KR20050100109A

KR20050100109A - 신규한 바실러스 속 균주, 버크홀데리아 속 균주 및 상기미생물을 이용한 토양 미생물 처리제

Info

Publication number: KR20050100109A
Application number: KR1020040025289A
Authority: KR
Inventors: 최용락; 이진우; 송옥렬; 정연주; 이용석; 김재훈; 김한오
Original assignee: 최용락; 주식회사 일신케미칼
Priority date: 2004-04-13
Filing date: 2004-04-13
Publication date: 2005-10-18
Also published as: KR100592540B1

Abstract

본 발명은 신규한 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) 균주와 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 이를 이용한 토양 미생물 제제에 관한 것이다. 본 발명이 제공하는 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) 균주는 염류 집적 재배지로부터 분리·동정하였으며, 난용성 인산염 가용화능이 우수하고, 식물병원균을 억제하는 뛰어난 기능을 갖는다. 본 발명이 제공하는 또 다른 균주인 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주는 프로테아제와 키티나제 분해력이 있어서 친환경적이며 내성균주의 발생 위험이 없이 환경적으로 안전하게 식물병원성 균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cineria)와 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 항진균 물질을 생산하여 식물병원균을 억제하는 기능을 가진다.

또한, 본 발명은 상기 분리균주 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23 균주와 바실러스 속(Bacillus sp.) DY-130 균주들을 이용한 토양처리용 미생물 제제를 제공하는데, 이는 상기 균주들을 배양한 액을 원심분리하여 균체를 동결시키고 증량제를 첨가함으로써 개발하였으며, 상기 균주들의 배양액에 아미노산 부산물 액을 혼합시키고 상기의 제제를 이 혼합액에 녹인 미생물처리제는 식물병원균의 제어능이 있고 식물의 생육을 촉진하는 우수한 효과가 있다.

Description

신규한 바실러스 속 균주, 버크홀데리아 속 균주 및 상기 미생물을 이용한 토양 미생물 처리제{A novel strains of Bacillus sp. and Burkholderia sp. and a soil microbial fertilizer thereof}

본 발명은 신규한 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) 균주와 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주 및 이를 이용한 토양 미생물 제제에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항진균 물질을 생산하는 미생물 및 난용성 인산염을 분해하는 미생물을 새로이 분리·동정하여 이로부터 환경오염을 감소시킬 수 있는 친환경적인 미생물 처리제 및 보관 중 높은 생육의 안정성을 보여주며 대량생산이 가능한 미생물 처리제를 개발하는 내용에 관한 것이다.

토양 중에 처리한 인산은 산성토양에서는 철 및 알루미늄 이온과, 알칼리성 토양에서는 칼슘이온과 쉽게 결합하여 불용화 됨으로써 토양 중 식물이 이용할 수 없는 불용성 인산의 양만 증가시키는 결과를 가져다준다. 실제로 인산은 토양중 0.05%(w/w)를 차지하고 있으나, 식물 또는 미생물이 이용할 수 있는 인산양은 그 중에서도 0.01%에 불과하다. 난용성 인산염을 식물이나 미생물이 이용하기 쉬운 H₂PO⁴-나 HPO₄ ²-의 이온형태로 전환시켜주는 과정을 '가용화'라 하며, 토양 속에는 이러한 가용화 반응을 일으키는 미생물이 많이 존재한다고 보고되어 있다. 이미 보고 되어진 인산가용화균으로는 바실러스 메가테리움(Bacillus megaterium), 바실러스 폴리믹솔(B. polymyxol), 슈도모나스 스트리아타(Pseudomonas striata), 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)(P118/89) 등의 세균이 알려져 있으며, 페니실리움 심플리시마움(Penicillium simplicisimaum), 페니실리움 아우란티오그리세움(P. aurantiogriseum), 페니실리움 빌라지(P. bilaji), 아스퍼질러스 아와모리(Aspergillus awamori), 아스퍼질러스 아쿨레아투스(A. aculeatus), 아스퍼질러스 나이거(A. niger) 등의 곰팡이도 있다.

이러한 인산 가용화균을 이용한 환경친화형 생물비료(biofertilizers)의 개발노력은 전세계적으로 부단히 이루어져 왔다. 이미 1950년대에 러시아와 동유럽에서 불용성 인산을 가용화시킬수 있는 미생물을 분리하여 토양에 처리한 결과 작물의 인산흡수를 증대시켜 평균 10%의 수량증가를 보았다는 보고가 있으며, 1980년대에는 페니실리움 빌라지(Penicillium bilaji) 등의 사상균이 인산의 흡수를 증대시키는 것으로 밝혀지기도 하였다.

