KR20050084847A - 조건성 복제 오리진을 보유하는 원형 ｄｎａ 분자, 이의제조방법 및 이를 유전자치료에 사용하는 방법 - Google Patents

조건성 복제 오리진을 보유하는 원형 ｄｎａ 분자, 이의제조방법 및 이를 유전자치료에 사용하는 방법 Download PDF

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Abstract

원핵생물 재조합 숙주 세포에서의 기능에, 이 숙주 세포에 외래성인 복제 개시 단백질을 필요로 하는 조건성 복제 오리진 및 이종의 치료 유전자를 함유하는 염색체외 DNA 분자 및 조건성 복제 오리진을 활성화시키는 이종의 복제 개시 단백질을 함유하는 원핵생물 재조합 숙주 세포. 이러한 숙주 세포는 pir 유전자 카피수 조절 영역, pir 유전자 류신 지퍼 유사 모티프 또는 pir 유전자 DNA 결합 영역에서 발생할 수 있는 하나 이상의 돌연변이를 보유한 pir 유전자를 함유할 수 있다.

Description

조건성 복제 오리진을 보유하는 원형 ＤＮＡ 분자, 이의 제조방법 및 이를 유전자치료에 사용하는 방법{CIRCULAR DNA MOLECULE HAVING A CONDITIONAL ORIGIN OF REPLICATION, PROCESS FOR THEIR PREPARATION AND THEIR USE IN GENE THERAPY}
본 발명은 유전자 치료 또는 재조합 단백질 생산에 사용할 수 있는 신규 조건성 복제 DNA 분자에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규 DNA 분자는 이하 pCOR™이라 부른다.
유전자 치료는 손상된 기관 또는 세포에 유전자 정보를 도입시켜 결손 또는 이상을 보정하는 방법으로 이루어진다. 이러한 유전자 정보는 상기 기관에서 추출된 세포로 시험관내 도입된 후 체내로 재주입되거나 또는 표적 조직에 직접 생체내 주입될 수도 있다. 고분자량의 음전하를 띤 분자로서 DNA는 인지질 세포막을 자발적으로 통과하기가 어렵다. 따라서, 유전자 전달이 수행될 수 있도록 다양한 벡터, 예컨대 바이러스 벡터, 및 또 다른 천연 또는 합성의 화학적 및/또는 생화학적 벡터가 사용되고 있다.
바이러스 벡터(레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노관련 바이러스 등)는 특히 막 통과에 매우 효과적이나, 병원성, 재조합, 복제 및 면역원성과 같은 일정한 수의 위험요인을 갖고 있다.
화학적 및/또는 생화학적 벡터는 이러한 위험요인을 피할 수 있다(Behr, 1993, Cotten and Wagner, 1993 참조). 이의 예에는 DNA와 침전물을 형성하여 세포에 의해 식포화("phagocytosis")될 수 있는 양이온(인산칼슘, DEAE-덱스트란 등)이 있다. 또한, DNA가 내포되어 혈장막에 융합되는 리포좀일 수도 있다. 합성 유전자 전달 벡터는 일반적으로 DNA와 결합하여 DNA와 함께 양성 하전 표면을 보유한 입자를 형성하는 지질 또는 양이온 중합체이다. 이러한 유형의 벡터의 예로서, 디옥타데실아미도글리실스퍼민(DOGS, Transfectam™) 또는 N-[1-(2,3-디올레일옥시)프로필]-N,N,N-트리메틸암모늄(DOTMA, Lipofectin™)을 들 수 있다.
하지만, 화학적 및/또는 생화학적 벡터 또는 나출형 DNA의 사용은 약리학적 순도의 DNA를 다량으로 생산할 수 있는 가능성이 있음을 내포하는 것이다. 이러한 이유로, 유전자 치료 기술에서 사용되는 의약 산물은 DNA 자체로 구성되지만, 인간의 치료목적으로 사용하기에 적당한 성질을 가진 DNA를 적당한 양으로 제조할 수 있는 것이 필수적이다.
비바이러스 벡터학에서, 사용되는 벡터는 박테리아 기원의 플라스미드이다. 유전자 치료에 일반적으로 사용되는 플라스미드는 (i) 복제 오리진, (ii) 항생제(카나마이신, 앰피실린 등) 내성 유전자와 같은 마커 유전자 및 (iii) 발현에 필요한 서열을 가진 1종 이상의 트란스유전자(인헨서, 프로모터, 폴리아데닐화 서열 등)을 수반한다. 하지만, 현재 이용가능한 기술은 전적으로 만족스럽지는 않다.
한편, 체내 확산의 위험은 여전히 남아있다. 즉, 체내에 존재하는 박테리아는 낮은 빈도로 플라스미드를 수용할 수 있다. 이의 발생가능성은, DNA가 환자의 체내에 확산되어 이 환자에 감염된 박테리아와 접촉하게 되거나 또는 공생 균총의 박테리아와 접촉하게 될 수 있는 생체내 유전자 치료 요법이 수반된다면 더욱 크다. 플라스미드를 수용하는 박테리아가 대장균과 같은 장내세균이면, 이 플라스미드는 복제될 수 있다. 이러한 사건은 이후 치료 유전자의 확산을 유도한다. 유전자 치료법에 사용되는 치료 유전자가 예컨대 림포킨, 성장인자, 항종양유전자 또는 숙주에 결손된 기능을 보유하여 유전자 결함을 수정할 수 있는 단백질을 암호할 수 있다면, 그 치료 유전자의 일부 확산은 예상할 수 없는 심각한 결과를 초래할 수 있다(예컨대, 병원성 박테리아가 인간 성장인자 유전자를 획득하는 경우).
다른 한편, 비바이러스 유전자 치료에 일반적으로 사용되는 플라스미드는 항생제(앰피실린, 카나마이신 등) 내성 마커를 보유한다. 이에 따라, 이러한 플라스미드를 획득한 박테리아는 플라스미드 내성 유전자를 선택하는 항생제와 유사한 군의 항생제를 이용하는 모든 항생제 치료시 당해 플라스미드를 선발하게 되므로 선발에 유리하다는 것은 부인할 수 없다. 이와 관련하여, 앰피실린은 세계적으로 가장 흔히 사용되는 항생제군인 α-락탐류에 속한다. 항생제 내성 유전자 외에 다른 선택 마커를 박테리아에 사용하여도 매우 유리할 수 있다. 이에 따르면, 이 마커를 보유한 플라스미드를 수용했을 수 있는 박테리아의 선발을 피할 수 있다.
따라서, 치료 유전자 및 내성 유전자의 확산은 가능한 많이 제한되는 것이 특히 중요하다.
도 1: 복제에 관여하는 R6K 영역의 기능적 조직도.
도 2: 플라스미드 R6k의 Π 단백질의 기능적 도메인에 대한 조직도.
도 3: E.콜리 XAC1의 게놈에 pir 유전자를 도입시키기 위한 프로토콜의 대표도.
도 4: 벡터 pXL2666, 2730 및 2754의 작제 도식.
도 5: pXL2774의 작제.
도 6: 2L 발효기에서의 증식 및 생산 동력학.
도 7: 800L 발효기에서의 증식 및 생산 동력학.
도 8: pXL3056의 작제.
도 9: 유도후 E.콜리 XAC-1pir116(pXL3056+PT7pol23)에 의해 생성되는 aFGF 단백질의 가시화. 변성된 총 세포 추출물을 12.5%-SDS 폴리아크릴아미드 겔 위에 침착시켰다. M: 분자량 마커(Biorad, 낮은 범위). 각 밴드는 화살표로 표시하고 질량(kD)을 나타내는 숫자를 표시했다. 1: 유도되지 않은 XAC-1pir116 (pXL3056+pUC4K); 2: 42℃에서 유도된 XAC-1pir116 (pXL3056+PUC4K); 3: 유도되지 않은 XAC-1pir116(pXL3056+PT7pol23) 클론 1; 4: 42℃에서 유도된 XAC-lpirll6 (PXL3056+PT7POL23) 클론 1; 5: 유도되지 않은 XAC-1pir116 (pXL3056+PT7pol23) 클론 2; 6: 42℃에서 유도된 XAC-1pir116(pXL3056+PT7pol23) 클론 2; tl: 정제된 aFGF 1㎍; t4: 정제된 aFGF 4㎍.
도 10: 벡터 pXL3029, pXL3030 및 pXL3179 또는 NV1FGF의 모식도.
도 11: R6K π개시인자 단백질의 기능적 도메인의 모식도.
도 12: pir116 및 pir42 돌연변이를 함유하는 pir 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열.
도 13: 상동성 재조합을 위한 pir116pir42 자살 벡터의 작제.
도 14: 영역 uidA::pir116 +/- pir42를 증폭시킬 때 수득되는 PCR 산물의 모식도.
도 15: TEX1 또는 TEX1pir42에서 생성되는 pCOR 플라스미드 pXL3179의 지형을 나타내는 아가로스 겔 전기영동.
도 16: 10개의 pir116cop21 유전잘?? 운반하는 pXL3749 자살 플라스미드의 모식도.
도 17: E.콜리 숙주 세포 TEX1cop21(라인 1 내지 4)에서, E.콜리 숙주 세포 XAC1pir(라인 5 내지 8)에서, E.콜리 TEX1(라인 9 내지 12)에서 생산될 때 pXL2979의 플라스미드 카피수를 나타내는 아가로스 겔 전기영동.
도 18: recA 자살 벡터의 작제를 위한 클로닝 전략의 개략도.
도 19: E.콜리 TEX2 균주의 영역을 증폭시킬 때 수득되는 PCR 산물의 모식도.
도 20: E.콜리 TEX2pir42(라인 B)에서, E.콜리 TEX1pir42(라인 C)에서, E.콜리 TEX1(라인 D)에서 생산되는 pCOR pXL3179의 지형을 나타내는 아가로스 겔 전기영동.
도 21: E.콜리 TEX2pir42의 발효를 통해 생성되는 플라스미드 pXL3179의 분석.
도 22: 플라스미드 카피수에 따라 형광성이 증가함을 보여주는 형광성 기반 분석법.
도 23: 형광성 기분 분석법으로 선별된 플라스미드의 다이아그램.
도 24: 플라스미드 pXL3830의 다이아그램.
도 25: 랜덤 돌연변이유발에 의해 생성된 카피수 증가 돌연변이체의 형광성 기반 선별을 증명하는 아가 평판.
도 26: 형광성 기반 선별 방법에 의해 확인된 카피수 증가 돌연변이체의 평가.
도 27: 박테리아 게놈에 삽입된 pir116 돌연변이체를 평가하기 위한 전략의 다이아그램.
도 28: 여러 pir116* 돌연변이체 E.콜리 균주에서의 pXL3179 카피수 평가.
도 29: E.콜리에서 상동성 재조합하기 위한 미니서클 벡터 작제에 사용된 플라스미드의 작제.
도 30: pir116* 돌연변이체 E.콜리 균주 생산에 사용된 미니서클 벡터의 작제.
도 31: 미니서클 벡터를 이용한 상동성 재조합에 의해 유전자 치환의 다이아그램.
도 32: 소듐 데옥시콜레이트를 함유하는 배지에서 증식된 이중 재조합체 클론의 증명.
도 33A 및 B: 이중 재조합체에 대한 조절 PCR 결과.
