KR20050085605A - 단일 에피토프의 표적화 - Google Patents

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KR20050085605A
KR20050085605A KR1020057010743A KR20057010743A KR20050085605A KR 20050085605 A KR20050085605 A KR 20050085605A KR 1020057010743 A KR1020057010743 A KR 1020057010743A KR 20057010743 A KR20057010743 A KR 20057010743A KR 20050085605 A KR20050085605 A KR 20050085605A
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쇠렌 모우릿센
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파멕사 에이/에스
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Abstract

본 발명은 자가 항원 내에 존재하는 단일 에피토프에 대해 지향된 특이적인 B 세포 면역성을 유발시킬 수 있는, 신규한 면역원 제제에 관한 것이다. 본 발명의 면역원 제제는 제1 수용체에 특이적으로 결합하는 키메라 결합 단백질로서, 상기 제1 수용체는 동물의 항원에 존재하는 제2 수용체에 결합하는 것이고, 상기 키메라 결합 단백질은: (a) 제1 수용체와 특이적으로 결합하고 제1 수용체와의 결합을 놓고 제2 수용체와 경쟁하는, 결합 부위 형태의 B 세포 에피토프, (b) 상기 포유류와 자가인 스캐폴드 단백질 구조 및 (c) 상기 동물과 이종이며 상기 동물 중의 MHC 클래스 II 분자에 결합하는, 1종 이상의 관용성 파괴 아미노산 서열을 포함하여 이루어진다. 바람직한 구체예에서, 상기 키메라 결합 단백질은 도입된 관용성 파괴 아미노산 서열을 갖는 항이디오타입 항체 형태이다. 본 발명은 또한 면역원의 제조 방법 및 상기 면역원을 치료에 이용하는 방법에 관한 것이기도 하다. 또한, 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 단백질, 핵산 단편, 재조합적으로 변형된 숙주 세포 및 바이러스에 관한 것이기도 하다.

Description

단일 에피토프의 표적화{TARGETING SINGLE EPITOPES}
본 발명은 활성 특이적인 면역요법 ("치료적 백신 접종 (therapeutic vaccination)") 분야에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 자가 항원에 존재하는 단일 에피토프에 지향된 특이적인 B 세포 면역성을 유발할 수 있는 신규한 면역원 제제에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이러한 면역원의 제조 방법, 이러한 면역원을 치료에 이용하는 방법에 관한 것이기도 하다. 뿐만 아니라, 본 발명은 본 발명의 방법을 실시하는데 유용한 단백질, 핵산 단편, 재조합적으로 변형된 숙주 세포 및 바이러스에 관한 것이기도 하다.
약한 항원과 자가 단백질을 표적으로 하는 활성 특이적 면역요법 (치료적 백신 접종이라고도 알려져 있음)은 지난 이십년간 많은 관심을 끌어 왔다. 어떤 질병 상태와 관련이 있는 항원을 표적화하기 위해 면역계를 자극한다는 아이디어는 환자의 적응성, 안정성 및 효능 측면에서 여러모로 유리한 측면을 갖는다.
전통적으로, 치료적 백신은 항원과 커다란 외래 캐리어 단백질 사이의 화학적 컨쥬게이트로서 제조되어 왔는데, 여기서 상기 캐리어 단백질은 면역계가 외래 물질로서 인식하는 T 세포 에피토프를 제공한다. 이러한 접근법을 보다 정교화시킨 방법에서는, 융합 파트너가 항원 (일반적으로는 단백질성)과 외래 캐리어로 구성되는 융합 분자들을 이용한다. 이러한 두가지 접근법은 자가 단백질보다 면역원성이 더 높은 커다란 캐리어 분자를 산용한다는 것과 B 세포 에피토프를 다수 사용한다는 단점을 함께 가짐으로 해서, 전형적으로, 면역 반응이 주로 캐리어 단백질에 지향되고 그 결과 백신 투여량을 시간이 지남에 따라 증가시켜야 한다는 결과를 초래한다 (당해 기술 분야에서 면역 반응의 "캐리어 억제" 현상으로 알려져 있음). 또한, 커라단 융합 구조물을 사용하면 항원 중의 에피토프를 차폐하는 경향이 있기 때문에, 면역 반응의 관련성을 더더욱 저하시키게 된다.
관련 접근법은, 하나의 정의된 추정 B 세포 에피토프 (짧은 펩타이드 형태)를 단일의 광범위하게 인식된 T 헬퍼 에피토프나 또는 캐리어 단백질에 커플링시키는 것이었다 ("합텐-캐리어" 접근법). 보다 큰 단백질로부터 유래된 펩타이드 스트레치의 자연적인 배열을 그대로 유지하는 것이 대단히 어렵기 때문에, 이러한 접근법은 두가지 모두 단일 B 세포 에피토프에 대한 면역 반응을 조절하기가 너무 어렵다는 공통의 결점을 갖는다. 일반적으로, 이러한 펩타이드 백신은, 유발된 약한 면역 반응으로 인해 많은 문제점에 봉착하게 된다.
또 다른 접근 방법은 자가 항원 또는 에피토프를 필요에 따라, 외래 TH 에피토프를 함유하는 서열과 조합하여, 비면역원성 캐리어에 커플링시키는 것이다. 예컨대, B 세포 에피토프와 TH 에피토프가 결합된 비면역원성 폴리히드록시폴리머 캐리어를 개시하고 있는 WO02/066056호 참조. 이러한 접근법은, 펩타이드에 기초한 다른 접근법과 마찬가지로, 비면역원성 캐리어에 결합된 펩타이드가 유의적인 선형 B 세포 에피토프인 경우에는 효과가 좋으나, 보다 복잡하게 3차원적으로 구속된 에피토프인 경우, 이러한 접근법은 면역원적으로 타당한 3차원 배열로 에피토프를 구속하는 수단을 제공하지 못한다는 결점이 있다.
또 다른 접근 방식은 하향 조절하고자 하는 항원을 인식하는 항체에 대한 항이디오타입 항체를 제조하는 것이었다. 대부분, 이러한 접근법은 항이디오타입 항체의 비이디오타입 대역이 캐리어 부분 역할을 하며, 항이디오타입 항체의 이디오타입이 목표로 하는 항원의 에피토프를 3차원적으로 모방하는 합텐-캐리어 접근법과 유사하다. 여기서도, 항이디오타입 항체는 백신 접종된 동물에게는 외래의 이물질이기 때문에, 시간이 지남에 따라, 항이디오타입 항체의 비필수부에 대해 면역 반응이 일어나거나 또는 항체가 자가 항체임으로 해서, 면역 반응이 매우 약할 것이라는 문제가 있다.
WO99/25378호에서는 결합쌍의 1 요소를 항체의 CDR (complementarity determining region: 상보성 결정 대역) 내로 이식하여 이와 같이 조작된 항체를 면역화제로서 사용하는 것이 제안되어 있다 - 모든 실무 목적 상, 이렇게 조작된 항체는 항이디오타입 항체가 그렇듯이 동일한 특성을 공유할 것이다. WO99/25378호는 이식된 분자에 대한 수용체로서 이종 항체 대 자가 항체를 사용하는 것과 관련된 문제점에 대해서는 아무런 언급도 하고 있지 않다. 즉, 이 문헌에는 백신 접종에 이종 항체를 사용할 경우의 캐리어 억제 문제나, 자가 항체를 사용할 경우의 면역원성 결여에 관하여서는 아무런 설명도 되어 있지 않다.
캐리어 억제와 관련된 상기한 문제점을 극복하는 한가지 방법이 WO95/05849호에 제시되어 있는데, 여기서는 자가 단백질의 3차원 구조를 유지하는 한편 자가 단백질의 아미노산 서열에 단일의 정의된 T 헬퍼 에피토프를 도입함으로써, 자가 단백질의 파괴를 최소화시키는 방식으로 면역화 변형시켜 이용한다. 이러한 접근법은 면역 반응을 캐리어 부분에 대한 것으로 쉬프트 시키지 않으면셔 자가 단백질 중의 대다수의 B 세포 에피토프를 표적화하는 면역 반응을 유발시킨다.
그러나, 어떤 항원들은 여러가지 이유로 인해, 완전한 분자와 반응성인 항체를 생산하는 백신 접종 수단에 의해서는 표적화시키기가 어렵다. 예컨대, 항원은 막 단백질일 수 있으며 이 경우 단지 적은 부분만이 세포외 상(phase)로 노출됨으로 해서, 항체 결합에 이용될 수 있을 뿐이다. 또한, 항원에 대한 폴리클로날 항체 반응을 지향시키는데 적합치 못한 2차 면역 메카니즘 (보체, NK 활성 등)의 활성화를 피하는 것도 중요한 관심사이다. 마지막으로, 어떤 항원들은 안전성의 이유로 해서, 즉 안전성 문제를 회피하기 위해 특이적인 에피토프 대역 내로 표적화되어야만 한다 - 예컨대, IgE는 FcεR 결합 대역 내로 안전하게 표적화될 수 있지만, 그 분자의 다른 부분들이 임상시 표적화될 수 있는가에 대해서는 논란이 있다.
이러한 항원들은 특이적 수동 면역요법으로 표적화될 수 있는데, 여기서는 예컨대, 모노클로날 항체가, 이를 필요로 하는 개체에게 투여되면 (모노클로날 항체는 오직 하나의 에피토프만을 인식한다), 이들은 2차 면역 반응을 일으키지 못한다. 그러나, 모노클로날 항체의 주입은 입원해 있는 동안 실시하여야 하고, 그 투여량은 종종 치료할 때마다 단백질 수그램 단위가 된다. 따라서, 모노클로날 항체를 이용한 치료 비용은 상당히 부담스럽다.
따라서, 캐리어 단백질과의 면역 반응성으로 인한 억제 문제 없이 자가 항원 중의 특정 에피토프에 대해 효과적인 면역 반응을 유발할 수 있는 제제가 시급히 필요하다.
도 1은 필라멘트상 파지의 개략도.
이 도면은 그의 단백질 껍질이 5가지의 상이한 코팅 단백질 (pIII, pVI, pVII, pVIII 및 pIX)로 구성되어 있는 필라멘트상 파지를 도시한 것이다.
도 2는 파지 디스플레이 기술의 개략도.
1회의 패닝은: E.coli 항체 라이브러리의 중복 감염, 재조합 파지 입자의 제조, 파지를 항원과 함께 인큐베이션시키기, 결합되지 않은 파지를 세정 공정을 통해 제거하기, 결합된 파지 입자를 용출시켜 신선한 E.coli 세포를 상기 용출된 파지로 형질도입시키는 것으로 구성된다.
발명의 목적
본 발명의 한가지 목적은, 목표로 하는 항원의 단일 에피토프에 대해 면역 반응을 유발시키는데 유용한 신규한 면역원 제제를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 이러한 면역원 제제의 제조 방법 및 사용 방법 뿐만 아니라 이러한 방법을 실시하는데 유용한 여러가지 분자 생물학적 도구를 제공하는 데 있다.
발명의 요약
본 발명자에 의해, 풍부한 자가 단백질 (예컨대 자가 면역글로불린)을 사용함으로써 항원의 B 세포 에피토프에 대응하거나 그와 동일한 단일의 3차원 구조를 나타낼 수 있는 "스캐폴드" 또는 "캐리어"를 제공할 수 있게 되었다. 이러한 변형된, 풍부한 자가 단백질은 보통은 충분한 면역원성을 나타내지 못하므로 스캐폴드 구조내로 도입된 B 세포 에피토프에 대해 효과적인 면역 반응을 나타내게 하기 위해, 본 발명에 따라 B 세포가 자가반응성 항체를 생산하도록 필요한 T 세포 보조를 자극시켜주는 외래 T 헬퍼 에피토프를 포함하도록 이들을 조작한다.
따라서, 최광의의 가장 일반적인 측면에서 본 발명은 동물에 면역원성인 키메라 결합 단백질에 관한 것으로, 상기 키메라 결합 단백질은 제1 수용체에 특이적으로 결합하는 것이고, 상기 제1 수용체는 다시 상기 동물의 항원에 존재하는 제2 수용체에 결합하는 것으로서, 상기 키메라 결합 단백질은:
- 제1 수용체와 특이적으로 결합하고, 제1 수용체와의 결합을 놓고 제2 수용체와 경쟁하는, 결합 부위 형태의 B 세포 에피토프,
- 결합 부위의 3차원 배열을 안정화시키며, 상기 포유류에 있어서 자가 유래인 스캐폴드 단백질 구조, 및
- 상기 동물과 이종이며 상기 동물의 MHC 클래스 II 분자와 결합하는, 적어도 1종의 관용성 파괴 아미노산 서열
을 포함하여 이루어진다.
본 발명은 또한 본 발명의 키메라 단백질을 코딩하는 핵산 단편에도 관계된다.
본 발명의 세번째 측면은 본 발명의 키메라 결합 단백질의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 본 발명의 핵산 단편을 발현시킬 수 있는 벡터에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 측면은 상기 항원의 에피토프에 대한 면역 반응을 유발하기 위해, 본 발명의 면역원 제제를 투여하는 것에 의한, 자가 항원에 대한 면역화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 특징을 상술하기에 앞서, 본 발명의 이해를 돕기 위해 몇가지 특수 용어와 표현들에 대해 이하에 정의한다.
본 명세서에서 "키메라 결합 단백질"이라 함은 천연적으로는 동일한 분자 중에 그와 같이 결합하여서는 발견되지 않는 아미노산 서열 조합을 포함하는 단백질/폴리펩타이드를 의미하는 것으로 한다. 더욱 구체적으로는, 키메라 결합 단백질은 외래 TH 에피토프 (키메라 결합 단백질의 잔여 부분과 천연적으로는 결합하지 않는다는 의미에서 외래)와 포유류의 단백질 (스캐폴드 또는 캐리어)로부터의 적어도 1종의 아미노산 서열을 함유한다. 또한, 이 용어는 키메라 결합 단백질이 결합 부위 기능을 하는 구조를 포함함을 시사하는 것이다. 이 결합 부위는 스캐폴드의 천연적인 부분일 수도 있고 (항이디오타입 항체인 경우), 또는 스캐폴드내로 도입되거나 이식되는 결합 부위일 수도 있다.
본 명세서에서 "면역원"이라는 용어는 면역 반응을 유발하는 제제 (물질 또는 물질의 조성물)를 가리킨다. 어떤 분자 (예컨대, 자가 숙주에서 관용되는 자가 단백질이나 전통적인 소형 합텐)들은 면역 반응을 유발하지 못한다는 것이 이해될 것이다.
"T 임파구" 또는 "T 세포"는 체액성 면역 반응에서의 헬퍼 활성 뿐만 아니라 다양한 세포 매개성 면역 반응에 책임이 있는 흉선 기원의 임파구를 가리키는 것으로 본 명세서에서 서로 교환적으로 사용된다.
본 명세서에서 "폴리펩타이드"라 함은 본 명세서에서 2 내지 10개 아미노산 잔기의 짧은 펩타이드, 11 내지 100개 아미노산 잔기의 올리고펩타이드와, 아미노산 잔기가 100개보다 많은 포리펩타이드를 모두 포괄한다. 또한, 이 용어는 단백질, 즉, 적어도 하나의 폴리펩타이드를 갖는 기능적 바이오분자도 포함하도록 의도된다; 적어도 2개의 폴리펩타이드를 포함할 경우, 이들은 복합체를 형성하거나, 공유적으로 링크되거나 또는 비공유적으로 링크될 수 있다. 단백질 중의 폴리펩타이드(들)은 글리코실화 및/또는 지질화될 수 있고/ 또는 배합군(prosthetic groups)을 함유할 수도 있다. 또한, "폴리아미노산"이라 함은 "폴리펩타이드"와 동의어로 한다.
"서브서열"이란 자연발생적인 아미노산 서열 또는 핵산 서열로부터 직접 유래하는, 각각 적어도 3개의 아미노산 또는 적어도 3개의 뉴클레오타이드의 연속 스트렛치를 의미한다.
"동물"이란 본 명세서에서 일반적으로, 예컨대 호모 사피엔스 (Homo sapiens), 커니스 도메스티쿠스 (Canis domesticus)등과 같은 동물 종 (바람직하게는 포유류)을 가리키는 것이지만, 반드시 단일의 1종의 동물만을 가리키는 것은 아니다. 그러나, 본 발명의 방법에 따라 면역화된 각각의 개체 모두가, 동일한 면역원(들)에 의해 그 동물을 면역화시킬 수 있도록, 실제로 동일한 항원을 생산하는 것이 중요하기 때문에, 상기 용어는 그러한 동물 종 집단을 가리키는 것이기도 하다. 예컨대, 만일, 항원의 유전적 변이체들이 상이한 인간 서브집단 내에 존재할 경우, 각 집단마다 그 항원에 대한 자가내성을 파괴할 수 있도록 이들 상이한 집단마다 상이한 면역원들을 사용하는 것이 필요할 수 있다. 당업자들에게는 본 명세서에서 말하는 동물이 면역계를 갖는 살아있는 동물이라는 것이 자명할 것이다. 동물은 포유동물과 같은 척추동물인 것이 바람직하다.
본 명세서에서 "항원 활성의 생체내 하향 조절"이라 함은 살아있는 생명체 내에서 문제의 항원과 그의 수용체/리간드 사이의 몇몇 상호반응의 저하 또는 항원이 발휘하는 여하한 다른 측정가능한 생리학적 활성의 하향 조절을 의미한다. 하향 조절은 몇가지 메카니즘에 의해 얻어질 수 있다: 이들 중, 항원 중의 활성 부위를 항체 결합에 의해 단순히 교란시키는 것이 가장 간단하다. 그러나, 항체 결합이 청소 세포 (scavenger cells: 대식세포 및 기타 식세포와 같은)에 의한 항원의 제거를 초래하는 것도 본 발명의 범위에 포괄된다. 또 다른 가능성으로는 성숙한 프로펩타이드를 성숙한 폴리펩타이드로 정상적으로 분해시키는 것을 간섭할 수 있는 항체들을 항원에 결합시키는 것을 들 수 있다.
"면역계에 대한 ... 제시를 수행하는"이라는 표현은 그 동물의 면역계가 잘 조절된 방식으로 면역원에 의해 챌린지된다는 것을 의미한다. 다음에서 명료히 설명되는 바와 같이, 면역계에 대한 이러한 챌린지는 여러가지 방식으로 수행될 수 있으며 가장 중요한 것은 "파막신(pharmaccines") (즉, 진행중인 질병을 치료 또는 경감시키기 위해 투여되는 백신)을 함유하는 폴리펩타이드를 이용한 백신 접종 또는 핵산 "파막신" 백신 접종이고, 생백신 및 바이러스 백신도 본 발명의 범위에 속한다. 달성해야 할 중요한 결과는, 그 동물 중의 면역 경쟁 세포들을 면역학적으로 유효한 방식으로 항원과 대면하도록 하는 것으로서, 이러한 결과를 달성하기 위한 정확한 수단(모드)는 본 발명의 발명 개념상 덜 중요하다.
"면역학적 유효량"이라 함은 면역학 기술분야에서 일반적으로 통용되는 의미, 즉, 면역원과 면역학적 특성을 공유하는 분자에 유의적으로 연관된 면역 반응을 유발할 수 있는 면역원의 양을 가리킨다.