그러나 국내에서의 미생물을 이용한 생물비료의 개발은 균주선발 및 배양특성 조사에만 접근한 수준이며, 유전학적인 접근은 아직 미흡한 실정이다. 더욱이 2000년대에는 환경보전을 위한 갖가지 규제강화로 화학비료에 대한 제약이 심화될 것으로 판단되기 때문에, 난용성 인산염을 효율적으로 분해하여 작물이 필요로 하는 인산질 비료성분을 충분히 공급해줄 수 있는 생물비료의 개발은 그 무엇보다도 시급한 과제라 할 것이다. 특히, 이러한 생물비료가 식물병원균의 생육제어 기능을 가지고 있을 경우에는 염류집적현상의 해소 및 항진균의 생물학적 방제가 가능한 장점이 있으므로, 난용성 인산염을 효율적으로 분해하면서도 생물병원균의 생육을 억제할 수 있는 기능의 미생물처리제를 개발하는 것이 가장 중요하다.

본 발명은 바로 상기와 같은 점을 감안하여 안출된 것으로, 염류집적 및 인산과다처리 재배지로부터 난용성 인산염을 가용화시킬 수 있고 항진균 활성을 가지는 고효율의 신규 미생물을 분리한 다음 상기 미생물을 이용하여 식물생육을 촉진시킬 수 있는 미생물 처리제를 개발하고 그 효과를 확인함으로써 그 목적을 달성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 난용성 인산염을 가용화시킬 수 있는 신규한 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) 균주와 진균류의 생육을 억제할 수 있는 물질을 생산하는 신규한 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 2가지 균주를 이용하여 식물생육을 촉진시키고 식물병원균 생육을 억제시킬 수 있는 신규한 생물농약 및 식물 영양을 위한 토양 처리용 미생물 제제를 제공함에 있다.

본 발명의 상기 목적은, 토양 중의 난용성 인산염을 가용화시키며 항진균 활성이 우수한 균주를 분리, 동정하여 분류학상의 위치를 확인하고, 상기 인산가용화 균주의 특성, 균체 생육도 및 생성되는 항균 물질의 특성에 대하여 검토함으로써 달성하였으며, 본 발명의 다른 목적은 상기 선별된 균주의 배양액을 건조시켜 생존도가 안정된 미생물 처리제를 제조하는 방법을 확립하고, 상기 미생물 처리제가 작물의 생육에 미치는 영향을 조사함으로써 달성하였다.

이하, 본 발명의 구성 및 작용을 상세히 설명한다.

먼저, 염류집적 및 인산과다처리 재배지로부터 채취하여 조제한 토양 10g을 100㎖의 멸균수에 넣고 250rpm으로 30분 동안 혼합한 후, 희석평판법으로 6단계까지 희석한 시료를 LB 배지에 도말하였다. 생성된 콜로니를 0.5% 트리-칼슘 포스페이트(tri-calcium phosphate)가 함유된 SM(sucrose minimal) 고체배지(sucrose 10g, NH₄NO₃0.27g, KCl 0.2g, MgSO₄·7H₂O 0.1g, MnSO₄·6H₂O 1mg, FeSO₄·7H₂O 1mg, Yeast extract 0.1g, 난용성 인산염 5g, agar 1.2%, H₂O/1L)에 접종하여 26℃, 3일간 배양하여 투명대(clear zone)를 형성하는 균주를 선발하였다. 선발된 균주는 단일 콜로니가 생성되도록 수차례 계대배양을 실시하였다.

분리균주의 동정은 난용성 인산염 가용화능이 확인된 인산가용화균을 동정하기 위하여 생화학적, 생리적 특성을 Bergey's manual에 따라 조사하여 동정하였으며, 아울러 정확성을 높이기 위해 그람염색을 실시한 결과를 이용하여 API system 32GN strip과 API 20E strip을 이용 및 16S rDNA의 염기서열을 결정하여 동정하였다.

인산가용화능 측정은 300㎖ 삼각 플라스크에 각종 난용성인산염이 0.5% 첨가된 SM배지 100㎖에 전배양한 균주를 접종한 후, 180rpm으로 필요한 시간동안 연속적으로 진탕배양하면서 배양액을 원심분리하여 얻어낸 상등액 내의 유리인산 농도와 pH 변화를 일정시간마다 측정함으로써 수행하였다. 즉, 균체배양액 1㎖을 실온에서 원심분리한 후 일정량의 상등액을 취하고 여기에 멸균수를 첨가하여 총 200㎕가 되게 한 다음, 여기에 시그마 회사의 인산측정용 시약 800㎕를 첨가하여 총 1㎖가 되게해서 혼합한 후, 50℃에서 20분간 방치한 다음 820nm에서 흡광도를 측정하였다.

배양학적 조건에 따른 인산가용화 특성 조사는 인산가용화균 균주의 배양학적 특성에 따른 난용성 인산염 가용화능의 차이를 조사하였다. 배양온도 차이에 따른 영향은 26℃, 30℃, 37℃에서 실시하였고, 배지의 초기 배양 pH별에 따른 영향은 pH 5.0, 6.0, 7.0 에서 실시하였다. 배지 조성의 차이에 따른 영향은 26℃, 초기배양 pH 6.0에서 글루코스(glucose)를 1%, 3%, 5% 농도별로 첨가하여 실시하였다. 균주에 의한 pH변화와 유리 인산 생성능은 12시간마다 측정하였으며, 이상의 배양 환경에 관한 모든 실험은 2회 반복 수행하여 평균값을 구함으로써 실험 오차를 최소화하였다.