본 발명의 과제는 구체적으로 유전자 치료 또는 시험관내 재조합 단백질의 생산에 사용될 수 있고, 비바이러스 벡터의 특정 기능을 보충할 수 있는 세포에서만 복제되는 신규 DNA 분자를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명은 이러한 DNA 분자의 제조에 특히 효과적인 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 DNA 분자는 플라스미드의 확산과 관련된 위험, 예컨대 (1) 치료 유전자의 비제어적 과잉발현을 유도할 수 있는 복제 및 확산, (2) 내성 유전자의 확산 및 발현을 제거할 수 있는 잇점을 갖고 있다. 본 발명에 따른 DNA 분자에 함유된 유전자 정보는 치료 유전자(들)와 이의 발현을 조절하는 시그널, 이 플라스미드의 숙주 세포 범위를 상당히 제한하는 조건적 기능성인 복제 오리진, 바람직하게는 항생제 내성을 부여하는 유전자와 상이한 감소된 크기의 선택 마커, 및 적당한 경우에 플라스미드 다량체를 분할시키는 DNA 단편을 포함하는 것이 효과적이다. 이러한 분자( 및 여기에 함유된 유전자 정보)가 미생물로 전달되고 안정하게 유지될 가능성은 매우 제한된다.
마지막으로, 본 발명에 따른 벡터는 원형 구조와 감소된 크기 및 수퍼코일형으로 인해 미니플라스미드라고도 불리는데, 다음과 같은 추가적인 장점이 있다: 통상적으로 사용되는 ColE1 유래 플라스미드에 비해 감소된 크기로 인하여, 본 발명에 따른 DNA 분자는 생체내 생체이용가능성이 보다 양호하고, 본 발명의 DNA 분자 또는 pCOR은 개시 단백질을 함유하지 않는 숙주 원핵세포 또는 진핵세포에서 안정된 염색체외 형태로 유지된다. 특히, 본 발명의 벡터는 세포 침투력 및 분산력이 증가된 것이다. 즉, 조직내 확산 계수가 분자량에 반비례한다는 것은 이미 알려진 사실이다(Jain, 1987). 이와 마찬가지로, 고분자량의 분자는 세포내에서 혈장막을 통한 투과성이 더 낮다. 또한, 플라스미드가 발현에 필수적인 핵으로 전달되기 위해서는, 핵공이 핵 내로 확산될 수 있는 크기를 제한하기 때문에 고분자량은 또한 단점이다(Landford et al., 1986). 또한, 본 발명에 따른 DNA 분자의 비치료 부분의 크기 감소는 DNA 분자의 크기를 감소시킬 수 있다. 박테리아에서 이러한 플라스미드의 복제와 선발에 필요한 부분(1kb)은 예를 들어 복제 오리진 및 내성 마커 벡터 부분이 3kb인 경우라고 계산하면 3배 정도 감소된다. 이와 같은 (i) 분자량 및 (ii) 음하전의 감소는 본 발명의 분자의 조직, 세포 및 핵 생체이용성 및 확산을 개선시켜준다.
보다 구체적으로, 본 발명은 당해의 1종 이상의 핵산 서열을 함유하는, 유전자 치료법에 유용한 원형 DNA 분자에 관한 것으로서, 이 분자의 복제를 허용하는 영역에는 숙주 세포에서의 기능에 이 숙주 세포에 대해 이종성인 1종 이상의 특수 단백질을 필요로 하는 복제 오리진을 함유하는 것을 특징으로 한다.
이러한 DNA 분자는 단일 가닥 형태이거나 이중 가닥 형태일 수 있으며서, 슈퍼코일 형태를 함유하는 것이 유리하다.
본 발명의 목적상, 사용되는 숙주 세포는 다양한 기원의 세포일 수 있다. 예를 들어, 진핵 세포 또는 원핵 세포일 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 원핵 세포이다.
박테리아 플라스미드의 복제에는 숙주 세포에 의해 암호화되는 1종 이상의 단백질과, RNA 폴리머라제, Rnase, DNA 폴리머라제 등의 종류를 필요로 한다. 이미 앞에서 설명한 이유로 인해, 이러한 종류의 복제 성분으로는, 처리된 유기체에서의 전파의 가능한 모든 위험성을 완전히 극복할 수는 없다. 유리하게도, 본 발명에 따른 DNA 분자가 보유한 복제 오리진의 기능성에는 숙주 세포에 이종성인 특정 단백질의 존재를 필요로 한다. 이러한 특징의 의의는 본 발명에 따른 플라스미드의 숙주 범위를 상기 개시인자 단백질을 발현하는 특정 균주만으로 축소시킨다는 점이다. 따라서, 본 발명의 배경하에 개발된 DNA 분자는 소위 조건성 복제 오리진(conditional origin of replication)을 보유하여 바람직하다.
본 발명에 따라 사용되는 조건성 복제 오리진은 다음과 같은 특징을 공유하는 플라스미드 또는 박테리오파지에서 유래할 수 있다: 즉 복제 오리진 내에 반복 서열 또는 이터론(iteron)을 함유하고, 자신에게 특이적인 복제 개시 단백질(Rep)을 하나 이상 암호화하는 플라스미드 또는 박테리오파지. 그 예로는 다음과 같은 플라스미드와 박테리오파지의 조건성 복제 시스템을 들 수 있다:
플라스미드 또는 박테리오파지 특정 개시인자 단백질
RK2(Stalker et al., 1981) TrfA
R1(Ryder et al., 1981) RepA
pSC101(Vocke and Bastia, 1983) RepA
F(Murotsu et al., 1981) 단백질 E
Rts1(Itoh et al., 1982, 1987) RepA
RSF1010(Miao et al., 1995) RepC
P1(Abeles et al., 1984) RepA
P4(Flensburg and Calendar, 1987) 알파 단백질
람다(Moore et al., 1981) 단백질 O
phi 82(Moore et al., 1981) phi 82 유래의 단백질 O
phi 80 phi 80 유래의 단백질 O
본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 청구된 DNA 분자에 사용되는 복제 오리진은 R6K라고 불리는 천연 E.콜리 플라스미드에서 유래된 것이다.
R6K의 복제 기능은 3개의 복제 오리진 α, β 및 γ(γ와 α가 복제의 90%를 담당한다)를 함유하는 5.5kbp DNA 단백질과 Π복제 개시인자 단백질 및 단백질 Bis를 암호화하는 오페론으로 대별된다. 이 플라스미드를 특정 카피수(게놈당 15카피)로 유지하는데 필요한 최소량의 유전자 정보에는 2가지 인자, 즉 ori γ의 400bp와, 산물이 Π개시인자 단백질인 유전자 pir이 함유되어 있어야 한다.
oriγ는 2개의 기능 부, 즉 코어 부와 활성인자 요소로 나뉘어질 수 있다(도 1). 복제에 필수성분인 코어부는 이터론(22bp의 7개 다이렉트 반복체)[여기에는 서열 1에 제시된 Π 단백질이 결합된다]과 숙주 단백질(IHF, DnaA)의 표적인 인접 분절을 함유한다.
본 발명의 바람직한 방식에 따라, 청구된 벡터의 복제 오리진은 플라스미드 R6K의 이러한 복제 오리진 γ 전체 또는 부분을 함유하며, 보다 바람직하게는 서열 1 또는 이의 유도체 중 하나의 전체 또는 일부를 함유한다.
매우 제한된 크기라는 장점이 있는 전술한 복제 오리진은 유전자 pir(서열 2)에 의해 생성되는 특정 개시인자 단백질, 단벡질 Pi의 존재하에서만 기능을 나타낸다. 이러한 단백질은 트란스로 작용할 수 있으므로, pir 유전자와 ori 감마를 물리적으로 분리시켜 둘 수 있으며, 이 플라스미드들에 특이적인 숙주로서 선택된 세포의 게놈으로 도입될 수 있다. Π의 돌연변이는 이의 억제 기능을 변화시킬 수 있고(Inuzuka and Wada, 1985), R6K 유도체의 카피수를 최초 카피수의 최고 10개 이상까지 증가시킬 수 있다. 이러한 치환은 Π에 의한 플라스미드 카피 수 조절에 중요한 역할을 하는 것으로 보이는 40개 아미노산의 도메인 내에서 또는 Π 단백질의 다른 영역에서 이루어질 수 있다.
본 발명의 유리한 구체예에 따르면, 숙주 세포에서 발현되는 Π 단백질은 서열 2에 제시된 유전자 또는 전술한 바와 같은 이의 유도체 중 하나의 발현, 보다 상세하게는 pir 유전자와 비교했을 때 돌연변이를 함유하는 유전자 pir116의 발현으로부터 생성된다. 상기 돌연변이는 개시 코돈으로부터 위치 106에 있는 프롤린이 류신으로 치환되는 것이다. 이러한 경우에, R6K 유도체의 카피수는 게놈당 약 250카피이다.
본 발명의 목적상, 유도체라는 용어는 고찰된 서열과 상이한 모든 서열로서, 유전자 및/또는 화학적 본성을 1종 이상 변형시켜 수득되는 서열 뿐만 아니라, 이러한 서열이나 이의 단편과 하이브리드하고 그 산물이 복제-개시인자 단백질 Π와 관련하여 나타나는 활성을 보유하는 모든 서열을 의미한다. 유전자 및/또는 화학적 본성의 변형이란 용어는 1개 이상의 잔지가 변형, 치환, 결실, 첨가 및/또는 변형된 모든 것을 의미한다는 것은 자명한 것이다. 또한, 유도체라는 용어에는 다른 세포원 유래, 특히 인간 기원인 세포, 또는 다른 유기체에서 유래되고 동일한 종류의 활성을 보유하는, 고찰된 서열과 상동성인 서열도 포함된다. 이러한 상동성 서열은 하이브리드화 실험을 통해 수득될 수 있다. 하이브리드화는 핵산 라이브러리를 가지고 통상적인 엄중도 조건(Maniatis et al., General techniques of molecular biology 참조) 하에 또는 바람직하게는 고엄중도 조건하에서 프로브로서 천연 서열 또는 이의 단편을 사용하여 수행할 수 있다.
전술한 바와 같은 조건성 복제 오리진 외에도, 청구된 DNA 분자는 소정의 숙주 내에서 DNA 분자가 선발되게 해 줄 수 있는 하나(또는 그 이상의) 유전자를 함유하는 영역을 함유한다.
이것은 카나마이신, 앰피실린, 클로람페니콜, 스트렙토마이신, 스펙티노마이신, 리비도마이신 등과 같은 항생제 내성을 부여하는 유전자 타입의 통상적인 마커일 수 있다.
하지만, 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 이러한 영역은 항생제 내성을 부여하는 유전자와 상이한 것일 수 있다. 즉, 그 산물이 제한된 배양 조건하에서 예상한 숙주의 생육성에 필수성분인 유전자일 수 있다. 예컨대, 다음과 같은 유전자일 수 있다:
- 천연 또는 합성 기원인, 억제인자 tRNA를 암호하는 유전자. 보다 바람직하게는 암버(amber) 코돈 rRNA(TAG)인 것이다.
- 산물이 특정 배양 조건하에서 세포의 대사에 필수성분인 유전자, 즉 대사산물(아미노산, 비타민 등)의 생합성에 관여하는 유전자, 또는 배양 배지(특정 질소 또는 탄소원)에 존재하는 물질을 동화작용할 수 있는 이화작용 유전자 등.
본 발명의 바람직한 방식에 따르면, 이러한 영역은 특정 코돈의 억제인자 tRNA를 암호하는 유전자의 발현 카세트를 함유한다. 이러한 유전자는 특히 페닐알라닌, 시스테인, 프롤린, 알라닌 및 히스티딘 아미노산을 암호하는 유전자 중에서 선택될 수 있다. 보다 상세하게는 암버 코돈(TAG)에 대한 억제인자 tRNA인 것이다.
