KR20050092820A - 결명차 추출물 또는 결명차 유래 화합물을 포함하는식물병원균 방제용 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 결명차 추출물 또는 결명차 유래 화합물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물에 관한 것이다. 특히 본 발명은 피리쿨러리아 그리시아, 리조토니아 솔라니, 보트리티스 시네라, 피토프토라 인페스탄스 또는 에리시페 그라미니스의 생육을 저해하여, 이로 인한 식물 병해를 효과적으로 방제할 수 있는 조성물을 제공한다.

Description

결명차 추출물 또는 결명차 유래 화합물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물{COMPOSITION FOR CONTROL PLANT PATHOGENS CONTAINING EXTRACT FROM CASSIA TORA OR COMPOUND DERIVED FROM CASSIA TORA}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 결명차 추출물 또는 결명차 유래 화합물을 포함하는 식물병원균 방제용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 피리쿨러리아 그리시아, 리조토니아 솔라니, 보트리티스 시네라, 피토프토라 인페스탄스 또는 에리시페 그라미니스의 생육을 저해할 수 있는 조성물에 관한 것이다.

[종래기술]

농작물의 경작 시에 발생되는 식물병원균에 의한 경제적 손실은 약 5-50 ％에 달하고 있으며, 개발도상국에서는 이로 인한 손실이 더욱 심각하여 농약을 사용하지 않을 수 없는 실정이다.(Agrios, G. N. In Plant Pathology, 4th Ed., Academic Press, pp 25-37, 1997. ; Oreke, E. C., Dehne, H. W., Schonbeck, F., and Weber, A. Crop production and crop protection: Estimated Losses in Major Food and Cash Crops. Elsevier, Amsterdam, 1994)

병원체에 의한 식물병 발생은, 병원체가 기주식물에 도달하여 부착되는 접종(inoculation) 또는 감염(infection)단계와, 병원체가 기주식물 내부로 들어가는 침입(invasion)단계로 이루어진다. 이후 침입한 병원체와 기주식물 간에 영양관계가 성립되면 최초의 병징이 나타날 때까지 2 - 15일간의 접종기간을 거치고, 기주식물의 병적인 반응(symptom)이 나타나며 병이 지속되면 식물은 죽게 된다. 이때 병원체는 자기가 필요로 하는 양분을 기주세포로부터 지속적으로 탈취하여 기주를 약화시키고, 독소나 효소 또는 생장조절제 등을 분비하여 기주세포의 대사를 교란시키며, 통도 조직을 통한 유기양분과 무기양분 및 물의 이동을 방해하여 접촉하고 있는 기주세포의 내용물을 다 소모시켜 병을 유발한다.

식물 기주에 대한 병원체 또는 환경요인의 지속적인 영향의 결과로 인한 기주 세포와 조직의 기능 이상을 일으키는 식물병은, 크게 하기의 요인에 의한 것으로 구분된다. 감염성 또는 생물성 원인으로 진균병, 세균병, 기생성 고등식물, 바이러스 및 선충 등이 있으며, 환경원인으로는 온도, 토양, 수분, 광량, 산소, 대기오염, 양분결핍, 무기성분의 독성, 토양산도, 농약독성 및 부적당한 경종접 등을 들 수 있다. 그 중 감염성 또는 생물성 원인에 의한 식물병은 살균제에 의한 방제의 대상이다.

지난 수십 년 동안 식물병원균의 제어는 합성 살균제에 의존해왔다. 합성 살균제는 살균효과가 매우 우수한 장점을 가지지만, 지속적이고 반복적인 사용으로 인하여 생태계가 파괴되고, 내성 병원균의 출현과 유용생물과 환경, 그리고 인간의 건강에 부작용을 유발하는 단점이 있다(Brown, A. W. A. John wiley and Sons, New Yorks, 525 pp, 1978). 따라서, 상기한 부작용을 감소시키면서 선택적 방제를 할 수 있는 새로운 살균제의 개발이 시급히 필요하게 되었다. 또한, 1900년대 이후에 개발된 유기합성 농약의 강한 독성, 병해충의 내성 또는 저항성 유발과 농업생산물 및 환경 중 농약의 잔류성이 사회적 문제로 야기되면서, 1970년대 이후에는 이들 농약이 내포하고 있는 모든 문제점을 개선 및 보완하여 인축에 저독성이면서 환경생태계에 영향이 없는 안전한 농약을 개발하는데 주력하고 있다.

