KR20050097117A - 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 고 당전이성사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈와 이를 이용한당전이 감미료의 제조방법 - Google Patents

지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 고 당전이성사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈와 이를 이용한당전이 감미료의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연 고감미 대체감미료인 스테비오사이드(stevioside)에 대한 당전이 반응 활성이 우수한 당전이 효소인 신규 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glycosyltransferase)를 생산하는 호열성 토양미생물 지오바실루스 티지-1(Geobacillus sp. TG-1), 이 균주가 분비, 생산하는 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈, 이를 암호화하는 유전자의 염기 및 아미노산 서열, 그리고 본 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드 감미료 제조방법에 관한 것이다.

Description

지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈와 이를 이용한 당전이 감미료의 제조방법{Cyclodextrin glycosyltransferase having high transglycosylating activity from Geobacillus sp TG-1 and its utilization for production of transglycosylated sweetener}
본 발명은 천연 고감미 대체감미료인 스테비오사이드(stevioside)에 대한 당전이 반응 활성이 우수한 당전이 효소인 신규 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glycosyltransferase)를 생산하는 호열성 토양미생물 지오바실루스 티지-1(Geobacillus sp. TG-1), 이 균주가 분비, 생산하는 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈, 이를 암호화하는 유전자의 염기 및 아미노산 서열, 그리고 본 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드 감미료 제조방법에 관한 것이다.
일반적으로, 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glycosyltransferase)는 각종 전분, 덱스트린(dextrin), 아밀로스(amylose), 아밀로펙틴(amylopectin)과 같은 전분류로부터 사이클로덱스트린(cyclodextrin)을 합성하는 환화반응(cyclization reaction), 당 분자를 분자간에 전이시키는 당전이 반응(transglycosylation reaction), 그리고 사이클로덱스트린 및 전분의 가수분해반응을 촉매하는 다기능 당전이 효소로서, 산업적으로 널리 활용되는 효소이다.(Okada, S., Kitahata, S., Shiosaka, M., Bunya, H., Kubota, M., Sakai, S., Tsujisaka, Y., Denpun Kagaku(1991), 38: 211-215).
사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈는 생산균주의 종류에 따라 분자량이 35,000~88,000 달톤(dalton) 범위이며, 일반적으로 온도는 40~55℃에서, 그리고 pH는 5.5~6.5인 중성 부근에서 높은 활성을 갖는다. 그러나 호알칼리성 바실루스(Bacillus)속 미생물 유래의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 경우 pH 10이상에서도 높은 활성을 가지는 경우도 있으며, 초고온성 혐기성 미생물인 써모안에어로박터 에스피(Thermoanaerobacter sp.)와 같은 초호열성 미생물이 생산하는 내열성 효소도 있다.(Okada, S., Kitahata, S., Shiosaka, M., Bunya, H., Kubota, M., Sakai, S., Tsujisaka, Y., Denpun Kagaku(1991), 38: 211-215; Mori., S., Hirose, S., Oya, T., Kitahata, S., Oyo Toshitsu Kagaku(1994), 41: 245-253).
사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈가 각종 전분류로부터 환화반응을 통하여 합성되는 사이클로덱스트린은 도넛 모양의 환상형 올리고당으로, 환상형의 독특한 구조는 수용액에서 사이클로덱스트린 분자내 공동의 내부는 소수성이고 외부는 친수성이어서 그 공동 내에 여러 유기 및 무기 화합물질을 포접하는 성질을 갖고 있다. 이러한 포접작용을 이용하여 각종 물성을 개선하는 분자캡슐로 이용되어 냄새 및 맛의 차폐, 고미 제거, 휘발성 물질의 안정화, 불안정성 물질의 안정화, 난용성 물질의 유화 또는 가용화 등 다양한 효과가 있어 산업적으로 폭 넓게 이용되고 있다(Parrish, M.A., Cyclodextrin-a review(1989), 42:1393)
사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈가 촉매하는 분자간 당전이 반응은 전분, 사이클로덱스트린, 또는 말토올리고당(maltooligosaccharide)과 같은 당공여체 중의 말단 당 분자를 당수용체인 단당류 또는 이당류, 이노시톨(inositol)과 같은 당알콜류, 그리고 스테비오사이드(stevioside)와 같은 각종 배당체에 전이시키는 효소반응이다. 당 분자가 전이된 각종 당전이 생성물은 감미의 향상, 용해성 증가, 장내 유용미생물 증식효과, 화학안정성의 증가 등 기능성이 부가되는 것으로 알려져 있다.(Miyake, T., Hijiya, H., US patent(1985), No.4537763; Miyake, T., Hijiya, H., US patent(1986), No.4621137; Yoneyama., M., Iritani, S., Miyake., T., US patent(1996), No.5565435).
이와 같은 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 높은 당 전이능이 알려지면서 이를 다양한 기능성 탄수화물소재 및 신규 당류 개발에 활용하려는 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 산업적 활용을 고려할 때 당 전이능이 높고 내열성을 갖춘 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 확보가 요구되고 있다.