이와 같이 특별한 경우에, 본 발명의 주제인 DNA 분자를 숙주 세포에서 선발하는데 사용되는 시스템은 2가지 요소, 즉 1) DNA 분자 상의 (sup) 유전자로 알려진 선발 마커를 구성하는, 암버 코돈(TAG)의 억제인자 전사 RNA를 암호하는 유전자, 및 2) 유전자 중 하나가 특정 배양 조건일 때 필수 성분인 암버 TAG 코돈을 함유하는 특정 숙주를 함유한다. 이러한 세포는 TAG 코돈을 함유하는 유전자 산물이 필수성분인 특정 배양 조건일 때, 즉 sup 발현을 허용하는 플라스미드가 세포에 존재하는 경우에만 증식할 수 있다. 따라서, 이러한 배양 조건은 DNA 분자의 선발에 압력이 될 수 있다. 사용된 sup 유전자는 천연 기원(Glass et al., 1982)이거나 또는 합성 구조물 기원일 수 있다(Normanly, et al, 1986, Kleina et al., 1990).
이러한 시스템은 암버 돌연변이를 함유하는 유전자에 따라 최대한의 유연성을 제공하여, 다양한 선발 배지를 사용할 수 있다. 예를 들어, 박테리아 락토코커스 락티스(Lactococcus lactis)에서 암버 코돈은 퓨린 생합성 유전자에 위치한다. 이것은 박테리아가 우유에서 증식될 때 억제인자 tRNA를 암호하는 유전자를 보유하는 플라스미드를 선발할 수 있게 해준다. 이러한 마커는 크기가 매우 작고, 파지 유래의 "이종" 서열이나 트란스포손을 함유하지 않는다는 장점이 있다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, DNA 분자는 또한 플라스미드 다량체의 분할을 가능케 해주는, 부위 특이적 재조합효소의 표적인, DNA 단편을 함유하기도 한다.
즉, 이러한 단편이, 원형이고 복제 오리진이 있는 DNA 분자에 도입되면, 이러한 플라스미드의 다량체의 분할이 가능해진다. 이러한 다량체는, 특히 R6K 유도체의 카피수를 증가시킬 수 있는 pir의 돌연변이 대립유전자, 예컨대 pir116을 보유하는 균주에서 DNA 분자가 제조될 때 관찰된다.
이러한 재조합은 서열 사이에 부위 특이적 재조합을 수반하는 다양한 시스템에 의해 달성될 수 있다. 보다 바람직하게는, 본 발명의 부위 특이적 재조합이 일반적으로 재조합효소라고 불리는 특정 단백질의 존재하에서 서로 재조합할 수 있는 특정 분자간 재조합 서열에 의해 수득되는 것이다. 이러한 경우에, 상기 단백질은 재조합효소 XerC 및 XerD이다. 이러한 이유로, 본 발명에 따른 DNA 분자는 일반적으로 이러한 부위 특이적 재조합을 허용하는 서열을 포함하기도 한다. 본 발명에 따른 유전자 작제물에 존재하는 특정 재조합 시스템(재조합효소 및 특정 인식 부위)은 기원이 다양할 수 있다. 구체적으로, 사용되는 특정 서열과 재조합효소는 상이한 구조 부류, 보다 상세하게는 트란스포손 Tn3 레졸바제(resolvase)과 또는 박테리오파지 람다 인테그라제(integrase)과에 속하는 것일 수 있다. 트란스포손 Tn3과에 속하는 재조합효소 중에서, 특히 트란스포손 Tn3 또는 트란스포손 Tn21 및 Tn522의 레졸바제(Stark et al., 1992); 박테리오파지 mu의 Gin 인버타제(invertase) 또는 대안적으로 플라스미드 레졸바제, 예컨대 RP4의 par 단편의 레졸바제(Abert et al., Mol.Microbiol. 12(1994) 131)를 예로 들 수 있다. 박테리오파지 λ 인테그라제 과에 속하는 재조합효소 중에는, 예컨대 파지 람다의 인테그라제(Landy et al., Science 197(1977) 1147), P22 및 φ80의 인테그라제(Leong et al., J. Biol. Chem. 260(1985) 4468), 헤모필러스 인플루엔자의 HP1(Hauser et al., J. Biol. Chem. 267(1992) 6859), 파지 P1의 Cre 인테그라제, 플라스미드 pSAM2의 인테그라제(EP 350 341) 또는 이외에 2μ 플라스미드의 FLP 재조합효소 및 E.콜리의 XerC 및 XerD 재조합효소가 있다.
본 발명의 주제를 구성하는 DNA 분자는 천연 E.콜리 플라스미드 ColE1 유래의 단편 cer를 함유하는 것이 바람직하다. 사용된 cer 단편은 cis 방식으로 플라스미드 다량체의 분할을 수행하는 것으로 밝혀진 바 있는 ColE1 유래의 382bp HpaII 단편이다(Summers et al., 1984; Leung et al., 1985). 또한, 보다 작은 크기(280bp)의 HpaII-TaqI 단편이나 또는 HpaII 단편에 함유된 보다 작은 단편(약 220bp)도 동일한 성질을 보유한다면 사용할 수 있다(Summers and Sherratt, 1988). 이러한 분할은 E.콜리 게놈에 의해 암호화되는 4개의 단백질, 즉 ArgR, PepA, XerC 및 XerD를 수반하는 특정 분자간 재조합을 통해 수행한다(Stirling et al, 1988,1989 ; Colloms et al., 1990, Blakely et al., 1993). 이러한 플라스미드 다량체 분할을 위해 천연의 E.콜리 플라스미드 ColE1 유래의 cer 단편을 삽입하면 분할율이 높아질 수 있고, 이에 따라 다량의 단량체를 복제방식으로 수득할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이것은 pBluescript SK+ 유래의 ColE1 복제 오리진을 함유하는 미니서클에 cer 부위를 삽입한 것이 효과적인 다량체 분할을 제공하지 못하는 것으로 밝혀진 바 있으므로(Kreiss et al. , Appl. Microbiol. Biotechnol, 49: 560-567 (1998)) 놀라웠고, 따라서 cis 작용성의 플라스미드의 효과적인 분할은 예측할 수 없었던 것으로, 플라스미드 형태 때문인 것으로 보인다. pCOR 플라스미드의 경우에, 효과적인 cis 분할은 pCOR에 cer이 존재할 때 달성되어, 예기치 않게 복제 방식으로 pCOR의 다량의 단량체를 수득할 수 있었다.
이와 관련하여, 특히 ColE1의 cer 단편 또는 전술한 바와 같은 이의 유도체 중 하나의 전부 또는 일부를 사용하는 것이 유리하다.
실행 변형예에 따르면, 본 발명의 DNA 분자는 추가로 리간드와 특이적으로 상호작용할 수 있는 서열을 함유할 수 있다. 특히, 특정 올리고뉴클레오타이드와 하이드리드화에 의해 3중 나선을 형성할 수 있는 서열이 바람직하다. 따라서, 이러한 서열은 본 발명의 분자를 지지체에 고정된 상보성 올리고뉴클레오타이드와의 선택적 하이드리드화에 의해 정제할 수 있게 해준다(예컨대 출원 WO 96/18744 및 WO 02/07727 참조). 이러한 서열은 본 출원인의 미국 공개 출원 2003/186268에 기술된 바와 같은 플라스미드의 복제 오리진에 본래 존재하거나 또는 WO 02/07727에 기술된 돌연변이유전자(transgene)에 본래 존재할 수 있으며, 또는 당해 유전자와 복제 오리진의 기능성에 영향을 미치지 않는다면 본 발명의 DNA 분자의 임의의 부위에 위치할 수도 있다. 따라서, 하이브리드화에 의한 3중 나선의 형성은 DNA에 존재하는 특정 상보성 서열과 올리고뉴클레오타이드 사이에 일어난다. 이와 관련하여 최상의 수율과 최상의 선택성을 얻기 위해서는 완전 상보성인 특정 서열과 올리고뉴클레오타이드를 본 발명의 방법에 사용한다. 그 예는, 특히 올리고뉴클레오타이드 폴리(CTT) 및 특정 서열 폴리(GAA)일 수 있다. 예를 들어, CTT와 같은 반복 모티프를 함유하는 올리고뉴클레오타이드는 상보성 단위(GAA)를 함유하는 특정 서열과 3중 나선구조를 형성할 수 있다. 문제의 서열은 특히 7개, 14개 또는 17개 GAA 유닛을 함유하는 영역 및 이에 상응하는 수의 반복 CTT를 함유하는 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 이러한 경우에, 올리고뉴클레오타이드는 폴리퓨린 가닥에 역방향으로 결합한다. 이러한 3중 나선은 Mg2+의 존재하에서만 안정하다(Vasquez et al., Biochemistry, 34: 7243-7251 (1995); Beal and Dervan, Science, 251: 1360-1363 (1991)).
전술한 바와 같이, 특정 서열은 pCOR에 본래 존재하는 서열이거나 또는 pCOR에 인위적으로 도입된 합성 서열일 수 있다. 특히, pCOR에 본래 존재하는 서열, 예컨대 플라스미드의 복제 오리진이나 마커 유전자에 존재하는 서열과 3중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드를 사용하는 것이 유리하다. 이러한 천연의 호모퓨린-호모피리미딘 영역과 3중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 합성은 미변형 pCOR 플라스미드에 적용할 수 있으므로 특히 바람직하다. 특정 올리고뉴클레오타이드와 3중 구조를 형성할 수 있는 특히 바람직한 표적 서열은 ColE1 및 pCOR 복제 오리진에서 확인되었다. ColE1 유래의 플라스미드는 플라스미드 복제에 관여하는 RNA-II 전사물의 상류에 위치한 12mer 호모퓨린 서열(5'-AGAAAAAAAGGA-3')(서열 33)을 함유한다(Lacatena et al., Nature, 294: 623 (1981)). 이 서열은 12-mer 상보성 5'-TCTTTTTTTCCT-3'(서열 34) 올리고뉴클레오타이드와 안정된 3중 구조를 형성한다. pCOR 골격쇄는 pCOR의 γ오리진 레플리콘의 A+T 고밀도 분절에 위치한 14개의 비반복성 염기의 호모퓨린 스트레치(5'-AAGAAAAAAAAGAA-3')(서열 35)를 함유한다(Levchenko et al., Nucleic Acids Res., 24: 1936 (1996)). 이러한 서열은 14mer 상보성 올리고뉴클레오타이드 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3'(서열 36)와 안정된 3중 구조를 형성한다. 상응하는 올리고뉴클레오타이드 5'-TCTTTTTTTCCT-3'(서열 37) 및 5'-TTCTTTTTTTTCTT-3'(서열 38)는 ColE1 ori 또는 pCOR(oriγ) 중 어느 하나의 복제 오리진에 위치한 이들 각각의 상보성 서열을 효과적이며 특이적으로 표적으로 정한다. 또한, 복제 오리진이나 마커 유전자에 존재하는 서열과 3중 나선을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오타이드의 사용은 동일한 올리고뉴클레오타이드로 상기 복제 오리진이나 마커 유전자를 함유하는 모든 DNA를 정제할 수 있기 때문에 특히 바람직하다. 따라서, 합성된 특정 서열을 병입시키기 위해 플라스미드 또는 이중가닥 DNA를 변형시킬 필요가 없다.
