強く発現し、白血球、脳、心臓、脾臓、小腸、肺、及び大腸に弱く発現し、胸腺、及び肝臓にさらに弱く発現していることが示された。
マウスLAT4遺伝子の第122−525番目の塩基に相当するcDNA断片を32P−dCTPでラベルし、これをプローブとして用いて、マウスの種々の組織から抽出したRNAに対してノーザンブロッティングを以下のようにして行った。3μgのポリ(A)+RNAを1%アガロース/ホルムアルデヒドゲルで電気泳動したのち、ニトロセルロースフィルターにトランスファーした。このフィルターを42℃で、32P−dCTPでラベルしたマウスLAT4cDNA断片を含んだハイブリダイゼーション液で1晩ハイブリダイゼーションを行った。フィルターを、65℃にて、0.1%SDSを含む0.1xSSCで洗浄した。
ノーザンブロッティングの結果(図25)、腎臓、胎盤、脳、小腸において強く発現していることが示された。
(1)マウスLAT4のツメガエル卵母細胞への機能発現
マウスLAT4のcDNAを含む発現プラスミドベクターpcDNA3.1(+)を制限酵素XbaIで切断し、T7 RNAポリメラーゼを用いてcRNA(cDNAに相補的なRNA)を調製した。
マウスLAT4遺伝子cRNA 25ngを卵母細胞に注入することによって発現させ、3日間培養した。
ロイシンの取り込み実験は、前記実施例3(1)記載方法に準じ、以下のように行った。すなわち、マウスLAT4遺伝子cRNA、もしくは対照として水を注入した卵母細胞を、14C−L−ロイシン(100μM)を含むNa+非含有取り込み用溶液(実施例3(1)参照)中にて10分培養して、細胞内への放射能の取り込みを測定した。
その結果、対照として水を注入した卵母細胞に比べて、LAT4を発現させた卵母細胞においてロイシンのおおきな取り込みが得られた。LAT3と同様に、またすでに報告されている輸送系LトランスポーターLAT1及びLAT2と異なり、LAT4は、4F2hcを必要とせず、単独で機能を発揮した。
マウスLAT4cRNAを注入した卵母細胞によるロイシン取り込み実験において培地に添加する塩の影響を調べた。ロイシンの取り込み実験は、マウスLAT4遺伝子cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記実施例3(1)記載方法に準じて実施した。
取り込み用溶液は、ナトリウムイオンの影響をみる場合は、標準取り込み用溶液に代え、Na+非含有取り込み用溶液を用いた。塩素イオンの影響をみる場合は、標準取り込み用溶液にかえて、Cl−非含有取り込み用溶液(標準取り込み用溶液のCl−をグルコネートに代えたものを用いた。
その結果(図19)、細胞外のナトリウムをコリンに代えても、細胞外の塩素イオンをグルコネートに変えても、ロイシン取り込みに何ら影響を与えなかった。このことから、LAT4はナトリウムイオン及び塩素イオンに非依存的に働くトランスポーターであることが示された。
分枝鎖中性アミノ酸を選択的に輸送するナトリウム非依存性アミノ酸トランスポーターLAT4の動力学試験を行った。基質ロイシンの濃度の違いによるロイシン取り込み率の変化を調べることにより、LAT3の動力学試験を行った。
ロイシンの取り込み実験は、ロイシン濃度0.01、0.03、0.1、0.3、1、3、10mMにおいて、マウスLAT4 cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記実施例3(1)記載方法に準じて実施した。その結果、ロイシンの取り込みは濃度依存的な飽和性の取り込みを示し、トランスポーターを介する輸送であることが確認された。加えて、LAT4を介するロイシンの輸送は、LAT3を介するロイシンの輸送と同様、高親和性成分と低親和性成分からなることが明らかになった。
マウスLAT4遺伝子cRNAを注入した卵母細胞によるロイシンの取り込み実験において、系への各種アミノ酸及びその類似物質添加の影響を調べた。
ロイシンの取り込み実験は、マウスLAT4遺伝子cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記実施例3(1)記載方法に準じて実施した。但し、Na+非含有取り込み用溶液を用い、10mMの各種化合物(非標識)の存在下及び非存在下で、14C−ロイシン(100μM)の取り込みを測定した。
その結果(図20)、イソロイシン、バリン、フェニルアラニン、メチオニンで、強いcis−阻害効果が観察された。酸性アミノ酸(アスパラギン酸、グルタミン酸)、塩基性アミノ酸(リジン、アルギニン)及びプロリンは、LAT4を介する14C−ロイシンの取り込みに影響しなかった。
D−アミノ酸のうち、D−ロイシン、D−ヒスチジン、D−メチオニンにより、LAT4を介する14C−ロイシンの取り込みの比較的強い抑制効果が得られた(図21)。
輸送系特異的な抑制薬であるBCH(2-aminobicyclo-(2,2,1)-heptane-2-carboxylic acid)、AIB(a-aminoisobutyric acid)、MeAIB(a-(aminomethyl)isobutyric acid)の効果を調べたが、LAT4を介する14C−ロイシンの取り込みは、輸送系L特異的抑制薬BCHより強く抑制され、LAT4が輸送系Lトランスポーターであることが示された(図22)。
各種アミノ酸及びその類似物質を基質として、LAT4による取り込みを調べた。
各種アミノ酸及びその類似物質の取り込み実験は、マウスLAT4遺伝子cRNAを注入した卵母細胞を用い、前記実施例3(1)記載方法に準じて実施した。但し、基質としては、14C−ロイシンに変えて、放射能ラベルされた各種の化合物を用いた。
その結果(図23)、L−ロイシン(14C化合物)、L−イソロイシン(14C化合物)、L−バリン(14C化合物)、L−フェニルアラニン(14C化合物)、L−メチオニン(14C化合物)を基質とした場合に、卵母細胞への大きな取り込みが認められた。D−ロイシン(14C化合物)を基質とした場合にも、卵母細胞への有意な取り込みが認められた。