본 명세서에서 단백질이 "변형되었다(modified)"라는 표현은 본 발명의 키메라 결합 분자의 스캐폴드 부분을 형성하는 해당 단백질의 골격을 구성하는 폴리펩타이드를 화학적으로 변형시켰다는 의미이다. 이러한 변형은 예컨대, 스캐폴드의 폴리펩타이드 서열 내에 특정 아미노산 잔기를 유도화시키는 것 (예컨대 알킬화, 아실화, 에스테르화 등)일 수 있으나, 이하의 설명에서 명백히 알 수 있듯이, 바람직한 변형은 그 아미노산 서열의 일차 구조의 변경 (또는 일차 구조에 대한 부가)을 포함하는 것이다.
"...에 대한 자가내성"을 얘기할 때, 본 발명에서 표적으로 하는 항원은 백신 접종될 집단 중의 자가 항원이므로, 그 집단의 정상적인 개체는 그 항원에 대한 면역 반응을 일으키지 않는 것으로 이해된다; 그럼에도, 어떤 동물 집단 중의 개체가 때때로, 예컨대 자가면역 질환의 일부로서 천연 항원에 대한 항체를 생산할 수 있다는 것을 배제할 수는 없다. 어떻든지 간에, 동물은 정상적으로는 그 자신의 항원에 대해서만 자가내성 (자가관용적)일 것이지만, 다른 동물종으로부터 유래되거나 또는 표현형을 달리하는 집단으로부터 유래된 항원 유사체 역시 상기 동물에 의해 관용될 가능성을 배제 할 수는 없다. 본 발명에서는, 스캐폴드 단백질 구조에 대한 그 동물의 관용성은 키메라 결합 단백질의 B 세포 에피토프에 대한 관용성보다 더 높은 레벨이다 - 실상, 스캐폴드 단백질 부분에 대한 관용성은 너무나 높아서 그 동물의 자연 발생적인 스캐폴드 단백질과의 항체 교차 반응에 의해서는 유의적인 면역학적 효과가 얻어지지 않는다.
"외래 T 세포 에피토프" (또는: "외래 T 임파구 에피토프")는 어떤 동물 종의 T 세포를 자극하고, MHC 분자에 결합할 수 있는 펩타이드이다. 본 발명에서 바람직한 외래 T 세포 에피토프는 "무차별(promiscuous)" 에피토프, 즉, 어떤 동물종 또는 동물 집단 중의 특정 부류의 MHC 분자의 실질적인 분획에 결합하는 에피토프이다. 이러한 무차별 T 세포 에피토프는 단지 매우 제한적인 수만 알려져 있으며, 이하에서 이들에 대해 자세히 설명한다. 본 발명에서 사용되는 면역원이 동물 집단의 가능한 한 커다란 분획에서 효과적이기 위해서는, 1) 동일한 키메라 결합 단백질 내로 여러개의 외래 T 세포 에피토프를 삽입하거나 2)서로 다른 무차별 에피토프가 삽입되어 있는 여러개의 키메라 결합 단백질을 제조할 필요가 있을 수 있다. 또한 외래 T 세포 에피토프의 개념은 은닉성(cryptic) T 세포 에피토프, 즉, 자가 단백질로부터 유래하며 문제의 자가 단백질의 일부로서가 아니라, 분리 형태로 존재할 경우 면역원성 거동만을 발휘하는 에피토프의 사용을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
"외래 T 헬퍼 임파구 에피토프" (외래 TH 에피토프)는 MHC 클래스 II 분자에 결합하는 외래 T 세포 에피토프이며, MHC 클래스 II 분자에 결합된 항원 제시 세포 (APC)의 표면 상에 제시될 수 있다. 이와 관련해서, "외래"라는 용어는 TH 에피토프가 면역화된 동물에 대해 외래적이라는 의미일 뿐만 아니라, TH 에피토프가 본 발명의 키메라 결합 단백질의 일부를 구성하는 스캐폴드 단백질 구조와 천연적으로 결합되지 않음을 의미하는 것이다. "관용성 파괴 아미노산 서열 (tolerance braking amino acid sequence)"란 적어도 하나의 그러한 외래 TH 에피토프를 포함하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에서 (바이오) 분자의 "기능적 부분"이라 함은 그 분자에 의해 발휘되는 적어도 한가지의 생화학적 또는 생리적 효과에 책임이 있는 분자의 부분을 의미한다. 당해 기술분야에서는 많은 효소와 기타 이펙터 분자들이 문제의 분자가 발휘하는 효과에 책임이 있는 활성 부위를 갖는다는 것이 잘 알려져 있다. 그 분자의 다른 부분은 안정화 또는 용해도 증진 목적을 위한 역할을 하는 것일 수 있으며 따라서 이러한 목적이 본 발명의 특정 구체예의 맥락에 해당하는 것이 아닐 경우에는 떼어버릴 수 있다. 예컨대 특정의 다른 시토카인을 키메라 결합 단백질 중에서 변형된 부분으로서 사용할 수 있는데 (하기 내용 참조), 이러한 경우, 필요로 되는 안정성이, 키메라 결합 단백질로의 통합에 의해 달성되기 때문에 안정성 문제는 관계없을 수 있다. 항체의 관점에서, 본 명세서에서 기능적 부분은 그 항체에 대해 타당한 에피토프에 결합할 수 있는, 항체 단편인 것으로 의도된다.
"애쥬번트"라는 용어는 백신 기술 분야에서 널리 사용되는 의미, 즉, 1)그 자체로는 백신의 면역원에 대한 특이적인 면역 반응을 이끌어내지 못하지만, 2)그럼에도 불구하고 그 면역원에 대한 면역 반응을 증강시킬 수 있는 물질 또는 물질들의 조성물을 의미한다. 또는, 다른 말로 하면, 애쥬번트 단독에 의한 백신 접종은 그 면역원에 대한 면역 반응을 제공하지 못하고, 면역원에 의한 백신 접종은 면역원에 대한 면역 응답을 일으킬수도, 일으키지 못할 수도 있지만, 면역원과 애쥬번트를 병용한 면역화는 면역원 단독에 의해 유발되는 것보다 더 강하게 면역원에 대한 면역 응답을 유발한다.
어떤 분자의 "표적화"는 본 발명의 문맥상 어떤 분자가 동물 내로 도입될 경우 특정 조직(들)에 우선적으로 나타나거나 특정 세포 또는 세포 유형과 우선적으로 결합되는 상황을 가리킨다. 이 효과는, 표적화를 용이화시키는 그룹의 분자 내로 도입하거나 표적화를 용이화시키는 조성물에 분자를 조성하는 등의 몇가지 방법에 의해 수행가능하다. 이 문제는 이하에 더욱 상세히 설명한다.
"면역계의 자극"이라 함은 어떤 물질 또는 물질의 조성물이 일반적이고, 비특이적인 면역자극적 효과를 나타냄을 의미한다. 몇가지 애쥬번트 및 추정적 애쥬번트 (특정 시토카인 등)는 면역계를 자극하는 능력을 공유한다. 면역자극제의 사용 결과 면역계의 "경계(alertness)"가 증가되면 면역원에 의한 동시적 또는 후속적 면역화가 면역원을 별도로 사용한 경우에 비해 훨씬 더 효과적인 면역 응답을 유발한다는 것을 의미한다.
"생산적 결합(productive binding)"이라 함은 MHC 분자에 결합된 펩타이드를 제시하는 세포에 관련된 T 세포를 자극할 수 있도록 펩타이드가 MHC 분자 (클래스 I 또는 II)에 결합하는 것을 의미한다. 예컨대, APC의 표면 상의 MHC 클래스 II 분자에 결합된 펩타이드가, 이 APC가 제시된 펩타이드-MHC 클래스 II 복합체에 결합된 TH 세포를 자극한다면, 생산적으로 결합되어 있다고 말한다.
본 발명은 몇가지 특이적인 결합제 (모노클로날 항체, 가용성 수용체, 소형 분자 억제제 등)가 안전하고 효과적인 것으로 치료기술 분야에서 허용되고 있다는 지식에 기초하여 발안되었다. 이러한 제제들로는 Remicade (Infliximab, 항TNF mAB), Hercaptin (Trastuzumab, 항HER-2 mAB), Xolair (Omalilzumab, 항IgE mAB), 및 Retuximab (항CD20 mAB을 들 수 있다. 그러나, 이들 특이적인 결합제들 대부분은, 기본적인 안전성 기준을 만족하기 위해서는 의료 감독 및 지도 하에 자주 복용하여야 한다. 따라서, 이들 분자들은 어느 정도 환자 적응성이 결여될 수 있으나, 임상 시도에서는 안전하고도 효과적인 것으로 입증되엇다. 상기 사실에 기초할 때, 면역시키고자 하는 바람직한 항원은 인간 기원의 것, 즉, 면역 반응이 인간 항원의 B 세포 에피토프에 지향된 것인 B 세포 에피토프라는 것을 이해할 수 있을 것이다.
본 발명자들에 의해 당해 기술 분야에서 인식되고 있는 결합제와 상호 반응하는 항원 구조에 대한 폴리클로날 항체 반응을 유발하는 백신을 제조함으로써 - 상기한 면역 반응이 모노클로날 항체의 투여에 의해 제공되는 것과 동일한 장점을 공유하면서도 (즉, 한번에 오직 하나의 항체만이 표적과 결합함으로 해서 2차 면역 반응이 촉발되지 않음), 항체 투여 빈도보다, 면역화 빈도를 훨씬 낮게 유지시킬 수 있다는 부가적인 장점을 제공하는 것이 가능하게 되었다. 또 다른 장점은 유발된 항체가 폴리클로날이기 때문에 (물론 단일 에피토프에 대해 높은 특이성을 가짐) 가능한 가장 강력한 결합 항체를 유발시키는 것이 가능하다는 것이다.
이 기술은 임상적으로 안전한 제제에 결합하는 구조를 정확하게 모사하는 (또는 그러한 구조와 동일한) 3차원 구조를 동정/분리하고 이를 풍부한, 그 밖의 점에 있어서는 비면역원성인 자가 단백질의 면역원 변이체로 내로 병합시킴으로써 수행된다. 이러한 관점에서 본 발명은 WO95/05849호의 면역원성 자가 단백질의 특이화된 변이체인 단백질 구조체를 개시하는 것이나, 여기에는, 그 자가 단백질 부분에 대한 면역 반응이 사소한 것이라는 중요한 차이가 있다. 하기 내용 참조.
어떠한 이론에 구애됨이 없이, 본 발명의 키메라 결합 단백질은 다음과 같은 이유로, 자기 항원의 단일 B 세포 에피토프에 대해 면역 반응을 일으키는데 효과적인 것으로 믿어진다: 예컨대, 항이디오타입 IgG 항체로 면역화시킬 경우, 그 항이디오타입 항체의 이디오타입에 의해 구성된 B 세포 에피토프에 대하여 면역 반응이 일어나는 것으로 관찰된다. 그러나, 그 항이디오타입 항체의 잔류부는 백신화 동물의 자가 유래된 것이고, 그 분자의 그 부분은 전통적인 캐리어 단백질 역할을 할것이므로, 분자의 그 부분에 대해 강력한 면역 반응이 일어날 것이다. 주로 자가 유래의 것인 항이디오타입 항체를 사용함으로써, 이러한 효과는 효과적으로 회피되지만, 대신, 이디오타입 구조에 대한 효과적인 면역 반응은 기대할 수 없다 - 이는, 임상적으로 유의적인 B 세포 반응을 초래하는 TH 임파구의 자극이 불충분하기 때문이다. 본 발명자는 이 특정 세팅에서 항이디오타입 항체에 강력한 외래 TH 에피토프(들)을 도입함으로 해서 그 분자에 대한 관용성을 파괴할 것을 제안한다.
혹시 효과적이지만 유해하기까지 한 면역 반응이 항이디오타입 항체에 대해 일어나는 것이 아닌가 하고 의심스러울수도 있지만, 이와 관련해서는 이 자가 단백질 (IgG)이 백신 접종된 개체의 혈청 중에 풍부한 자가 단백질이 되도록 선택됨을 숙지하는 것이 중요하다. 따라서, 면역계는 그 항체에 대해 생리적으로 타당한 반응을 일으키지 못할 것인데, 이는, B 세포의 면역학적 무반응으로 인해, 면역계가 그러한 단백질에 대해 B 세포 반응을 일으키는 것이 전적으로 불가능하거나, 또는 항체 생산을 실질적으로 유발되지만, 자가 항체 구조가 넘쳐나기 때문에, 이디오타입과 반응하지 않는 유발된 항체들이 대량의 IgG에 결합함으로 인해서 혈청에 "흡수되기" 때문이다.
따라서, 발휘되는 효과와 무관하게, 유일하게 타당하고 효과적인 면역 반응은 항이디오타입 항체의 이디오타입에 대해 지향된 것인데, 이는 항체 반응의 이 부분은 풍부한 혈청 단백질과의 반응성에 의해 "희석"되지 않기 때문이다.
본 발명의 접근 방법은 이러한 면역화된 자가 항이디오타입 항체의 사용만으로 한정되는 것이 아님이 이해될 것이다. 다른 많은 자가 단백질들이 면역시키고자 하는 B 세포 에피토프에 대한 캐리어 구조 역할을 할 수도 있으며 - 여기서 중요한 것은 그 많은 자가 단백질에 대해 유발될 수 있는 항체가 없거나, 또는 항체들이 그 많은 자가 단백질에 대해 유발된다 해서, 이들이 생체내에서 그 많은 자가 단백질에 대한 그들의 결합으로 인해 아무런 악영향을 일으키지 못한다는 것이다 - 즉, 자가 단백질의 농도가 너무 높아서, 목적하는 B 세포 에피토프 외부 대역과 교차 반응하는 항체들을 흡수할 수 있다는 것이다.
본 발명의 키메라 결합 단백질의 특성
스캐폴드 단백질 구조
스캐폴드 단백질 구조는 두가지 목적의 기능을 갖는다. 그 한가지는 의도한타당한 면역 반응을 일으키고자 하는 B 세포 에피토프의 천연 3차원 배열을 스캐폴드 단백질이 안정화시켜야 한다는 것이다. 둘째는, 키메라 결합 단백질을 이용하여 면역화시키는 경우, 스캐폴드 단백질 구조에 대해 유발된 항체 (유발되는 항체가 있는 경우)가 악영향을 미칠수 없어야 한다는 것이다.
스캐폴드 단백질 구조의 안정화 효과와 관련해서: 이것은 일반적으로는 스캐폴드 단백질 구조의 활성 부위 또는 노출된 루프 구조를 이용할 것이다. 예컨대, 어떤 항체의 상보성 결정 대역 (CDRs: complementarity determining regions)은 항체의 헤비 체인과 라이트 체인의 불변부 부분에 의해 그의 정확한 배열을 유지하며, 이것은 활성 또는 결합 부위를 갖는 기타 분자와 효소 중의 활성 부위의 경우에도 마찬가지이다.
스캐폴드 단백질 구조의 비악영향 특성과 관련해서는, 풍부한 단백질로부터 유도된 것들을 이용하는 것이 바람직한데, 이는 이러한 스캐폴드 단백질 구조에 대한 항체가 생산된다 해도, 이러한 항체들이 면역화된 개체에서 자연적으로 일어나는 대량의 스캐폴드 단백질에 의해 흡수될 것이라는 의미이다. 이러한 맥락에서, 스캐폴드 단백질 구조는 풍부한 혈청 단백질로부터 유도되는 것이 특히 바람직하다.
이러한 혈청 단백질의 풍부성은 적어도, 이 단백질에 대해 유발된 항체들이 어떤 나쁜 면역학적 효과도 일으키지 않을 정도 만큼은 높아야 한다. 따라서, 본 발명에 따라, 풍부한 혈청 단백질의 정상적인 혈청 농도는 혈청 100 ml 당 적어도 0.1 g이다. 풍부한 혈청 단백질의 정상적인 혈청 농도는 적어도 혈청 100 ml 당 적어도 0.3 g, 예컨대 혈청 100 ml 당 적어도 0.4 g, 적어도 0.6 g, 적어도 0.8 g, 적어도 1.0 g, 적어도 1.2 g, 적어도 1.4 g, 및 적어도 1.5 g인 것이 바람직하다. 풍부한 혈청 단백질이 알부민인 경우에는 이보다 더 높은 농도, 즉: 혈청 100 ml 당 적어도 2.0 g, 적어도 2.5 g, 적어도 3.0 g, 적어도 3.5 g, 및 적어도 4.0 g인 것이 좋다.
따라서, 특히 흥미로운 스캐폴드 단백질 구조는 알부민, 면역글로불린 (예컨대 IgG 및 IgA), 트랜스페린, α2-마크로글로불린, 합타글루빈, α1-리포단백질, β1-리포단백질으로부터 유래되는 것으로서, 이들 모두는 혈청 농도가 높은 단백질들이다.
키메라 결합 단백질은 IgG와 같은 항체 분자로부터 유래되는 것이 특히 바람직하다. 스캐폴드 단백질 구조는 보통은 그 분자의 비이디오타입 대역, 즉, 완전 항체의 비이디오타입 대역이나 F(ab')2 단편, Fab 단편 및 scFv와 같은 단편으로부터 유도될 것이다. 완전 항체 또는 적어도 그 항체의 Fc부의 대부분을 함유하는 단편을 이용함으로써, 키메라 결합 단백질이 자가 애쥬베이션(adjuvation) 성분을 포함할 수 있다.
따라서, 바람직한 구체예에서, 스캐폴드 단백질 구조는 상기 동물에 자가유래인 폴리펩타이드의 실질적으로 완전한 아미노산 서열, 예컨대, 그 동물의 항체로부터의 헤비 및/또는 라이트 체인의 Fc의 실질적으로 완전한 아미노산 서열을 포함한다. 또한, 스캐폴드 단백질 구조가 그의 친(parent) 자가 단백질을 면역학적으로 닮으려면, 상기 스캐폴드 단백질 구조가 그 동물 중의 자가 스캐폴드 단백질 구조에서 발견되는 B 세포 에피토프를 실질적인 수만큼 포함하는 것이 바람직하다. 스캐폴드 단백질 구조는 상기 동물에 자가적인 폴리펩타이드와 동일한 3차 (및, 타당한 경우 4차) 구조를 갖는 것이 가장 바람직하다. 스캐폴드 단백질 구조가 항체로부터 유도되는 경우, 키메라 결합 단백질은 그의 구조 내에 실질적으로 완전한 항체 분자를 포함할 것이다.
자가 단백질의 3차 구조 및 4차 구조를 보존하는 방법은 당해 기술 분야에 알려져 있다. 예컨대, 외래 TH 에피토프가 도입된 유사 자가 단백질을 제조할 수 있다. 예컨대 WO95/05849, WO00/20027 및 WO00/15807호 참조 - 본 발명의 키메라 결합 단백질의 일부를 형성하는 스캐폴드 단백질 구조상에 가해지는 변형과 관련하여 이들 문헌의 기재 내용을 이용할 수 있다.