완전 상보성 서열이 바람직하지만, 친화성 상실이 크지 않다면 올리고뉴클레오타이드 서열과 DNA에 존재하는 서열 간의 약간의 부정합(mismatch)가 허용되는 것으로 이해되어야 한다. E.콜리 β-락타메이즈 유전자에 존재하는 서열5'-AAAAAAGGGAATAAGGG-3'(서열 39)을 예로 들 수 있다. 이 경우에, 폴리퓨린 서열에 중재된 티민은 제3 가닥의 구아닌에 의해 인식될 수 있어, G*TA 3중자(triplet)를 형성할 수 있고, 이것은 2개의 T*AT 삼중자가 인접해 있으면 안정하다(Kiessling et al., Biochemistry, 31: 2829-2834 (1992)).
특정 구체예에 따르면, 사용된 올리고뉴클레오타이드는 서열 (CCT)n, 서열 (CT)n 또는 서열 (CTT)n을 함유할 수 있고, 여기서 n은 1 내지 15(15를 포함한다) 사이의 정수이다. 특히, (CT)n 또는 (CTT)n 형의 서열을 사용하는 것이 유리하다. 올리고뉴클레오타이드는 또한 (CCT), (CT) 또는 (CTT) 유닛을 조합할 수도 있다.
사용된 올리고뉴클레오타이드는 자연 올리고뉴클레오타이드(비변형의 자연 염기로 구성된 것)이거나 화학 변형된 올리고뉴클레오타이드일 수 있다. 구체적으로, 올리고뉴클레오타이드는 증가되기 위해, 뉴클레아제 내성을 부여하거나 뉴클레아제에 대해 보호될 수 있거나 특정 서열에 친화성을 부여하는 특정 화학 변형을 보유하는 것이 유리하다.
본 발명의 대표적인 DNA 분자로서, 플라스미드 pXL2774 및 이의 유도체는 청구되는 것 중 가장 바람직하다. 본 발명의 목적상, 유도체란 용어는 pXL2774 유래의 모든 작제물로서, 루시퍼라제 유전자 이외의 당해의 1종 이상의 유전자를 함유하는 것을 의미하는 것이다. 또한, 치료 유전자의 발현 카세트를 함유하는 플라스미드 pXL3179 또는 NV1FGF, 및 pXL3029 및 pXL3030을 예로 들 수 있다. 가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 출원인의 미국 특허 4,686,113에 기술된 바와 같은 FGFa 또는 FGF-1 유전자를 함유하는 pCOR(pXL3179 또는 NV1FGF로 표시됨)에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 이러한 치료적 DNA 분자의 생산에 특히 효과적인 특정 숙주 세포 작제방법의 개발에 관한 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 1종 이상의 DNA 분자와, 이러한 DNA 분자의 복제 오리진의 기능성을 조절하며 숙주 세포에 특이적이며 이종성인 단백질 함유하에 상기 DNA 분자에 의해 형질전환된 숙주 세포의 선발을 허용하는 조건하에서 숙주 세포를 배양하는 것을 특징으로 하는 원형 DNA 분자의 생산 방법에 관한 것이다.
보다 바람직하게는, DNA 분자의 복제 오리진의 기능성을 조절하는 단백질이 해당 유전자로부터 동일계에서 발현되는 것이다. 복제 개시 단백질을 암호하는 유전자는 사용된 조건성 복제 오리진의 유도체와 상용성이거나 재조합, 트란스포손, 박테리오파지 또는 임의의 다른 벡터에 의해 숙주 세포의 게놈내로 도입될 수 있는 보조 레플리콘에 의해 운반될 수 있다. 단백질을 발현하는 유전자가 보조 레플리콘에 존재하는 경우에, 이 레플리콘에는 3'말단에 위치하고 전사 종결 시그널을 특정하는 영역 뿐만 아니라 세포 내에서 기능적 전사를 수행하기 위한 프로모터 영역가 함유되기도 한다. 프로모터 영역과 관련하여, 이러한 프로모터 영역은 고찰 중인 유전자가 세포내에서 기능할 수 있을 때 그 유전자의 발현 역할을 본래 담당하고 있는 프로모터 영역일 수 있다. 또한, 다른 기원의 영역(다른 단백질의 발현을 담당하는) 또는 심지어 합성 기원의 영역일 수도 있다. 특히, 원핵세포 또는 박테리오파지 유전자용 프로모터 서열인 경우일 수도 있다. 예를 들어, 세포 게놈에서 얻은 프로모터 서열인 경우도 있을 수 있다.
복제-개시 단백질을 암호하는 유전자로는, DNA 분자내에서 사용된 복제 오리진의 기능성을 조절하는 개시인자 단백질에 특이적인 플라스미드(또는 유도체)의 카피수를 증가시킬 있는 야생형 유전자 또는 돌연변이된 대립유전자가 사용될 수 있다.
이러한 돌연변이체는 특히 플라스미드 R6K(Inuzuka and Wada, 1985; Greener et al., (1990)), Rtsl (Terawaki and Itoh, 1985, Terawaki et al., 1990; Zeng et al., 1990), F(Seelke et al., 1982; Helsberg et al., 1985; Kawasaki et al., 1991), RK2(Durland et al., 1990; Haugan et al., 1992, 1995), pSC101(Xia et al., 1991; Goebel et al., 1991 ; Fang et al., 1993)에 대해 설명되어 있다.
사용된 DNA 분자가 플라스미드 R6K 유래의 복제 오리진을 함유하는 경우에, 개시인자 단백질은 동일 플라스미드 유래의 Π단백질 유도체이다. 특히, 초기 카피수를 인지될 정도로 증가시킬 수 있는 상기 단백질의 변이 형태를 발현하는 것이 바람직하다. 이를 위해, 숙주 세포에 병입된 유전자는 서열 2에 나타낸 서열 또는 이의 유도체 중 하나의 서열 전체 또는 일부인 것이 바람직하며, 보다 바람직한 것은 pir116 유전자인 것이다. 관련 돌연변이는 프롤린이 류신으로 치환된 것이다. 본 발명의 특정 구체예에 따르면, 이러한 pir116 유전자가 숙주 세포 게놈에 직접 병입된다.
선택된 배양 조건하에서 필수적인, 특정 숙주 세포의 유전자 중 하나는 DNA 분자내의 선발된 억제인자 tRNA를 통해 인식될 수 있는 특정 코돈을 함유하는 것이 바람직하다. 본 발명의 바람직한 방식에 따르면 이것은 암버 TAG 코돈이다. 이러한 경우에, TAG 코돈을 함유하는 유전자의 산물이 필수성분인 배양 조건하에서, 숙주 세포에 sup 발현을 허용하는 플라스미드가 존재하는 경우에만 세포는 성장할 수 있다. 이러한 배양 조건은 DNA 분자의 선발에 압력을 행사한다.
암버 코돈을 함유하는 유전자는 아미노산 아르기닌의 생합성에 관여하는 유전자인 것이 바람직하다. 이 유전자 argE는 N-아세틸오르니티나제를 암호하고(Meinnel et al., 1992), 이 경우에 점 돌연변이 Gln-53에 상응하는 TAG 코돈(CAG →TAG)을 함유하면; 이어서 최소 M9 배지(Maniatis et al., 1989)에서 배양 시 sup 유전자를 보유하는 플라스미드가 선발될 수 있는 압력이 제공된다. 또한, 이러한 유전자는 비타민이나 핵산 염기 생합성 유전자이거나 또는 특정 질소원이나 탄소원의 사용을 허용하는 유전자이거나 또는 기능성이 선택된 배양 조건에서 세포 생육성에 필수적인 기타 다른 유전자일 수 있다.
숙주 세포는 E.콜리 균주 중에서 선택되는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 E.콜리 XAC-1 균주인 것이다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, 청구된 방법에 사용된 숙주 세포는 게놈에 pir116 유전자를 함유하고 플라스미드 pXL2774 또는 이의 유도체 중 하나에 의해 형질전환된 E.콜리 균주 XAC-1 세포이다.
본 발명의 유리한 변형예에 따르면, 청구된 방법에 사용되는 숙주 세포는 endA1 유전자 또는 상동성 유전자가 불활성화된 원핵 세포이다. endA 유전자는 E.콜리의 엔도뉴클레아제 I을 암호한다. 이러한 주변세포질 효소는 이중가닥 DNA를 절단하는 비특이적 활성을 갖고 있다(Lehman, I. R. , G. G. Roussos and E. A. Pratt (1962) J. Biol. Chem. 237: 819-828 ; Wright M. (1971) J. Bacteriol. 107: 87-94). 에세르키아 콜리(야생형 또는 endA)의 다양한 균주에서 수행된 연구는 이러한 박테리아 균주의 추출물에서 배양한 플라스미드 DNA가 endA+ 균주에서는 분해되지만 endA 돌연변이체에서는 분해되지 않음을 보고한 바 있다((Wnendt S. (1994) BioTechniques 17: 270-272). endA+ 균주 또는 endA 돌연변이체에서 분리된 플라스미드 DNA의 정성분석은 프로메가 컴패니에서 자신의 정제 시스템을 사용하여 연구한 바 있다(Shoenfeld, T., J. Mendez, D. Storts, E. Portman, B. Patterson, J. Frederiksen and C. Smith. 1995. Effects of bacterial strains carrying the ENDAL genotype on DNA quality isolated with Wizard plasmid purification systems. Promega notes 53). 그 결과는 다음과 같다: endA 돌연변이체로부터 제조한 DNA의 품질은 시험된 endA+ 균주에서 제조한 DNA의 품질 보다 전반적으로 우수하다.
즉, 플라스미드 DNA 제제의 품질은 이러한 엔도뉴클레아제로의 임의의 오염에 의해 영향을 받는다(비교적 장기간 DNA 분해).
endA 유전자의 결실이나 돌연변이는 이러한 엔도뉴클레아제 활성을 더 이상 갖는 않는 돌연변이가 대체로 야생형 박테리아와 같이 행동하기만 한다면 어려움없이 관찰될 수 있다(Durwald, H. and H. Hoffmann-Berling (1968) J. Mol. Biol. 34: 331-346).
endA1 유전자는 돌연변이, 완전 또는 부분 결실, 붕괴 등을 통해 불활성화될 수 있다. pCOR 플라스미드 생성을 위해 선택된 E.콜리 균주의 endA 유전자의 불활성화는 보다 구체적으로는, 문헌(Cherepanov, P. P. and W. Wackernagel. 1995. Gene disruption in Escherichia coli : TCR and KmR cassettes with the option of Flp-catalyzed excision of the antibiotic-resistance determinant. Gene 158: 9-14)에 기술된 △endA::TcR 결실부를 P1 박테리오파지를 이용하여 전이시키거나 또는 당해 박테리아의 게놈에 존재하는 야생형 대립유전자를 상동성 재조합에 의해 돌연변이 또는 결실성 endA 대립유전자로 교환시켜 제조할 수 있다. 본 발명의 상황에서 이러한 유형의 균주의 사용은 생성된 DNA의 품질을 바람직하게 향상시킬 것이다.