따라서, 본 발명은 천연 고감미 대체감미료인 스테비오사이드(stevioside)에 대한 당전이 반응 활성이 우수한 당전이 효소인 신규 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈(cyclodextrin glycosyltransferase)를 생산하는 호열성 토양미생물 지오바실루스 티지-1(Geobacillus sp. TG-1), 이 균주가 분비, 생산하는 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈, 이를 암호화하는 유전자의 염기 및 아미노산 서열, 그리고 본 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드 감미료 제조방법을 제공함에 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여 당 전이능이 높고 내열성을 갖춘 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분비하는 호열성 미생물을 새로이 탐색하고, 분리된 균주의 생리적, 생화학적 특성 조사 및 16에스 리보좀 유전자의 염기서열(16S ribosome DNA sequence)의 분류ㆍ계통 분석(phylogenetic analysis)을 통하여 균주를 분류ㆍ동정하는 것이다.
또한 분리된 호열성 미생물이 생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분리·정제하여 효소적 특성을 규명하고, 분리·정제된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드와 같은 각종 당전이 감미료를 제조하는데 활용하는 것이다.
그리고, 분리균주가 분비·생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호화하는 유전자를 상기 균주의 염색체 디엔에이(DNA)로부터 분리하여 그 염기서열 및 이로부터 아미노산 서열을 결정하는 것이다.
본 발명에서는 국내의 각종 토양으로부터 당 전이능이 높고 내열성을 갖춘 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분비하는 호열성 미생물을 탐색한 결과, 티지-1으로 번호를 붙인 신규 호열성 토양 미생물을 분리하였다. 선별된 신규 호열성 토양미생물 티지-1의 형태적, 생리적, 그리고 생화학적 특성과 16S 라이보좀 디엔에이(16S ribosmomal DNA) 유전자의 염기서열을 분석한 결과를 바탕으로 지오바실루스 에스피 티지-1(Geobacillus sp. TG-1)으로 분류ㆍ동정하였다. 상기 균주를 부다페스트조약에 의거, 한국농용미생물보존센타(KACC)에 기탁번호 KACC 91097로 2004년 3월 26일 기탁하였다(최초기탁일).
신규 호열성 토양미생물 지오바실루스 에스피 티지-1은 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 세포밖으로 분비ㆍ생산하였으며, 페닐세파로즈 시엘-4비 소수성 크로마토그래피(Phenyl Sepharose CL-4B hydrophobic chromatography)와 세파덱스 지-75 겔 여과 크로마토그래피(Sephadx G-75 gel permeation chromatography)를 이용하여 효소를 분리ㆍ정제하였다. 그리고, 정제한 신규 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 효소적 특성 및 분자량을 측정하였다.
분리ㆍ정제된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈는 pH 6.0과 50℃에서 최적 당전이 효소반응을 보였으며, 분자량은 69,000달톤이었다. 그리고 정제된 효소의 아미노말단의 아미노산 서열은 Asn-Leu-Asn-Lys-Val-Asn-Phe- Val-Ser-Asp-Val-Val-Val-Gln-Ile 순으로 나타났다.
그리고, 이 균주가 생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 암호화하는 유전자를 지오바실루스 에스피 티지-1의 염색체 디엔에이(genomic DNA)로부터 유전자를 분리하고 이 유전자의 염기 및 아미노산 서열을 분석하였다.
지오바실루스 에스피 티지-1에 의해 생산된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 환화반응과 분자간 당전이 반응의 특징을 검토한 결과 본 효소는 환화반응보다는 분자간 당전이 반응에 적합한 당전이성이 높은 효소임을 알 수 있었다. 또한 본 효소의 다양한 당수용체에 대한 당전이능을 검토한 결과 포도당, 맥아당, 설탕, 셀로비오스(cellobiose), 그리고 당알콜인 이노시톨(inositol)과 배당체인 스테비오사이드(stevioside)에 대해 우수한 당전이능을 보였으며, 특히 고감미 대체 감미료로 널리 사용되고 있는 스테비오사이드에 대한 당전이능이 가장 우수하여 당전이 스테비오사이드 제조에 적합한 당전이 효소임을 확인하였다.
아래 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 아래 실시예에 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 기술적 사상을 벗어나지 않는 범위내에서 여러 가지 치환, 변형 및 변경이 가능하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진자에게 있어 자명한 것이다.
<실시예 1> 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈생산 신규 호열성 토양미생물 티지-1의 분류 및 동정.
토양에서 새로이 분리한 당 전이능이 높은 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분비하는 호열성 토양미생물 티지-1를 주사형 전자현미경으로 형태를 관찰한 결과, 도 1에서 보는 바와 같이 크기가 0.8~1.0 ×2.5~3.3㎛의 매우 긴 막대(rod) 형태를 보였다. 또한 티지-1의 분류·동정을 목적으로 형태, 생화학 및 생리적 특징을 '버지'의 세균 분류 동정 실험서(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology)에 제시된 방법에 따라 조사하여 그 결과를 표1에 나타내었다.