4차 구조를 보존하는 방법 역시 기술 분야에 공지이며 적절한 스캐폴드 단백질 구조에 쉽게 응용될 수 있다. 한가지 가능성은 모노머 유닛 중 하나만이 본 발명에 따라 변형된 멀티머 단백질을 제조하는 것이며 (즉, 멀티머 단백질의 천연 모노머 유닛과 정확하게 반응하도록 이 유닛의 3차원 구조를 보존함으로써 모노머 유닛이 변형됨), 각각의 모노머 유닛이 이러한 원리에 따라 변형된 멀티머 변이체를 제조하는 것도 가능하다. 그러나, 또 다른 가능성은 WO03/042244호 (본 명세서에 참조로 통합됨)의 설명에 따라 다른 점에 있어서는 멀티머인 단백질을 "모노머화"하는 것이다. 멀티머화를 허용하는데 충분히 구조를 보존하는 모노머 유닛들의 적절한 변형과 관련한 이 문헌의 다른 설명도 본 발명의 목적상 알맞다.
스캐폴드 단백질 구조가 IgG 분자인 경우, 2차 면역 메카니즘과 그들의 작용을 완전히 회피하기 위해서, 보체를 고정시키지 못하는 서브클래스를 이용하는 것이 유리할 때가 종종 있다. 이것은 예컨대 키메라 결합 단백질을 이용한 면역화 표적이 IgE인 경우 흥미롭다. 그러나, 본 발명의 키메라 결합 단백질에 의해 유발된 임상적으로 타당한 항체들은 동일한 항원에 동시에 결합하는 일 없이 오직 하나의 단일 에피토프에만 결합할 것이기 때문에 (특정 탄수화물에서와 같이 에피토프가 반복적인 특성을 갖는 것이 아닌 한), 이러한 주의는 그다지 필요하지 않을 것으로 믿어진다. 보체 고정 및 활성화는 하나의 항체에 대한 결합만으로는 부족하기 때문에, 이러한, 그리고 다른 2차 이펙터 메카니즘은 문제가 되지 않을 것이다.
키메라 결합 단백질의 B 세포 에피토프 부분
상기 내용으로부터 이해될 수 있는 바와 같이, 스캐폴드 단백질 구조는 백신 접종 하고자 하는 동물에서 발견되는 항원 중의 항원 결정인자와 동일하거나 유사-동일한 공간 배열로, 목적하는 B 세포 에피토프를 제시하는 목적으로 사용된다.
이러한 목적을 달성하는 한가지 방법은 동정된 항원의 B 세포 에피토프를 공지의 제시 구조 또는 스캐폴드 내로 그래프트시키는 것이다. 예컨대, 공지의 항원 에피토프의 아미노산 서열을 제시하기 위해 항체의 상보성 결정 대역 (CDRs)을 변형시킨, 유전적으로 변형된 항체를 제조하는 방법이 기술 분야에 알려져 있다. 항체의 경우, 이들은 예컨대 CDR 그래프팅 (EP 0 239 400; WO 91/09967; US 5,530,101; 및 US 5,585,089), 비니어링(veneering) 또는 리서피싱 (resurfacing) (EP 0 592 106; EP 0 519 596; Padlan E.A., Molecular Immunology 28 (4/5):489-498 (1991); Studnicka 외, Protein Engineering 7(6):805-814 (1994); Roguska 외, PNAS 91:969-973 (1994)) 및 체인 셔플링 (US 특허 제5,565,332)을 비롯한 다양한 기술을 이용하여 인간화될 수 있다.
또는, B 세포 에피토프는 본 발명의 방법에 따라 분리될 수 있는 여하한 아미노산 서열일 수 있다. 후술 내용 참조. 전술한 바와 같이, 본 발명은 이디오타입이 키메라 결합 단백질의 B 세포 에피토프 부분을 구성하는 항이디오타입 항체를 사용하는데 부분적으로 의존하지만, 다른 풍부한 혈청 단백질들을 본 발명에 따라 노출된 루프 구조 중에서 무작위적으로 변형 및 스크리닝시켜 적절한 결합종을 분리시킬 수 있다. 본 발명의 혁신적인 스크리닝법을 이용함으로써, 키메라 결합 단백질의 B 세포 에피토프 부분을 적절한 배열로 실질적으로 제시할 수 있으며, 따라서 만족스러운 방식으로 B 세포 에피토프를 제시할 수도 있고, 제시할 수 없을 수도 있는, 스캐폴드 내로 B 세포 에피토프를 도입하는 것이 필요하지 않다.
따라서, 본 발명의 키메라 결합 단백질은 항체의 이디오타입에 의해 구성되는 B 세포 에피토프를 함유하는 것이 바람직하다. 여기에는 몇가지 이유가 있다: 무엇보다도, 어떤 항체의 이디오타입은 에피토프와 결합하는 것으로 알려진, 정의된 3차원 배열을 갖는다. 또한, 그 항체의 이디오타입이 다른 항체의 이디오타입과 반응성일 경우에는, 그 항체의 이디오타입은 그 다른 항체가 반응하는 항원성 에피토프를 모방할 것이다. 따라서, 문제의 에피토프가 선택된 스캐폴드 단백질 구조 중에 충분히 잘 제시될 것인지를 시험할 필요가 없고, 에피토프가 지엽적인지 또는 천연적으로 어셈블된 위상학을 갖는지도 문제되지 않는다. 뿐만 아니라, 항이디오타입 항체는 백신화제로서 기능할 수 있음으로 해서, 그 이디오타입에 대한 면역 반응을 일으키는 것으로 입증된 바 있다. 마지막으로, 이러한 전략을 이용함으로써, 비단백질성 항원에 대한 항체 반응을 도출할 수 있는 전적으로 단백질 기원의 백신 제제를 고안하는 것이 가능하다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에서, 본 발명의 키메라 결합 단백질은, 상기 제1 수용체가 면역화시키고자 하는 동물 중의 제2 수용체와 결합하는 리간드의 특정 결합 대역이나 항체의 이디오타입인 것이다. 이러한 문맥에서, 본 발명의 키메라 결합 단백질은, 상기 제1 수용체가 모노클로날 항체의 이디오타입인 것인 특히 바람직하다.
관용성 파괴 아미노산 서열 및 그의 위치
물론, 관용성 파괴 아미노산 서열은 키메라 결합 단백질 중의 어떠한 적절한 위치로든 위치될 수 있다. 예컨대, 이것은 스캐폴드 단백질 구조에 대한 단순 융합 파트너 또는 컨쥬게이션 파트너의 형태로 도입될 수 있으며, 이러한 구체예에서는, 관용성 파괴 아미노산 서열이 돤전한 단백질을 구성할 수 있다. 이러한 기술은 당해 기술 분야에 널리 알려져 있으며 글루타르알데하이드 수단에 의해 항원에 대한 캐리어 단백질의 화학적 커플링을 포함한다.
그러나, 관용성 파괴 아미노산 서열은 스캐폴드 단백질 구조의 아미노산 서열 중에 치환 또는 아미노산 삽입 수단으로 도입되는 것이 바람직하다. 특히 바람직한 본 발명의 키메라 결합 단백질은 상기 관용성 파괴 아미노산 서열을 포함하도록 변형된 항이디오타입 항체이거나 또는 그의 효과적인 결합 단편이다 (여기서 상기 항이디오타입 항체는 면역화될 동물의 자가 유래된 것임).
전술한 바와 같이, 관용성 결합 아미노산 서열의 도입은 스캐폴드 단백질 구조에 적어도 하나의 아미노산을 삽입, 부가, 결실 또는 치환시킴으로써 달성될 수 있다. 물론, 정상적인 상황은 아미노산 서열에 하나보다 많은 변경을 도입시키는 것일 것이지만 (예컨대, 완전한 T 세포 에피토프에 의한 삽입 또는 치환), 달성하고자 하는 중요한 목적은 키메라 결합 단백질이 항원 제시 세포 (APC)에 의해 프로세싱될 경우, APC 표면에 MHC 클래스 II 분자 관점에서 제시되는 관용성 파괴 아미노산 서열을 유발할 것이라는 것이다. 따라서, 적절한 위치의 스캐폴드 단백질 구조의 아미노산 서열이 관용성 파괴 아미노산 서열에서도 발견될 수 있는 몇몇 아미노산 잔기를 포함할 경우에는, 이러한 관용성 파괴 아미노산 서열의 도입은 아미노산의 삽입, 부가, 결실 및 치환에 의해 외래 에피토프의 잔류 아미노산을 제공함으로써 달성될 수 있다. 즉, 본 발명의 목적 달성을 위해, 삽입이나 치환에 의해 완전한 TH 에피토프를 도입할 필요가 없다는 뜻이다.
아미노산 삽입, 결실, 치환 또는 부가의 수는 적어도 2, 예컨대 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 및 25개의 삽입, 치환, 부가 또는 결실인 것이 바람직하다. 또한, 아미노산 삽입, 치환, 부가 또는 결실의 수는 150을 초과하지 않는 것이, 즉, 100 이하, 90 이하, 80 이하 및 70 이하인 것이 바람직하다. 아미노산의 치환, 삽입, 결실 또는 부가의 수는 60을 넘지 않는 것이, 특히 그 수가 50을 넘지 않거나 40을 넘지 않는 것이 특히 바람직하다. 가장 바람직한 것은, 그 수가 30을 넘지 않는 것이다. 아미노산 부가와 관련해서는, 결과적인 구조물이 융합 폴리펩타이드 형태인 경우, 이들이 종종 150을 초과할 수 있음을 숙지하여야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예는 적어도 1종의 면역우세적인 (immunodominant) 관용성 파괴 아미노산 서열 (본 명세서에서 "외래 면역 우세 TH 에피토프"라고도 칭함)을 도입하는 것을 포함한다. TH 에피토프의 면역 우세성 문제는 문제의 동물 종에 따라 달라지리라는 것이 이해될 것이다. 본 발명에서, "면역우세"라는 용어는 단순히, 백신 접종된 개체/집단에서 유의적인 면역 반응을 일으키는 에피토프에 대한 것을 가리키는 것이지만, 한 개체/집단에서 면역 우세적인 TH 에피토프가 자가의 다른 개체에서도 반드시 면역우세적인 것은 아니라는 것이 잘 알려져 있다 (비록 후자의 개체에서 MHC-II 분자에 결합할 수 있다고 해도). 따라서, 본 발명의 목적 상, 면역 우세적인 TH 에피토프는 면역 우세적인 항원에 제시될 때 T 세포의 보조럴 제공하는데 효과적일 것인 TH 에피토프이다. 일반적으로, 면역 우세적인 TH 에피토프는 그의 고유한 특성으로서, 이들이 나타나는 폴리펩타이드와 관계없이, 항상 MHC 클래스 II 분자에 결합된 채로 제시될 것이다.
또 다른 중요한 사항은 TH 에피토프의 MHC 제한과 관련한 이슈이다. 일반적으로 자연 발생적인 TH 에피토프는 MHC 제한적이어서, 즉, TH 에피토프를 구성하는 특정 아미노산은 MHC 클래스 II 분자의 서브세트에만 효과적으로 결합할 것이다. 이는, 이번에는 대부분의 경우 하나의 특이적인 TH 에피토프를 사용할 경우 그 집단의 분획에만 효과적인 백신 성분을 결과시킨다는 효과를 나타내고, 그 분획의 크기에 따라, 더 많은 TH 에피토프를 동일한 분자에 포함시키는 것이 필요할 수도 있고, 또는 그의 성분들이, 도입된 TH 에피토프의 특성에 따라 서로 다른 변이체 키메라 결합 단백질인 다성분 백신을 제조하는 것이 필요할 수도 있다.
사용되는 TH 세포의 MHC 제약이 완전히 알려져 있지 않은 경우에는 (예컨대 백신 접종된 동물의 MHC 조성이 잘 정의되어 있지 않은 상황), 특이적인 백신 조성에 의해 포괄되는 집단의 분획은 다음 수학식에 의해 결정될 수 있다:
스캐닝 1
식 중, pi는 백신 조성물 중에 존재하는 i번째 TH 에피토프에 대한 반응자들의 집단에서의 빈도수를 나타내고, n 은 백신 조성물 중의 외래 TH 에피토프의 총 수이다. 따라서, 그 집단 중에서 반응 빈도가 각각 0.8, 0.7 및 0.6인 3개의 외래 TH 에피토프를 함유하는 백신 조성물은 다음과 같이 표시될 것이다:
1 - 0.2 x 0.3 x 0.4 = 0.976
즉, 그 집단의 97.6 퍼센트는 그 백신에 대한 MHC-II 매개 반응을 통계적으로 나타낼 것이다.
전술한 수학식 I은 사용된 펩타이드의 다소나마 정확한 MHC 제한 페턴이 공지인 경우에는 적용되지 않는다. 예컨대, 만약 어떠한 특정 펩타이드가 HLA-DR 대립 유전자 DR1, DR3, DR5 및 DR7에 의해 코딩된 인간의 MHC-II 분자에만 결합한다면, HLA-DR 대립 유전자가 코딩하는 나머지 MHC-II 분자와 결합하는 또 다른 펩타이드와 이 펩타이드를 함께 사용함으로써, 문제의 집단을 100% 커버하는 것이 가능해진다. 마찬가지로, 두번째 펩타이드가 DR3과 DR5와만 결합한다면, 이 펩타이드의 부가는 이러한 커버리지를 전혀 증가시키지 않을 것이다. 만일, 집단 반응을 백신 중의 HH 에피토프의 MHC 제한에 대해서만 기초해서 계산한다면, 특정 백신 조성물에 의해 커버되는 집단의 분획은 다음 수학식에 의해 결정될 수 있다:
스캐닝 2
식 중, ψ j 는 그 집단 중에서, 백신 중의 어느 하나의 TH 에피토프에 결합하는 MHC 분자를 코딩하는 대립 유전자 주조직 적합 항원 염색체 (allelic haplotypes)의 빈도의 합으로서, 3가지 공지 HLA 위치 (DP, DR 및 DQ)의 j번째에 속하는 값이다; 실제로는, 어떤 MHC 분자들이 백신 중의 각각의 TH 에피토프를 인식할 것인지를 먼저 결정한 후 이들의 유형 (DP, DR, 및 DQ)을 기록하고 - 그 다음, 이렇게 기록된 여러가지 대립 유전자 주조직 적합 적합 항원 염색체의 각각의 빈도를 유형별로 요약함으로써, ψ 1 , ψ 2 및 ψ 3 를 얻는다.
수학식 I의 pi 값은 대응하는 이론값 ni를 초과할 수도 있다:
스캐닝 3
식 중, υj는 그 집단 중에서, 백신 중의 i번째 TH 에피토프와 결합하는 MHC 분자를 코딩하는 대립 유전자 주조직 적합 항원 염색체의 빈도의 합으로서, 3가지 공지 HLA 위치 (DP, DR 및 DQ)의 j번째에 속하는 값이다. 이것은 그 집단의 1-ni가 fresidual_i = (pi-ni)/(1-ni)의 반응자 빈도라는 의미이다. 따라서, 수학식 II를 변형시켜 다음의 수학식 IV를 얻을 수 있다:
스캐닝 4
식 중, 1-fresidual_i가 음의 값일 경우에는 이를 0으로 잡는다. 수학식 IV에서는, 모든 에피토프가 주조직 적합 항원 염색체의 동일한 세트에 대해 매핑된 주조직 적합 항원 염색체일 것이 요구됨을 숙지하여야 한다.
따라서, 키메라 결합 단백질에 도입될 관용성 파괴 아미노산 서열을 선택할 때는, 그 에피토프에 대해 입수가능한 모든 정보를 다 포함시켜야 하는 것이 중요하다: 1) 각각의 에피토프에 대한 집단 중 반응자의 빈도, 2) MHC 제한 데이터, 및 3) 해당하는 주조직 적합 항원 염색체의 집단 중의 빈도.
어떤 동물 종의 개체 또는 동물 집단의 대부분에서 활성적인, 천연 발생적인 "무차별 (promiscuous)" TH 에피토프가 몇가지 존재하는데 이들을 백신 내로 도입할 경우 동일 백신에서, 매우 많은 수로 여러가지 유사체가 요구될 필요성이 감소된다.
무차별 에피토프는 본 발명에 따라, 파상풍 독소 (예컨대 P2 및 P30 에피토프), 디프테리아 독소, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 (HA), 및 P. falciparum CS 항원으로부터의 에피토프와 같은, 자연발생적인 인간의 TH 에피토프일 수 있다. P2 및 P30 에피토프의 서열은 각각 Gln-Tyr-Ile-Lys-Ala-Asn-Ser-Lys-Phe-Ile-Gly-Ile-Thr-Glu-Leu (SEQ ID NO: 1) 및 Phe-Asn-Asn-Phe-Thr-Val-Ser-Phe-Trp-Leu-Arg-Val-Pro-Lys-Val-Ser-Ala-Ser-His-Leu-Glu (SEQ ID NO: 2)이다.
지난 수년간 여러가지 무차별 TH 에피토프들이 동정되었다. 특히 여러가지 HLA-DR 대립 유전자에 의해 코딩된 HLA-DR 분자의 대부분에 결합할 수 있는 펩타이드들이 동정되었으며 이들은 모두 본 발명에 따라 사용되는 유사체에 도입시킬 수 있는 T 세포 에피토프들이다. 참조. 또한 본 발명에 참조로 통합된 다음 문헌에 설명된 에피토프들: WO 98/23635 (Frazer IH 외, The University of Queensland에 양도됨); Southwood S 외, 1998, J. Immunol. 160: 3363-3373; Sinigaglia F 외, 1988, Nature 336: 778-780; Chicz RM 외, 1993, J. Exp. Med 178: 27-47; Hammer J 외, 1993, Cell 74: 197-203; 및 Falk K 외, 1994, Immunogenetics 39: 230-242. 후자의 참조문헌은 HLA-DQ 및 -DP 리간드도 다루고 있다. 이러한 참고 문헌에 수록된 모든 에피토프들은 본 발명에서 사용될 관용성 파괴 아미노산 서열의 후보로서 적당하며, 이들과 공통의 모티프를 공유하는 에피토프들도 그러하다.
또는, 관용성 파괴 아미노산 서열은 대부분의 MHC 클래스 II 분자와 결합할 수 있는 여하한 인공적인 TH 에피토프일 수 있다. 이러한 맥락에서, WO95/07707 및 대응하는 논문인 Alexander J. 외, 1994, Immunity 1: 751-761 (두가지 문헌 모두 본 발명에 참조로 병합됨)에 설명된 범 DR 에피토프 펩타이드 ("PADRE": pan DR epitope)는 본 발명에 따라 사용될 관용성 파괴 아미노산 서열의 흥미로운 후보들이다. 이들 논문에 개시된 것들 중 가장 효과적인 PADRE는 투여될 경우 안정성 증진을 위해 C- 및 N-말단에 D-아미노산을 가지는 것이라는 점을 숙지하여야 한다. 그러나, 본 발명은 주로 키메라 결합 단백질의 일부로서, 적절한 에피토프를 병합하는 것을 주목적으로 하며, 이는 APCs의 리소좀 구획 내에서 효소적으로 분해되어 MHC-II 분자 관점에서 후속적인 제시되고 따라서 본 발명에서 사용된 에피토프에 D-아미노산을 병합시키는 것은 적당하지 않다.