난용성 인산염 종류별에 따른 인산가용화 특성 조사는 인산가용화 균주의 인산염 종류별에 따른 인산염 가용화능의 차이를 조사하였다. 즉, 3종류의 난용성 인산염, 트리-칼슘 포스페이트(tri-calcium phosphate), 하이드록시아파티트(hydroxyapatite), 알루미늄 포스페이트(aluminum phosphate)가 0.5% 함유된 SM 배지, pH 6.0, 26℃에서 12시간마다 분리 균주의 인산가용화능 및 pH 변화를 측정하였다.

인산가용화의 기작으로 생각되는 배양액 속의 글루콘산(gluconic acid)의 생성여부는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.)으로부터 정제된 글루코네이트 디하이드로게나제(gluconate dehydrogenase;GDH)를 사용하여 측정하였다. LB 배지에 인산가용화 균주를 전 배양후 10mM 인산 완충액(pH7.5)에 두번 씻은 후, 글루코스 최소 배지(pH6.8)에 5%(v/v)가 되게 접종하여 30℃, 180rpm으로 수일간 배양하였다. 배양액을 소형원심분리기로 6000rpm, 5분간 실온에서 원심 분리 하였다. 상층액을 반응액(0.1M potassium phosphate buffer, pH 6.0, 10mM DCIP, 3mM PMS, GDH, 0.1unit, H₂O / 1ml)에 혼합하여 25℃, 600nm에서 DCIP의 감소 정도로 배양액 속의 gluconic acid 함량을 측정하였다.

미생물처리제의 조제는 인산 가용화균 버크홀데리아 속 균주 및 바실러스 속 균주를 36 시간 정도(세포수: 10¹²/ml)까지 액체배양 하여 원심분리로 집균한 다음, 상기 집균된 균체에 증량제(skim milk)를 10% 정도 첨가한 후 동결 건조함으로써 조제한다(균체수 : 10¹¹/g). 본 발명에서 조제된 처리제는 아미노산 액(일신케미칼 사의 아미노산 부산물, 0.001%의 농도로 처리)으로 희석하여 사용하였으며 비교적 척박한 사양토 및 황토에 2 품종(나물콩, 장콩)의 대두재배를 실시하여 토양내의 이화학적 조성, 토양미생물의 군락 및 작물생육에 미치는 영향을 조사하였다.

이하, 본 발명의 구체적인 구성을 실시예를 들어 자세하게 설명하지만, 본 발명의 권리범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 본 발명의 신규 미생물 버크홀데리아 속( Burkholderia sp.) DA-23 및 바실러스 속( Bacillus sp.) DY-130의 선별

경남 김해시의 비닐하우스 재배 지역 내 근권 토양에서 희석 평판법으로 세균을 분리한 결과 건조 토양 1g당 세균수는 ≒2~5 × 10⁸ cfu/㎖ 였다. 콜로니의 모양, 색깔 등으로 보아 다른 균주로 생각되는 것을 트리-칼슘 포스페이트(tri-calcium phosphate)가 함유된 SM 고체배지 상에 접종하여 배양하였다. 3일 후에 투명대를 관찰한 결과, 10% 이상의 균주가 분명한 투명대를 보였으며, 그 중에서 비교적 투명대 영역이 넓게 나타난 균주를 1차 선별하였다. 상기 1차 선별된 균주를 다시 인산염 첨가 배지에서 배양하여 유리 인산 생성량이 비교적 높은 수준의 세균을 선발하였으며, 그 결과 DA-23, DA-33, DA-57, DA-71-1로 명명된 4종이 매우 높은 인산가용화능을 나타내었다(도 8 참조).

상기 4종의 분리균주를 동정하기 위하여 그람염색, 현미경 관찰 등의 생리 생화학적인 특성을 Bergey′s manual에 따라 조사한 결과, 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.)일 가능성이 높은 것으로 판단되었다. 동정의 정확성을 기하기 위해 상기 균주를 API system으로 다시 동정하였으며, 그 결과 DA-23이 버크홀데리아 속과 99.9% 유사도를 보여 Bergey's manual에 의한 동정과 일치하였다.

또한 토양 중에서 분리한 균주 중 병원균의 생육억제와 관련이 있는 프로테아제 및 키티나제의 강력한 효소 활성을 보유하고 있는 균주를 동일한 조건으로 동정한 결과, DY-130으로 명명한 균주가 그러한 활성을 보유하고 있는 것으로 나타났으며, 상기 균주는 바실러스 속(Bacillus sp.) 균주로 판명되었다.

상기 분리된 균주 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23 및 바실러스 속(Bacillus sp.) DY-130의 생리적, 생화학적 특성을 하기 표 1에 나타내었다.