분리한 토양미생물 티지-1은 고온인 50~65℃에서 높은 생장률을 보였으며, 운동성이 있고, 그람 양성, 카탈레이즈(catalase), 디하이드록시아세톤(dihydroxy- acetone)에 대해 양성반응, 유레이즈(urease)에 대해서는 음성반응을 보였다. 카제인(casein), 젤라틴(gelatin), 전분에 대한 분해능, 인돌(indole)과 황화수소(H2S)의 형성능, 그리고 포도당, 갈락토즈(galactose), 맥아당, 만노즈(mannose), 만니톨(mannitol) 등 다양한 당을 이용할 수 있었다. 따라서 상기 균주 티지-1은 지오바실루스(Geobacillus) 속에 속하는 것으로 판단된다.
[표 1] 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분비하는 호열성 토양미생물 티지-1의 형태, 생화학, 그리고 생리적 특징.
보다 명확한 분류ㆍ동정을 위하여 16S 라이보좀 디엔에이 단편을 중합효소 증폭법(Polymerase Chain Reaction)을 이용하여 티지-1의 염색체 디엔에이로부터 증폭한 후, 증폭된 16S 라이보좀 디엔에이 단편의 염기서열을 결정하였다. 결정된 염기서열을 엔제이 네이버 조이닝 프로그램(NJ neighber joining program)으로 분석하여 16S 라이보좀 디엔에이의 계통 분류 분석을 실시하여 그 결과를 도2에 나타내었다.
도 2에서 보는 바와 같이 신규 호열성 토양 미생물 티지-1은 지오바실루스(Geobacillus) 속에 속하는 새로운 종의 미생물로 동정되었으며, 탄소원으로 매우 다양한 당류 이용성과 호열성인 특징을 갖고 있어 최종적으로 지오바실루스 에스피 티지-1(Geobacillus sp.TG-1)으로 최종 명명하였다. 상기 균주를 한국농용미생물보존센타에 기탁번호 KACC 91097로 2004년 3월 26일 기탁하였다(최초기탁일).
<실시예 2> 신규 호열성 토양미생물 지오바실루스 에스피 티지-1으로부터 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 생산 및 분리ㆍ정제.
고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 생산하고자, 본 발명에서 선별한 지오바실루스 에스피 티지-1을 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 생산배지(2% 옥수수전분, 1% 옥수수 침지추출물, 0.5% 염화칼슘, 0.5% 염화나트륨, 0.05% 염화철, pH 6.5)에 접종하고 56℃에서 24시간 진탕 배양하면서 배양시간에 따른 균체량, 분비된 단백질량과 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 효소활성의 변화를 관찰하였다. 그 결과, 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 생산량을 나타내는 효소활성이 배양 18시간까지 급격히 상승하여 최고값인 배양액 1 리터 당 1,200 단위에 달하였으며 이후 정지기로 접어들었다.
고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분리·정제하고자, 배양액을 고속원심분리기로 원심분리하여 미생물 균체를 제거한 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 조효소액을 한외여과장치(한계 분자량50,000 달톤)로 농축하고 10 mM 트리스-염산 완충용액(Tris-HCl buffer, pH 7.0)으로 5회 투석하였다. 투석된 조효소액을 소수성 페닐세파로즈 시엘-4비 크로마토그래피(Phenyl Sepharose CL-4B chromatography)에 효소를 흡착시키고 1 M 트리스 말레익산 완충용액(Tris-maleic acid-NaOH bufffer, pH 6.5)으로 세척한 후, 흡착된 효소를 25%(w/v) 에틸렌 글리콜(ethylene glycol)로 용출시켰다. 용출된 효소액을 10 mM 트리스-염산 완충용액(pH 7.0)으로 한외여과하여 농축시킨 후 단백질양과 효소활성을 측정하였다. 농축된 용액을 다시 세파덱스 지-75 겔여과 크로마토그래피법(Sephadex-75 gel permeation chromatography)을 이용하여 효소를 분획하였으며, 정제여부를 단백질 전기영동법을 이용하여 확인하였다.
정제된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 분획은 50 mM 트리스 말레익산 완충용액(Tris-maleic acid-NaOH bufffer, pH 6.5)에 투석한 후 효소활성측정, 단백질정량, 그리고 에스디에스-폴리아크릴아마이드 전기영동(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)을 실시하여 회수율과 정제도를 확인한 결과, 최종적으로 28배의 정제도, 12%의 회수율을 얻었다. 그리고 이때 단백질에 대한 비활성은 4,952 단위/밀리그램 단백질(units/mg protein)의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 얻을 수 있었다.
<실시예 3> 정제된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 효소적 특성.
(1) 분자량 및 아미노말단의 아미노산 서열.
정제된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 분자량을 에스디에스-폴리아크릴아마이드 겔 전기영동법으로 측정하였다. 그 결과 도 3과 같이 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 분자량은 약 69,000달톤(dalton)이었다. 지금까지 보고 되고 있는 대부분의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 분자량은 64,000~75,000달톤 사이인 것으로 알려져 있는데, 분리정제된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈도 이들과 유사한 분자량을 보였다.