또한, 본 발명은 전술한 DNA 분자를 함유하는 임의의 재조합 세포에 관한 것이다. 이러한 세포는 다양한 기원의 세포, 예컨대 진핵세포, 원핵세포 등 유래의 세포일 수 있다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 청구된 방법에 사용된 E.콜리 XAC-1 숙주세포는 TEX1로 표시한 것으로서, traD 유전자 또는 F' 전이가 폐지되도록 불활성화된 이의 상동성 유전자를 함유한다. traD는 tra 오페론 중 하나의 5' 말단에 위치하며 DNA 전달 및 DNA 대시에 직접 연관된 81.7kDa 막단백질을 암호한다(Frost et al., Microbiology Reviews, 1994,58 : 162-210). traD 돌연변이체는 DNA를 전달하지 못한다(Panicker et al. , J. Bacteriol. , 1985,162 : 584-590). 에피솜의 traD 유전자는 당해 기술분야의 숙련된 자에게 공지된 방법을 이용한 돌연변이, 완전 또는 부분 결실 또는 붕괴를 통해 불활성화될 수 있다(실시예 9 참조). 이러한 유전자를 불활성화시키는 1가지 방법은 실시예 1에 제시되어 있으며, 그 결과 수득되는 E.콜리 XAC-1 pir116 endA- traD- 균주는 TEX1로 표시하였다(Soubrier et al., Gene Therapy, 1999,6 : 1482-1488).
본 발명의 일 구체예에 따르면, 청구된 방법에 사용된 숙주 세포는 pir42 돌연변이와 함께 pir116 돌연변이를 함유하는 E.콜리 균주 XAC-1의 세포이다. pir116 및 pir42 돌연변이는 pi 단백질의 다른 도메인에 영향을 미친다. pir116 돌연변이는 카피수 조절 영역에 영향을 미치는 반면, pir42 돌연변이는 추정상의 류신 지퍼 모티프에 영향을 미친다(도 11). pir116과 pir42 돌연변이를 함유하는 pir 유전자의 뉴클레오타이드 및 아미노산 서열은 도 12에, 그리고 각각 서열 21 및 22에 제시하였다. pir42 돌연변이는 메티오닌 개시인자 코돈의 위치 124에서 C가 T로 전이된 것을 포함하며, 이에 따라 위치 42의 프롤린이 류신으로 치환된 것이다. pir42 돌연변이는 미론 등(Proc Natl Acad Sci U S A, 1994.91 (14): p. 6438-42 ; EMBO J, 1992.11 (3): p.1205-16)에 의해 설명된 바 있는 것으로서, 플라스미드 "ori 감마 R6K-KmR-pir42"의 카피수가 야생형 pir 유전자를 보유하는 동일 플라스미드와 비교했을 때 2.5배 정도 증가되는 것으로 보고된 바 있다. 하지만, 이러한 pir42 돌연변이는 pir116 플라스미드와 함께 사용되거나 설명된 바 없으며, pir116과 조합된 pir 유전자 중의 다른 카피수 증가 돌연변이, 예컨대 cop21 은 플라스미드 카피 수를 증가시키지 못한 바, E.콜리 XAC-1 endA- traD- 균주에서의 pir116 및 pir42 돌연변이의 조합이 플라스미드 카피 수의 유의적 증가를 나타낸다는 발견은 놀라운 것이었다. 따라서, 출원인은 돌연변이된 pir116과 pir42 유전자를 함유하는 E.콜리 숙주 균주에서 생성되는 플라스미드의 카피수와 관련하여 이러한 조합의 예상치못한 결과를, pir116 단독을 보유하는 균주 또는 pir116 돌연변이와 pir 유전자의 다른 돌연변이, 예컨대 돌연변이 cop21를 포함하는 숙주 세포와 비교하여 관찰했다(Inuzuka et al., FEBS Lett, 1988.228 (1): p. 7-11). 예를 들어, E.콜리 TEX1 pir42(= XAC-1 endA- traD- pir116 pir42)는 pir116 균주 또는 pir116과 cop21 조합 돌연변이를 함유하는 균주와 비교했을 때 플라스미드 수의 2 내지 5배 증가를 나타냈다(실시예 11 참조). 다른 구체예에서, pir 유전자는 예컨대 카피수 조절 영역, 류신 지퍼 유사 모티프, DNA 결합 영역 또는 pir 유전자에 의해 암호화된 단백질 pi의 다른 영역에서 일어날 수 있는 1종 이상의 돌연변이를 함유한다.
본 발명에 따른 원핵세포 숙주 세포는 또한 DNA 결합 도메인과 같은, pir 유전자 카피에 의해 암호된 단백질 pi의 동일 도메인 또는 다른 도메인 및/또는 카피수 조절 영역 및/또는 류신-지퍼 모피프에 존재하는 1종 이상의 돌연변이를 포함하기도 한다. 이러한 원핵세포 재조합 숙주 세포는 숙주 세포의 게놈이나 플라스미드에 존재하는 이종의 pir 유전자를 함유할 수 있다.
이러한 돌연변이는 후술되는 본 발명의 일 양태에 따른 플루오레세인 기반 선별 방법을 통해 선별될 수 있다. 실시예 13에 제시된 바와 같이, pir 유전자의 적어도 하나의 돌연변이, pir116 돌연변이, DNA 결합 도메인내의 돌연변이를 함유하는 숙주 세포가 본 발명에 따른 플루오레세인 기반 선별 방법을 통해 선별되었다. pir116 외에 DNA 결합 도메인에 존재하는 돌연변이[즉, 예컨대 위치 292의 티로신(K)이 메티오닌(M)으로 치환된 작제물 100B, 위치 130의 글루탐산(E)이 발린(V)로 치환된 작제물 114C, 또는 위치 117의 아스파르트산(D)이 글리신(G)으로 치환된 작제물 201C]를 함유하는 숙주 세포는 플루오레세인 기반 선별 방법을 이용한 플라스미드 높은 카피수 생성 능력에 대해 시험되었다.
본 발명의 다른 구체예에 따르면, 청구된 방법에 사용되는 숙주 세포는 recA 또는 상동성 유전자가 불활성화된 원핵생물 숙주 세포이다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 숙주 세포가 돌연변이 pir116, pir42, endA-, traD-, recA-를 함유하는 E.콜리 균주 XAC-1인 것이다. 이러한 균주의 명칭은 TEX2pir42로 표시했다. recA는 당업자에게 공지된 방법에 의해 불활성화될 수 있다. recA는 재조합의 주요 단백질을 암호화하는 바, 이 유전자의 돌연변이는 플라스미드의 다량체화를 유도할 수 있는 분자간 재조합 및 플라스미드의 재조합 매개 변화의 빈도를 감소시킨다. 실시예 12에 기술된 바와 같이, 5' 말단에 3개의 해독 종결 코돈(각 프레임에 하나씩)을 함유하는 결실된 recA 유전자는 PCR에 의해 수득될 수 있다. 그 결과 수득되는 불활성화된 유전자는 그 다음 유전자 치환에 의해 TEX1 게놈 중으로 도입시켰다(실시예 12.1).
이러한 세포는 상기 플라스미드를 소정 세포로 도입시킬 수 있는 당해 기술분야에 공지된 모든 기술을 통해 수득한다. 이러한 기술은 구체적으로 당업자에게 공지된 형질전환, 전기침투, 접합, 원형질 융합 또는 기타 다른 기술일 수 있다.
균주 XAC-1pir116은 부다페스트 조약하에 2003년 10월 10일자로, 프랑스 75724 파리 세덱스 15 뤼 뒤 독투르 루 28에 소재하는 콜렉시옹 나시오날 드 퀼튀레즈 드 미크로오르가니스메즈(CNCM), 파스퇴르 연구소에 기탁하여 수탁번호 I-3108을 부여받았다.
균주 TEX2pir42는 부다페스트 조약하에 2003년 10월 10일자로, 프랑스 75724 파리 세덱스 15 뤼 뒤 독투르 루 28에 소재하는 콜렉시옹 나시오날 드 퀼튀레즈 드 미크로오르가니스메즈(CNCM), 파스퇴르 연구소에 기탁하여 수탁번호 I-3109를 부여받았다.
본 발명에 따른 DNA 분자는 백신화 또는 유전자의 모든 용도 및 유전자를 소정 세포, 조직 또는 유기체에 전달하는 세포 치료법 또는 재조합 단백질의 시험관내 생산에 사용될 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 DNA 분자는 환자에게 이식하기 위한 목적으로, 생체내 직접 투여 또는 시험관내 또는 생체외에서의 세포 변형에 사용될 수 있다.
이와 관련하여, 본 발명의 다른 목적은 전술한 바와 같은 1종 이상의 DNA 분자를 함유하는 약학적 조성물에 관한 것이다. 상기 분자는 화학적 및/또는 생화학적 형질감염 벡터에 결합되거나 결합되지 않을 수 있다. 특히, 양이온(인산칼슘, DEAE-덱스트란 등) 또는 리포좀을 수반할 수 있다. 결합된 합성 벡터는 양이온 폴리머이거나 지질일 수 있다. 이러한 벡터의 예에는 DOGS(Transfectam™) 또는 DOTMA(lipofectin™)이 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 국소, 경구, 비경구, 비내, 정맥내, 근육내, 피하, 안내 또는 경피 투여용으로 제형화될 수 있다. 청구된 플라스미드는 주사용 형태 또는 다른 용도로 사용되는 것이 바람직하다. 또한, 주사성 제형에, 특히 치료받는 부위에 직접 주사시 약학적으로 허용되는 임의의 부형제와 혼합될 수 있다. 구체적으로, 멸균된 등장성 용액제 또는 무수 조성물, 특히 경우에 따라 멸균수 또는 생리학적 식염수를 첨가하여 주사성 용제로 제조될 수 있는 동결건조형 조성물이 포함될 수 있다. 여기에는 특히 글루코스 또는 염화나트륨에 희석된 Tris 또는 PBS 완충액이 포함될 수 있다. 환자의 질환 영역에 대한 직접 주사는 치료 효과가 질환 조직의 준위에서 농축될 수 있기 때문에 유리하다. 사용되는 용량은 다양한 변수의 함수에 따라 조정될 수 있으며, 특히 유전자, 벡터, 사용되는 투여 방식, 관련된 병리상태 또는 원하는 치료 기간의 함수로서 조정될 수 있다.
본 발명의 DNA 분자는 표적 세포에서의 전사 및 가능하다면 해독시 목적한 치료 산물, 백신 산물, 농업용 산물 또는 수의학적 산물을 생성하는 당해의 1종 이상의 유전자, 즉 1종 이상의 핵산(합성 또는 반합성 DNA, gDNA, cDNA 등)을 함유할 수 있다.
치료적 목적의 유전자 중에는 예를 들어 보다 구체적으로 효소, 혈액 유도체, 호르몬 및 림포킨, 즉 인터루킨, 인터페론, TNF 등(FR 92/03120), 성장인자, 신경전달물질 또는 이의 전구체 또는 합성 효소 및 영양성 인자(BDNF, CNTF, NGF, IGF, GMF, AFGF, BFGF, NT3, NT5, VEGF-B, VEGF-C 등), 아포지단백질: APOAI, ApoAIV, ApoE 등(FR 93/05125), 디스트로핀 또는 미니디스트로핀(FR 91/11947), 종양 억제 유전자: p53, Rb, Rap1A, DCC, k-rev 등(FR 93/04745), 응고에 관여하는 인자를 암호하는 유전자: 팩터 VII, VIII, IX 등, 자살 유전자: 티미딘 키나제, 시토신 디아미나제 등; 또는 대안적으로 자연 또는 합성 면역글로불린의 전체 또는 일부(Fab, ScFv 등), RNA 리간드(WO 91/19813) 등을 암호하는 유전자가 있다. 또한, 치료 유전자는 표적 세포에서의 발현 시, 세포 mRNA의 전사 또는 유전자의 발현을 조절할 수 있는 안티센스 서열 또는 유전자일 수 있다. 이러한 서열은 예컨대특허 EP140,308에 설명된 기술에 따라 표적 세포에서 세포 mRNA에 상보성이지만 단백질로의 해독은 차단되는 RNA로 전사될 수 있다. 본 발명의 pCOR에 의해 운반될 수 있는 당해의 삽입체는 표적 유전자의 해독을 방해하여(Wilson et al. , Curr Opin Mol Ther. 2003 Aug; 5 (4): 389-96), 이러한 유전자의 발현을 조절할 수 있는 RNAi 이다.