분리 동정된 상기 버크홀데리아 속 DA-23 및 바실러스 속 DY-130의 16S rDNA를 PCR 실험으로 얻어서 부분적인 염기서열을 결정하였다(도 12). 그 결과 결정된 염기서열도 상기 판명결과와 일치하였으며, 상기 균주들은 각각 지금까지 알려지지 않은 신종의 인산 가용화균 및 식물병원성 길항균임이 밝혀졌다. 따라서, 상기 과정에 의해 얻어진 신규 미생물, 즉 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23 및 바실러스 속(Bacillus sp.) DY-130 균주를 2004년 2월 13일 농업생명공학연구원 한국농용미생물보존센터에 기탁하여 각각 기탁번호 KACC 91093 및 KACC 91092를 부여받았다.

본 발명 분리 균주의 생리적 및 생화학적 특성

특성	버크홀데리아 속 DA-23	특성	바실러스 속 DY-130
그람 염색(Gram stain)	-	그람 염색(Gram stain)	+
모양(Shape)	짧은 원형(short rods)	운동성(Mobility)	+
동화(Assimilation on)		최적 온도(Optimum temperature)	37℃
람노스(Rhamnose)	-	호기성(Growth in air)	+
아세테이트(Acetate)	+	생리적(Physiological)	+
L-아라비노스(L-Arabinose)	+	아르기닌 디하이드롤레이즈(Arginine dehydrolase)	-
2-케토글루코네이트(2-ketogluconate)	+	라이신 디카르복실레이즈(Lysine decarboxylase)	-
N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)	+	오르니틴 디카르복실레이즈(Ornithine decarboxylase)	-
DL-락테이트(DL-lactate)	+	시트레이트유틸리제이션(Citrate utilization)	-
프로플로네이트(Proplonate)	+	황화수소 생산(Production of H₂S)	-
3-하이드록시-부티레이트(3-hydroxy-butyrate)	+	유레아제(Urease)	-
D-리보스(D-Ribose)	+	인돌 생산(Indole production)	-
L-알라닌(L-Alanine)	+	젤라틴 가수분해(Proteolysis of gelatin)	+
카프레이트(Caprate)	+	글루코스(Glucose)	+
4-하이드록시-벤조네이트(4-hydroxy-benzonate)	+	말토스(Maltose)	+
이노시톨(Inositol)	+	락토스(Lactose)	-
만니톨(Mannitol)	+	리보스(Ribose)	+
발레이트(Valerate)	+	글리세롤(Glycerol)	+
L-세린(L-Serine)	+	에리스리톨(Erythritol)	-
D-수크로스(D-sucrose)	-	만니톨(Mannitol)	+
D-글루코스(D-glucose)	+	이노시톨(Inositol)	+
시트레이트(Citrate)	+	소르비톨(Sorbitol)	+
L-프롤린(L-Proline)	+	자일리톨(Xylitol)	-
말토스(Maltose)	-	셀로비오스(Cellibose)	+
살리신(Salicin)	+	람노스(Rhamnose)	-
히스티딘(Histidine)	+	사카로스(Saccharose)	+
이타코네이트(Itaconate)	+	멜리비오스(Melibiose)	+
D-멜리비오스(D-Melibose)	-	아미그달린(Amygdalin)	-
5-케토글루코네이트(5-ketogluconate)	-	L-아라비노스(L(T)-arabinose)	+

슈베레이트(Suberate)	+	이뉼린(Inulin)	+
L-푸코스(L-Fucose)	+	5-케토글루코네이트(5-ketogluconate)	-
글리코겐(Glycogen)	-	세포형태	간균
말로네이트(Malonate)	-
D-소르비톨(D-sorbitol)	+
3-하이드록시-벤조네이트(3-hydroxy-benzonate)	-

실시예 2 : 버크홀데리아 속( Burkholderia sp.) DA-23의 배양학적 특성에 따른 인산 가용화 특성 조사

버크홀데리아 속 DA-23의 배양학적 특성에 따른 인산가용화 특성을 조사하기 위하여 배양 온도별, 배양 초기 pH 별, 배지 조성의 차이에 따른 실험을 실시하였으며, 그 결과를 도 1 및 도 2에 나타내었다.

먼저, 도 1은 26℃, 30℃ 및 37℃의 다른 조건에서 배양한 버크홀데리아 속 DA-23 균주가 나타내는 인산 가용화능에 대한 정량적 분석 결과로, 이 때 상기 DA-23 균주는 0.5%의 트리-칼슘 포스페이트를 함유하는 SM 배지(sucrose minimal medium)에서 배양되었다. 26℃에서 상기 균주는 배양시간 60시간에 도달될 때까지 30℃와 37℃의 인산 방출량보다 인산 값이 낮게 나왔으나 그 이후는 340ppm으로 오히려 증가하는 수준이었다. 이러한 경향은 상기 균주를 미생물 비료로서 개발하기 위하여, 포장 온도인 저온 하에서 좀더 유효한 인산 가용화능을 가져야 한다는 조건에 잘 부합되어진다. 모든 처리구의 경우 배양 1일후부터는 배양액의 pH가 급격히 감소하였으며, 26℃의 경우 72시간에는 pH 4.62까지의 저하와 더 높은 인산 가용화능이 나타났다. 그러나, 같은 조건과 같은 시간대의 인산 가용화능을 비교하면, 버크홀데리아 속 DA-23의 인산 가용화능은 30℃일 때가 가장 우수하였다.