특히 바람직한 한가지 PADRE 펩타이드는 아미노산 서열 AKFVAAWTLKAAA (SEQ ID NO: 3) 또는 그의 면역학적으로 효과적인 서브서열이다. 이것과 MHC 제한이 동일하게 결여된 다른 에피토프는 본 발명의 미케라 결합 단백질에 제시되어야 하는 바람직한 관용성 파괴 아미노산 서열들이다. 이러한 초무차별 에피토프들은 백신화된 동물의 면역계에 오직 하나의 단일 키메라 결합 단백질 종만을 제시하는, 본 발명의 가장 간단한 구체예를 가능케 해 줄 것이다.
전술한 내용으로부터, 스캐폴드 단백질 구조 내로 관용성 파괴 아미노산 서열을 도입할 경우 본 명세서에서 설명된 바와 같이 변형 처리될 B 세포 에피토프의 실질적인 분획 또는 심지어 자가의 스캐폴드 단백질 (또는 그의 도메인)의 3차원 구조가 보존된다는 것이 이해될 것이다. 이러한 보존 여부의 확인은 여러가지 방식으로 확인가능하다. 그 한가지 방법은 스캐폴드 역할을 하는 천연 분자에 대해 지향된 폴리클로날 항혈청 (예컨대 토끼 또는 다른 적절한 동물에서 생산된 항혈청)을 간단하게 제조한 다음, 이 항혈청을 생산된 키메라 결합 단백질에 대한 테스트 시약 (예컨대, 경쟁적인 ELISA에서)으로서 사용하는 것이다. 자가의 스캐폴드 단백질 구조가 반응하는 것과 동일한 정도로 항혈청과 반응하는 키메라 결합 단백질은 그 자가의 스캐폴드 단백질 구조와 동일한 3차원 구조를 갖는 것으로 간주되는 반면, 그러한 항혈청과 제한적인 (그러나 여전히 유의적이면서 특이적인) 반응성을 나타내는 키메라 분자는 본래의 B 세포 에피토프의 실질적인 분획을 유지하는 것으로 간주된다. 또는, 자가의 스캐폴드 단백질 상의 다른 에피토프들과 반응하는 모노클로날 항체들을 선택하여 테스트 패널로서 사용할 수도 있다. 이러한 접근 방식은 1) 자가의 스캐폴드 분자의 에피토프 매핑과 2) 키메라 결합 단백질 중에 유지된 에피토프의 매핑을 가능케 해준다는 장점이 있다.
물론, 세번째 접근 방식은 자가의 스캐폴드 단백질 또는 그의 생물학적으로 활성적인 절단물의 3차원 구조를 해상해서 (전술 내용 참조) 이를, 키메라 결합 단백질의 해상된 3차원 구조와 비교하는 것이다. 3차원 구조는 X선 회절 연구 또는 NMR-분광광도계의 도움으로 해상할 수 있다. 3차원 구조와 관련된 추가의 정보는 어느 정도는 원형 이색성 연구로부터 얻으르수 있는데 이 연구는, 주어진 분자의 3차원 구조에 관하여 유용한 정보를 제공하기 위해서, 단지 순수항 혀태의 폴리펩타이드만을 필요로 한다는 장점이 있다 (그 반면, X-선 회절 연구는 결정화된 폴리펩타이드의 제공을 필요로 하고, NMR은 폴리펩타이드의 동위체형 변이체의 제공을 필요로 하며 해상하고자 하는 폴리펩타이드에 대해서도 크기가 제한된다는 문제가 있다). 그러나, 원형 이색성 연구는 2차 구조 요소의 정보를 통한 정확한 3차원 구조의 간접적인 증거만을 제공할 수 있을 뿐이기 때문에, 결론적인 데이터를 얻기 위해서는, 궁극적으로 X-선 회절 및/또는 NMR이 필요하다.
본 발명은 필요한 TH 에피토프를 제공해주는 외래 요소를 스캐폴드 단백질 구조에 도입하는데 특히 적합한 대역을 동정하는데 의존한다. 특히 바람직한 대역은 플렉서블 루프 대역 (3차원 구조에 직접 기여하지 않으)과 플렉서블 링커 대역 및 N 또는 C 말단이다. 또는, TH 에피토프를, 그 에피토프의 2차 구조와 고도로 유사한 2차 구조를 갖는 대역 내로 도입시킬 수도 있다 (α-헬릭스 부분을 형성할 수 있는 에피토프로 α-헬리칼 대역을 치환시킬 수 있고, β-스트랜드 대역 부분을 형성할 수 있는 에피토프로 β-스트랜드 대역을 치환시킬 수 있다). 스캐폴드 단백질 구조 중의 아미노산을 관용성 파괴 아미노산 서열로 치환시킴으로써 키메라 결합 단백질을 제조하는 경우, 그러한 도입은 해당 스캐폴드 단백질의 에피토프에 대해 최소한으로 영향을 미치게 하는 것으로 하는 것이 중요하다. 따라서, 보통은 그러한 치환에 의하여, 결실된 아미노산이 해당 스캐폴드 단백질 (서브0서열의 30% 이하를 구성하는 변이체만이 결과될 것이고, 정상적인 환경하에서는, 이러한 수치는 기껏해야 20%, 즉, 15% 이하, 10%이하, 또 7.5% 이하가 될 것이다. 완전 항체와 같이 대형 분자인 경우, 그 수치는 그보다도 더 낮아서 예컨대 기껏해야 5%, 즉 4% 이하, 그리고 더 적게는 3% 이하, 또는 2% 이하가 된다.
키메라 결합 단백질의 임의 구성 성분
결합 부위 형태의 전술한 B 세포 에피토프는 별론으로 하고, 본 발며으이 스캐폴드 단백질 구조와 관용성 파괴 아미노산 서열, 키메라 결합 단백질은 다른 여러가지 특성들을 갖기도 한다. 이 구체예에서는, 키메라 결합 단백질이:
- 항원 제시 세포 (APC)에 대한 키메라 결합 단백질의 표적화를 실시하는 적어도 1개의 제1 부분(moiety), 및/또는
- 면역계를 자극하는 적어도 1개의 제2 부분, 및/또는
- 면역계에 대한 키메라 결합 단백질의 제시를 최적화시켜 주는 적어도 1개의 제3 부분
을 포함한다.
이들 제1, 제2 및 제3 부분과 관련한 기능 및 구조적 특성들을 이하에 설명한다:
이들은 스캐폴드 단백질 구조의 아미노산 서열의 적절한 화학기에 공유적 또는 비공유적으로 부착된 측기 형태로 존재할 수 있다. 이것은 주된 아미노산 서열을 변경시킴이 없이, 또는 적어도, 그 사슬의 개별적인 아미노산들 간의 펩타이드 결합에 변화를 일으킴이 없이, 자가 스캐폴드 단백질로부터 유래된 아미노산 잔기의 스트렛치가 유도됨을 의미하는 것이다.
상기 부분들은 또한 자가 스캐폴드 단백질 및/또는 관용성 파괴 아미노산 서열로부터 유래된 아미노산 서열의 융합 파트너 형태일 수도 있다. 이와 관련해서, 이러한 두가지 가능성 모두 아미노산 서열을 캐리어와 컨쥬게이션시키는 옵션을 포함한다는 것을 숙지하여야 한다. 하기 내용 참조. 즉, 이러한 문맥상, "융합 단백질"이라는 용어는 단지, 그 구조를 코딩하는 DNA 단편의 발현에 의해 제조된 융합 구조물에만 한정되는 것이 아니라, 후속적인 화학 반응에서 펩타이드 결합에 의해 연결된 두개의 단백질들 간의 컨쥬게이트도 포괄하는 것이다.
전술한 바와 같이, 키메라 결합 단백질은 APC 또는 B 임파구로 키메라 결합 단백질을 표적화시키는 제1 부분의 도입을 포함할 수 있다. 예컨대, 제1 부분은 B 임파구에 특이적인 표면 항원이나 APC 특이적 표면 항원에 대한 특이적 결합 파트너일 수 있다. 이러한 많은 특이적 표면 항원들은 기술 분야에 잘 알려져 있다. 예컨대, 이 부분은 B 임파구나 APC 상에 수용체가 있는 탄수화물일 수 있다 (예컨대 만난 또는 만노스). 또는, 제2 부분은 합텐일 수 있다. 임파구나 APC 상의 표면 분자를 특이적으로 인식하는 항체 단편을 제1 부분으로서 이용할 수도 있다 (표면 분자는 예컨대, 대식세포와 단핵구의 FCγ 수용체, 예컨대 FCγRI일 수 있고, 또는, CD40이나 CTLA-4와 같은 기타의 특이적인 표면 마커일 수도 있다) - 이러한 문맥 상, 항이디오타입 IgG인 본 발명의 키메라 결합 단백질의 사용이 IgG의 FCγ 수용체 결합 대역의 형태로 이러한 제1 부분을 제공한다는 것은 매우 가치가 있다.
이러한 모든 예시적인 표적화 분자들이 애쥬번트의 일부로서 사용될 수 있음을 이해하여야 한다. 하기 내용 참조. CD40 리간드, CD40에 대한 항체, 또는 CD40에 결합하는 그의 변이체들은 수지상 세포에 키메라 결합 단백질을 표적화시킬 것이다. 이와 동시에, 최근의 연구 결과에 의하면 CD40 분자와의 상호반응에 의해, CTL 반응을 얻는데 있어서 TH 세포들이 필수적이지 않은 것으로 나타났다. 따라서, CD40 결합 분자의 제1 부분으로서의 일반적인 이용 (또는 애쥬번트, 하기 내용 참조)은 CTL 반응을 상당한 정도로 증가시킬 것이다; 실상, 이러한 CD40 결합 분자의 애쥬번트로서의 용도와 본 발명의 의미상 "제1 부분"은 그 자체로 진보적인 것이라 믿어진다.
증가된 면역 반응을 얻기 위하여 키메라 결합 단백질을 특정 세포 유형에 표적화시키기 위한 대안 또는 보충적 방안으로서, 면역계를 자극하는 전술한 제2 부분을 포함시킴으로써 면역계의 반응성 수준을 높이는 것이 가능하다. 이러한 제2 부분의 전형적인 예로는 시토카인, 열충격 단백질 및 호르몬과 이들의 유효 부분을 들 수 있다.
본 발명에 따라 사용될 적절한 시토카인은 일반적으로 백신 조성물 중에서 애쥬번트로서도 기능할 것이다. 예컨대, 인터페론 γ (IFN-γ), Flt3 리간드 (Flt3L), 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF); 또는, 시토카인 분자의 기능부의 제2 부분으로서 충분할 수도 있다. 이러한 시토카인의 애쥬번트 물질로서의 용도와 관련하여서는, 하기 내용을 참조하면 된다.
또는, 제2 부분은 독소, 예컨대 리스테리오라이신 (LLO), 지질 A 및 열에 불안정한 내독소일 수도 있다. 또는 MDP(뮤라밀 디펩타이드), CFA (완전 프로인드 애쥬번트) 및 트레할로스 디에스테르 TDM 및 TDE와 같은 몇가지 미코박테리아 유도체들도 흥미로운 후보들이다.
본 발명에 따라, 제2 부분으로서 이용되는 적절한 열충격 단백질은 HSP70, HSP90, HSC70 (열충격 인지체), GRP94 및 칼레티큘린 (CRT)일 수 있다.
면역계에 대한 키메라 결합 단백질의 제시를 촉진시키는 제3 부분의 도입 가능성 역시 본 발명의 중요한 구체예이다. 당해 기술 분야는 이러한 원리의 몇가지 예를 제시하고 있다. 예컨대, Borrelia burgdorferi 단백질 OspA의 팔미토일 지질화 앵커를 이용하여 자가 애쥬베이션 폴리펩타이드를 제공할 수 있다는 것이 알려져 있다 (예컨대 WO96/40718). 지질화 단백질은 폴리펩타이드의 지질화 앵커부 및 그로부터 돌출될 분자의 잔류부를 구성하는 코어와 함께 미셀형 구조를 형성하여, 결과적으로 항원 결정인자를 복수개 제시하는 것으로 보인다. 따라서, 이러한 접근방식 및 상이한 지질화 앵커 (예컨대, 미리스틸기, 파르네실기, 제라닐-제라닐기, GPI-앵커, 및 N-아실 디글리세라이드기)를 이용하는 관련 접근 방식을 이용하는 것이 본 발명에서는 바람직한데, 이는 이러한 지질화 앵커를 재조합적으로 제조된 단백질에 제공하는 것이 상당히 직접적이면서도, 예컨대, 키메라 결합 단백질에 대한 융합 파트너로서 단지, 천연 발생적인 시그널 서열만을 필요로 한다는 점에서 특히 그러하다. 하기 내용 참조. 또 다른 가능성은 보체 인자 C3의 C3d 단편 또는 C3 자체를 사용하는 것이다 (Dempsey 외, 1996, Science 271, 348-350 및 Lou & Kohler, 1998, Nature Biotechnology 16, 458-462) 참조).
본 발명에 따른 면역화 표적
본 발명의 키메라 결합 단백질은 모노클로날 항체 요법에 있어서 적절한 표적인 것으로 기왕에 알려진 항원들을 표적으로 하는 활성 특이적 면역요법에 특히 적합하다. 예컨대, 면역글로불린 E, CD20, CD11a, 베타 아밀로이드, HER-2, 및 TNFα는 본 발명에 모두 적합한 표적들로서, 전수한 제2 수용체가 이들 항원들 중 하나에 존재함을 의미한다. 그러나, 하나의 단일 에피토프를 표적화하는 것이 충분한 (또는 심지어 필요하기 까지 한) 여타의 다른 단백질성 또는 비단백질성 항원을 표적으로 하는 활성 특이적 면역 요법에서는 키메라 결합 단백질을 사용하는 것이 바람직하다.
이러한 표적들은 그 분자의 매우 특이적인 "안전한" 대역만을 표적화하는 것이 바람직한 것일 수 있고 (IgE의 경우처럼, 항IgE 항체의 가교에 의해 유발된 아나필락시스 분제를 회피하기 위해 FCεR 겨합 대역을 표적화시키는 것이 바람직한 경우), 또는, CD20의 경우처럼, 적은 부분만이 세포외상에 노출된, 달리 항체에 접근할 수 없는 항원의 정의된 노출 대역일 수도 있다.
본 발명에 있어서, 면역화에 특히 바람직한 표적은 다음과 같다:
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그러나, 모노클로날 항체 요법이 효과적이거나, 특이적이고 치료적으로 안전한 에피토프 또는 수용체 구조에 결합하는 다른 리간드 (가용성 수용체와 같은)를 이용한 치료 요법이 효과적인 모든 경우에 있어서는, 본 발명에 따른 키메라 결합제를 제조하는 것이 가치가 있다.
핵산 및 기타 분자 생물학적 도구
본 발명은 또한 본 발명의 핵산 결합 단백질을 코딩하는 핵산 단편에 관계된 것이기도 하다. 이러한 핵산 단편은 본 발명의 키메라 결합 단백질의 재조합적 제조방법에 유용할 뿐만 아니라, 핵산 백신 접종을 위한 면역화제의 일부로서도 유용하다. 하기 내용 참조.
상기한 기재내용으로부터, 키메라 결합 단백질이 재조합적 유전자 기술 수단에 의해서 뿐만 아니라, 화학합성 또는 화학적 반합성법으로도 제조될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다; 후자의 두가지 옵션은 그러한 변형이 단백질 캐리어 (예컨대 KLH, 디프테리아 독소, 파상풍 독소 및 BSA) 및 탄수화물 폴리머와 같은 비단백질성 분자에 대한 커플링으로 구성되는 경우, 그리고 물론, 그러한 변형이 폴리펩타이드-유래성 펩타이드 사슬에 측쇄나 측기를 부가하는 것을 포함하는 경우 특히 적당하다.
재조합 유전자 기술의 목적 상, 그리고, 핵산 면역화의 목적 상, 키메라 결합 단백질 또는 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 단편은 중요한 화학적 산물이다. 따라서, 본 발명의 중요한 한 부분은 전술한 키메라 결합 단백질, 바람직하게는, 스캐폴드 단백질 구조 내로 외래 TH 세포 에피토프가 삽입 및/또는 부가, 바람직하게는 치환 및/또는 결실에 의해 도입된 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 단편에 관한 것이다. 본 발명의 핵산 단편은 DNA 또는 RNA 단편일 수 있다. 또한 본 발명의 범위에는 본 발명의 키메라 결합 단백질을 코딩하는 핵산 단편에 상보적인 핵산 단편도 포함된다.
본 발명의 핵산 단편은 일반적으로는 적절한 벡터 내로 삽입됨으로써 본 발명의 핵산 단편을 갖는 클로닐 벡터 또는 발현 벡터를 형성할 것이다. 이러한 본 발명의 벡터 구조와 관련한 상세 내용은 형질전환 세포 및 미생물과 관련하여 후술하기로 한다. 사용 목적 및 적용 유형에 따라, 벡터는 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니 염색체 또는 바이러스 형태를 취할 수 있으며, 특정 세포에서 일시적으로만 발현되는 네이키드(naked) DNA도 중요한 벡터이다. 본 발명의 바람직한 클로닝 및 발현 벡터는 자가 복제할 수 있음으로 해서, 고도 발현 또는, 후속적인 클로닝을 위한 고도 복제를 위해 높은 복제수를 갖는 것들이다.
본 발명의 벡터의 일반적인 개요는 5'→3' 방향으로 다음의 구성원들이 작동적으로 결합된 것이다: 본 발명의 핵산 단편의 발현을 추진하기 위한 프로모터, 폴리펩타이드 단편의 막 내로 분비 또는 통합될 수 있는 리더 펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열, 본 발명의 핵산 단편 및 터미네이터를 코딩하는 핵산 서열. 생산 균주 또는 세포주에서 발현 벡터를 이용하여 작동하는 경우, 형질전환 세포의 유전적 안정성 목적상, 벡터가 숙주 세포 내로 도입될 경우, 숙주 세포 게놈 내로 병합되는 것이 바람직하다. 이와 대조적으로, 어떤 동물에서 생체내 발현을 실시하는데 사용될 벡터를 이용하여 작업될 경우 (즉, DNA 백신 접종시 벡터를 사용할 경우), 보안상의 이유로, 숙주 세포 게놈 내에 병합될 수 없는 벡터를 사용하는 것이 바람직하다; 전형적으로는 네이키드 DNA 또는 비병합성 바이러스 벡터가 사용되며, 어느 것을 이용할 것인지에 대한 선택 기준은 당업자에게 잘 알려져 있다.
본 발명의 벡터들은 본 발명의 키메라 결합 단백질을 제조하기 위해 숙주 세포를 형질전환시키는데 사용된다. 본 발명의 일부이기도 한 이러한 형질전환 세포는, 본 발명의 핵산 단편 및 벡터의 증식을 위해 사용되거나 또는 본 발명의 키메라 결합 단백질의 재조합적 생산을 위하여 사용되는 배양된 세포 또는 세포주일 수있다. 또는, 형질전환 세포들은 핵산 단편 (하나의 단일 또는 복수개의 복제물들)이 삽입되어 키메라 결합 단백질의 세균막이나 세포벽 내로 분비 또는 병합되는 적절한 생백신 균주일 수도 있다.