또한, 당해의 유전자는 백신성 유전자, 즉 백신 생성용으로, 인간이나 동물에서 면역반응을 일으킬 수 있는 항원성 펩타이드를 암호하는 유전자일 수 있다. 이러한 항원성 펩타이드는 예컨대 엡스타인-바르 바이러스, HIV 바이러스, B형 간염 바이러스(EP 185,573), 또는 슈도라비스 바이러스 또는 대안적으로 종양의 특이 항원 펩타이드(EP 259,212)일 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 DNA 분자에서 당해의 치료용, 백신용, 농업용 또는 수의용의 유전자는 추가로 표적 유기체 또는 세포에서의 기능적 전사에 유용한 프로모터 영역 뿐만 아니라 전사 종결 시그널 및 폴리아데닐화 부위를 나타내는 3' 말단에 존재하는 영역을 함유한다. 프로모터 영역과 관련하여 설명하면, 이 영역이 관련 세포 또는 유기체에서 기능할 수 있을 때 연구중인 유전자의 발현에 본래 책임이 있는 프로모터 영역일 수 있다. 이러한 프로모터 영역은 또한 다른 기원의 영역(즉, 다른 단백질 발현에 책임이 있는 영역) 또는 심지어 합성 기원일 수도 있다. 특히, 진핵생물 또는 바이러스 유전자 유래의 프로모터 서열일 수 있다. 예를 들어, 이 서열은 표적 세포의 게놈에서 수득되는 프로모터 서열일 수 있다. 사용될 수 있는 진핵생물 프로모터 중에는 특이적 또는 비특이적이고, 유도성 또는 비유도성이며, 강하게 또는 약하게 유전자의 전사를 자극하거나 억제하는 모든 프로모터이거나 또는 유도된 서열일 수 있다. 진핵생물 프로모터는 특히 편재적 프로모터(HPRT, PGK, α-액틴, 튜블린의 유전자 프로모터 등), 중간 필라멘트 프로모터(GFAP, 데스민, 비멘틴, 신경섬유, 케라틴 등의 유전자 프로모터), 치료 유전자 프로모터(예컨대, MDR, CFTR, 팩터 VIM, ApoAI 등의 유전자 프로모터). 조직 특이적 프로모터(피루베이트 키나제, 빌린, 장의 지방산 결합 단백질, 평활근의 α-액틴 등의 유전자 프로모터 또는 대안적으로 자극(스테로이드 호르몬 수용체, 레틴산 수용체 등)에 반응하는 프로모터일 수 있다. 이와 마찬가지로, 바이러스 게놈 유래의 프로모터 서열, 예컨대 아데노바이러스 E1A 및 MLP 유전자의 프로모터, CMV 초기 프로모터 또는 대안적으로 RSV의 LTR 프로모터 등일 수 있다. 또한, 이러한 프로모터 영역은 활성화 또는 조절 서열의 첨가 또는 조직 특이적 발현이나 우세하게 조직 특이적인 발현을 허용하는 서열의 첨가에 의해 변형될 수 있다.
더욱이, 당해 유전자는 추가로 합성된 산물을 표적 세포의 분비 경로로 유도하는 시그널 서열을 함유할 수도 있다. 이러한 시그널 서열은 합성 산물의 자연 시그널 서열일 수 있으나, 다른 기능의 시그널 서열 또는 합성 시그널 서열일 수도 있다. 본 발명에 따라 사용되는 바람직한 시그널 서열은 문헌[Taniguchi et al., Gene, 1980,233 (4763): 541-5]에 기술된 바와 같은 인간 인터페론의 분비 시그널 펩타이드이다.
당해 유전자에 따라, 본 발명의 DNA 분자는 여러 병리상태, 예컨대 유전자 질병(영양실조, 낭종 섬유증 등), 신경변성 질환(알쯔하이머 질환, 파킨슨 병, ALS 등), 암, 응고 장애와 관련된 병리상태 또는 이상지질단백혈증과 관련된 병리상태, 바이러스 감염과 관련된 병리상태(간염, AIDS 등) 또는 농업분야 및 수의학 분야 등에 관련있는 병리상태의 치료 또는 예방에 사용될 수 있다.
바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 DNA 분자는 말초 동맥 폐색 질환 및 간헐 파행과 같은 중요한 사지 허혈증 병리상태를 치료하는데 유용하다.
또한, 본 발명은 재조합 단백질의 생산에 사용되는 조건성 복제 DNA 분자의 용도에 관한 것이다. 박테리아는 다양한 기원, 진핵생물 또는 원핵생물의 단백질을 생산하는데 사용될 수 있다. 박테리아 중에서도, E.콜리는 조작 용이성, 이용가능한 다수의 발현 시스템 및 수득될 수 있는 다량의 단백질 때문에 이종 유전자 발현에 최선의 유기체이다. 하지만, 본 발명의 시스템은 전술한 바와 같이 지향성이 복제 오리진의 본성에 의해 결정되는 기타 다른 유기체에서도 사용될 수 있음은 자명한 것이다. 이러한 용도에 있어서, 당해의 핵산 서열은 선택된 숙주, 특히 원핵생물 숙주에 적당한 발현 시그널의 조절 하에 있는 암호 영역을 함유한다. 예를 들면, Plac, Ptrp, PT7, Ptrc, Ptac, PL, PBAD 또는 PR 프로모터, 샤인-달가노 서열 등(이 세트는 발현 카세트를 구성한다)일 수 있다. 당해의 핵산 서열은 약학, 농-식품, 화학 또는 농화학 분야에서 중요한 단백질을 암호하는 모든 서열일 수 있다. 그 예에는 구조 유전자, 상보성 DNA 서열, 합성 또는 반합성 서열 등이 있다.
발현 카세트는 본 발명의 주제인 조건성 복제 벡터에 도입되어, E.콜리 내에서 당해 단백질의 발현을 허용하는 조건성 복제 벡터를 구성할 수 있다. 이 벡터에는 여러 가지 장점, 즉 박테리아에서 선택을 위해 항생제의 사용이 불필요한 점(비용 절감, 항생제 또는 최종 산물에 잠재적 독성 유도 산물의 존재에 관한 연구의 불필요), 사실상 자연에 플라스미드의 전파 가능성이 없다는 점(조건성 복제 오리진), 전적으로 규정된 배지에서의 발효 가능성의 장점이 있다. 하기 제시되는 실시예는 재조합 단백질 생산에 있어서 이러한 조건성 벡터의 유리한 성질을 보여준다.
전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 DNA 분자는 pir 유전자가 제거되된 R6K 유래의 복제 오리진 ORIγ를 함유하고 DNA 분자의 대규모 생성에 사용되는 특정 숙주 세포의 게놈 내로 도입된다. 임상 시험 및/또는 DNA 기반의 유전자 치료법에는 항상 플라스미드의 증가량을 생성하는 방법이 필요하다. 생산 숙주 세포는 1종 이상의 돌연변이를 함유하는 pir 유전자, 예컨대 돌연변이 pir116 및/또는 pir42를 보유하도록 유전자조작된다. 이와 같이 돌연변이된 숙주 균주의 사용은 플라스미드 카피 수의 증가 및 이에 따른 생산 수율의 유의적 증가를 초래한다. 또한, 이와 같이 생산된 플라스미드의 형태는 매우 만족스럽다.
특정 양태에 따르면, 카피수 증가 돌연변이체를 선별하는 신규 형광성 기반 방법이 제공된다. 이러한 형광성 기반 선별 방법은 플라스미드의 기본 카피수가 이미 매우 높은 경우, 예컨대 돌연변이체 pir116을 사용하여 수득되는 경우, 예컨대 세포 당 약 400 카피의 플라스미드가 생성되는 경우에는 사용할 수 없는 박테리아의 항생제 내성의 준위를 기반으로 한 고전적인 선별 방법 보다 훨씬 우수하다. 본 발명에 따른 형광성 기반의 선별 방법은 카피 증가 수의 적색 형광성 리포터 유전자로서 cobA 유전자를 사용하는 것이 바람직하다. 슈도모나스 디니트리피간스(Pseudomonas Denitrificans)(Crouzet et al. , J. Bacteriol. 1999,172 : 5968-79) 유래의 유전자인 cobA 유전자는, 비타민 B12 경로의 효소로서 유로젠 III 분자에 2개의 메틸 기를 첨가하는 유로 III 메틸트란스퍼라제를 암호한다. 윌트 등(Nature Biotechnology, vol. 17,1999, pp1175)은 E.콜리, 효모 및 포유동물 세포에 적당한 형광성 전사 리포터 유전자로서 cobA의 사용을 기술한 바 있다. 예를 들어, 이러한 형광성 리포터 유전자는 유로 III 메틸트란스퍼라제를 암호하는 cobA 유전자의 과잉발현으로 인한 형광성 포르피리노이드 화합물을 축적하는, 재조합 플라스미드를 함유하는 E.콜리 균주의 선발에 사용되었다. UV 광이 조사될 때, 이러한 세포는 밝은 적색의 형광을 띤다(Biotechniques, 1995, vol 19, no. 7, p. 760).
본 출원인은 놀랍게도 cobA 유전자를 보유하는 플라스미드의 카피수와 핑크색에서 적색으로 변화되는 형광성 준위 사이에 밀접한 상관성이 있음을 발견했다. 따라서, 본 발명에 따른 카피수 증가 돌연변이체의 형광성 기반 선별 방법은 생산 숙주 세포의 게놈에 삽입되거나 플라스미드를 통해 운반되는 pir 유전자와 같은 임의의 유전자의 돌연변이체 또는 E.콜리와 같은 생산 숙주 세포의 게놈 평가로 이루어질 수 있는 다양한 돌연변이체의 선별에 유용하다.
플라스미드 카피수와의 상관성 외에도, 본 발명의 형광성 기반 선별 방법은 형질전환된 숙주 세포를 평판배양하고 하룻밤 동안 항온배양한 뒤, UV광에 노출시켜 생성되는 형광성 강도 발현을 조사하고, 이로써 숙주 세포에서의 플라스미드 카피 수를 직접 추론하는 것만을 필요로 하기 때문에 용이하고도 신속하게 수행된다.
따라서, 본 발명은
(a) 표적 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 도입시키는 단계;
(b) 유로III 메틸트란스퍼라제를 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 함유하고 카피수가 표적 서열의 영향을 받는 플라스미드를 함유하는 숙주 세포를 돌연변이된 표적 서열로 형질전환시키는 단계;
(c) 뉴클레오타이드 서열이 발현되는 조건하에 숙주 세포를 증식시켜 숙주 세포 배양물을 제조하는 단계;
(d) 이러한 숙주 세포 배양물을 UV광에 노출시키는 단계; 및
(e) 그 결과 숙주 세포 배양물에서 나타나는 형광성을 측정하는 단계를 포함하여, 플라스미드 카피수 증가 돌연변이 측정방법을 제공한다.