또한 1960년대 이후 선택성 살균제가 개발, 실용화된 이후 1970년대에 들어, 살균제에 대한 병원균의 내성(tolerance) 문제가 대두되었다. 선택성 살균제는 그 작용특성에 있어 대상 생물의 범위와 작용점이 한정되어 있으므로, 침입된 약제에 의해 균체내 작용점에 이상이 발생되거나 약제가 작용점에 도달하는 경로의 생리적 조건이 변화되는 경우 병원균에 대한 약제작용이 떨어질 수 있다.

따라서, 이러한 부작용을 감소시키고 선택적 방제를 위한 새로운 살균제의 개발이 필요한 실정이다. 식물은 다양한 물질을 가지고 있기 때문에 식물병원균 방제를 위해 이용되어질 수 있다. 이러한 이유로 많은 연구가 이루어지고 있으며, 식물체 추출물과 식물화합물(phytochemicals)을 살균제뿐만 아니라 이의 모핵화합물로 개발하기 위한 연구 대상으로, 관심이 집중되고 있다(Miyakado, M. J. Pesticide Sci., 11, 483-492, 1986. ; Hedin, P. A., Hollingworth, R. M., Masler, E. P., Miyamoto, J. and Thompsom, D. G. ACS Symp. Ser. No. 658, Am. Chem. Soc., Washington, D. C., 1997).

따라서, 본 발명은 식물병원균을 방제할 수 있는 천연식물 추출물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 식물병원균을 방제할 수 있는 천연식물 유래 화합물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 식물병원균을 방제할 수 있는 천연식물 추출물 또는 화합물을 포함하는 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 결명차 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 살균 조성물을 제공한다.

또한 본 발명은 에모딘(Emodin), 레인(Rhein) 및 이의 유도체로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물을 제공한다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명자들은 식물병원균을 방제할 수 있는 식물을 스크리닝하던 중, 결명차가 식물병원균에 대하여 우수한 살균효과를 가짐을 확인하여 이를 토대로 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 결명차 추출물 또는 결명차 유래 화합물을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 결명차는 긴강남차(Cassia tora 및 Cassia obtusifolia)로도 불리우는 콩과에 속하는 여러해살이풀이다.

본 발명의 결명차 추출물은 결명차 전식물, 결명차의 잎, 뿌리, 줄기, 종자, 꽃 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 추출용매를 사용하여 추출될 수 있다. 예컨대, 결명차 종자인 결명자에 물 또는 유기용매를 1:1 내지 1:100 중량비율로 가하여 추출 또는 분획하여 결명차 추출물을 제조가능하다. 상기 유기용매로는 탄소수 1 내지 5의 알콜, 헥산, 아세톤, 에틸아세테이트, 염화메틸렌 또는 클로로포름유기용매가 있으며, 알콜로는 메탄올, 에탄올, 부탄올 또는 이소프로판올가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 추출방법은 통상의 식물 추출물 제조시 사용되는 침지법 또는 층분리일 수 있으며, 예컨대 메탄올 조 추출물을 제조한 후, 이에 헥산, 클로로포름, 에틸아세테이트 및 부탄올을 순차적으로 가하여 층분리한 분획으로 결명차 추출물을 제조할 수 있다.

본 발명의 결명차 추출물, 특히 결명차 메탄올 추출물, 헥산 추출물, 클로로포름 추출물 및 에틸아세테이트 추출물은 식물병원균에 대하여 우수한 살충활성을 가진다. 상기 식물병원균은 바람직하기로는 피리쿨러리아 그리시아(Pyricularia grisea), 보트리티스 시네라(Botrytis cinerea), 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) 및 에리시페 그라미니스(Erysiphe graminis)로 이루어진 군으로부터 선택된 것이다.

본 발명에 따른 결명차 유래 화합물은 화학식 1의 에모딘(Emodin, 3-methyl-1,6,8-trihydroxyanthraquinone), 화학식 2의 레인(Rhein, 4,5-Dihydroxyanthraquinone-2-carboxylic acid) 화학식 3의 크리아진 및 이들 화합물의 유도체로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물이다.