実施例4により得られたヒトLAT4のcDNAを、XhoIで切断して、T3 RNAポリメラーゼを用いてcRNAを調製した。ヒトLAT4遺伝子cRNAを卵母細胞に発現させ14C−ロイシンの取り込みを測定した。
ヒトLAT4遺伝子cRNA 25ngを卵母細胞に注入することによって発現させ3日間培養した。ヒトLAT4遺伝子cRNAを注入した卵母細胞について、基質としてロイシンを用い、基質の取り込み実験を実施例3(1)に準じて行った。
その結果、ロイシンの取り込みは、マウスLAT4と同様、ヒトLAT4を発現させた卵母細胞では、対照として水を注入した卵母細胞に比べて大きなロイシンの取り込みが観察された。さらに、ヒトLAT4もマウスLAT4と同様な基質選択性を示すことが示された。
Claims (6)
- ヒト以外の宿主細胞に対して、以下の(A)ないし(H)から選択されるタンパク質であって、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質をコードする遺伝子を用いて形質転換し、該タンパク質が過剰発現されたことにより、該タンパク質によって輸送される分枝鎖中性アミノ酸の体内動態あるいは生体内代謝が促進されたヒト以外の形質転換動物;
(A)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(B)配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(C)配列番号6で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(D)配列番号8で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(E)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
(F)配列番号4で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
(G)配列番号6で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
(H)配列番号8で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。 - ヒト以外の宿主細胞に対して、以下の(a)ないし(h)から選択されるDNAであって、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質をコードするDNAを用いて形質転換し、該タンパク質が過剰発現されたことにより、該タンパク質によって輸送される分枝鎖中性アミノ酸の体内動態あるいは生体内代謝が促進されたヒト以外の形質転換動物;
(a)配列番号1で示される塩基配列からなるDNA、
(b)配列番号3で示される塩基配列からなるDNA、
(c)配列番号5で示される塩基配列からなるDNA、
(d)配列番号7で示される塩基配列からなるDNA、
(e)配列番号1で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
(f)配列番号3で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
(g)配列番号5で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA、
(h)配列番号7で示される塩基配列からなるDNAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするDNA。 - 以下の(A)又は(B)から選択されるタンパク質であって、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質に対する抗体であって、かつヒト前立腺癌細胞及びヒト腎臓癌細胞を特異的に認識する抗体;
(A)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(B)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 以下の(A)、(B)、(E)及び(F)から選択される、ナトリウム非依存的に分枝鎖中性アミノ酸及びその類似物質を輸送する能力を単一分子で発揮するタンパク質に対する抗体を有効成分とする抗体試薬を用いて、腎臓癌細胞と正常細胞とを区別する方法;
(A)配列番号2で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(B)配列番号4で示されるアミノ酸配列からなるタンパク質、
(E)配列番号2で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質、
(F)配列番号4で示されるアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が欠失、置換もしくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質。 - 配列番号1又は3で示される塩基配列の中の異なる2箇所の位置から選択される連続する14塩基以上の部分配列及びその相補的な配列を含む1対のプライマーからなるヌクレオチド、又はそれを腎臓癌細胞と正常細胞を区別するためのプライマーセットとして用いるヌクレオチド試薬。
- 請求項5に記載のヌクレオチド試薬を用いることを特徴とする、腎臓癌細胞と正常細胞とを区別する方法。
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