분리·정제된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 아미노말단의 아미노산 서열을 단백질 아미노산 서열분석기(Procise LC protein sequencer)를 이용하여 분석한 결과 아미노산 서열은 Asn-Leu-Asn-Lys-Val-Asn-Phe-Val- Ser-Asp-Val-Val-Val-Gln-Ile 순이었다. 호열성 지오바실루스 에스피 티지-1의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈는 내열성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 생산하는 것으로 알려진 지오바실루스 스테아로써모필러스 이티-1(G. stearothermophilus ET1, Chung, H. C., S. H. Yoon, M. J. Lee, M. J. Kim, K. Kwon, I. W. Lee, J. W. Kim, B. H. Oh, H. S. Lee, V. A. Spiridonova, and K. H. Park., J. Agric. Food Chem.(1998) 46: 952-959) 및 지오바실루스 스테아로써모필러스 엔오2(G. stearothermophilus No.2, Fujiwara S, H. Kakihara, K. Sakaguchi, and T. Imanaka., J. Bacteriol.(1992) 174: 7478-7481) 유래의 것과 93% 그리고 87%의 높은 상동성을 보여 본 발명의 호열성 지오바실루스 티지-1 유래의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈도 내열성 효소임을 알 수 있었다.
(2) 최적 반응 pH 및 온도.
최적 반응 pH를 관찰하기 위해 적정 pH의 완충용액에 10%(w/v) 가용성 전분과 0.3 단위/밀리리터(units/mL)의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 첨가하여 50℃에서 30분 간 반응시켜 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 활성을 측정한 결과는 도 4(A)와 같다. 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈는 pH 6.0에서 가장 높은 반응성을 나타내었다.
염화칼슘이 함유된 20 mM 트리스-염산(pH 6.0) 완충액에 동일 활성의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈와 가용성 전분을 혼합하여 30℃에서 90℃까지 5℃ 간격을 두고 30분 간 반응하여 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 최적 반응 온도를 알아보았다. 도 4(B)에서처럼 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈는 70℃에서 가장 높은 활성을 나타내었다. 이는 본 효소가 호열성 미생물 유래의 내열성을 가진 효소임을 나타내는 것이다.
(3) 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당공여체인 전분당류에 대한 기질 특이성.
본 발명의 지오바실루스 에스피 티지-1 유래의 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당공여체에 대한 기질 특이성을 검토하기 위하여, 당수용체를 맥아당으로 하고 말토올리고당, 사이클로덱스트린, 가용성 전분 및 각종 전분을 당공여체로 하여 당전이 반응수율을 관찰한 결과, 아래 표 2에서 보는 바와 같이 사이클로덱스트린류와 전분류가 높은 당전이 반응수율을 보였으며, 말토올리고당은 다소 낮은 값을 나타내었다. 특히 감마-사이클로덱스트린이 60.4%로 가장 높은 당전이 반응수율을 나타내었다.
[표 2] 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당공여체에 대한 기질 특이성
(4) 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당수용체에 대한 기질 특이성.
당수용체에 대한 기질특이성을 조사하고자, 가용성 전분을 당공여체로 사용하고 각종 단당류, 이당류, 당알콜류, 그리고 배당체를 당수용체로 사용하여 정제된 지오바실루스 에스피 티지-1 유래의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당전이 반응수율을 검토한 결과는 표 3과 같다.
그 결과 단당류보다는 이당류에서 높은 당전이 수율을 보였으며 맥아당이 67%로 가장 높았으며, 단당류는 포도당만이 49%로 비교적 높은 당전이율을 보였다. 당알콜류에 대한 당전이 수율은 종류에 따라 차이가 크게 나타났으며 이노시톨(inositol)이 45%의 다소 높은 수율을 보인 반면 솔비톨(sorbitol)과 말티톨(maltitol)은 당수용체로 거의 이용되지 않았다. 또한 각종 배당체에 대한 당전이 반응수율도 종류에 따라 변화가 심하였으며, 그 중 스테비오사이드(stevioside)에 대한 당전이 반응수율이 75%로 가장 높은 전환 수율을 보였다. 그러나 나린진(naringin)의 경우 9%였고, 헤스페리딘(hesperidin)과 아스코빅산(ascorbic acid)에서는 거의 일어나지 않았다.
이상의 결과에서 보는 바와 같이 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 내열성 고당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈는 스테비오사이드에 대해 가장 높은 당전이성을 보여, 최근 대체감미료로 주목받고 있는 당전이 스테비오사이드 제조에 적합한 효소로 판단된다.
[표 3] 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당공여체에 대한 기질 특이성.
<실시예 4> 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 내열성 고당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당전이 반응능 분석.
지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 내열성 고당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당전이 반응능을 기존의 상업적으로 시판되고 있는 아마노사(Amano Co., Japan), 하야시바라사(Hayashibara Co., Japan), 그리고 노보사(Novo Co., Netherland)의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈와 비교분석하였다. 이를 위하여 당공여체인 가용성 전분과 당수용체인 스테비오사이드를 각각 1.0%(w/v)로 혼합된 반응액에 동일한 효소활성의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 첨가하고 당전이 반응을 수행하여 최종적인 당전이 반응수율을 조사하여 표 4에 나타내었다.