(화학식 1)

(화학식 2)

(화학식 3)

상기에 나타낸 2종 화합물은 식물병원균, 특히 피리쿨러리아 그리시아, 리조토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네라, 피토프토라 인페스탄스 및 에리시페 그라미니스로 이루어진 군으로부터 선택된 식물 병원균에 대하여 우수한 살균활성을 가진다.

본 발명에서 제공하는 식물병원균 방제용 조성물은 유효성분으로 결명차 추출물 또는 결명차 유래 화합물을 포함하며, 이때 유효성분은 각각의 단일 성분일 수 있으나, 사용목적 및 방법에 따라 2종이상의 혼합물일 수도 있다. 혼합물의 혼합비는 방제하고자 하는 식물 병원균의 활성도에 따라 적절히 조절하는 것이 바람직하며, 예컨대 각 혼합물이 구성성분은 동일 중량비율일 수 있다.

본 발명의 식물병원균 방제용 조성물은 유효성분만을 단독으로 포함할 수 있으며, 유효성분을 0.001 내지 99 중량%, 바람직하기로는 1 내지 20 중량%로 포함하고 잔량의 부형제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 부형제는 통상의 미생물 제제, 살균제, 항균효과 증진제, 희석제 또는 담체일 수 있다.

식물병원균 방제용 조성물은 적용하는 식물 또는 적용방법에 따라 적절한 제형으로 제조할 수 있으며, 예컨대 액제, 유제, 훈연제, 훈증제, 도포제 또는 입제로 제조할 수 있다. 상기 식물병원균 방제용 조성물은 식물에 통상의 방법으로 적용할 수 있다. 구체적인 적용방법은 도포처리, 침지처리, 훈증처리, 또는 살포처리이며, 예컨대 식물병원균 방제용 조성물을 토양, 식물의 잎, 줄기, 종자, 꽃 또는 열매에 살포할 수 있으며, 이때 물 또는 그 외 희석제에 상기 조성물을 희석하여 사용할 수 있다. 본 발명의 식물병원균 방제용 조성물의 적용가능한 식물은 피리쿨러리아 그리시아, 리조토니아 솔라니, 보트리티스 시네라, 피토프토라 인페스탄스 및 에리시페 그라미니스로 이루어진 군으로부터 선택된 식물 병원균이 감염가능한 모든 종류의 식물이며, 그 예로는 벼, 토마토, 가지, 피망, 오이, 호박, 양배추, 양파, 셜롯, 부추(백반엽고병), 딸기, 양상추, 아스파라거스, 파드득나물, 토란, 머위, 연, 함초, 나륵풀, 감자, 강낭콩, 완두 또는 보리가 있다.

식물병원균 방제용 조성물의 적용시기는, 식물병원균의 증식이 원활한 시기에 하는 것이 좋으며, 이는 식물병원균이 발병하는 식물에 종류에 따라 다를 수 있으므로, 식물의 종류에 따라 적절한 시기에 적용하는 것이 바람직하다. 통상적인 적용시기는 식물의 파종, 재배 및 수확 중이다.

식물병원균 방제용 조성물의 적용시기를 보다 구체적으로는 설명하면, 피리쿨러리아 그리시아는 대표적으로 벼 도열병(Rice Blast)을 유발하는 균으로, 여름철 저온시(15 내지 23 ℃), 높은 습도 및 이슬 지속(10시간이상) 또는 질소비료 과다 사용시 발병되므로, 상기한 조건에 해당되는 시기에 본 발명의 방제용 조성물을 적용할 수 있다. 또한 통상적인 벼 도열병 방제시기, 즉 종자소독(침종전), 미도열병(이앙정), 잎도열병(6월하군에서 7월중순) 및 이삭도열병(1차: 2-3개월 출수시, 2차: 1차 방제후 5-7일후)에 적용할 수 있다.