본 발명의 바람직한 형질전환 세포는 세균 (예컨대 Escherichia (예컨대 E. coli], Bacillus (예컨대 Bacillus subtilis], Salmonella 또는 Mycobacteria [바람직하게는 비병원성, 예컨대 M. bovis BCG]), 효모 (예컨대 Saccharomyces cerevisiae), 및 원생동물과 같은 미생물이다. 또는, 형질전환 세포는 곰팡이, 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유동물 세포와 같은 다세포 유기체로부터 유래된다. 가장 바람직한 것은 인간으로부터 유래된 세포이다. 후술하는 세포주 및 벡터란 참조.
클로닝 및/또는 최적 발현의 목적 상, 형질전환 세포는 본 발명의 핵산 단편을 복제할 수 있는 것이 바람직하다. 핵산 단편을 발현하는 세포는 본 발명의 바람직한 유용한 구체예이다; 이들은 키메라 결합 단백질의 소규모 또는 대규모 제조에 사용가능하고, 또는 비병원성 세균의 경우, 생백신에서 백신 구성원으로서 사용될 수 있다.
본 발명의 키메라 결합 단백질을 형질전환 세포 수단에 의해 제조할 경우, 필수적인 것은 아니지만, 발현 산물을 형질전환 세포 표면 상에 담지되게 하거나 배양 배지 내로 분비시키는 것이 편리하다.
효과적인 생산 세포가 동정된 경우에는, 그를 기초로 해서 본 발명의 벡터를 지니면서 키메라 결합 단백질을 코딩하는 핵산 단편을 발현하는 안정한 세포주를 수립시키는 것이 바람직하다. 바람직하게는, 이러한 안정한 세포주는 본 발명의 키메라 결합 단백질을 분비 또는 담지함으로 해서, 그의 정제를 용이하게 해준다.
일반적으로, 숙주 세포와 양립가능한 종으로부터 유래된 복제물과 대조군 서열을 함유하는 플라스미드 벡터가 그 숙주와 관련하여 사용된다. 벡터는 보통 복제 부위, 형질전환 세포에서 표현형 선별을 가능케 해주는 마킹 서열을 지닌다. 예컨대, E. coli는 일반적으로 E. coli 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 이용하여 형질전환된다 (예컨대, Bolivar 외, 1977 참조). pBR322 플라스미드는 암피실린과 테트라사이클린 내성에 대한 유전자를 함유하므로 형질전환 세포를 동정하기 위한 용이한 수단을 제공해준다. pBR 플라스미드 또는 기타의 미생물 플라스미드 또는 파지는 또한 발현을 위해 원핵생물 미생물에 의해 사용될 수 있는 프로모터도 포함해야 하거나 또는 함유할 수 있도록 변형되어야만 한다.
재조합 DNA 구축에 가장 널리 사용되는 프로모터들은 B-락타마제 (페니실리나제)와 락토스 프로모터계 (Chang 외, 1978; Itakura 외, 1977; Goeddel 외, 1979) 및 트립토판 (trp) 프로모터계 (Goeddel 외, 1979; EP-A-0 036 776)를 함유한다. 이들이 가장 널리 사용되기는 하지만, 다른 미생물 프로모터들도 발견되어 사용되고 있으며, 이들 뉴클레오타이드 서열과 관련한 상세 내용 역시 공개되어 있으므로, 당업자라면 플라스미드 벡터와 이들을 기능적으로 접합시킬 수 있을 것이다 (Siebwenlist 외, 1980). 원핵생물로부터 유래된 몇가지 유전자들은 그 자신의프로모터 서열로부터 E. coli에서 효율적으로 발현될 수 있으므로 인공적인 수단에 의해 다른 프로모터를 부가할 필요가 없다.
원핵생물에 더해, 효모 배양체와 같은 진핵 미생물도 사용가능하며, 본 발명에서 프로모터는 발현을 추진시킬 수 있어야 한다. Pichia pastoris와 같은 다수의 여타 균주도 많이 쉽게 입수할 수는 있지만, Saccharomyces cerevisiae 또는 흔한 빵효모가 진핵 미생물 중 가장 널리 사용되는 것들이다. Saccharomyces 에서의 발현을 위해서는, 예컨대 플라스미드 YRp7이 흔히 이용된다 (Stinchcomb 외, 1979; Kingsman 외, 1979; Tschemper 외, 1980). 이 플라스미드는 예컨대 ATCC no. 44076 또는 PEP4-1과 같이 트립토판에서 자랄 수 없는 효모의 변이 균주에 대한 선별 마커를 제공하는 trpl 유전자를 이미 함유한다 (Jones, 1977). 효모 숙주 게놈의 특징으로서의 trpl 자리의 존재는 이어서 트립토판의 부재시의 성장에 의한 형질전환체를 검출하는 효과적인 환경을 제공해준다.
효모 벡터 중의 적절한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나제에 대한 프로모터 (Hitzman 외, 1980) 또는 기타의 해당 효소 (Hess 외, 1968; Holland 외, 1978), 예컨대 에놀라제, 글리세랄데하이드-3-포스페이트 데히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스페이트 이소머라제, 포스포글루코스 이소머라제, 및 글루코키나제를 포함한다. 적절한 발현 플라스미드를 구축함에 있어서, 이들 유전자와 연관된 종결 서열은 또한 발현시키고자 하는 서열의 발현벡터 3' 말단에 접합되어 mRNA를 폴리아데닐화 및 종결시킨다.
생육 조건에 의해 제어되는 전사와 관련하여 부가적인 장점을 갖는 다른 프로모터들은 알코올 데히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소 및 전술한 글리세랄데하이드-3-포스페이트 데히드로게나제 및 말토스 및 갈락토스 이용에 책임이 있는 효소에 대한 프로모터 대역이다. 효모에 적합한 프로모터, 복제 기점 및 종결 서열을 함유하는 플라스미드 벡터이면 어느 것이든 적합하다.
미생물에 더해서, 다세포 생명체로부터 유래된 세포 배양체 역시 숙주로서 사용가능하다. 이론상, 척추동물 배양체건 무척추동물 배양체건, 이러한 세포 배양체이면 어느 것이든 이용가능하다. 그러나, 척추동물 세포의 것이 가장 흥미로우며, 최근 들어서는, 척추동물 세포를 배양하여 증식시키는 것이 (조직 배양) 일반적인 공정이 되었다 (Tissue Culture, 1973). 이러한 유용한 숙주 세포주의 예로는 VDERO 및 HeLa 세포, 중국산 햄스터 난소 (CHO) 세포주, 및 W138, BHK, COS-7 293 및 MDCK 세포주를 들 수 있다.
이러한 세포에 대한 발현 벡터는 보통 (필요하다면) 복제 기점, 발현시키고자 하는 유전자 전방에 위치된 프로모터, 필요한 리보좀 결합 부위, RNA 스플라이스 부위, 폴리아데닐화 부위, 및 전사 종결 서열을 함유한다.
포유동물 세포에서의 사용을 위해, 발현 벡터 상의 조절 기능이 바이러스 물질에 의해 종종 제공된다. 예컨대, 흔히 사용되는 프로모터는 폴리오마, 아데노바이러스 2로부터 유래된 것들이며, 가장 흔한 것은 Simian Virus 40 (SV40)이다. SV40 바이러스의 조기 및 후기 프로모터가 특히 유용한데 이는 이들 두가지가 모두 SV40 바이러스의 복제 기점 역시 함유하는 단편으로서 바이러스로부터 쉽게 얻어지기 때문이다 (Fiers 외, 1978). 바이러스의 복제 기점 내에 위치하는 BglI 부위를 향해 HindIII 부위로부터 시작되는 약 250 bp의 서열을 포함하는 한, 다소 작거나 큰 SV40 단편들 역시 이용가능하다. 또한, 숙주 세포계와 양립가능한, 목적하는 유전자 서열과 일반적으로 연관된 콘트롤 서열 또는 프로모터를 이용하는 것 역시 가능하고 종종 바람직하기도 하다.
복제 기점은 SV40 또는 기타 바이러스 (예컨대 폴리오마, 아데노, VSV, BPV)로부터 유래될 수 있는 것과 같은 외인성 기점을 포함하도록 벡터를 제조함으로써 제공될수도 있고, 또는 숙주 세포의 염색체 복제 메카니즘에 의해서도 제공될 수 있다. 벡터가 숙주 세포 염색체 내로 통합될 경우, 종종 후자로 충분하다.
본 발명의 조성물
전술한 내용으로부터 명확히 알 수 있는 바와 같이, 본 발명의 키메라 결합 단백질, 본 발명의 핵산 단편 또는 본 발명의 키메라 결합 단백질을 발현함으로 해서 면역원 제제로서 기능할 수 있는, 비병원성 바이러스 또는 세균을 포함하는 면역원 조성물을 제조하는 것이 특히 흥미롭다.
따라서, 본 발명은 또한 자가 숙주 에서 항원에 대한 항체 생산을 유발하기 위한 조성물에 관한 것이기도 하며, 이 조성물은:
- 본 발명의 키메라 결합 단백질 또는 본 발명의 핵산 단편 또는 본 발명의 벡터 (비병원성 바이러스 또는 미생물과 같은 베터를 포함함) 및,
- 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 캐리어 및/또는 비히클 및/또는 애쥬번트
를 포함하여 이루어진다.
면역학적으로 허용가능한 캐리어 및 애쥬번트에 관한 논의는 본 발명의 백신 접종 기술에 관한 섹션에서 다루기로 한다.
폴리펩타이드 백신 접종
본 발명은 자가 항원 또는 어떤 동물에서 상기 자가 항원의 에피토프를 나타내는 세포를 하향 조절하는 방법에 관한 것으로, 이 방법은 그 동물의 면역계에 본 발명의 키메라 결합 단백질의 면역학적 유효량을 제시하는 것을 포함하여 이루어진다. 이러한 목적을 달성하는 한가지 바람직한 방법은 키메라 결합 단백질의 면역학적 유효량을 문제의 동물에게 투여하는 것을 수반하다. 바람직하게는, 키메라 결합 단백질에 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 캐리어 및/또는 비히클, 및, 임의로 애쥬번트가 함께 조성되는것이 좋다.
키메라 결합 단백질을 동물에게 투여함으로써 그 동물의 면역계에 제시할 때, 폴리펩타이드의 포뮬레이션은 당해 기술 분야의 지식과 이론을 일반적으로 따른다.
활성 성분으로서 펩타이드 서열을 함유하는 백신의 제조는 일반적으로, US 특허 4,608,251; 4,601,903; 4,599,231; 4,599,230; 4,596,792; 및 4,578,770에 의해 예시되는 바와 같이 당해 기술분야에 일반적으로 알려져 있으며, 상기한 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 통합된다. 일반적으로 이러한 백신은 액체 용액 또는 현탁액으로서 주사가능한 형태로 조제되며; 주사에 앞서 현탁액, 액체로 용해되기에 적합한 고체 형태도 제조될 수 있다. 이러한 제제는 또한 유화될 수도 있다. 활성 면역원성 성분은 또한 약학적으로 허용가능하며 활성 성분과 양립가능한 부형제와도 종종 혼합된다. 적절한 부형제의 예로는 물, 염수, 덱스트로스, 글리세롤, 에탄올 등, 및 이들의 조합물을 들 수 있다. 또한, 수망되는 경우, 백신은 소량의 보조 성분, 예컨대 습윤제 또는 유화제, pH 완충제 또는 백신의 효능을 증강시켜주는 보조제를 함유할 수도 있다: 후술하는 애쥬번트에 관한 내용 참조.
백신은 비경구적으로 주사, 예컨대 피하, 피내 또는 근육내로 주사될 수 있다. 다른 투여 방식에 적합한 부가적인 포뮬레이션에는 좌제, 및 몇몇 경우 경구, 볼내, 설하, 복강내, 질내, 항문내, 두개골내에 투여되기 위한 포뮬레이션이 포함된다. 좌제의 경우, 예컨대 폴리알킬렌 글라이콜 또는 트리글리세라이드와 같은 전통적인 결합제 및 캐리어를 포함할 수 있고; 이러한 좌제는 0.5 내지 10%, 바람직하게는 1 내지 2% 범위로 활성 성분을 함유하는 혼합물로부터 형성될 수 있다. 경구용 포뮬레이션은 보통, 이러한 일반적으로 사용되는 부형제, 예컨대, 약제학적 등급의 만니톨, 락토스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린 나트륨, 셀룰로스, 탄산 마그네슘 등을 포함한다. 이들 조성물은 용액, 좌제, 정제, 알약, 캡슐제, 서방형 포뮬레이션 또는 분말제 형태이며 활성 성분을 10-95%, 바람직하게는 25-70%의 양으로 함유한다. 경구용 포뮬레이션의 경우, 콜레라 독소가 바람직한 포뮬레이션 파트너이다 (또한 가능한 컨쥬게이션 파트너이기도 하다).
키메라 결합 단백질은 중성 또는 염 형태로서 백신 내로 조성될 수 있다. 약학적으로 허용가능한 염에는 산부가염 (펩타이드의 유리 아미노기와 함께 형성됨) 및 예컨대 염산, 인산과 같은 무기산, 또는 아세트산, 옥살산, 타르타르산, 만델산 등과 같은 유기산과 함께 형성되는 염이 포함된다. 유리 카르복실기와 함께 형성되는 염은 예컨대 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘 또는 수산화제이철과 같은 무기염기 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2-에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수도 있다.
백신은 투여용 포뮬레이션과 혼화가능한 방식으로, 그리고 치료적으로 효과적이면서 면역원을 나타내는 양으로 투여된다. 투여량은 예컨대 면역 반응을 유발시킬 개체의 면역계의 능력, 목적하는 보호 범위를 비롯하여 치료 대상에 따라 달라진다. 적절한 투여량 범위는 1회 백신 접종마다 활성 성분 수백 마이크로그램 정도이며, 바람직한 범위는 약 0.1 ㎍ 내지 2000 ㎍ (1-10 mg 범위의 더 많은 양도 고려될 수 있다), 예컨대 약 0.5 ㎍ 내지 1000 ㎍, 바람직하게는 1 ㎍ 내지 500 ㎍, 특히 약 10㎍ 내지 100 ㎍의 양이다. 초기 투여를 위한 적절한 요법 및 부스터 용량 역시 가변적이지만, 후속적인 접종 또는 기타 투여를 수반하는 초기 투여량에 의해 정형화될 수 있다.
투여 방식은 매우 광범위할 수 있다. 백신 투여를 위한 여하한 종래의 방식이 모두 적용가능하다. 여기에는 고체상의 생리학적으로 허용가능한 베이스, 또는 생리적으로 허용가능한 분산액 형태의 경구 적용, 주사 등에 의한 비경구 적용이 포함된다. 백신의 투여량은 투여 경로와 백신화될 대상자의 연령 및 항원 포뮬레이션에 따라 달라질 것이다.
백신의 키메라 결합 단백질 중 몇가지는 백신에서 충분히 면역원성이지만, 다른 몇가지 경우에는 백신이 애쥬번트 물질을 추가로 포함해야지만 면역 반응이 증가된다. 자가항원에 대한 자가 관용성을 쉽게 파괴시켜주는 것으로 입증될 수 있는 애쥬번트를 사용하는 것이 특히 바람직하다.
백신에 대해 애쥬번트 효과를 달성하는 다양한 방법이 알려져 있다. 일반적인 이론과 방법은 "The Theory and Practical Application of Adjuvants", 1995, Dun-can E.S. Stewart-Tull (편집.), John Wiley & Sons Ltd, ISBN 0-471-95170-6, 및 "Vaccines: New Generation Immunological Adjuvant", 1995, Gregoriadis G 외 (편집), Plenum Press, New York, ISBN 0-306-45283-9에 상세히 설명되어 있으며 두가지 문헌 모두 본 명세서에 참조로 통합되었다.
바람직한 애쥬번트의 한가지 그룹은 수지상 세포와 같이 APC에 의한 백신 분자의 흡수를 도와 이들을 활성화시킨다. 이들의 예로는 면역 표적화 애쥬번트; 독소, 시토카인 및 미코박테리아 유도체와 같은 면역 조절 애쥬번트; 오일 포뮬레이션; 폴리머; 미셀 형성 애쥬번트; 사포닌; 면역자극 복합 매트릭스 (ISCOM 매트릭스); 입자; DDA; 알루미늄 애쥬번트; DNA 애쥬번트; γ-인슐린; 및 캡슐화 애쥬번트를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 일반적으로 키메라 결합 단백질의 제1, 제2 및 제3 부분으로서 유용한 화합물 및 제제와 관련된 전술한 내용들은 본 발명의 백신의 애쥬번트에서의 이들의 사용에도 준용되는 것으로 이해되어야 한다.
애쥬번트 사용은 수산화알루미늄 또는 인산알루미늄 (명반)과 같은 제제를 완충 염수 중에서 0.05 내지 0.1% 용액으로서, 0.25% 용액으로서 사용되는 슈가의 합성 폴리머 (예컨대 Carbopol)과 혼합하여, 백신중에서 단백질과 70 내지 101℃에서 30초 내지 2분간 각각 열처리함으로써 응집시키는 것을 포함하며 교차결합제에 의한 응집도 가능하다. 알부민에 대한 펩신 처리된 항체 (Fab 단편)을 이용한 재활성화에 의한 응집, C. parvum과 같은 박테리아 세포 또는 내독소나 그램 음성 박테리아의 리포다당류 성분과의 혼합물, 만나이드 모노올리레이트와 같은 생리적으로 허용가능한 오일 비히클 중의 에멀젼 (Aracel A) 또는 블록 치환기로 사용되는 퍼플루오로카본의 20% 용액과의 에멀젼 (Fluosol-DA)도 사용가능하다. 스쿠알렌 및 IFA와 같은 오일과의 혼합물도 바람직하다.
본 발명에서 DDA (디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드)는 DNA와 γ-인슐린과 같이 애쥬번트로서 흥미로운 후보이며, 또한 프로인드 완전 및 불완전 애쥬번트와 QuilA 및 QS21와 같은 퀼라자(quillaja) 사포닌도 RIBI로서 흥미롭다. 모노포스포릴 지질 A(MPL), 상기한 C3 및 C3d, 및 뮤라밀 디펩타이드 (MDP)도 가능하다.
리포좀 포뮬레이션 역시 애쥬번트 효과를 부여하는 것으로 알려져 있으므로, 리포좀 애쥬번트도 본 발명에서 바람직하다.