본 발명에 따르면, 이러한 측정방법은 추가로 상기 단계 (e)에서 측정된 형광성과, 돌연변이되지 않은 표적 서열을 함유하는 숙주 세포의 배양물에서 나타나는 형광성을 비교하는 단계가 포함되기도 한다.
유로III 메틸트란스퍼라제 유전자는 슈도모나스 데니트리피칸스 유래의 cobA 유전자에 의해 암호되는 것이 바람직하다.
돌연변이는 1종 이상의 돌연변이를 함유하는 이종의 pir 유전자를 함유하는 플라스미드에 존재할 수 있다. 이러한 플라스미드는 다른 pir 영역, 예컨대 카피 조절 영역 및/또는 DNA 결합 도메인, 및/또는 류신-지퍼 모티프 및/또는 다른 pir 유전자 영역 등에 1종 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다. 또한, 이러한 플라스미드는 이종의 pir 유전자 카피수 조절 영역 및 류신 지퍼 유사 모티프에 1종 이상의 돌연변이를 함유할 수도 있다. 또한, pir 유전자 DNA 결합 영역에 추가로 돌연변이를 함유할 수도 있다. 더욱이, 이 플라스미드는 카피 조절 영역 및/또는 DNA 결합 영역 및/또는 류신 지퍼 유사 모티프를 암호하는 pir 유전자의 동일 영역이나 다른 영역, 또는 단백질 Π의 다른 영역에 1종 이상의 돌연변이를 함유할 수 있다.
한도내에서, 본 발명에 따른 원핵생물 재조합 숙주 세포는 pir116 돌연변이와 DNA 결합 영역내의 제2 돌연변이, 예컨대 pir292, pir130 또는 pir117을 함유한다(도 26).
이와 같이 돌연변이된 생산 숙주 균주는 미니서클(minicircle)과 같은 보편적인 플라스미드 도구를 이용하여 제조하는 것이 유리하다. 이러한 미니서클 기술에 대해서는 특히 본 출원인의 미국 특허 6,143,530 및 6,492,164 또는 PCT 출원 WO 96/26270에 설명되어 있다.
미니서클은 어떤 복제 오리진도 함유하지 않는 재조합 DNA 분자로서, 임의의 미생물의 게놈 중의 유전자 치환에 우수한 자살 벡터이다. 구체적으로, 당해의 유전자(들)에는 미니서클에 다이렉트 배향으로 배치된, 2개의 부위 특이적 재조합 허용 서열이 인접되어 있다. 다이렉트 배향으로의 배치는 2개의 서열이 재조합 DNA 미니서클에서 동일한 5'-3' 극성으로 배치되는 것을 의미한다. 미니서클의 유전자 작제물은 일반적으로 복제 오리진이 없는 원형의 이중가닥 DNA 분자이지만, 선형일 수도 있고, 다이렉트 배향으로 배치된, 부위 특이적 재조합을 허용하는 두 서열이 인접해 있는 당해 유전자(들)를 함유한다. 이러한 본 발명의 구체예에 따르면, 미니서클은 임의의 컴피턴트 미생물의 게놈에 존재하는 유전자를 치환시키기 위한 목적으로, 상기 미생물의 형질전환에 사용할 수 있다.
유전자 치환을 위한 미니서클은 최소한 다음과 같은 인자를 함유하는 모 플라스미드로부터 제조되는 것이다:
a) 복제 오리진 및 선택 마커 유전자,
b) 다이렉트 배향으로 배치된, 부위 특이적 재조합을 허용하는 2개의 서열, 및
c) 상기 서열 b) 사이에 배치되는 1종 이상의 당해의 유전자.
유전자 작제물에 존재하는 특정 재조합 시스템은 기원이 다른 것일 수 있다. 구체적으로, 사용된 특정 서열과 재조합효소는 다른 구조 부류에 속하는 것으로서, 특히 박테리오파지 λ의 인테그라제 과, 또는 트란스포손 Tn3의 레졸바제 과에 속하는 것일 수 있다. 박테리오파지 λ의 인테그라제 과에 속하는 재조합효소 중에는, 예컨대 파지 람다의 인테그라제(Landy et al., Science 197(1977) 1147), P22 및 φ80의 인테그라제(Leong et al., J. Biol. Chem. 260(1985) 4468), 헤모필러스 인플루엔자의 HP1(Hauser et al., J. Biol. Chem. 267(1992) 6859), 파지 P1의 Cre 인테그라제, 플라스미드 pSAM2의 인테그라제(EP 350 341) 또는 이외에 2μ 플라스미드의 FLP 재조합효소가 있다. 따라서, 미니서클은 박테리오파지 λ 인테그라제 과의 부위 특이적 시스템을 이용한 재조합을 통해 제조되면, 본 발명의 따른 DNA 분자는 일반적으로 해당 박테리오파지 또는 플라스미드의 2개의 att 첨부 서열 사이의 재조합으로부터 산출되는 서열을 추가로 포함한다.
트란스포손 Tn3 과에 속하는 재조합효소에는, 예컨대 트란스포손 Tn3 또는 트란스포손 Tn21 및 Tn522의 레졸바제(Stark et al., Trends Genet, 8,432-439, 1992); 박테리오파지 mu의 Gin 인버타제, 또는 대안적으로 RP4의 par 단편의 플라스미드(Albert et al., Mol. Microbiol. 12: 131,1994)와 같은 플라스미드의 레졸바제가 있다. 미니서클이 트란스포손 Tn3 과의 부위 특이적 시스템을 이용한 재조합을 통해 제조되면, 일반적으로 미생물 게놈에 삽입하고자 하는 당해의 유전자 외에도, 당해의 트란스포손 레졸바제의 2개의 인식 서열 사이의 재조합으로부터 산출되는 서열이 추가로 미니서클에 함유된다. 또한, 부위 특이적 재조합을 허용하는 서열은 파지 P1의 loxP 영역에서 유래되는 것일 수 있는데, 이는 단백질 존재하에 서로 특이적으로 재조합할 수 있는 2개의 반복 서열로 대부분 이루어진, Cre로 불리는 서열이다(Sternberg et al., J. Mol. Biol. 150: 467,1971). 따라서, 미니서클 제조에 사용된 플라스미드는 (a) 박테리아 복제 오리진 및 선택 마커 유전자; (b) 박테리오파지 P1(loxP 영역)의 반복 서열; 및 (c) 이 서열(b) 사이에 배치되는, 미생물 게놈에 삽입하고자 하는 1종 이상의 당해의 유전자를 함유한다.
부위 특이적 재조합을 허용하는 서열을 함유할 수 있는 미니서클은 박테리오파지의 첨부 서열(attP 및 attB 서열)이나, 이러한 첨부 서열 유래의 서열과 같이, 박테리오파지에서 유래되는 서열이다. 이러한 서열은 절단효소(excisionase)의 유무에 관계없이 인테그라제라는 재조합효소의 존재하에 서로 특이적으로 재조합할 수 있다. 상기 "이러한 첨부 서열 유래의 서열"이란 용어에는 적당한 재조합효소의 존재하에 특이적으로 재조합하는 능력을 보유하는, 박테리오파지의 첨부 서열의 변형에 의해 수득되는 서열이 포함된다. 따라서, 이러한 서열은 상기 서열의 감소된 단편이거나, 또는 다른 서열(제한효소 부위 등)이 첨가되어 확장된 단편일 수 있다. 또한, 돌연변이, 특히 점 돌연변이에 의해 수득되는 변형체일 수도 있다. 또한, 박테리오파지 또는 플라스미드의 attP 및 attB 서열이란 용어는, 본 발명에 따르면, 상기 박테리오파지 또는 플라스미드에 특이적인 재조합 시스템의 서열, 즉 상기 파지 또는 플라스미드에 존재하는 attP 서열 및 이에 상응하는 염색체 attB 서열을 의미한다. 첨부 서열은 당해기술분야에 공지되어 있고, 그 예로는 파지 λ, P22, Φ80, P1 및 헤모필러스 인플루엔자의 HP1의 첨부 서열, 또는 플라스미드 pSAM2 또는 2μ플라스미드의 첨부 서열이 포함된다.
미니서클은 전술한 모플라스미드로부터 용이하게 제조된다. 이러한 미니서클의 제조방법은 모플라스미드로 형질전환된 세포 배양물을 절단효소의 유무에 관계없이 인테그라제와 접촉시켜, 부위 특이적 재조합을 유도하는 것으로 이루어진다. 배양물과 인테그라제(절단효소의 유무에 관계없이)는, 상기 인테그라제 해당 유전자와 첨가되는 경우의 절단효소에 해당하는 유전자를 함유하는 플라스미드 또는 파지를 이용한 형질감염이나 감염을 통해 접촉시킨다. 또는, 예컨대 상기 인테그라제 및 이용되는 경우 절단효소를 암호하는 유전자가 숙주 세포에 존재한다면 발현을 유도한다. 이하에 언급되는 바와 같이, 이러한 유전자는 게놈에 통합된 형태로 숙주 세포에 존재하거나, 복제 플라스미드 상에, 또는 비치료 부분에 있는 본 발명의 플라스미드 상에 존재할 수 있다.
생체내 부위 특이적 재조합을 이용하여 본 발명에 따른 미니서클을 제조하기 위하여, 절단효소의 사용여부에 관계없이 인테그라제를 특히 한순간에 세포 또는 배양 배지에 첨가하거나 유도시킨다. 이를 위해 다양한 방법을 사용할 수 있다. 제1 방법에 따르면, 절단효소 유전자의 여부에 관계없이, 예컨대 재조합효소 유전자, 즉 인테그라제 유전자를 발현 조절 형태로 함유하는 숙주 세포가 사용된다. 절단효소 유전자의 여부에 관계없이 인테그라제 유전자는 예컨대 프로모터의 조절 하에 또는 유도성 프로모터 시스템의 조절하에 도입되거나, 또는 온도 민감성 시스템에 도입될 수 있다.
구체적으로, 인테그라제 유전자는 성장기 동안 잠복성인 온도 민감성 파지에 존재하는 것으로서, 적당한 온도에서 유도될 수 있다(예컨대, 용원성 파지 γ Xis- cI857).
또는, 이 유전자는 조절 프로모터, 예컨대 placUV5 프로모터의 조절하에 배치될 수 있는데, 그 숙주 세포는 E.콜리 G6191로 불리는 것이다.
절단효소 유전자의 여부에 관계없이 인테그라제는 조절 프로모터, 예컨대 아라비노스에 의해 조절되는 araBAD(아라비노스)의 PBAD 프로모터의 조절하에 도입될 수 있다(Guzman et al. , J. Bacteriol, 1995,4121-4130 ; US5,028, 530). 특히, PBAD 프로모터의 사용은 유도제로서 아라비노스의 존재하에 절단효소 및 인테그라제의 발현이 충분히 이루어지게 해주어, 박테리아에서 높은 카피수로 존재하는 플라스미드의 90% 이상이 재조합될 수 있는 반면, 아라비노스의 부재하에서는 이 프로모터가 강하게 억제된다. 절단효소의 유무에 관계없이 인테그라제의 발현을 위한 카세트는 플라스미드, 파지, 또는 심지어 비치료 영역에 있는 본 발명의 플라스미드에 의해 운반될 수 있다. 이는 숙주 세포의 게놈에 통합되거나 복제 형태로 유지될 수 있다. 이러한 숙주 세포에는 특히 E.콜리 G6264 및 E.콜리 G6289가 있다. 다른 방법에 따르면, 유전자의 발현을 위한 카세트는 성장기 후의 세포 배양물 형질감염 또는 감염에 사용되는 플라스미드 또는 파지에 의해 운반된다. 이러한 경우에, 유전자는 발현 조절되는 형태로 존재할 필요는 없다. 특히, 임의의 구성형 프로모터가 사용될 수 있다. 또한, DNA는 단백질과의 직접 배양을 통해, 플라스미드 제조물 상의 인테그라제 및 이용되는 경우 절단효소와 접촉될 수도 있다.