보트리티스 시네라는 토마토, 가지, 피망, 오이, 호박, 양배추, 양파, 셜롯, 부추(백반엽고병), 딸기, 양상추, 아스파라거스, 파드득나물, 토란, 머위, 연, 함초, 나륵풀, 감자, 강낭콩 또는 완두에 감염하여 재빛곰팡이병을 유발하며, 통상적으로 저온, 습윤한 환경을 선호하여 흐리고 비온 뒤 맑은 날이 계속되면 급속하게 확산된다. 또한 발병 적온은 15 ℃ 전후이므로, 상기한 시기에 방제용 조성물을 적용하는 것이 좋다.

리조토니아 솔라니는 주로 벼 잎집 무늬 마름병(Rice Sheath Blight)을 유발하는 균으로, 주로 고온(30 내지 32 ℃), 다습(96% 이상의 습도) 또는 질소과다 및 밀식 조건에서 발병되므로, 상기한 조건에 해당되는 시기에 본 발명의 방제용 조성물을 적용할 수 있다. 또한 통상적인 방제시기, 즉 7월중순에 1차 적용 및 7월하순에 2차 적용하는 것이 좋다.

피토프토라 인페스탄스는 토마토 역병(Tomato Late Blight)의 원인균으로, 노지재배에서는 5 - 7월에 발생이 많으며 억제재배에서는 9 - 11월, 시설의 촉성재배에서는 12 - 2월, 반촉성재배에서는 3 - 5월에 발생이 많으므로, 상기 시기에 여러차례 방제용 조성물을 적용하는 것이 좋다. 또한 피토프토라 인페스탄스는 비가 올때 전파 감염성이 높아지므로, 노지재배에서는 비오기 직전에 방제하고, 시설재배지에서 관수할 때 방제용 조성물을 물에 타서 공급할 수 있다.

에리시페 그라미니스는 보리 흰 가루병(Barley Powdery Mildew)의 원인변으로, 분생포자의 발아 최적온도는 20 ℃이고, 발병에 알맞은 온도는 15 - 20 ℃이며 자낭포자의 성숙에 건습상태의 반복적 조건이 필요하며, 통풍이 나쁘고 음습하며 질소비료를 많이 준 맥류에서 수확기 즈음해서 많이 발생하므로, 상기한 기간에 적용하는 것이 좋다.

식물병원균 방제용 조성물의 적용량은 각 식물의 종류, 병원균 및 적용방법에 따라 적절히 조절할 수 있다. 일예로, 식물병원균 방제용 조성물은 농지 m² 면적당 5 내지 50 g을 시비하거나, 유효성분 기준으로 10 내지 200 ug/plant을 적용할 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예의 한정되는 것은 아니다.

실시예 1-6 : 결명차 추출물 제조

결명자 300 g을 믹서기에서 곱게 마쇄하고, 500 ㎖ 삼각플라스크에 넣은 다음 메탄올 200 ㎖을 혼합하여 실온 암실에서 3일간 방치하였다. 3일 후 여과한 다음 여과액을 회전진공농축기(EYELA autojack NAJ-160, Japan)로 농축하였다. 농축물은 다시 메탄올에 혼합하는 과정을 2회 반복하여 메탄올 추출물(실시예 1)을 제조하였다.

실시예 1의 결명차 메탄올 추출물 20 g을, 800 ㎖의 증류수에 녹인 후 동량의 헥산을 혼합하여 층분리하고, 헥산층을 수득하였다. 상기 과정을 2회 실시하여 헥산 분획 1,600 ㎖를 수득하였다. 상기 분획은 농축 및 동결건조하여 실시예 2의 결명차 헥산 추출물로 준비하였다.

상기 헥산 분획을 수거한 이후 잔류한 물분획에 클로로포름 800 ㎖를 2회 반복하여 혼합 층분리하고, 클로로포름 분획 1,600 ㎖를 수득하였다. 상기 클로로포름 분획은 농축 및 동결건조하여 실시예 3의 결명차 클로로포름 추출물로 준비하였다.

상기 클로로포름 분획을 수거한 이후 잔류한 물분획에 에틸아세테이트 800 ㎖를 2회 반복하여 혼합 층분리하고, 에틸아세테이트 분획 1,600 ㎖을 수득하였다. 상기 에틸아세테이트 분획은 농축 및 동결건조하여 실시예 4의 결명차 에틸아세테이트 추출물로 준비하였다.