그 결과 본 발명의 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 내열성 고당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당전이 반응수율이 67%로 현재 당전이 효소활성이 우수한 것으로 알려진 하야시바라사와 노보사의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 당전이 반응수율 61%와 62%보다 높았다. 따라서 본 발명의 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈는 당전이능이 현재 시판효소보다 우수한 고당전이성 효소로 산업적 활용가치가 높을 것으로 판단된다.
[표 4] 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈와 시판 당전이 효소와의 당전이 반응능 비교.
<실시예 5> 고당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드 제조.
(1) 당전이 스테비오사이드 제조를 위한 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 적정 사용량.
본 발명의 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 내열성 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용하여 당전이 스테비오사이드를 제조하기 위하여 효소 첨가량에 따른 스테비오사이드의 당전이 반응수율을 조사하였다. 이를 위하여 당공여체로 가용성 전분 50그램/리터와 당수용체로 스테비오사이드 50그램/리터를 혼합하고 당전이 효소인 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 전분 1그램당 5에서 70 단위의 효소를 첨가한 후 50℃에서 24시간동안 당전이 반응을 수행하였다.
그 결과 도 5에서 보는 바와 같이 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 양이 전분 1그램당 5에서 25 단위일 때까지는 당전이율이 지속적으로 증가하였으나 그 이후로는 오히려 더 이상 크게 증가하지 않았다. 따라서 본 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용하여 당전이 스테비오사이드 제조를 위한 적정 효소 사용량은 전분 1그램당 25 단위 이상으로 판단된다.
(2) 본 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드 제조에서 적정 당공여체와 당수용체의 혼합비율.
본 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드 제조에서 적정 당공여체와 당수용체의 혼합비율을 조사하고자 가용성 전분을 75 그램/리터로 고정하고 스테비오사이드의 농도를 5그램/리터에서 100 그램/리터까지 변화시킨 후 24시간 후의 당전이반응을 수행하였다.
그 결과 도 6에서 보는 바와 같이 스테비오사이드의 첨가농도가 증가함에 따라 당전이율이 증가하여 당공여체인 가용성 전분과 당수용체인 스테비오사이드의 혼합비율이 3:2인 스테비오사이드 첨가농도가 50그램/리터일때 최대 93%까지 도달하였다. 따라서 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드 제조에서 적정 당공여체와 당수용체의 혼합비율은 3:2(그램 전분/그램 스테비오사이드)로 판단된다.
<실시예 6> 고당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 유전자의 클로닝 및 염기서열 분석.
신규 호열성 지오바실루스 에스피 티지-1의 염색체 디엔에이(genomic DNA)를 분리하여 제한효소 HindⅢ를 이용하여 부분 분해한 후 아가로스겔 전기영동(agarose gel electrophoresis)으로 분리하였다. 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 아미노말단과 단백질내 일부 아미노산 서열로부터 제조한 디엔에이 탐침(DNA probe)을 이용하여 서던 하이브리드화(southern hybridization)를 통해 양성반응을 나타낸 약 2.2 kb의 디엔에이 단편을 얻었다. 상기의 디엔에이 단편을 pZErOTM-2 벡터(Invitrogen Co. California, USA)에 삽입하여 대장균에 형질전환시켰다.
재조합 대장균은 1.5%(w/v)의 가용성 전분과 50㎕/ml의 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 엘비 고체배지(LB solid media)에서 37℃에서 1일간 배양하였다. 배양 후 고체배지에 요오드 용액에 노출시켜 전분이 분해되어 형성되는 전분 분해환이 관찰된 집락(colony)을 분리하고, 카나마이신(kanamycin)을 포함하는 엘비 액체배지(LB liquid media)에서 다시 배양하였다. 배양된 재조합 대장균을 원심분리기를 이용하여 회수한 후 초음파로 파쇄하여 얻은 세포 추출물을 조효소액으로 이용하여 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 활성을 측정하여 가장 높은 당전이 활성을 보이는 집락에 형질전환된 지오바실루스 에스피 티지-1의 디엔에이 단편이 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 유전자임을 증명하고 그 염기서열을 분석하여 그 결과를 지오바실루스 에스피 티지-1 유래의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 유전자의 염기 및 아미노산 서열로 서열목록 1과 2에 나타내었다.
본 발명에서 확보한 신규 호열성 지오바실루스 에스피 티지-1 균주는 당전이반응 활성이 매우 높은 내열성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분비하는 새로운 호열성 토양미생물로 판단된다. 또한 상기 기탁균주 지오바실루스 에스피 티지-1(KACC 91097)가 분비하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 역시 지금까지 보고된 것 보다 높은 당전이반응 활성을 보이는 새로운 내열성 고당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈로서, 특히 스테비오사이드에 대한 당전이반응 활성이 특이적으로 매우 높은 특성을 가지고 있었다. 이와 같은 효소적 특성으로 보아 본 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈는 현재 고감미 대체 감미료인 당전이 스테비오사이드제조에 매우 적합한 효소에 매우 적합하다고 판단되어 산업적 활용도가 매우 클 것으로 기대된다.
도 1 : 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분비하는 신규 호열성 토양미생물 티지-1을 전자현미경으로 관찰한 사진.