한편, 도 2는 초기 배양 pH가 5.0, 6.0 및 7.0의 다른 조건에서 배양한 버크홀데리아 속 DA-23이 나타내는 인산 가용화능에 대한 정량적 분석 결과로, 이 때 상기 DA-23 균주는 26℃, 0.5%의 트리-칼슘 포스페이트를 함유하는 SM 배지에서 배양되었다. 상기 균주는 초기 배양 pH가 5.0 일 때 배양 72시간에 4.6로의 pH 저하와 최대의 유리인산을 방출하였다. 초기 배양 pH가 6.0 일 때 배양 72시간에는 4.42의 pH 저하와 최대 유리인산을 방출하였다. 초기 배양 pH가 7.0 일 때 배양 36시간에서 72시간까지 pH 저하와 유리인산 방출량이 일정하였다. 모든 처리구에서 배양 72시간 이후는 pH 저하와 최대 유리인산의 방출량은 영향이 없었다.

실시예 3 : 난용성 인산염 기질 및 과당에 따른 종류별 인산 가용화 특성 조사.

(1) 버크홀데리아 속 DA-23의 트리-칼슘 포스페이트(tri-calcium phosphate), 하이드록시아파티트(hydroxyapatite), 알루미늄 포스페이트(aluminum phosphate) 등의 다양한 난용성 인산염 기질에 대한 인산 가용화능을 포장온도에 근접한 26℃ 처리구에서 비교 조사하여 그 결과를 도 3에 나타내었다.

이 때, 상기 버크홀데리아 속 DA-23 균주는 pH 6.0, 26℃, 0.5%의 상기 다양한 난용성 인산염을 함유하는 SM 배지에서 배양되었으며, 그 결과, 트리-칼슘 포스페이트(Tri-calcium phospahte)를 기질로 사용했을 때에는 배양 72시간에 4.62의 pH 저하로 최대 350ppm의 유리인산을 방출하였고, 하이드록시아파티트(hydroxyapatite)를 기질로 사용했을 때에는, 4.71로의 pH 저하와 최대 280ppm 정도로 비교적 높은 유리인산을 방출하였다. 반면에 알루미늄 포ㅡ페이트(Aluminium phosphate)의 경우에는, 3.8로의 급격한 pH 저하를 보였으나, 유리인산 생성이 거의 15ppm 정도로 인산가용화능이 매우 낮았다.

(2) 한편, 버크홀데리아 속 DA-23의 당 종류(수크로스, 말토스, 글루코스)에 따른 인산염 가용화 특성을 포장온도에 근접한 26℃ 처리구에서 비교 조사하여 그 결과를 도 4에 나타내었다. 이 때, 상기 DA-23 균주는 26℃, 1%의 다양한 탄소원(수크로스, 말토스, 글루코스) 및 0.5%의 트리-칼슘 포스페이트를 함유하는 최소 배지에서 배양되었으며, 그 결과, 포도당을 탄소원으로 사용하였을 경우가 가장 높은 가용화능을 보여 최대 570ppm 정도의 유리 인산을 방출하였다.

(3) 따라서 포도당을 탄소원으로 하여 그 이용농도(1%, 3%, 5%)에 따른 영향을 조사하였으며, 그 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에서, 상기 DA-23 균주는 26℃, pH 6.0, 0.5%의 트리-칼슘 포스페이트를 함유하는 최소 배지에서 배양되었으며, 3%의 포도당을 처리하였을 때가 가장 높은 유리 인산 방출량을 보여, 배양 후 72시간 경에는 최대 1150ppm 정도의 유리 인산을 방출하는 경향이었다.

(4) 난용성 인산염의 가용화에 유기산이 관여한다는 것이 알려져 있고, 상기의 실험 결과에서 유리인산의 방출량이 증가함에 따라 pH가 저하되며, 이는 유기산 생성에 의한 결과라고 추정되어져서, 본 발명 버크홀데리아 속 DA-23의 가용화 특성을 알아보고자 하였다.

이미 밝혀진 유기산에는 글루콘산(gluconic acid), 시트르산(citric acid) 등이 알려져 있으며, 이중 GDH(glucose dehydrogenase)에 의한 글루콘산(gluconic acid)의 생성 및 2-케토글루콘산(2-ketogluconic acid)의 생성이 난용성 인산염의 가용화와 밀접한 관계를 가지고 있다고 밝혀져 있으므로, 본 발명의 분리 균주 DA-23을 0.5% 난용성 인산염이 첨가된 배지에서 배양한 다음 상기 배양액 속의 글루콘산(gluconic acid)의 생성 유무를 경시적으로 측정하였다.