상기 에틸아세테이트 분획을 수거한 이후 잔류한 물 분획에 부탄올 800 ㎖을 2회 반복하여 혼합 층분리하고, 부탄올 분획 1,600 ㎖ 및 물 분획을 각각 수득하였다. 상기 부탄올 분획 및 물 분획은 각각 농축 및 동결건조하여 실시예 5 및 6의 결명차 부탄올 추출물 및 결명차 물 추출물로 준비하였다.

실험예 1: 결명차 추출물의 식물병원균에 대한 살균활성 검증

1-1. 실험방법

식물병원균 방제활성은 유 등(1998)이 사용했던 전면처리방법(whole plant method)으로 수행하였다.

일반적인 조추출물에서 살균활성 검정은 5,000 ㎍/㎖을 출발농도로 하여 생물검정을 실시하였으며, 분획, 분리 및 정제 중에 수행된 시료의 농도는 2,000, 1,000, 500, 250, 125 ㎍/㎖에서 측정하였다. 시료는 1 ㎖ 증류수에 1,000 ㎍의 트윈 20(Junsei Chemical, Co. Japan)을 섞은 혼합물에 녹여 사용하였다. 시료용액은 각각 50 ㎖씩 동시에 두 개의 폿트(Pot)에 살포하고, 1일간 건조시킨 후 각각의 병원균을 대상 식물에 접종하였다. 대조군으로는 트윈 20을 사용하였으며 모든 실험은 3회 반복하였다.

가. 벼 도열병(Rice Blast)

벼 도열병(도 1)의 원인균인 피리쿨러리아 그리시아(Pyricularia grisea)에 대한 살균활성 검정실험은 2엽기의(three plant/pot) 벼(품종: 낙동벼)에 대하여 실시하였다.

시료를 살포한 식물에 병원균의 포자 현탁액(1 x 10⁶ 포자/㎖)을 분무접종하고, 상대습도 85 %, 온도 25 ℃인 암실에서 24시간 동안 방치시킨 후, 약제 처리된 식물 및 대조군을 상대습도 85 %, 온도 26 ± 2 ℃인 항온 항습실에서 5일간 배양한 다음 발병면적을 조사하였다. 발병 조사는 2엽기 벼의 최상위엽 바로 밑의 완전 전개된 잎에 형성된 병반면적율로 조사하였다.

나. 벼 잎집 무늬 마름병(Rice Sheath Blight)

벼 잎집 무늬 마름병(도 2)의 원인균인 리조토니아 솔라니(Rhizoctonia solani)에 대한 살균활성 검정실험은 3엽기의 벼(품종: 낙동벼)에 대하여 실시하였다.

벼 잎집 무늬 마름병 균은 밀기울에서 28 ℃, 7일간 배양하고, 잘게 마쇄하여 폿트의 지제부의 토양에 접종하여 습실상의 암실에서 24시간동안 방치시킨 후 상대습도 85 %, 온도 28 ± 2 ℃인 항온항습실에서 5일간 배양한 뒤 발병 면적율을 조사하였다.

다. 오이 잿빛 곰팡이병(Cucumber Gray Mold)

오이 잿빛 곰팡이병(도 3)의 원인균인 보트리티스 시네라(Botrytis cinerea)에 대한 살균활성 검정실험은, 본엽 1엽기의(one plant/pot) 오이(품종: 백다다기)에 대하여 실시하였다.

오이 잿빛 곰팡이병균의 포자 형성을 위하여 PDA 평판배지에 오이 잿빛 곰팡이병균을 접종하여 20 ℃, 암실조건의 배양기에서 15일간 배양하여 형성시킨 포자 현탁액(1 x 10⁶ 포자/㎖)을, 시료 처리된 식물에 분무 접종하고 상대습도 90 %, 온도 20 ℃인 항온항습실에서 4 - 5일간 발병을 유도시킨 후 본엽 1엽의 병반면적율을 조사하였다.

라. 토마토 역병(Tomato Late Blight)

토마토 역병(도 4)의 원인균인 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans)에 대한 살균활성 검정실험은, 본엽 2 - 3 엽기의 (two plants/pot) 토마토(품종: 서광)에 대하여 실시하였다.