또한 본 발명에 따라, 면역자극 복합체 매트릭스 잎 (ISCOM 매트릭스) 애쥬번트를 선택하는 것도 바람직한데, 이는, 특히 이 유형의 애쥬번트가 APCs에 의한 MHC 클래스 II 발현을 상향조절할 수 있는 것으로 나타났기 때문이다. ISCOM 매트릭스는 Quillaja saponaria로부터의 (임의로 분획화된) 사포닌(트리테르페노이드), 콜레스테롤 및 인지질로 구성된다. 면역원성 단백질과 혼합될 경우, 얻어진 입자상 포뮬레이션은 ISCOM 입자로 알려진 것으로서, 여기서 사포닌은 60-70 중량%, 콜레스테롤과 인지질은 10-15 중량%, 단백질은 10-15 중량%이다. 면역자극 복합체의 조성과 사용에 관한 상세 내용은 애쥬번트에 관해 다루고 있는 상기한 교재들 뿐만 아니라, Morein B 외, 1995, Clin. Immuno-ther. 3: 461-475 및 Barr IG 및 Mitchell GF, 1996, Immunol. 및 Cell Biol. 74: 8-25에서도 찾아볼 수 있으며 (두가지 모두 본 발명에 참조 통합됨) 완전한 면역자극 복합체의 제조방법에 관한 유용한 지침을 제공해준다.
애쥬번트 효과를 달성할 수 있는 또 다른 매우 흥미로운 (따라서 바람직한) 가능성은 Gollelin 등의 1992년 방법 (본 발명에 참조 통합됨)에 설명된 기술을 사용하는 것이다. 요약하면, 본 발명의 항원과 같은 적절한 항원의 제시를, 그 항원을 단핵세포/대식세포 상의 Fcγ 수용체에 대한 항체 (또는 항원 결합 항체 단편)에 컨쥬게이션시킴으로써 증강시킬 수 있다. 특히 항원과 항-FcγRI 간의 컨쥬게이션이 백신 접종의 목적을 위한 면역원성을 증가시키는 것으로 입증되었다.
다른 가능성은 키메라 결합 단백질의 제1 및 제2 부분에 대한 후보로서 상기한 면역 조정 물질 (즉, 시토카인) 및 표적화를 이용하는 것이다. 이와 관련해서 폴리 I:C와 같은 시토카인의 합성 인듀서도 가능하다.
적절한 미코박테리아 유도체는 뮤라밀 디펩타이드, 완전 프로인드 애쥬번트, RIBI 및 TDM 및 TDE와 같은 트레할로스의 디에스테르 중에서 선택된다.
적절한 면역 표적 애쥬번트가 CD40 리간드 및 CD40 항체 또는 그의 특이적 결합 단편 (상기 내용 참조), 만노스, Fab 단편 및 CTLA-4 중에서 선택된다.
적절한 폴리머 애쥬번트는 덱스트란, PEG, 전분, 만난 및 만노스와 같은 탄수화물; 플라스틱 폴리머; 라텍스 비드와 같은 라텍스 중에서 선택된다.
면역 응답을 조정하는 또 다른 흥미로운 방법은 면역원 (임의로 애쥬번트 및 약학적으로 허용되는 캐리어 및 비히클과 함께)을 "가상 임파절(VLN:virtual lympho node)" (ImmunoTherapy, Inc., 360 Lexington Avenue, New York, NY 10017-6501에 의해 개발된 특허 의료기구) 내로 포함시키는 것이다. VLN (얇은 튜브형 장치)은 임파절을 모방한 구조와 기능을 갖는 것이다. 피부 밑에 VLN을 삽입하면 시토카인과 케모카인의 급증과 함께 멸균 염증 부위가 생성된다. T 세포와 B 세포 뿐만 아니라 APCs도 이 위험 신호에 신속히 대응하여, 염증 부위로 귀소해서 VLN의 다공성 매트릭스 내로 축적된다. 어떤 항원에 대한 면역 응답을 일으키는데 필요한 항원 투여량은 VLN을 사용할 경우 감소된다는 것과 VLN을 이용한 백신 접종에 의해 부여된 면역 보호반응이 애쥬번트로서 Ribi를 이용한 통상적인 면역화를 뛰어넘는 것으로 나타났다. 이 기술은 예컨대, "From the Laboratory to the Clinic, Book of Abstracts, October 12th - 15th 1998, Seascape Resort, Aptos, Cali-fornia" 중의 Gelber C 외, 1998, "Elitation of Robust Cel-lular and Humoral Immune Responses to Small Amounts of Immuno-gens Using a Novel Medical Device Designated the Virtual Lymph Node"에 간략히 설명되어 있다.
백신은 적어도 1년에 1회, 예컨대 1년에 적어도 1, 2, 3, 4, 5, 6 및 12회 투여된다. 더욱 구체적으로, 그것을 필요로 하는 개체에게 1년에 1-12회, 즉, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 또는 12회 투여된다. 본 발명에 따른 바람직한 자가 백신의 사용에 의해 유발되는 메모리 면역이 영구적인 것은 아니기 때문에, 면역계는 유사체들에 의해 주기적으로 챌린지될 필요가 있는 것으로 밝혀진 바 있다.
유전적 변이로 인해, 상이한 개체들이 동일한 폴리펩타이드에 대해 여러 강도로 면역응답하여 반응할 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 백신은 면역 반응의 증가를 위해 여러가지 상이한 폴리펩타이드들을 포함할 수 있다. 이와 관련해서 외래 T 세포 에피토프 도입의 선택과 관련한 상기 설명 참조. 백신은 상기 정의한 바와 같은 폴리펩타이드들 두가지 이상 포함할 수 있다.
백신은 결과적으로 3-20개의 상이한 변형 또는 비변형 폴리펩타이드, 예컨대 3-10개의 상이한 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 그러나, 대개 폴리펩타이드의 수는 최소한 1 또는 2개의 폴리펩타이드를 유지할 것이다.
생백신 (live vaccines)
면역계에 대한 제시를 실시하는 두번째 방안은 생백신 기술을 사용하는 것이다. 생백신 접종에서는, 키메라 결합 단백질을 코딩하는 핵산 단편에 의해 형질전환된 비병원성 미생물을 동물에게 투여함으로써 면역계에 대한 제시가 수행된다. 떠는, 그러한 핵산 단편을 포함하는 벡터를 이용하여 미생물을 형질전환시킨다. 비병원성 미생물은 예컨대 미코박테리움 보비스 (Mycobacterium bovis BCG.), 비병원성 스트렙토코커스 spp (Streptococcus spp.), 이. 콜라이 (E. coli), 살모넬라 (Salmonella spp.), 비브리오 콜레라 (Vibrio cholerae), 시겔라 (Shigella) 등과 같은 적절한 약독화 박테리아 균주 (계대 수단을 통하거나, 또는 재조합 DNA 기술에 의한 병원성 발현 생성물의 제거를 통해 약독화됨)일 수 있다. 현행 기술에 따른 생백신의 제조방법을 다룬 리뷰로 예컨대 Saliou P, 1995, Rev. Prat. 45: 1492-1496 및 Walker PD, 1992, Vaccine 10: 977-990를 들 수 있으며, 이들 두 문헌 모두 본 발명에 참조로 통합되었다. 이러한 생백신에 사용되는 핵산 단편 및 벡터에 관한 상세를 다음에 설명하였다.
특히 BCG는 생세균 백신으로서 집중적으로 사용되어 왔다: BCG 백신은 전세계적으로 결핵을 예방하는데 성공적으로 사용되어 왔다. 생후 백신 접종을 수행할 수 있으며 인체면역결핍 바이러스 1형에 감염된 개체에 있어서도 거의 심각한 합병증을 나타내지 않는다. BCG는 강력한 면역 애쥬번트 활성을 나타내며, 표재 방광암의 치료에 집중적으로 사용되었다.
폴리펩타이드 백신의 경우, TH 에피토프 및/또는 제1 및/또는 제2 및/또는 제3 부분은 존재하는 경우, 스캐폴드 단백질 구조로부터 유도된 아미노산 서열에 대한 융합 파트너 형태일 수 있다.
세균 생백신의 대체물로서, 후술하는 본 발명의 핵산 단편을 비바이러스성 바이러스 백신 벡터 내로 통합시킬 수 있다. 적절한 바이러스 벡터는 우두, MVA (변형된 우두 바이러스), 카나리아 발진병 바이러스, 조류 발진 바이러스 및 수두 바이러스 등을 들 수 있다. 또는 단순포진 바이러스 변이체를 사용할 수도 있다.
보통은, 비병원성 미생물 또는 바이러스를 동물에게 오직 1회만 투여하지만, 어떤 경우에는 보호성 면역을 유지하기 위해, 일생에 두번 이상 미생물을 투여하는 것이 필요할 수 있다.
또한, 유용한 애쥬번트로서 설명된 시토카인과 같은, 상술한 면역조절물질의 형태로 제1, 제2 및/또는 제3 부분을 코딩하는 대역을 함유하는 핵산(들)로 미생물을 형질전환시킬 수 있다. 이 구체예의 바람직한 한가지 버젼은 상이한 리딩 프레임 또는 적어도 상이한 프로모터의 조절 하에 유사체에 대한 코딩 대역과 면역조절물질에 대한 코딩 대역을 갖는 것을 포괄한다. 이렇게 함으로써, 키메라 결합 단백질이 면역조절물질에 대한 융합 파트너로서 생산되는 것이 회피되며, 유리한 효과를 종종 제공할 수 있다. 또는, 두개의 별개의 뉴클레오타이드 단편들을 형질전환제제로서 이용할 수 있다.
핵산 백신 접종
펩타이드를 기제로 한 백신의 전통적인 투여의 대안으로서, 핵산 백신 접종 ("핵산 면역화", "유전적 면역화", "유전자 면역화" 및 "DNA 백신 접종"이라고도 알려져 있음)은 여러가지 흥미로운 특성을 제공한다.
먼저, 전통적인 백신 접근법과 대조적으로, 핵산 백신 접종은 면역원성 제제의 대규모 생산을 소비하는 공급원을 필요로 하지 않는다 (예컨대, 폴리펩타이드 백신 접종에 필요한 키메라 결합 단백질을 생산하는 미생물의 공업규모의 발효 형태). 뿐만 아니라, 면역원의 정제 장비 및 리폴딩 계획도 필요하지 않다. 그리고 마지막으로, 도입된 핵산의 발현 산물을 생산하기 위해서, 핵산 백신 접종은 백신 접종된 개체의 생화학적 장치에 의존하므로, 발현 산물의 최적의 후번역 프로세싱이 일어날 것으로 기대된다; 상기한 바와 같이, 본래의 B 세포 에피토프의 유의적 분획이 세포외적으로 노출된 폴리펩타이드 서열로부터 유도된 키메라 결합 단백질 변형된 분자 중에 보존되어야 하고, B 세포 에피토프는 원래 여하한 (바이오)분자 (예컨대 탄수화물, 지질, 단백질등) 부분들에 의해 구성될 수 있기 때문에, 이것은 자가 백신 접종의 경우 특히 중요하다. 따라서, 면역원의 천연 글리코실화 및 지질화 양상은 전반적인 면역원성에 있어 매우 중요한 것일 수 있고, 이것은 면역원을 생산하는 숙주를 가짐으로써 해결될 것으로 기대된다.
따라서, 본 발명의 방법의 중요한 구체예는 본 발명의 키메라 결합 단백질을 코딩 및 발현하는 핵산 단편을 투여함으로써 그러한 제시를 수행하는 것과 관련이 있다.
전통적인 백신 접종 접근방식의 경우, 핵산 백신 접종은 APC 내로, 제2 유사체를 코딩 및 발현하는 적어도 1종의 핵산 단편을 생체내 도입하는 것과 병용될 수 있다. 제1, 제2 및 제3 부분 및 TH 에피토프와 관련된 고려사항도 여기에 적용된다.
이 구체예에서, 도입된 핵산은 바람직하게는 DNA인 것이 좋고, 이것은 네이키드 DNA, 하전된 또는 하전되지 않은 지질과 함께 조성된 DNA, 리포좀 중에 조성된 DNA, 바이러스 벡터 중에 포함된 DNA, 트랜스펙션-용이화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 칼슘 침전제제와 함께 조성된 DNA, 불활성 캐리어 분자에 커플링된 DNA, 및 애쥬번트와 함께 조성된 DNA 형태인 것이 바람직하다. 이러한 관점에서, 전통적인 백신 포뮬레이션 중의 애쥬번트의 사용과 관련한 모든 고려사항이 DNA 백신의 포뮬레이션에도 실제로 적용된다. 따라서, 폴리펩타이드를 기재로 한 백신의 관점에서 애쥬번트의 사용과 관련한 모든 개시내용은 핵산 백신 접종 기술에서의 그들의 사용에서도 준용된다. 투여용 포뮬레이션 및 투여 방식 및 투여 경로와 관련된 기타의 고려사항의 경우도 마찬가지이며, 따라서, 전통적인 백신과 관련하여 전술된 바와 같은 이러한 고려사항은 핵산 백신 접종 기술에서 이들을 이용하는 데에도 준용된다.
핵산 백신의 특히 바람직한 포뮬레이션 유형은 DNA를 함유하는 미립자이다. 적절한 미립자가 예컨대 WO98/31398에 설명되어 있다.
상기한 폴리펩타이드 기제 백신의 투여 경로 및 투여 계획은 본 발명의 핵산 백신에도 적용가능하며 폴리펩타이드의 투여 경로 및 투여 계획과 관련한 상기한 모든 설명이 핵산의 경우에도 준용된다. 여기에 핵산 백신은 정맥 및 동맥내로 적절히 투여될 수 있음도 덧붙여진다. 뿐만 아니라, 핵산 백신은 소위 유전자총에 의해 투여될 수 있다는 것이 잘 알려져 있으므로, 이러한 투여방식과 그와 동등한 방식의 투여방식 역시 본 발명의 일부로 간주된다. 마지막으로, 핵산 투여시 VLN을 사용하면 우수한 결과 얻어지는 것으로 보고되었기 때문에, 특정한 투여 방식이 특히 바람직하다.
뿐만 아니라, 면역화 제제로서 사용되는 핵산(들)은, 제1, 제2 및/또는 제3부분을 코딩하는 대역들을 예컨대, 유용한 애쥬번트로서 설명된 시토카인과 같은 상기한 면역조정 물질의 형태로 함유할 수 있다. 이 구체예의 바람직한 버젼은 상이한 리딩 프레임 또는 적어도 상이한 프로모터의 조절 하에 키메라 결합 단백질에 대한 코딩 대역과 면역조절물질에 대한 코딩 대역을 갖는 것을 포괄한다. 그렇게 함으로써 키메라 결합 단백질이 면역조절물질에 대한 융합 파트너로서 생산되는 것을 피할 수 있으며, 이는 스캐폴드 단백질 구조의 구조 보존 측면에서 유리한 효과인 것으로 믿어진다. 또는, 두가지 별개의 뉴클레오타이드 단편들을 사용할 수 있지만, 두가지 모두의 코딩 대역이 동일한 분자를 포함할 경우 확실한 공동 발현의 장점을 고려하면 덜 바람직하다.
보통의 정상적인 환경에서는, 백신의 핵산을 바이러스 프로모터에 의해 그 발현이 조절되는 벡터의 형태로 도입한다. 본 발명에 따른 벡터에 관하여 보다 상세한 설명은 예컨대 하기 설명을 참조하면 된다. 또한, 핵산 백신의 포뮬레이션과 용도에 관한 상세한 설명은 Donnelly JJ 외, 1997, Annu. Rev. Immunol. 15: 617-648 및 Donnelly JJ 외., 1997, Life Sciences 60: 163-172에서 찾아볼 수 있다. 이들 두가지 문헌은 모두 본 명세서에 참조로 통합되었다.
발현 산물의 유출이 일어나지 않도록 핵산 백신 중의 발현 카세트를 구축할 수 있다 (예컨대, 막 통합 또는 분비를 결과시키는 시그널 서열 생략에 의해). 이러한 방식으로, 오직 소량의 발현 산물만이 유출되는 반면, 나머지는 MHC 분자 관점에서 펩타이드 단편으로서 프로세싱 및 제시될 것이다.
여러 접근 방식들의 병용
개선된 면역 반응을 용이화시킴에 있어서, 다양한 초회 감작 (프라임) - 부스트 전략이 효과적인 것으로 입증되었다. 따라서, 본 발명에 따라, 핵산 백신 접종, 생백신 접종 및 폴리펩타이드 백신 접종을 조합하여 사용할 수 있다. 그러나, 핵산이나 바이러스 백신 접종을 통해 초회 감작시켜 폴리펩타이드 백신으로 부스트 시키는 것이 특히 바람직하며, 특히 폴리펩타이드 백신이 초회감작 백신의 핵산으로부터의 발현 산물을 함유하는 경우 특히 그러하다.
키메라 결합 단백질의 동정 및 제조 방법
전술한 바와 같이, 본 발명의 키메라 결합 단백질의 가장 중요한 특성은 이들이 비록 스캐폴드 단백질 구조와 관용성 파괴 아미노산 서열의 두가지 모두와 반응성인 항체를 유발할 수 있다 하더라도, 목적하는 B 세포 에피토프를 표적화시키는데만 효과적인 면역 반응을 이끌어내는 능력을 이들이 갖는다는 것이다.
B 세포 에피토프의 효과적인 제시를 위한 분석 방법이 이용가능하다면, 키메라 결합 단백질을 조작하는 것이 그리 간단하지는 않을 것이다. B 세포 에피토프는 매우 다양한 구조를 가질 수 있기 때문에, 하나의 B 세포 에피토프 및 그의 제시에 적합한 스캐폴드 단백질 구조는 다른 B 세포 에피토프에는 적합하지 않을 것이 거의 확실하기 때문에, 적어도 B 세포 에피토프와 스캐폴드 단백질 구조의 효과적인 조합이 동정된 경우에 본 발명이 최적 실시된다.
따라서, 본 발명의 키메라 결합 단백질을 동정하는 방법은 최광의에서 다음 공정을 포함할 것이다:
1) 어떤 동물의 목적하는 자가 항원에 결합하고 제1 수용체를 포함하는 제1 분자를 제공하는 공정,
2) 상기 제1 분자의 상기 제1 수용체에 선택적으로 결합할 수 있는 능력에 대해 제2 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 공정,
3) 상기 공정2)에서 선택적으로 결합하는 라이브러리의 구성원을 분리하는 공정, 및
4) 적어도 a) 공정 3)에서 분리된 구성원의 결합 부위, b) 상기 결합 부위의 천연 3차원 구조를 안정화시키는, 상기 동물의 자가 유래의 스캐폴드 단백질 구조, 및 c) 비인간 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 함유하는 키메라 결합 단백질을 합성 기술 또는 재조합 기술을 이용하여 제조하는 공정; 또는
i) 1) 정확한 본래의 3차원 배열의 제2 수용체 또는 그의 미모토프 (mimotope), 2) 상기 3차원 배열을 안정화시키고, 상기 동물 중 제2 수용체가 유도된 것과는 다른 분자로부터 유도된, 상기 동물의 자가 유래의 스캐폴드 단백질 구조, 및 3) 관용성 파괴 아미노산 서열을 함유하는 키메라 결합 단백질을 합성 기술 또는 재조합 기술을 이용하여 제조하는 공정.