도 2 : 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분비하는 신규 호열성 토양미생물 티지-1의 분류·동정을 위하여, 16S 라이보좀 디엔에이 염기서열을 분석하여 작성한 16S 라이보좀 디엔에이의 계통분류도.
도 3 : 본 발명의 신규 호열성 토양미생물 지오바실루스 에스피 티지-1이 분비, 생산하는 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 분리ㆍ정제하여 분자량을 확인한 단백질 전기영동사진.
도 4 : 본 발명에서 분리ㆍ정제된 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 적정 반응 pH와 온도를 검토한 그래프.
도 5 : 본 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드 제조함에 있어, 당전이 효소인 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈의 첨가량에 따른 스테비오사이드에 대한 당전이율에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 6 : 본 발명의 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 이용한 당전이 스테비오사이드 제조함에 있어, 당공여체인 가용성 전분과 당수용체인 스테비오사이드의 혼합비율이 스테비오사이드에 대한 당전이율에 미치는 영향을 나타낸 그래프.
도 7 : 본 발명 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 유전자의 염기서열.
도 8 : 본 발명 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 단백질의 아미노산 서열.
<110> ENZBio Co. Ltd <120> Cyclodextrin glycosyltransferase having high transglycosylating activity from Geobacillus sp. TG-1 and its utilization for production of transglycosylated sweetener <130> KACC 91097 <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 2121 <212> DNA <213> Geobacillus sp. TG-1 <400> 1 atgagaagat ggctttcgct agtcttgagc atgtcatttg tatttagtgc aatttttata 60 gtatctgata cgcagaaagt caccgttgaa gcagctggaa atcttaataa ggtaaacttt 120 acatcagatg ttgtctatca aattgtagtg gatcgatttg tggatggaaa tacatccaat 180 aatccgagtg gagcattact tagctcagga tgtacgaatt tacgcaagta ttgtggtgga 240 gattggcaag gtatcatcaa taaaattaac gatggatatt taacagatat gggtgtgaca 300 gcgatctgga tttctcagcc tgtagaaaat gtattttccg tgatgaatga tgcaagcggt 360 tccacatcct atcatggtta ttgggcgcgc gattttaaaa agccaaaccc gttttttggt 420 agcctcagtg atttccaacg tttagttgat gctgcacatg caaaaggaat aaaggtaatt 480 attgactttg cccccaacca tacttctcct gcttcacaaa cgaatccttc ttatatggaa 540 aacggacgac tgtacgataa tgggacattg cttggcggtt acacaaatga tgccaacatg 600 tattttcacc ataacggtgg aaaaacgttt tccagcttag aggatgggat ttatcgaaat 660 ctgtttgact tggcggacct taaccatcag aaccctgtta ttgataggta tttaaaagat 720 gcagtaaaaa tgtggataga tatggggatt gatggtatcc gtatggatgc ggtgaagcac 780 atgccgtttg gatggcaaaa atctctgatg gatgagattg ataactatcg tcctgtcttt 840 acgtttgggg agtggttttt gtcagaaaat gaagtggacg cgaacaatca ttactttgcc 900 aatgaaagtg gaatgagttt gctcgatttt cgtttcggac aaaaccttcg tcaagtattg 960 cgcaataaca gcgataattg gtatggcttt aatcaaatga ttcaagatac ggcatcagca 1020 tatgacgagg ttctcgatca agagcaagta acattcatag acaaccatga tatggatcgg 1080 tttatgattg acggaggaga tccgcgcaag gtggatatgg cacttgctgt attattgaca 1140 tcccgtggcg taccgaatat ttactatggt acatacatga ccggtaacgg cgatccaaac 1200 aatcgtaaga tgatgagttc attcaataaa aatactcgcg cgtatcaagt gattcaaaaa 1260 ctatcttctc tccgacgaaa caatccggcg ttagcttatg gtgatacgga acagcgttgg 1320 atcaatggcg atgtgtatgt gtatgagcga cagtttggca aagatgttgt gttagttgcc 1380 gttaatcgta gttcaagcag taattactcg attactggct tatttacagc tttaccagca 1440 ggaacatatt taacggatca gcttggcggt cttgacggaa atacaattca agtcggttca 1500 aatggatcag ttaatgcatt tgacttagga ccgggggaag tcggtgtatg ggcatacagt 1560 gcaacagaaa gcacgccaat tattggtcat gttggaccga tgatggggca agtcggtcat 1620 caagtaacca ttgatggcga aggattcgga acaaatacgg gcactgtgaa gttcggaacg 1680 acagctgcca atgttgtgtc ttggtctaac aatcaaatcg ttgtggctgt tcaccaacca 1740 aatgtgggaa aatataatat taccgtccaa tcatcaagcg gtcaaacgag tgcggcttat 1800 gataactttg aagtactaac aaatgatcaa gtgtcagtgc ggtttgttgt taataacgcg 1860 actaccaatc tagggcaaaa tatatacatt gttggcaacg tatatgagct cggcaactgg 1920 gacactagta aggcaatcgg tccaatgttc aatcaagtgg tttactccta tcctacatgg 1980 tatatagatg tcagtgtccc agaaggaaag acaattgagt ttaagttcaa gccaagtttt 2040 acctagtcaa