시료 처리된 식물에, 토마토 역병균 병원균의 포자 현탁액(1 x 10⁵ zoospores/㎖)을 분무 접종하고, 25 ℃ 습실상에서 48시간 습실 처리한 후 상대습도 95 %, 온도 20 ± 2 ℃인 항온항습실에서 4일간 발병을 유도시킨 뒤 병반면적율을 조사하였다.

마. 보리 흰 가루병(Barley Powdery Mildew)

보리 흰 가루병(도 5)의 원인균인 에리시페 그라미니스(Erysiphe graminis)에 대한 살균활성 검정실험은, 1엽기(four plants/pot)의 보리(품종: 동보리)에 대하여 실시하였다.

식물에 시료를 살포하고 24시간 동안 통풍건조한 후, 흰가루병 포자 현탁액(600 ㎎/L, 250 ppm Tween 20)을 분무 접종하고, 상대습도 50 %, 20 내지 23 ℃의 항온 항습실에서 10일간 발병을 유도시킨 후 병반면적율을 조사하였다.

1-2. 실험결과

상기 실험에서 측정한 병반 면적율을 이용하여 방제가(%)를 하기 계산식으로 환산하였고, 그 결과는 하기 표 1 및 표 2에 나타내었다.

(계산식)

방제가(%) = [(A-B)/A] X 100

A : 대조군의 병반면적율

B : 시료 처리된 식물의 병반면적율

농도(ppm)	식물 병원균 방제가 (%)
	RCB	CGM	TLB	BPM
5,000	100	80	90	100
RCB: 벼 도열병, CGM: 오이 잿빛 곰팡이병, TLB: 토마토 역병, BPM: 보리 흰 가루병

상기 표 1에 나타난 바와 같이, 결명차 메탄올 추출물은 5,000 ㎍/㎖의 농도에서 벼 도열병(RCB), 오이 잿빛 곰팡이병(CGM), 토마토 역병(TLB) 및 보리 흰 가루병(BPM)에 대하여 우수한 살균효과를 나타내었다.

시료	농도(ppm)	식물 병원균 방제가 (%)
		RCB	CGM	TLB	BPM
실시예 2	2,000	0	65	0	0
실시예 3	2,000	90	72	92	100
실시예 4	2,000	100	75	72	100
RCB: 벼 도열병, CGM: 오이 잿빛 곰팡이병, TLB: 토마토 역병, BPM: 보리 흰 가루병

상기 표 2에서, 실시예 2는 오이 잿빛 곰팡이병에 대하여 우수한 살균효과를 나타내었고, 실시예 3 및 실시예 4는 벼 도열병, 오이 잿빛 곰팡이병, 토마토 역병 및 보리 흰 가루병에 대하여 우수한 살균효과를 나타내었다.

실시예 7-9: 결명차 유래 화합물 분리 및 정제

실시예 3의 결명차 클로로포름 추출물 및 실시예 4의 에틸아세테이트 추출물로부터 활성 화합물을 각각 분리 정제하였다.

(1) 클로로포름 추출물

실시예 3에서 수득한 클로로포름 추출물(13 g)을 실리카겔 컬럼크로마토그래피와 HPLC를 여러 회 실시하여, 화합물을 분리하였다.

1차 실리카겔 컬럼크로마토그래피는 클로로포름:메탄올(0, 10, 20, 30, 40, 50%) 그리고 100 % 메탄올 순의 전개용액으로 6가지 분획을 용출시켰다. 상기 6가지 분획(C1, C2, C3, C4, C5, C6)은 클로로포름:메탄올(10:1)상에서 박층크로마토그래피(TLC, SIL G/UV₂₅₄, 0.25 mm layer with fluorescent indicator, Machereynagel Co. Germany)하여 동일한 스팟(UV 램프로 확인, UVGL-58, UV-254/366 nm, UVP Inc. U.S.A)은 통합 후 감압농축하였다. 농축물은 5가지 식물병원균에 대하여 살균효과를 검사하여, 두번째 분획(C2)이 활성분획임을 확인하였다.

2차 실리카겔 컬럼크로마토그래피는 상기 두 번째 활성분획(C2)을 클로로포름:메탄올 (25:1)의 용매상에서 실시하였고, 총 5가지 분획(C21, C22, C23, C24, C25)을 용출시켰다. 상기와 동일한 실험을 실시하여 세 번째 분획(C23)이 활성분획임을 확인하였다. 또한 상기 세 번째 분획을 상온에서 정치시켜 침전물(C231)과 상층액(C232)을 분리하여 각각에 대한 살균효과를 검사하였고, 침전물에서 살균효과를 확인하였다.