본 발명의 상기한 키메라 결합 단백질을 제조하는 방법은 여러가지이다. B 세포 에피토프 부분에 대해 전술한 바와 같이, 키메라 결합 단백질의 그 부분은 본 발명의 백신에 의해 표적화된, 적당한 자가 항원에서 목적하는 (이미 동정된) 에피토프일 수 있다. - 이것은 에피토프가 선형 펩타이드 에피토프인 경우 가장 달성하기 쉽다. 이러한 조건 하에서는, B 세포 에피토프가 적절한 풍부한 자가 단백질 구조 중에 삽입되거나, 또는 추정적인 스캐폴드 구조에 무작위적으로 도입되어 후속적으로, 이렇게 얻어진 라이브러리를 제1 수용체에 선택적으로 결합된 그 구성원들에 대해 스크리닝할 수 있다. 따라서, 이 구체예에서, 전술한 라이브러리는 B 세포 에피토프 또는 그의 미모토프가 다양한 무작위적 위치에서 셔플된 공지의 추정적인 스캐폴드 단백질 구조 (관용성 파괴 아미노산 서열이 이미 존재할 수 있음)로 구성되며 - 이 라이브러리로부터, 제1 수용체에 적합한 결합을 제공하는 구성원들만이 선택될 것이다 (예컨대 적절한 mAB).
또는, B 세포 에피토프의 도입 위치를 고정시키는 반면, B 세포 에피토프 자체는 이 위치에 삽입된 무작위 서열의 라이브러리로부터 동정할 수도 있다. 이것은 제1 수용체에 결합한 구성원들과 동일한 클래스 및 서브클래스의 항체 라이브러리를 스크리닝함으로써 바람직하게 달성될 수 있다. 따라서, 이 구체예에서, 전술한 라이브러리는 공지의 B 세포 에피토프가 고정된 위치에서 스캐폴드 단백질 구조 내로 도입된 무작위 서열 라이브러리의 구성원인, 공지의 잠정적인 스캐폴드 단백질 구조 (여기서 관용성 파괴 아미노산 서열은 이미 존재할 수 있음)로 이루어진다. 이 라이브러리로부터, 제1 수용체에 적절하게 결합하는 구성원들(예컨대 적절한 mAB)만을 선택한다.
전술한 스크리닝을 반드시 필요로 하지는 않는 세번째 가능성은 목적하는 항원의 에피토프를 모방하는 천연발생적인 항이디오타입 항체를 분리하는 것이다. 예컨대, 어떤 동물이 자가 항원에 대한 항체를 산생하면, 그 동일한 동물은 이들 항체의 이디오타입과 반응성인 항이디오타입 항체들도 산생한다. 이러한 항이디오타입 항체들을 분리하여, 서열을 결정한 다음, 관용성 파괴 아미노산 서열이 도입된 변형 버젼을 제조할 수 있다. 또한, 얻어진 분자는 B 세포 에피토프 (항이디오타입 항체의 이디오타입), 스캐폴드 단백질 구조 (항이디오타입 항체의 비이디오타입 대역) 및 관용성 파괴 아미노산 서열을 포함할 것이다.
이 세번째 가능성의 특화된 한가지 버젼은 다음의 전략을 이용한다: 제1 수용체를 포함하는 제1 분자를 면역원으로서 이용하여 제2 수용체와 함께 항원을 산생하는 숙주에 자가적인 항체를 발현하는 트랜스제닉 동물을 면역화시키고 - 필요하다면, 제1 분자를 파상풍 독소, KLH, 및 디프테리아 독소와 같은 면역원성 캐리어 분자에 커플링시킬 수 있다 (제1 분자가 그 트랜스제닉 동물에 자가 유래인 경우). 트랜스제닉 동물은 예컨대 인간의 면역글로불린을 발현하는 비인간 동물일 수 있다 (예컨대, WO 93/12227, US 5,877,397, US 5,874,299, US 5,814,318, US 5,789,650, US 5,770,429, US 5,661,016, US 5,633,425, US 5,625,126, US 5,569,825, US 5,545,806, WO 91/10741 및 WO 01/25492에 개시된 설명 참조). 이러한 상황 하에서 제1 분자는 제1 분자와 반응하는 인간의 항체 생산을 유발할 것이다. 하이브리도마 제조를 위한 표준 기술을 이용함으로써 (Kohler 및 Millstein의 고전적 교시에 따라), 제1 분자와 반응하는 모노클로날 항체를 생산하는 선택된 하이브리도마를 제조한다. 하기 내용 참조. 이들 인간의 모노클로날 항체들을 제1 수용체에 대한 이들의 특이적 결합 여부에 대해 스크리닝하여 제1 분자의 다른 부분에 비특이적으로 결합하는 mAB들은 배제시킨다. 특이적으로 결합하는 mAB를 생산하는 하이브리도마를 분리하고 표준 클로닝 및 분자 생물학 기술을 이용함으로써, 이들 항체 (또는 그의 단편)를 코딩하는 DNA를 이용하여 적절한 생산 세포주를 형질전환시킨다 (물론, 동일한 서열을 가지나, 예컨대 합성 또는 PCR 수단에 의해 제공된ㄴ DNA를 이용하여 형질전환시킬 수도 있음). 관용성 파괴 아미노산 서열과 관련해서, 이것은 DNA가 생산 세포주내로 형질전환된 경우에는 클로닝 단계의 일부로서 도입될 수 있으나, IgG 분자가, mAB에 의해 궁극적으로 백신 접종시키고자 하는 동물의 관용성을 파괴할 아미노산 서열을 포함하는 경우, 상기 트랜스제닉 동물에 대안이 제공된다.
실상, 본 발명의 방법의 전술한 모든 구체예에서, 관용성 파괴 아미노산 서열은 후반 공정, 즉, B 세포 에피토프와 스캐폴드 단백질 구조의 조합이 동정된 후에 도입될 수 있다. 그러나, 필요하다면, 관용성 파괴 아미노산 서열을 스크리닝 공정에 존재하도록 포함시키는 것도 가능하다.
본 발명의 적절한 키메라 결합 단백질을 동정하기 위한 전술한 방법에서, 제1 분자는 항체인 것이 바람직하고, 더욱 바람직하게는 모노클로날 항체인 것이 좋다. 전술한 바와 같이, 이는 이디오타입에 대해 타당한 면역 반응만을 일으킬 면역화된 항이디오티압 항체의 제조를 가능케 해준다. 따라서, 제1 수용체는 그 항체의 이디오타입인 것이 가장 바람직하다.
상기 방법의 공정 2)와 공정 3)에 의해 제1 수용체와 특이적으로 상호반응하는 라이브러리 구성원들을 분리할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 수용체가 보다 큰 분자의 일부인 경우 (예컨대, 수용체가 항체의 항원 결합부인 경우), 스크리닝에 의해 보다 큰 분자의 잔부와 반응하는 몇몇 분리/동정된 구성원들이 일어날 것이다. 이러한 무관한 반응을 하는 구성원들을 배제시키기 위해, 본 발명에 따라 공정 3)에서의 스크리닝은, 후속 단계에서 이러한 구성원들을 배제시키도록, 제1 수용체의 외부에서 제1 분자와 결합하는 라이브러리의 구성원들을 동정할 수 있게 해주는 배제 공정을 포함하는 것이 바람직하다. 이러한 배제 공정은
a) 제1 분자 중의 제1 수용체 외부 대역에 대한 상기 라이브러리 구성원의 결합 능력 여부를 시험하여, 그러한 결합을 할 수 있는 라이브러리 구성원은 배제시키는 시험, 또는
b) 제1 수용체에 대한 결합을 놓고 제2 수용체와 경쟁할 수 있는 상기 라이브러리 구성원들의 능력을 시험하여, 그러한 능력을 나타내지 않는 라이브러리 구성원을 배제시키는 시험
을 포함한다.
즉, 상기 옵션 (a)는 스캐폴드 단백질 구조 및/또는 관용성 파괴 아미노산 서열에 결합하는 라이브러리 구성원의 포획에 의존하는 것이다: 예컨대, 제1 수용체가 결여된 제1 분자 (제1 분자로서 사용된 항체와 동일한 서브클래스의 무관한 항체를 사용하는 경우)를 컬럼 중의 크로마토그래피 용매에 고정시킨 크로마토그래피 공정에서 라이브러리를 상기 컬럼을 통해 통과시킬 경우: 컬럼에 의해 유지되지 않는 구성원들만이 제1 수용체에 결합하는 것들일 것이다.
옵션 (b)는 제1 수용체에 대한 결합을 놓고 적절한 제 2 수용체와 경쟁할 수 있는 라이브러리 구성원들만을 선택하는, 경쟁 분석에 의존하는 것이다. 이 방법은 제1 분자 (제1 수용체를 포함)를 컬럼 중의 크로마토그래피 용매에 고정시킨 그로마토그래피 공정에 의해서도 수행가능하며, 여기서, 제2 수용체를 포함하는 분자는 과량으로 컬럼에 부하시켜, 모든 제1 수용체를 차단하고, 마지막으로 라이브러리 구성원을 컬럼을 통해 통과시킨다. 컬럼을 통과하는 것들만이 제1 수용체에 결합하는 것들이다.
제2 분자의 라이브러리를 제공하는 한가지 적절한 방법은 하기 실시예에 제시된 바와 같이, 파지 디스플레이를 이용하는 것이지만, 리보좀 디스플레이, mRNA-디스플레이, 및 효모 표면 디스플레이 기술도 가능하다.
파지 디스플레이 기술
일례로서 파지 디스플레이 기술을 들어 본 발명을 설명한다 - 그러나, 결합 파트너 라이브러리를 스크리닝하는, 당해 기술분야에 공지인 다른 방법들도 본 발명에서 이용 가능한 것으로 이해되어야 한다.
필라멘트형 파지의 표면 상에 펩타이드와 단백질을 디스플레이할 수 있는 능력을 이용함으로써 표현형과 유전형 사이의 직접적인 물리적 링크를 제공하기 위해 파지 디스플레이 기술을 이용한다.
이 기술은 세균 표면 상의 F-섬모와 상호 반응함으로써 세균을 감염시키는 필라멘트형 박테리오파지 (예컨대 f1 및 M13)의 감염력을 이용한다. 대부분의 세균성 바이러스와 달리, 필라멘트형 파지는 세포 용해에 의해 방출되는 것이 아니라, 파지가 패키징되어 세균막 내로 조립되는 동안 세포로부터 분비된다. 세균 세포의 성장은 감염에 의해 단지 약간만 감소될 뿐이기 때문에 배양중 매우 높은 파지 약가를 달성하는 것이 가능하다 (Markowski 및 Russel 1997).
필라멘트형 파지 단백질의 껍질은 도 1에 도시된 바와 같이, 5가지 상이한 피복 단백질 (PIII, PVI, PVII, PVIII 및 PIX)로 구성된다. 파지 표면에 펩타이드나 단백질을 디스플레이하기 위해서, 펩타이드/단백질의 코딩 서열을, 파지의 피복 단백질의 코딩 서열과 결합시켜야 한다. George Smith는 파지 게놈의 gIII (마이너 피복 단백질인 pIII의 코딩 서열) 내로 소형 단백질을 코딩하는 DNA 단편을 클로닝시켜, 결과적으로 얻어진 파지가 특이적 항체에 의해 인식될 수 있는 폴리펩타이드를 함유한다는 것을 최초로 입증하였다. (Smith GP, 1985). 그 후, 파지 상에 디스플레이될 경우, 몇몇 단백질들이 기능적인 것으로 입증되었는데, 그 예로는, E. coli 알칼라인 포스파타제 (McCafferty 외, 1991), 인간의 성장 호르몬 (Bass 외, 1990), β-락타마제 및 항체 단편 (McCafferty 외, 1990 및 Huse 외, 1989)를 들 수 있다.
몇가지 항체 라이브러리들 역시 필라멘터형 파지 상에서 디스플레이 되었다 - 예컨대, 항체 라이브러리를 벡터로서 전체 파지 게놈을 이용하여 클로닝시킨 바 있다 (Clackson 외, 1991). 또 다른 대안으로서, 파지미드 벡터도 널리 사용되고 있다. 파지미드는 필라멘트형 파지의 인티제닉 (integenic) 대역을 나타내는 플라스미이다. 이 대역은 DNA 복제 기점과 DNA 패키징 시그널을 함유한다. 헬퍼 파지에 의해 중복 감염됨 세포에서 파지미드가 번식될 경우, 이 파지미드 DNA는 파지 게놈 자체와 동일한 방식으로 파지 입자 내에서 패키징된다. 디스플레이 목적상 파지미드는 항체-단편과 융합된 파지의 피복 단백질 (대개 pIII 또는 pIII의 일부)의 코딩 서열을 지닌다. 헬퍼 파지에 의한 중복 감염에 의해, 항체 단편이 파지 표면에 디스플레이 되고, 피복 단백질에 융합된다 (Hoogenboom 외, 1991, Oerum 외, 1993).
항체 라이브러리의 구축
파지 디스플레이용 항체 라이브러리는 시판되고 있다 (예컨대 Dyax사의 인간 파지 항체 라이브러리). 라이브러리의 제조 방법 역시 설명된 바 있다 (Engberg 외 1996 및 Krebber 외, 1997). 항체 라이브러리의 구축은 일반적으로 항체를 생산하는 세포를 함유하는 소스로부터의 mRNA의 분리로부터 출발한다 (Winter 외, 1994). 이어서 mRNA를 RT-PCR에 의한 cDNA 합성 주형으로서 사용한다. 항체 레퍼토리의 PCR 증폭은 항체 단편의 헤비 체인 및 라이트 체인 유전자의 증폭을 위해 고안된 특정 프라이머를 사용함으로써 수행된다. 이어서, 증폭된 헤비 및 라이트 체인 유전자를 벡터 내로 클로닝시킨 다음 표면에 F-섬포를 발현하는 E. coli 균주 내로 형질전환시킨다. 형질전환된 세포는 액상 배지 또는 플레이트 상에서 증식시키고, 이렇게 증식된 세포들은 항체 라이브러리를 구성한다 (Engberg 외, 1996, Krebber 외, 1997).
본 발명에 따라, 디스플레이하는데 가장 바람직한 라이브러리는 인간 항체 라이브러리이겠지만, 다른 종으로부터의 항체 라이브러리도 유용하다. 그러한 경우, 동정된 항체의 초가변부를 동정하여 인간 항체 스캐폴드의 초가변부 내로 치환시킨다.
바이오패닝 (Biopanning)
파지 디스플레이 항체 라이브러리를 제조하기 위해, 항체 라이브러리를 헬퍼 파지에 의해 중복 감염시킬 필요가 있다. 중복 감염 후, 감염된 세균은 재조합 파지 입자들을 생산하며 여기서 각각의 파지는 동일한 파지 입자중의 유전자에 의해 코딩된 독특한 항체를 나타낸다. 항체 단편의 디스플레이는 선별을 거듭함으로써 (바이오패닝 또는 패닝) 항원-특이적 파지의 선별 및 정제가 가능하게 된다.
도 2에 도시된 바와 같이, 1회의 선별은: E. coli 항체 라이브러리의 중복 감염, 재조합 파지 입자의 생산, 파지를 항원과 함께 인큐베이션시키기 (예컨대 선택된 모노클로날 항체), 세정 공정에 의한 비결합 파지의 제거, 결합된 파지 입자의 용출 및 용출된 파지에 의한 신선한 E. coli 세포의 형질도입. 결합된 파지의 용출은 일반적으로 낮은 pH 완충액을 이용하여 수행되지만, 높은 pH의 완충액, 가용성 항원 또는 단백질 분해성 절단에 의해서도 용출시킬 수 있다. 후자의 경우, 피복 단백질 서열과 항체-단편 간의 벡터에 특이적인 프로테아제 인식 부위가 삽입되어 있다 (Johansen 외, 1995). 수차례의 패닝 후 개별적인 클론들을 분리하고 결합 친화도 및, 선택된 항원에 대한 특이성에 대해 분석한다.
선별 전략
항원 (예컨대 Herceptin 또는 Retuximab과 같이, 임상 세팅에서 유용한 것으로 입증된 전술한 모노클로날 항체중 어느 것이든 무방함)은 ELISA 웰, 라텍스- 또는 자석 비드, 면역튜브 또는 컬럼와 같은 상이한 고체상 위에 고정시킬 수 있다. 세포 표면 항원의 경우, 파지를 세포 상에서 직접 선별할수도 있고, 또는 항원을 디스플레이하는 세포들을 이들 세포에 독특한 마커의 특성에 따라, 예컨대 형광 활성화 세포 소팅 (FACS)에 의해 소팅시킬 수 있다 (Hoogenboom, 1997). 배경 바인더 (고정화 매질에 합하는 파지)를 회피하기 위해, 이들 방법들을 한데 병합하거나 변경시킬 수 있다. 예컨대 초회 패닝에서 항원이 ELISA 웰 상에 고정화되고 두번째 패닝에서는 라텍스 비드 상에 고정화됨. 이 방법은 교대 패닝으로 불리운다 (Andersen 외, 1996). 비특이적 결합을 회피하기 위한 또 다른 방법은 무관한 항원과 예비 인큐베이션시키는 공정을 이용하는 것으로, 예컨대, MHC-펩타이드 복합체의 특이성을 갖는 항체-단편이 요구되는 경우, 패닝하기 전에 파지-라이브러리에 빈(empty) MHC-복합체를 첨가하는데, 이것은 MHC-펩타이드 복합체 이외의 다른 대역에 대해 특이성을 갖는 파지들은 제거시킨다 (Krogsgaard 외, 2000). 바인더는 패닝 공정에 따라 패닝을 3회 또는 4회 수행한 후에 대개 분리가능하다.
또한, 본 발명은 백신 접종하고자 하는 동물에서 공지 수용체 구조와 상호 반응하는, 목적하는 대역에 결합하는 파지만을 분리하는 것을 목적으로 하기 때문에, 그 항원 중의 다른 대여과 결합하는 파지 역시 제거하는 것이 좋다. 예컨대, 항원이 모노클로날 항체인 경우, 그리고 그 모노클로날의 이디오타잎과 결합하는 파지를 분리하는 것만이 타당한 경우, 2회차 선별을 실시함으로써, 모노클로날 항체의 표적 리간드와 경쟁하는 파지만을 선별할 수 있다.
이것은 크로마토그래피 컬럼 중의 비드에 결합된 mAB를 파지 입자와 함께 예비 인큐베이션시킨 다음 비결합 파지를 제거하는 세정 공정에 의해 수행가능하다. 그 후, mAB에 과량의 리간드를 첨가하면 경쟁으로 인해 축출된 파지가 용출된다.
또는, 항원에 대한 결합 공정을 이미 거친 파지를, 항원과 그의 공지 리간드가 함께 예비 인큐베이션시키는 컬럼에 적용시킬 수도 있다.
항원 (제1 수용체)에 결합하는 파지를 동정 및 분리한 후, 키메라 결합 단백질을 쉽게 제조할 수 있다.
스크리닝된 항체 라이브러리의 특성에 따라, 키메라 결합 단백질을 제공하는 공정은 양성 항체의 간단한 분리 및 정제 (스크리닝된 라이브러리가 관용성 파괴 아미노산 서열도 포함하는 항체 또는 단편을 포함할 경우), 관용성 파괴 아미노산 서열 및/또는 스캐폴드 단백질 구조의 필요 부분을 도입하기 위한 양성 항체의 DNA 코딩의 유전공학적 조작 (항체의 단편들만이 스크리닝되어 나무지 스캐폴드 단백질 구조 모두 또는 일부분의 공급이 필요한 경우), 및, 항원 결합부를 관용성 파괴 아미노산 서열을 갖는 적절한 스캐폴드 단백질 구조로 이동시키기 위해 양성 항체를 코딩하는 DNA를 유전공학적으로 조작하는 것을 포함할 것이다.