ttacgtaaac tgaatcctgg cccccttcag ccacataccc cgtatgtcca 2100 cgttgtcttt cgtgcggtta a 2121 <210> 2 <211> 681 <212> PRT <213> Geobacillus sp. TG-1 <400> 2 Met Arg Arg Trp Leu Ser Leu Val Leu Ser Met Ser Phe Val Phe Ser 1 5 10 15 Ala Ile Phe Ile Val Ser Asp Thr Gln Lys Val Thr Val Glu Ala Ala 20 25 30 Gly Asn Leu Asn Lys Val Asn Phe Thr Ser Asp Val Val Tyr Gln Ile 35 40 45 Val Val Asp Arg Phe Val Asp Gly Asn Thr Ser Asn Asn Pro Ser Gly 50 55 60 Ala Leu Leu Ser Ser Gly Cys Thr Asn Leu Arg Lys Tyr Cys Gly Gly 65 70 75 80 Asp Trp Gln Gly Ile Ile Asn Lys Ile Asn Asp Gly Tyr Leu Thr Asp 85 90 95 Met Gly Val Thr Ala Ile Trp Ile Ser Gln Pro Val Glu Asn Val Phe 100 105 110 Ser Val Met Asn Asp Ala Ser Gly Ser Thr Ser Tyr His Gly Tyr Trp 115 120 125 Ala Arg Asp Phe Lys Lys Pro Asn Pro Phe Phe Gly Ser Leu Ser Asp 130 135 140 Phe Gln Arg Leu Val Asp Ala Ala His Ala Lys Gly Ile Lys Val Ile 145 150 155 160 Ile Asp Phe Ala Pro Asn His Thr Ser Pro Ala Ser Gln Thr Asn Pro 165 170 175 Ser Tyr Met Glu Asn Gly Arg Leu Tyr Asp Asn Gly Thr Leu Leu Gly 180 185 190 Gly Tyr Thr Asn Asp Ala Asn Met Tyr Phe His His Asn Gly Gly Lys 195 200 205 Thr Phe Ser Ser Leu Glu Asp Gly Ile Tyr Arg Asn Leu Phe Asp Leu 210 215 220 Ala Asp Leu Asn His Gln Asn Pro Val Ile Asp Arg Tyr Leu Lys Asp 225 230 235 240 Ala Val Lys Met Trp Ile Asp Met Gly Ile Asp Gly Ile Arg Met Asp 245 250 255 Ala Val Lys His Met Pro Phe Gly Trp Gln Lys Ser Leu Met Asp Glu 260 265 270 Ile Asp Asn Tyr Arg Pro Val Phe Thr Phe Gly Glu Trp Phe Leu Ser 275 280 285 Glu Asn Glu Val Asp Ala Asn Asn His Tyr Phe Ala Asn Glu Ser Gly 290 295 300 Met Ser Leu Leu Asp Phe Arg Phe Gly Gln Asn Leu Arg Gln Val Leu 305 310 315 320 Arg Asn Asn Ser Asp Asn Trp Tyr Gly Phe Asn Gln Met Ile Gln Asp 325 330 335 Thr Ala Ser Ala Tyr Asp Glu Val Leu Asp Gln Glu Gln Val Thr Phe 340 345 350 Ile Asp Asn His Asp Met Asp Arg Phe Met Ile Asp Gly Gly Asp Pro 355 360 365 Arg Lys Val Asp Met Ala Leu Ala Val Leu Leu Thr Ser Arg Gly Val 370 375 380 Pro Asn Ile Tyr Tyr Gly Thr Tyr Met Thr Gly Asn Gly Asp Pro Asn 385 390 395 400 Asn Arg Lys Met Met Ser Ser Phe Asn Lys Asn Thr Arg Ala Tyr Gln 405 410 415 Val Ile Gln Lys Leu Ser Ser Leu Arg Arg Asn Asn Pro Ala Leu Ala 420 425 430 Tyr Gly Asp Thr Glu Gln Arg Trp Ile Asn Gly Asp Val Tyr Val Tyr 435 440 445 Glu Arg Gln Phe Gly Lys Asp Val Val Leu Val Ala Val Asn Arg Ser 450 455 460 Ser Ser Ser Asn Tyr Ser Ile Thr Gly Leu Phe Thr Ala Leu Pro Ala 465 470 475 480 Gly Thr Tyr Leu Thr Asp Gln Leu Gly Gly Leu Asp Gly Asn Thr Ile 485 490 495 Gln Val Gly Ser Asn Gly Ser Val Asn Ala Phe Asp Leu Gly Pro Gly 500 505 510 Glu Val Gly Val Trp Ala Tyr Ser Ala Thr Glu Ser Thr Pro Ile Ile 515 520 525 Gly His Val Gly Pro Met Met Gly Gln Val Gly His Gln Val Thr Ile 530 535 540 Asp Gly Glu Gly Phe Gly Thr Asn Thr Gly Thr Val Lys Phe Gly Thr 545 550 555 560 Thr Ala Ala Asn Val Val Ser Trp Ser Asn Asn Gln Ile Val Val Ala 565 570 575 Val His Gln Pro Asn Val Gly Lys Tyr Asn Ile Thr Val Gln Ser Ser 580 585 590 Ser Gly Gln Thr Ser Ala Ala Tyr Asp Asn Phe Glu Val Leu Thr Asn 595 600 605 Asp Gln Val Ser Val Arg Phe Val Val Asn Asn Ala Thr Thr Asn Leu 610 615 620 Gly Gln Asn Ile Tyr Ile Val Gly Asn Val Tyr Glu Leu Gly Asn Trp 625 630 635 640 Asp Thr Ser Lys Ala Ile Gly Pro Met Phe Asn Gln Val Val Tyr Ser 645 650 655 Tyr Pro Thr Trp Tyr Ile Asp Val Ser Val Pro Glu Gly Lys Thr Ile 660 665 670 Glu Phe Lys Phe Lys Pro Ser Phe Thr 675 680

Claims (4)

  1. 고감미 대체 감미료인 스테비오사이드에 대해 특이적으로 높은 당전이반응 활성을 나타내는 신규 고당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 세포외로 분비·생산하는 한국농용미생물보존센타에 기탁번호 KACC 91097로 등록된 신규 호열성 토양미생물 지오바실루스 에스피 티지-1(Geobacillus sp. TG-1).