상기 침전물(C231)은 클로로포름:메탄올(50:1) 상에서 3차 실리카겔크로마토그래피를 실시하고, 용출시킨 5가지 분획(C2311, C2312, C2313, C23P4) 중에 세 번째 분획(C2313)인 활성분획임을 확인하였다.

상기 세 번째 분획(C2313)은 유속 1.5 ml/min, 클로롤포름:아세톤:메탄올(50:2:1), Sephadex LH-20 컬럼(Pharmacia, 800 x 49 mm, USA)을 실시하여 4개의 분획(C23131, C23132, C23133, C23134)중에 첫 번째(C23131: Chrysazine)와 세 번째 분획(C23133)이 살균활성을 띄었다.

C23133은 유속 2.0 ml/min, 클로롤포름:메탄올(20:1)로 충전하고, Polyclar AT 컬럼(Touzart and Matignon, 100 g, USA)을 사용하여 용출용매로는 메탄올의 비율을 점진적으로 (1, 2, 5, 10%) 실시하여 3개의 분획(C231331, C231332, C231333)중에 두 번째(C231332: Emodin)이 살균활성을 띄었다.

정제한 활성분획은 크로마토그래피와 분광학적인 방법(Mass, FT-IR, 1H NMR, 13C NMR)으로 분석하여, 크리아진(Chrysazine) 및 에모딘(Emodin) 화합물을 확인하였다.

(1) 에틸아세테이트 추출물

에틸아세테이트 추출물(20 g)을 실리카겔 컬럼크로마토그래피로 여러 회 반복하여 분리하였다. 유리관 칼럼(Merck 70-230, 900 g, 90 x 6.0 cm)을 시료의 양에 따라 선택하여 사용하였다. 에틸아세테이트 추출물의 주 전개용매는 헥산:에틸아세테이트(20:1, 10:1, 5:1. 3:1, 2:1과 1:1), 에틸아세테이트, 메탄올순의 전개용매로 실시하여 용출 분획들을 수득하였다. 분획은 감압 증류하여 살균효과를 확인하였다. 그 결과 용출된 6가지 분획(E1, E2, E3, E4, E5, E6) 중 세 번째 분획(E3)이 가장 높은 활성을 나타내었다.

상기 세 번째 분획에 대한 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 더욱 실시하였다. 헥산:에틸아세테이트(5:1)의 용매로 용출시켜 5가지 분획(E31, E32, E33, E34, E35)을 수득하였고, 5가지 분획은 박층크로마토그래피(TLC, SIL G/UV₂₅₄, 0.25 mm layer with fluorescent indicator, Machereynagel Co. Germany)하였다. TLC 전개용매는 헥산:에틸아세테이트(5:1)를 사용하였고, 전개결과 UV 램프(UVGL-58, UV-254/366 nm, UVP Inc. U.S.A)로 확인하였을 때 동일 스팟으로 확인된 분획은 통합하였고, 감압 농축한 후 살균효과를 검사하였다. 그 결과 5가지 분획중 두 번째 분획(E32)에서 강한 살균효과가 나타났다.

상기 두 번째 분획은 상온에서 24시간 방치한 후에 오일(E321)과 침전물(E322)로 분리하였고, 오일 및 침전물에 대한 살균효과를 실험하였다. 그 결과 침전물(E322)이 강한 살균효과를 나타내었다.

상기에서 수득한 침전물을 클로로포름:메탄올(30:1)상에서 실리카겔 크로마토그래피를 실시하여, 다섯가지 분획(E3221, E3222, E3223, E3224, E3225)을 수득하였다. 분획들은 감압 농축하고, 살균효과를 확인한 결과 두번째 분획(E3223)이 활성분획이었다.

상기 활성분획은 클로롤포름:메탄올(50:1)상에서 세번째 분획(E3223)을 실리카겔크로마토그래피를 실시하여 세가지 분획(E32231, E32232, E32233)을 수득하였다. 상기 세가지 분획시료는 박층크로마토그래피(TLC)로 동일성 여부를 판단하고, 살균효과를 검사하였다. 그 결과 세가지 분획중에 두 번째 분획(E32232)에서 살균효과를 나타내었다.