그 결과를 도 6 및 도 7에 나타내었다. 도 7에서, 버크홀데리아 속 DA-23은 글루코스 최소 배지에서 배양 48 시간에 최대의 GDH 효소활성을 나타내었으며, 36시간 경에는 최대 9.5 mM의 글루콘산(gluconic acid)를 생성하였다. 2일째 경과시 부터는 약간 감소하는 경향을 보였다. 한편, 대조군으로서 사용한 E.coli JM109의 배양액에서는 GDH 효소활성이 없었으며 글루콘산(gluconic acid)가 검출되지도 않았다. 이 결과는 E. herbicola EH010의 균주에서 생성된 8.65mM의 글루콘산(gluconic acid) 생성량보다 우수한 결과를 나타낸 것이다. 이상의 결과는 버크홀데리아 속 DA-23 균주가 글루콘산(gluconic acid)를 생성함으로써 인산염을 가용화 시킴을 나타낸 결과이다.

실시예 4: 본 발명 미생물 처리제가 토양의 이화학적 조성에 미치는 영향

본 발명의 미생물 처리제는, 먼저 100L 배양기에 각각 실시예 1에서 분리한 버크홀데리아 속 DA-23 균주와 바실러스 속 DY-130 균주를 1%로 접종하고, 36h, 250rpm, 0.5 vvm 으로 진탕 배양한 후, 배양한 70L의 배양액에 증량제 스킴 밀크(skim milk) 750g을 넣어 교반하고, 16000rpm 으로 집균한 후, 상기 집균된 균을 동결건조기에 동결건조 함으로써 제조하였다.

상기 본 발명 미생물 처리제를 아미노산 액(일신케미칼 사의 아미노산 부산물)으로 300배 희석하여 사양토 또는 황토에 처리하고, 상기 각 토양에 대두(나물과 장콩의 두 품종) 재배를 실시한 다음 재배 전후 상기 토양의 pH와 EC를 시료：증류수의 비를 1：5로 하여 측정하였다. 유기물 함량은 Tyurin법, 총 질소는 Kjeldahl 증류법으로 분석하였으며, 양이온성 치환 용량은 N-NHOAc용액(pH7.0)으로 침출된 것을 ICP로 정량하였다. 그리고 토양의 유효인산은 Bray No.1법으로 추출 후 바나도몰리브덴산을 이용한 비색법으로 측정하였다. 측정된 상기 토양의 이화학적 조성을 본 발명 미생물 처리제의 처리 전 측정값과 비교하였으며, 그 결과를 하기 표 2에 기재하였다.

실험결과, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 본 발명 미생물 처리제의 균주 배양물을 농도별로 처리한 토양과 처리하기 전의 토양에서 pH, EC, PO, 추출-양이온(Ex-cation), NO₃-N에는 유의적인 차이를 나타내지 않았으며, 유기물 함량(OM)은 처리 후에 약간 증가하였으나, 처리에 따라서 토양에 큰 영향을 미치지 않음을 알 수 있었다.

본 발명 미생물 처리제로 재배된 토양의 이화학적 성질 변화

처리		pH	EC(dS/m)	OM(%)	P₂O₅ (mgkg^-1)	CEC(cm01kg^-1)				NO₃-N(ppm)
처리		pH	EC(dS/m)	OM(%)	P₂O₅ (mgkg^-1)	K	Ca	Mg	Na	NO₃-N(ppm)
토양1(사양질)	처리전	6.23	0.83	1.53	818	0.39	2.89	0.46	0.13	78
토양1(사양질)	처리후(300배)	6.30	0.82	1.58	926	0.41	2.95	0.48	0.11	82
토양2(황토)	처리전	4.91	0.20	0.13	495	0.13	3.49	0.38	0.25	4
토양2(황토)	처리후(300배)	5.40	0.35	0.45	670	0.17	3.60	0.41	0.20	55

실시예 5: 본 발명 미생물 처리제가 대두의 식물체 생육에 미치는 영향

상기 실시예 4에서 미생물 배양액으로 조제한 본 발명의 미생물 처리제를 다시 아미노산 액을 이용하여 300배로 희석시킨 후 이를 관행시비(N.P.K 시비)와 함께 사양질 토양 및 황토의 시험토양에 관주처리하여 각각 나물콩과 장콩의 2종류 대두 품종을 재배하였다. 비교처리구로서 N.K 시비구(인산무처리구) 및 N.P.K 시비구(관행시비 처리구)를 이용하여 동일한 실험을 수행하였다. 지상부의 초장과 생체중을 측정하여 생육정도를 확인하였으며, 지상부 전체를 풍건시켜 조제한 시료로 무기질 성분을 분석하였다.