전술한 바와 같이, 본 발명의 실시예가 비록 항체의 파지 디스플레이에 촛점을 맞춰 설명되어 있지만, 다른 많은 분자, 특히 알부민도 본 발명의 적합할 것이다.
펩타이드 또는 단백질의 디스플레이를 위한 기타 방법
본 발명의 원리에 따라 키메라 결합 분자를 제공하기 위해 사용될 수 있는 특이적 결합 파트너를 동정하기 위한 방법들이 여러가지 존재한다. 예컨대, 리보좀 디스플레이 (Mattheakis, L.C. 외 (1994) Hanes, J. and Plueckthun, A. (1997)), mRNA-디스플레이 (Roberts, R.W. 및 Szostak, J.W. (1997) Liu, R. 외 (2000)), 및 효모 표면 디스플레이 (Boder E.T 및 Wittrup KD (1997))는 모두 본 명세서에서 설명된 파지 디스플레이 기술의 유망한 대안책이다. 또한, 예컨대 US 5,498,538호에 설명된, TSAR's (totally synthetic affinity reagents: 전적으로 합성적인 친화성 시약)의 분리 기술 역시 본 발명의 목적을 달성하는 역할을 하는 것이고, 특히, 거짓 양성 상호반응이 스크리닝 아웃되는 미국특허 6,074,829호에 설명된 것과 같은 효모 2-하이브리드 기술 역시 그러하다.
특정 구체예: Xolair 경쟁 항체(Abs)의 유발
모노클로날 항체인 Xolair는 비만 세포 (mast cells)와 호중구 상의 FcεRI 수용체에 결합될 경우 IgE와 교차결합하지 못한 채로, IgE에 결합하는 것으로 알려져 있다. 본 발명의 키메라 결합 단백질을 제조하기 위해, 다음의 간단한 공정들을 수행할 수 있다:
- Xolair를 수득하는 공정 (예컨대, 시판품으로부터),
- 전적으로 인간의 IgG 파지 디스플레이 라이브러리 (파상풍 독소로부터의 P2 및 P3 에피토프 또는 전술한 PADRE 에피토프와 같은 적절한 에피토프를 잠재적으로 함유하는)를 생산/수득하는 공정,
- Xolair를 갖는 파지 디스플레이 중에서 1) Xolair에 대한 결합에 대해 인간의 IgE와 경쟁하고/경쟁하거나 (양성적 선별) 2) 비특이적 IgG를 인식하지 않는 (음성적 선별) 항체를 탐색하는 공정,
- 선별된 항이디오타입 항Xolair 항체 (P2 & P30 또는 PADRE를 포함)를 이용하여 인간을 면역화시키는 공정,
- 발생된 항체 반응의 특이성과 안전성을 시험하는 공정.
참고문헌 목록
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Claims (56)

  1. 동물에서 면역을 일으키고, 상기 동물의 항원에 존재하는 제2 수용체와 결합하는 제1 수용체에 특이적으로 결합하며,
    - 제1 수용체와 특이적으로 결합하고, 제1 수용체와의 결합을 놓고 제2 수용체와 경쟁하는, 결합 부위 형태의 B 세포 에피토프,
    - 결합 부위의 3차원 배열을 안정화시키며, 상기 포유류에 있어서 자가 유래인 스캐폴드 단백질 구조, 및
    - 상기 동물과 이종이며 상기 동물의 MHC 클래스 II 분자와 결합하는, 적어도 1종의 관용성 파괴 아미노산 서열
    을 포함하여 이루어지는 키메라 결합 단백질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질 구조가 풍부한 단백질, 바람직하게는 풍부한 혈청 단백질로부터 유래되는 것인 키메라 결합 단백질.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질 구조가 알부민, 면역글로불린, 트랜스페린 및 α2-마크로글로불린으로부터 유래된 것인 키메라 결합 단백질.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질 구조가 IgG로부터 유래된 것인 키메라 결합 단백질.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질 구조가 완전한 항체 및 F(ab')2 단편, Fab 단편 및 scFv와 같은 그의 단편으로 구성된 군 중에서 선택된 분자의 비이디오타입 대역으로부터 유래된 것인 키메라 결합 단백질.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질 구조가 상기 동물에 있어서 자가 유래인 폴리펩타이드의 실질적으로 완전한 아미노산 서열을 포함하는 것인 키메라 결합 단백질.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질 구조가 상기 동물에 있어서 자가 유래인 스캐폴드 단백질 구조에서 발견되는 B 세포 에피토프를 실질적인 수만큼 포함하는 것인 키메라 결합 단백질.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스캐폴드 단백질 구조가 상기 동물에 있어서 자가 유래인 폴리펩타이드와 실질적으로 동일한 3차원 구조를 갖는 것인 키메라 결합 단백질.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B 세포 에피토프가 항체의 이디오타입으로 구성되는 것인 키메라 결합 단백질.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체는 항체의 이디오타입이거나 상기 동물 중의 제2 수용체와 결합한느 리간드의 특이적 결합 대역인 것인 키메라 결합 단백질.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제1 수용체는 모노클로날 항체의 이디오타입인 키메라 결합 단백질.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관용성 파괴 아미노산 서열은 스캐폴드 단백질 구조의 아미노산 서열 내로 아미노산 삽입 또는 치환에 의해 도입되는 것인 키메라 결합 단백질.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 동물이 인간인 키메라 결합 단백질.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 관용성 파괴 아미노산 서열을 포함하도록 변형된 항이디오타입 항체이거나 또는 그의 유효한 결합 단편인 키메라 결합 단백질.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 제2 수용체를 포함하는 상기 동물의 항원이 면역글로불린 E, CD20, CD11a, 베타 아밀로이드, HER-2, 및 TNFα 중에서 선택되는 것인 키메라 결합 단백질.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    - 키메라 결합 단백질을 항원 제시 세포 (APC) 또는 B 임파구에 표적화시키는 하나 이상의 제1 부분, 및/또는
    - 면역계를 자극하는 하나 이상의 제2 부분, 및/또는
    - 면역계에 대한 키메라 결합 항체의 제시를 최적화시켜주는 하나 이상의 제 3 부분
    을 추가로 포함하는 키메라 결합 단백질.
  17. 제16항에 있어서, 관용성 파괴 아미노산 서열 및/또는 제1 및/또는 제2 및/또는 제3 부분이 스캐폴드 단백질 구조 중의 적절한 측기에 결합됨으로 해서 키메라 결합 단백질 내에 존재하는 것인 키메라 결합 단백질.
  18. 제17항에 있어서, 관용성 파괴 아미노산 서열 및/또는 제1 및/또는 제2 및/또는 제3 부분이 하나 이상의 아미노산 치환 및/또는 결실 및/또는 삽입 및/또는 부가에 의해 스캐폴드 단백질 구조 중에 존재하는 것인 키메라 결합 단백질.
  19. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 관용성 파괴 아미노산 서열이 상기 동물이 속한 동물 종에서 무차별적인 것인 키메라 결합 단백질.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 관용성 파괴 아미노산 서열이 천연 무차별 T 헬퍼 세포 에피토프 및 인공적인 MHC-II 결합 펩타이드 서열 중에서 선택되는 것인 키메라 결합 단백질.
  21. 제20항에 있어서, 천연 T 세포 에피토프가 P2 또는 P30과 같은 파상풍 독소 에피토프, 디프테리아 독소 에피토프, 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌 에피토프, 및 P. falciparum CS 에피토프 중에서 선택되고, 인공 MHC-II 결합 펩타이드 서열은 PADRE 펩타이드인 키메라 결합 단백질.
  22. 제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 부분은 B 임파구나 APC 상에 수용체가 있는 탄수화물 또는 합텐과 같이, B 임파구 특이적인 표면 항원 또는 APC 특이적 표면 항원에 대한 실질적으로 특이적인 결합 파트너인 키메라 결합 단백질.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 제2 부분은 시토카인 및 열충격 단백질 중에서 선택되는 것인 키메라 결합 단백질.
  24. 제23항에 있어서, 시토카인은 인터페론 γ (IFN-γ), Flt3L, 인터류킨 1 (IL-1), 인터류킨 2 (IL-2), 인터류킨 4 (IL-4), 인터류킨 6 (IL-6), 인터류킨 12 (IL-12), 인터류킨 13 (IL-13), 인터류킨 15 (IL-15), 및 과립구-대식세포 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 중에서 선택되거나 그의 유효한 일부분이고, 열청격 단백질은 HSP70, HSP90, HSC70, GRP94 및 칼레티큘린 (CRT) 중에서 선택되거나 그의 유효한 일부분인 키메라 결합 단백질.
  25. 제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 제3 부분은 팔미토일기, 미리스틸기, 파르네실기, 제라닐-제라닐기, GPI-앵커, 및 N-아실 디글리세라이드기와 같은 지질 특성을 갖는 것인 키메라 결합 단백질.
  26. 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 키메라 결합 단백질을 코딩하는 핵산 단편 또는 그에 상보적인 핵산 단편.
  27. 자율 복제를 할 수 있는 벡터와 같이, 제26항에 따른 핵산 단편을 함유하는 벡터.
  28. 제27항에 있어서, 플라스미드, 파지, 코스미드, 미니 염색체 및 바이러스 중에서 선택된 벡터.
  29. 제27항 또는 제28항에 있어서, 5'→3' 방향으로 제26항에 따른 핵산 단편의 발현을 추진하기 위한 프로모터, 폴리펩타이드 단편의 막 내로 분비 또는 통합될 수 있는 리더 펩타이드를 코딩하는 임의의 핵산 서열, 제26항에 따른 핵산 단편 및 임의로 터미네이터가 작동적으로 결합되어 있는 벡터.
  30. 제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 있어서, 숙주 세포 내로 도입될 경우, 숙주 세포 게놈 중에 통합될 수 있거나 통합될 수 없는 벡터.
  31. 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터가 진핵 세포 및/또는 원핵 세포 중에서 발현을 추진하는 것인 벡터.
  32. 제26항에 따른 핵산 단편을 복제할 수 있는 형질전환 세포와 같이, 제27항 내지 제30항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 함유하는 형질전환 세포.
  33. 제32항에 있어서, 세균, 효모, 원생동물 중에서 선택된 미생물, 또는 곰팡이, S2 또는 SF 세포와 같은 곤충 세포, 식물 세포 또는 포유 동물 세포 중에서 선택된 다세포 생명체로부터 유래된 세포인 형질전환 세포.
  34. 제32항 또는 제33항에 있어서, 그의 표면에 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에서 정의된 키메라 결합 단백질을 분비하거나 함유하는 형질전환 세포와 같은, 제26항에 정의된 핵산 단편을 발현하는 형질전환 세포.
  35. - 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 키메라 결합 단백질, 및
    - 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 캐리어 및/또는 비히클 및/또는 애쥬번트를 포함하여 이루어지는, 자가 숙주에서 항원에 대한 항체 생산을 유발하기 위한 조성물.
  36. - 제26항에 따른 핵산 단편 또는 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 벡터, 및
    - 약학적 및 면역학적으로 허용가능한 캐리어 및/또는 비히클 및/또는 애쥬번트를 포함하여 이루어지는, 자가 숙주에서 항원에 대한 항체 생산을 유발하기 위한 조성물.
  37. 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하고, 제26항에 따른 핵산 단편을 발현하며, 필요에 따라, 그의 표면에 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 키메라 결합 단백질을 분비하거나 함유하는 안정한 세포주.
  38. 제26항에 따른 핵산 단편 또는 제27항 내지 제31항 중 어느 한 항에 따른 벡터로 숙주 세포를 형질전환시키는 것을 포함하는, 제32항 내지 제34항 중 어느 한 항에 따른 세포의 제조 방법.
  39. 1) 어떤 동물의 목적하는 자가 항원에 결합하고 제1 수용체를 포함하는 제1 분자를 제공하는 공정,
    2) 자가 항원을 생산하는 상기 동물에 자가적인 항체 또는, 상기 동물에서 관용성을 파괴하는 1종 이상의 아미노산 서열 역시 포함한다는 사실을 제외하고는, 자가 항원을 생산하는 상기 동물에 자가적인 항체를 생산하는 트랜스제닉 동물을, 필요에 따라 면역원 캐리어에 커플링되어 있는 제1 분자를 이용하여 면역시키는 공정,
    3) 제1 분자에 결합하는 항체들을 생산하는 하이브리도마를 제조 및 분리하는 공정,
    4) 상기 제1 수용체에 대해 선택적으로 결합하는 항체를 생산할 수 있는 능력에 대해 상기 공정 3)의 하이브리도마를 스크리닝하는 공정, 및
    5) 적어도 항체 또는 그의 기능적 부분을 코딩하는 유전 물질로 적절한 숙주 세포를 형질전환시키는 공정으로서, 여기서 상기 유전 물질은 선택적으로 결합하는 항체를 생산하는 상기 공정 4)의 하이브리도마로부터 분리되거나 분리될 수 있는 물질인 공정,
    6) 공정 5)에서 형질전환된 숙주 세포를, 적어도 항체 또는 그의 기능적 단편의 생산을 용이하게 해주는 조건 하에서 배양시켜 숙주 세포 배양체로부터 항체 또는 그의 기능적 단편을 회수하는 공정
    을 포함하여 이루어지는, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 키메라 결합 단백질의 제조 방법.
  40. 1) 어떤 동물의 목적하는 자가 항원에 결합하고 제1 수용체를 포함하는 제1 분자를 제공하는 공정,
    2) 상기 제1 분자의 상기 제1 수용체에 선택적으로 결합할 수 있는 능력에 대해 제2 분자의 라이브러리를 스크리닝하는 공정,
    3) 상기 공정2)에서 선택적으로 결합하는 라이브러리의 구성원을 분리하는 공정, 및
    4) 적어도 a) 공정 3)에서 분리된 구성원의 결합 부위, b) 상기 결합 부위의 천연 3차원 구조를 안정화시키는, 상기 동물의 자가 유래의 스캐폴드 단백질 구조, 및 c) 비인간 MHC 클래스 II 결합 아미노산 서열을 함유하는 키메라 결합 단백질을 합성 기술 또는 재조합 기술을 이용하여 제조하는 공정; 또는
    i) 1) 정확한 본래의 3차원 배열의 제2 수용체 또는 그의 미모토프 (mimotope), 2) 상기 3차원 배열을 안정화시키고, 상기 동물 중 제2 수용체가 유도된 것과는 다른 분자로부터 유도된, 상기 동물의 자가 유래의 스캐폴드 단백질 구조, 및 3) 관용성 파괴 아미노산 서열을 함유하는 키메라 결합 단백질을 합성 기술 또는 재조합 기술을 이용하여 제조하는 공정
    을 포함하여 이루어지는, 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 키메라 결합 단백질의 제조 방법.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 제1 분자가 항체, 바람직하게는 모노클로날 항체인 방법.
  42. 제41항에 있어서, 제1 수용체가 항체의 이디오타입인 방법.
  43. 제39항 내지 제42항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 3)의 스크리닝이, 제1 수용체 이외의 제1 분자와 결합하는 라이브러리 구성원의 동정을 가능케 해줌으로써, 후속 단계로부터 이러한 구성원을 배제시켜주는, 배제 공정을 포함하는 것인 방법.
  44. 제43항에 있어서, 상기 배제 공정이
    a) 제1 수용체 외부의 제1 분자 부분에 대한 상기 라이브러리 구성원의 결합 능력 여부를 시험하여, 그러한 결합을 할 수 있는 라이브러리 구성원은 배제시키는 시험 및/또는
    b) 제1 수용체에 대한 결합을 놓고 제2 수용체와 경쟁할 수 있는 상기 라이브러리 구성원들의 능력을 시험하여, 그러한 능력을 나타내지 않는 라이브러리 구성원을 배제시키는 시험
    을 포함하는 방법.
  45. 제40항에 종속되는 것을 전제로, 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 3)이 제2 분자의 파지 디스플레이를 포함하는 것인 방법.
  46. 제40항에 종속되는 것을 전제로, 제40항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 공정 3)에서, 제2 분자의 라이브러리를 리보좀 디스플레이, mRNA 디스플레이 또는 효모 표면 디스플레이 처리하는 방법.
  47. 동물의 면역계에 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 따른 키메라 결합 단백질의 면역학적 유효량을 제시함으로써 제1항 또는 제25항에 정의된 제2 수용체를 그 구조 중에 포함하는 자가 항원에 대하여 특이적 면역 반응을 유발시키는 것을 포함하여 이루어지는, 동물에 있어서, 자가 항원 또는 상기 자가 항원의 에피토프를 디스플레이하는 세포를 하향 조절하는 방법.
  48. 제47항에 있어서, 키메라 결합 단백질의 유효량을 피내, 피하, 및 근육내 경로와 같은 비경구 경로; 복강내 경로; 경구 경로; 볼내 경로; 설하 경로; 경막외 경로; 척수 경로; 항문 경로; 및 두개골 경로와 같은 비경구 경로 중에서 선택된 경로를 통해 동물에게 투여하는 방법.
  49. 제48항에 있어서, 유효량이 키메라 결합 단백질 0.5 ㎍ 내지 2,000 ㎍ 범위인 방법.
  50. 제47항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 결합 단백질이 가상 임파절 (VLN) 장치 중에 함유된 방법.
  51. 제47항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 키메라 결합 단백질이 자가항원에 대한 자가관용성의 파괴를 용이하게 해주는 애쥬번트와 함께 조성되어 있는 방법.
  52. 제47항에 있어서, 면역계에 대한 키메라 결합 단백질의 제시는 키메라 결합 단백질을 코딩하는 핵산(들)을 동물 세포 내로 도입함으로써 수행되고, 그에 따라 상기 세포에 의해, 도입된 핵산(들)의 생체내 발현이 달성되는 방법.
  53. 제52항에 있어서, 도입된 핵산(들)이 네이키드 DNA, 하전된 또는 하전되지 않은 지질과 함께 조성된 DNA, 리포좀 중에 조성된 DNA, 바이러스 벡터 중에 포함된 DNA, 트랜스펙션-용이화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 표적화 단백질 또는 폴리펩타이드와 함께 조성된 DNA, 칼슘 침전제제와 함께 조성된 DNA, 불활성 캐리어 분자에 커플링된 DNA, 및 애쥬번트와 함께 조성된 DNA 중에서 선택되는 것인 방법.
  54. 제53항에 있어서, 핵산(들)이 VLN 장치 중에 함유된 방법.
  55. 제47항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 1년에 적어도 1회 투여/도입, 예컨대 1년에 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 6회, 및 적어도 12회 투여/도입하는 방법.
  56. 제47항에 있어서, 면역계의 제시가 제26항에 따른 핵산 단편을 담지 및 발현시키는 비병원성 미생물 또는 바이러스의 투여에 의해 수행되는 방법.
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