  2. 청구항 1에 있어서; 지오바실루스 에스피 티지-1이 분비하는 다음과 같은 특징을 갖는 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈.
    (1) 물리적 특성 : 분자량과 아미노 말단의 아미노산 서열이 각각 69,000달톤과 Asn-Leu-Asn-Lys-Val-Asn-Phe-Val-Ser-Asp-Val-Val-Val-Gln-Ile 순서인 것을 특징으로 하는 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 고 당전이성 신규 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈.
    (2) 최적 효소반응 pH 및 온도 : 최적 효소반응 pH 및 온도가 6.0과 70℃인 것을 특징으로 하는 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 고 당전이성 신규 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈.
    (3) 당 수용체에 대한 기질 특이성 : 당수용체로 당류로는 포도당, 맥아당, 셀로비오스(cellobiose) 그리고 설탕, 당알콜류로는 이노시톨(inositol), 그리고 배당체로는 스테비오사이드(stevioside)에 대해 특이적으로 높은 당전이 반응 활성을 가지는 것을 특징으로 하는 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 고 당전이성 신규 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서; 기탁균주 지오바실루스 에스피 티지-1이 분비하는 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈를 전분 또는 전분(질)과 스테비오사이드 혼합액에 첨가하여 당전이반응을 수행함으로써 당전이 스테비오사이드를 제조함을 특징으로 하는 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 고 당전이성 사이클로텍스트린 글로고실트랜스퍼레이즈와 이를 이용한 당전이 감미료의 제조방법.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서; 기탁균주 지오바실루스 에스피 티지-1이 분비하는 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈로 본 특허의 서열목록 1과 서열목록 2에 제시된 염기 및 아미노산 서열을 갖는 내열성 지오바실루스 에스피 티지-1이 생산하는 고 당전이성 사이클로덱스트린 글리코실트랜스퍼레이즈 유전자.
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Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100800506B1 (ko) * 2006-02-01 2008-02-04 경북대학교 산학협력단 엘-아스코르브산-알파-글리코사이드 당전이 특이성바실루스 에스피 비엘-12 유래 사이클로덱스트린글리코실트랜스퍼레이즈와 활용
CN102492757A (zh) * 2011-11-25 2012-06-13 中国农业大学 一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法
WO2019193356A1 (en) * 2018-04-04 2019-10-10 Optibiotix Limited Sweeteners and methods of production thereof
US11242550B2 (en) * 2018-01-15 2022-02-08 Jiangnan University High-throughput enzymatic preparation of glucosylated steviol glycosides under programming temperatures
CN116769857A (zh) * 2023-08-23 2023-09-19 诸城市浩天药业有限公司 一种糖基化肌醇的制备及分离纯化工艺

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100800506B1 (ko) * 2006-02-01 2008-02-04 경북대학교 산학협력단 엘-아스코르브산-알파-글리코사이드 당전이 특이성바실루스 에스피 비엘-12 유래 사이클로덱스트린글리코실트랜스퍼레이즈와 활용
CN102492757A (zh) * 2011-11-25 2012-06-13 中国农业大学 一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法
CN102492757B (zh) * 2011-11-25 2014-04-09 中国农业大学 一种用β-环糊精葡萄糖基转移酶提高甜菊糖苷味质的方法
US11242550B2 (en) * 2018-01-15 2022-02-08 Jiangnan University High-throughput enzymatic preparation of glucosylated steviol glycosides under programming temperatures
WO2019193356A1 (en) * 2018-04-04 2019-10-10 Optibiotix Limited Sweeteners and methods of production thereof
CN116769857A (zh) * 2023-08-23 2023-09-19 诸城市浩天药业有限公司 一种糖基化肌醇的制备及分离纯化工艺
CN116769857B (zh) * 2023-08-23 2023-11-07 诸城市浩天药业有限公司 一种糖基化肌醇的制备及分离纯化工艺

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