그 결과를 도 11 및 하기 표 3에 나타내었다. 먼저 도 11을 보면, 초장에서는 관주 300배액 처리구에서 25.8㎝로 N.K 시비구(무처리구), N.P.K 시비구(관행시비 처리구) 보다 가장 생육이 양호하게 나타났으며, 생체중에서도 관주 300배액 처리구에서 대체적으로 생육이 좋게 나타나 관행시비구 처리에 비해 유의성이 인정되었다. 또한, 본 발명의 미생물 처리제가 나물콩의 식물체 성분에 미치는 영향을 나타낸 표 3을 보면, 식물체의 무기질 성분의 함량은 상기 시험토양 2종류 모두에서, 관행시비 및 미생물처리제 처리구가 T-N 및 P₂O₅의 성분함량이 증가하는 경향으로 본 발명 미생물 처리제의 효과가 나타났다.

이상의 결과를 요약하면 본 발명 미생처리제 희석액을 처리한 결과는 관행시비 및 300배액> 관행시비> 인산무처리구의 순으로 생육상태가 양호한 것으로 나타났다.

본 발명 미생물 처리제가 대두의 식물체 성분에 미치는 영향(ω/ω%)

처리		T-N	P₂O₅	K	Ca	Mg	Na
사양질토양	A	1.65	0.44	1.48	0.17	0.27	0.20
	B	2.12	0.61	1.54	0.21	0.37	0.25
	C	2.30	0.74	1.53	0.22	0.39	0.24
황토	A	1.21	0.31	0.84	0.15	0.21	0.16
	B	1.45	0.47	0.97	0.17	0.25	0.19
	C	1.71	0.56	1.06	0.17	0.25	0.18
A: N.K 시비구, B: N.P.K 시비구, C: N.P.K 시비 및 본 발명 미생물 처리제(300배액) 시비구

실시예 6:　본 발명 미생물 처리제의 시용이 토양 미생물 생태에 미치는 영향 조사

본 발명 미생물 처리제의 시용이 토양 미생물 생태에 미치는 영향을 조사하기 위하여, 상기 실시예 5에서 본 발명 미생물 처리제의 300배 희석액으로 처리된 대두 재배지역 내의 미생물 수를 측정하였다. 이 때, 측정된 미생물은 세균, 방선균, 사상균으로 각각 TSA (Tryptic Soy Agar), AIA (Actinomycetes Isolation Agar), PDA with Chloramphenicol을 이용하여 적당히 희석을 시식하여 한천도말평판법을 이용하여 계수 측정하였다. 도말평판 후 세균은 30℃에서 48시간 배양하였고, 방선균과 사상균의 측정은 27℃에서 4일간 배양하여 평판상에 나타난 각 콜로니 수를 3반복으로 측정하여 평균값으로 비교하였다.

실험결과, 하기 표 4에 나타난 바와 같이 본 발명 미생물 처리제 희석액의 처리에 따라 총 미생물 수가 증가하여, 2차 채취시의 총 미생물 수는 1차 채취시 미생물 수의 약 1.5배에 달하였다. 방선균 역시 수적으로 증가를 보이고 있었으나 곰팡이의 밀도는 거의 변화가 없었다. 이는 본 발명 미생물 처리제에 포함된 바실러스 속 DY-130 균주가 토양 내에 존재하면서 항진균성 물질을 생성함으로써 곰팡이 생장에 영향을 미친 것으로 생각되었다. 2차 실험결과 역시 미생물 배양액의 처리에 따라 총 미생물 수는 처리 전 1.24×10⁴/g 에서, 1, 2차 채취시 각각 1.49×10⁴/g, 1.80×10⁴/g 으로 증가하였다.

따라서 본 발명 미생물 처리제 희석액의 처리는 토양 내 미생물의 분포를 변화시키면서 대두 생육을 양호하게 하고, 일부의 식물병원균 생육을 저해시킴을 확인하였다.

본 발명 미생물 처리제의 시용이 토양 미생물 생태에 미치는 영향

구분	미생물의 평균 밀도 (×10⁴/g), ( ) : %
구분	처리 전	1차 채취(4주후)	2차 채취(8주후)
총 균수	1.241(100)	1.490(100)	1.795(100)
세균	1.082(87.2)	1.280(85.9)	1.549(86.1)
방선균	90(7.2)	116(7.8)	147(8.2)
사상균	69(5.6)	94(6.3)	12(5.7)

실시예 7: 본 발명 미생물처리제의 식물병원균 억제효과 조사

본 발명에서 선별된 바실러스 속(Bacillus sp.) DA-23 및 버크홀데리아 속 (Burkholderia sp.) DA-23 균주가 생산한 대사물질이 항진균 특성을 가지는지를 확인하고자, 상기 균주를 Yeast 추출물을 포함하는 한천 배지에 접종하고, 식물 병원성 진균인 보트리티스 시네리아(Botrytis cineria), 푸사리움 옥시스포룸(Fusarium oxysporium), 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)를 배양하여 lown을 한 후 병원성 진균의 생육을 저해하는 효과를 확인하였다. 이 때, 식물 병원성 진균의 생육저해 현상확인은 30℃에서 3일간 배양하면 병원성 균이 서서히 생육하다가 바실러스(Bacillus sp.) DY-130 균주가 성장한 지역에 도달된 후부터는 생육이 저해된 투명대 형성(inhibition zone)으로부터 확인하였다.