E32232는 유속 2.0 ml/min, 클로롤포름:메탄올(50:1), 분취용 Prep. HPLC 컬럼을 실시하여 3개의 분획(E322321, E322322, E322323)중에 두 번째 분획(E322322: Rhein)이 활성을 띄었다.

정제된 화합물은 크로마토그래피와 분광학적인 방법(Mass, FT-IR, 1H NMR, 13C NMR)을 이용하여, 레인(Rhein)을 확인할 수 있었다.

실험예 2: 결명차 유래 화합물의 식물병원균에 대한 살균활성 검증

실시예 7 내지 9의 화합물 각각은 500, 250 및 125 ㎍/㎖의 농도로 사용하여 식물병원균에 대한 살균활성을 확인하였다. 실험방법은 실시예 1과 동일한 방법으로 실시하였으며, 대조구로 클로로탈로닐(Chlorothalonil)과 디클로플루아니드(Dichlofluanid)를 사용하였다. 그 결과는 표 3에 나타내었다.

시료	농도(ppm)	식물 병원균 방제가 (%)
		RCB	RSB	CGM	TLB	BPM
실시예 7	500	0	100	85	65	100
	250	0	72	65	40	92
	125	0	54	42	20	84
실시예 8	500	0	75	51	100	0
	250	0	55	34	100	0
	125	0	43	14	81	0
실시예 9	500	100	0	68	78	100
	250	82	0	41	64	100
	125	55	0	23	47	84
클로로탈로닐	50	0	0	0	95	0
디클로풀루아니드	50	0	0	92	0	0
RCB: 벼 도열병, RSB: 벼 잎집 무늬 마름병CGM: 오이 잿빛 곰팡이병, TLB: 토마토 역병, BPM: 보리 흰 가루병

상기 표 3에 나타난 바와 같이, 실시예 7의 에모딘은 벼 잎집 무늬 마름병, 오이 잿빛 곰팡이병, 토마토 역병 및 보리 흰 가루병에 대하여, 실시예 8의 레인은 벼 잎집 무늬 마름병, 오이 잿빛 곰팡이병 및 토마토 역병에 대하여, 실시예 9의 크리아진은 벼 도열병, 오이 잿빛 곰팡이병, 토마토 역병 및 보리 흰 가루병에 500, 250, 125 ㎍/㎖의 농도에서 살균효과를 나타내었다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명의 결명차 추출물 및 결명자에서 분리한 화합물은 식물병원균에 활성을 가져, 벼 도열병, 벼 잎집 무늬 마름병, 오이 잿빛 곰팡이병, 토마토 역병 또는 보리 흰 가루병 방제에 기존의 화학방제제를 대체할 천연생리활성물질로 사용할 수 있다.

도 1은 벼 도열병 사진이고,

도 2는 벼 잎집 무늬 마름병 사진이고,

도 3은 오이 잿빛 곰팡이병 사진이고,

도 4는 토마토 역병 사진이고,

도 5는 보리 흰 가루병 사진이다.

Claims (5)

1. 결명차 추출물을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 결명차 추출물은 결명차 또는 이의 일부를 탄소수 1 내지 5의 알콜, 헥산, 에틸아세테이트, 클로로포름 및 증류수로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 용매로 추출한 것인 식물병원균 방제용 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 식물병원균은 피리쿨러리아 그리시아(Pyricularia grisea), 보트리티스 시네라(Botrytis cinerea), 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) 및 에리시페 그라미니스(Erysiphe graminis)로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.
4. 에모딘(Emodin), 레인(Rhein) 및 이들의 유도체로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 화합물을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물.
5. 제 4항에 있어서, 상기 식물병원균은 피리쿨러리아 그리시아(Pyricularia grisea), 리조토니아 솔라니(Rhizoctonia solani), 보트리티스 시네라(Botrytis cinerea), 피토프토라 인페스탄스(Phytophthora infestans) 및 에리시페 그라미니스(Erysiphe graminis)로 이루어진 군으로부터 선택된 조성물.