그 결과를 도 9 및 도 10에 나타내었다. 상기 도 9 및 도 10을 통하여, 본 발명의 바실러스 속(Bacillus sp.) DA-23 균주 및 버크홀데리아 속 (Burkholderia sp.) DA-23 균주가 잔디 등의 병원성 진균류인 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 보트리티스 시네리아(Botrytis cineria)에 대하여 항진균 활성이 매우 뛰어남을 확인하였다. 이외에도 식물의 덩굴쪼김병을 유발하는 푸사리움 옥시스포룸( Fusarium oxysporum )에 대해서도 생육저해 투명대 형성(inhibition zone)을 보였다.

상기 본 발명의 분리 균주가 생산한 항균물질을 분리하고자 상기 균주의 배양액을 원심분리한 배양 여액에 pH 2.0이 될 때까지 농염산을 첨가하였다. 이 반응액을 4℃에서 O/N 반응시켜 침전시킨 후, 원심분리 하였다. 그 결과 생성된 침전물을 10배의 메탄올로 진탕하여 추출한 뒤, 감압 농축하여 암갈색의 조 추출물을 얻었고, 상기 건조된 조 추출물은 녹여서 병원균의 길항능력을 확인하기 위한 생육저해 투명대 형성(inhibition zone) 시험에 사용하였다.

그 결과 리조크토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 보트리티스 시네리아(Botrytis cineria)에 대한 길항력 효과도 같은 결과를 보였다.

이상 상기 실시예를 통하여 명백한 바와 같이, 본 발명은 뛰어난 인산가용화능을 가짐으로써 식물의 생장을 촉진시키고 토양의 지질을 개선하는 특성의 새로운 버크홀데리아 속 미생물(Burkholderia sp. DA-23) 및 식물병원균의 생육억제 물질을 생산하여 보트리티스 시네리아(B. cineria), 리조크토니아 솔라니(R. solani) 등의 진균류에 대한 우수한 항균활성을 나타내는 새로운 바실러스 속 미생물(Bacillus sp. DY-130)을 제공하는 탁월한 효과가 있다. 또한, 본 발명은 공서가능한 상기 버크홀데리아 속 미생물과 바실러스 속 미생물을 함께 이용하여 환경오염의 걱정없이 토양 속에 다량으로 축적되어 있는 불용성 인산염을 작물이 이용할 수 있는 형태의 유리인산으로 전환할 수 있고 또한 식물병원균의 생육을 억제하여 작물의 생육을 촉진시킬 수 있는 환경친화형 생물농약을 제공함으로써 환경산업 및 농업산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

도 1은 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23의 배양온도에 따른 인산염 가용화 특성을 나타낸 것이다.

도 2는 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23의 pH에 따른 인산염 가용화 특성을 나타낸 것이다.

도 3은 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23의 인산염 종류에 따른 인산염 가용화 특성을 나타낸 것이다.

도 4는 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23의 당종류에 따른 인산염 가용화 특성을 나타낸 것이다.

도 5는 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23의 글루코스(glucose) 농도에 따른 인산염 가용화 특성을 나타낸 것이다.

도 6은 HPLC를 이용한 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23의 글루콘산(gluconic acid) 측정을 나타낸 것이다.

도 7은 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23의 배양시간에 따른 pH와 생육도(a), GDH의 활성(activity)과 글루코네이트(gluconate) 함량(b)을 나타낸 것이다.

도 8은 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23에 의한 난용성인산염의 분해를 나타낸 것이다.

도 9은 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23의 식물병원균인 보트리티스 시네리아(B. cineria)와 리조크토니아 솔라니(R. solani)에 대한 생육저해현상을 나타낸 것이다.

도 10은 바실러스 속(Bacillus sp.) DY-130의 식물병원성균인 보트리티스 시네리아(B. cineria)와 리조크토니아 솔라니(R. solani)에 대한 생육 저해현상을 나타낸 것이다.

도 11은 본 발명 미생물처리제를 이용한 식물생육 효과시험의 결과를 나타낸 것이다.

도 12는 버크홀데리아 속 (Burkholderia sp.) DA-23(a)와 바실러스 속 (Bacillus sp.) DY-130(b)의 동정을 위한 16S rDNA의 염기서열 결정결과를 나타낸 것이다.

Claims

인산 가용화능을 갖는 버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23 (KACC 91093).
식물병원성 진균류의 생육억제 물질을 생산하는 바실러스 속(Bacillus sp.) DY-130 (KACC 91092).
버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23 (KACC 91093) 균주 및 바실러스 속(Bacillus sp.) DY-130 (KACC 91092) 균주를 유효성분으로 함께 함유하는 것을 특징으로 하는 토양 처리용 미생물 제제.
버크홀데리아 속(Burkholderia sp.) DA-23 (KACC 91093) 균주 및 바실러스 속(Bacillus sp.) DY-130 (KACC 91092) 균주를 유효성분으로 함유하고, 부가하여 동물성 복합아미노산을 함유하는 것을 특징으로 하는 토양 처리용 미생물 제제.