이와 같이 제조된 미니서클은 표적 미생물에 삽입하고자 하는 당해의 1종 이상의 유전자를 함유하는 발현 카세트를 포함하고, 복제 오리진이 결실되어 있으며, attB와 attP 서열 사이에 부위 특이적 재조합으로부터 산출되는 서열 attR 또는 attB와 attP 서열 사이에 부위 특이적 재조합으로부터 산출되는 서열 attL을 함유한다. 따라서, 이러한 미니서클은 임의의 미생물에서의 유전자 치환을 위한 보편적 자살 벡터로서 사용될 수 있다. 실제로, 치환하고자 하는 유전자가 상동성 서열 및 항생제 내성 유전자 인접하에 운반되는 미니서클은 도 31에 제시된 바와 같은 상동성 재조합을 통해 임의의 미생물의 게놈 중의 표적 부위에 용이하게 통합된다. 2차 선발 압력으로 인해 촉발될 수 있는 제2 절단 단계는 게놈 내에 새롭게 삽입된 유전자를 운반하는 미생물만을 효과적으로 선발할 수 있다.
또한, 본 발명은 미생물의 유전자 조작방법에 관한 것이다. 이 신규 방법은 기원에 관계없이 모든 미생물의 유전자 조작에 사용할 수 있다. 실제로, 미니서클은 임의의 복제 오리진을 함유하지 않아서 모든 종류의 미생물에서 유전자 치환에 보편적으로 사용될 수 있다. 이러한 방법은 미생물에서 이중 상동성 재조합을 통해 유전자를 치환시키는 박테리오파지 M13의 사용방법의 대안으로서 바람직하다.
본 발명의 특정 구체예에 따르면, 미니서클에는 제1 재조합 단계에 대해 선발을 가능케하는 항생제 내성 유전자와 같은 제1의 선발용 마커를 함유한다. 제2 선발용 마커는 유전자 III 또는 기능적으로 결실된 유전자 III'인 것이 바람직하다. 유전자 III 또는 이의 기능적 변형체는 문헌(Mol. Gen. Genet., 186,185-92, 1982)에 기술된 바와 같이 데옥시콜레이트에 대한 감수성을 부여할 수 있고, 이에 따라 제2 재조합 사건을 역선발할 수 있게 해준다(도 31). 따라서, 본 방법은 당해 기술분야에 공지된 임의의 형질전환 방법, 바람직하게는 전기침투를 이용하여 미생물에 미니서클을 도입시키는 단계 및 이 미니서클의 통합 사건을 항생제가 보충된 배양물에서 또는 다른 선발 압력하에 선발하는 단계 및 그 다음 데옥시콜레이트 처리로 또는 다른 적당한 선발 압력하에 제2 절제 사건을 선발하는 단계로 구성된다.
이하, 본 발명은 후속되는 실시예를 참조로 하여 보다 상세히 설명되며, 이러한 설명은 단지 예시적인 목적으로서, 제한하는 것이 아닌 것으로 간주되어야 한다.
I. 재료 및 방법
A) 재료
1) 배양 배지
완전 LB, 2XTY 및 SOC 배지와 M9 최소배지(Maniatis et al, 1989)를 사용했다. 아가 배지는 디프코 아가 15g을 첨가하여 제조했다. 또한, 필요한 경우에는 이 배지에 항생제(앰피실린 또는 카나마이신)를 각각 100mg/l 및 50mg/l의 농도로 보충했다. 발색성 기질 X-Gal 및 X-Gluc는 40mg/l의 농도로 사용했다.
2) E.콜리 균주, 플라스미드 및 박테리오파지
사용된 E.콜리 균주, 플라스미드 및 박테리오파지는 하기 실시예에 각각 제시했다.
B) 방법
1) DNA 제조
박테리아 DNA(플라스미드 및 게놈) 및 파지 DNA(M13의 복제 형태)의 분리, 제한효소 분해, DNA 단편의 결찰, 아가로스 겔 전기영동(TBE 완충액에서) 및 다른 표준 기술은 효소 사용에 대한 제조자의 추천이나, 또는 문헌["Molecular Cloning: a Laboratory Manual" (Maniatis et al., 1989)]에 기술된 절차에 따라서 수행했다.
전기영동 중에 사용된 DNA 크기 마커는 선형 단편에 대한 1kb 래더(BRL)와 미분해 플라스미드에 대한 슈퍼코일형 DNA 마커(Stratagene)이다.
서열분석은 형광성 디데옥시뉴클레오타이드와 Taq DNA 폴리머라제(PRISM Ready Reaction DyeDideoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems)를 이용한 자동법으로 변형된 생거법(Sanger et al., 1977)에 따라서 수행했다.
사용된 올리고데옥시뉴클레오타이드(서열 번호로 표시, 하기 참조)는 α-시아노에틸 보호기를 이용하여 포스포아미다이트법으로 "Applied Biosystems 394 DNA/RNA Synthesizer"를 가지고 합성했다(Sinha et al., 1984). 합성 후, 보호기는 암모니아로 처리하여 제거한다. 부탄올로 2회 침전시켜 올리고뉴클레오타이드를 정제 및 농축시킨다(Sawadogo et al., 1991).
PCR 증폭에 사용된 올리고뉴클레오타이드 서열:
서열 3: 5'-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3'
서열 4: 5'-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3'
서열 5: 5'-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3'
서열 6: 5'-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3'
PCR 반응(Saiki et al., 1985)은 총 100㎕ 부피중에서 다음과 같은 조건하에 수행했다. 반응 혼합물에는 조사되는 균주 유래의 게놈 DNA 150ng, 2가지 올리고뉴클레오타이드 프라이머(24mer) 각각 1㎍, 10XPCR 완충액 10㎕이 포함되며, 그 조성물은 다음과 같다: "500mM KCl, 0.1% 젤라틴, 20mM MgCl2, 100mM Tris-HCl pH 7.5" 및 2.5 유닛의 Taq DNA 폴리머라제(Amplitaq Perkin-Elmer). 퍼킨 엘머 세투스 DNA 써멀 사이클러기에서의 PCR 조건은 다음과 같다: 91℃에서 2분, 변성(91℃에서 1분), 하이브리드화(42℃에서 2분) 및 신장(72℃에서 3분) 단계의 연속 30회 사이클, 및 마지막으로 72℃에서 5분. 이와 같이 하여 수득한 산물은 제한효소로 절단하거나 절단하지 않고 아가로스 겔 전기영동을 통해 분석했다.
각종 플라스미드 종의 DNA 토포이소머라제 분석은 다음과 같은 절차에 따라 수행했다: 실험실에서 정제한 효소를 37℃에서 1시간 동안 항온처리한다. 반응 혼합물(총 부피: 40㎕)의 조성은 다음과 같다: 플라스미드 150ng, DNA 토포이소머라제 I 300ng 또는 E.콜리 DNA 자이레이즈 150ng, 또는 S.아우레우스 DNA 토포이소머라제 IV 160ng 및 각 효소에 특이적인 완충액 20㎕. 이러한 완충액의 조성은 다음과 같다:
DNA 토포이소머라제 I: 50mM Tris-HCl pH 7.7, 40mM KCl, 1mM DTT, 100㎍/ml BSA, 3mM MgCl2, 1mM EDTA;
DNA 토포이소머라제 IV: 60mM Tris-HCl pH 7.7, 6mM MgCl2, 10mM DTT, 100㎍/ml BSA, 1.5mM ATP, 350mM 글루탐산칼륨;
DNA 자이레이즈: 50 mM Tris-HCl pH 7.7, 5 mM MgCl2, 1.5 mM ATP, 5 mM DTT, 100㎍/ml BSA, 20 mM KCl.
2) E.콜리 형질전환
형질전환은 청 및 밀러(Chung and Miller, 1988)가 제시한 TSB(형질전환 및 저장 완충액)법에 따라 통상적으로 수행했다. TG1(Gibson et al., 1984)과 같은 균주에서는, 수득되는 형질전환율이 pUC4K(Vieira and Messing; 1982) 1㎍당 형질전환체 약 105 내지 106 범위였다. 이보다 높은 형질전환율이 필요한 경우에는, 전기침투기 제조사(Biorad)가 추천하는 절차에 따라 전기침투를 실시하여 박테리아를 형질전환시켰다. 이와 같은 방법은 pUC4K 1㎍당 형질전환체 108 내지 1010의 효율로 증가시킬 수 있다.
3) 양이온 리포펙턴트(lipofectant)를 매개로 한 세포 형질감염
사용된 세포는 24웰 평판에 50,000 세포/웰의 밀도로 전날 접종한 NIH 3T3 마우스 섬유아세포이다. 배양배지로는 글루코스 4.5g/l를 함유하고 10% 태내송아지 혈청. 1% 20mM 글루타민 용액 및 항생제(스트렙토마이신 5.103 ㎍/ml, 페니실린 5.103㎍/ml)가 보충된 DMEM 배지이다(Gibco). 플라스미드 DNA(9‰NaCl 25㎕ 중에 1㎍)를 리포펙턴트 현탁액과 부피 대 부피 기준으로 혼합했다. 4가지 "리포펙턴트 함량/DNA 함량" 비를 시험했다: 0, 3, 6 및 9. 이러한 비는 플라스미드 DNA 1㎍이 3.1nmol의 음전하를 보유하고, 리포펙턴트가 분자당 3개의 양성 전하를 함유하는 것을 고려하여 계산된 것이다. 10분간 접촉시켜 DNA/지질 복합체를 형성시킨 후, 무혈청 배양 배지(500㎕) 중의 세포에 DNA-리포펙턴트 혼합물 50㎕를 첨가했다. 이 세포를 상기와 동일한 배지로 2회 예비세척했다. 이에 따라 혈청에 의한 형질감염의 억제를 피할 수 있다. 항온배양(CO2 배양기에서 37℃하에 2시간) 후, 이 배지에 10% 태내 송아지 혈청을 첨가한다. 이 세포를 그 다음 24시간 동안 재항온배양한다.
4) 진핵생물 세포의 루시퍼라제 활성 측정
활성 측정은 형질감염 24시간 후 수행한다. 루시퍼라제는 ATP, Mg2+ 및 O2의 존재하에 루시페린의 산화를 촉매하고, 동시에 광자를 생성한다. 조도계로 측정한 방사광의 총 양은 시료의 루시퍼라제 활성에 비례한다. 사용된 시약은 프로메가(루시퍼라제 분석 시스템) 제품으로, 추천된 절차에 따라 사용했다. 세포 용해후, 각 추출물의 불용성 분획은 원심분리로 제거한다. 세포 용해 완충액에 희석되거나 희석되지 않은 상청액 5㎕를 가지고 분석을 수행한다.
5) 세포 추출물에 존재하는 단백질 농도 측정
농도 측정은 비신코닌산을 이용한 BCA법(Pierce)에 따라 실시한다(Wiechelman et al., 1988). 표준 BSA 범위는 용균 완충액(cf. III-B-4)으로 제조한다. 분석될 시료와 상기 범위는 0.1M 요오도아세트아미드/0.1M Tris 완충액(pH 8.2)으로 37℃에서 1시간 동안 부피 대 부피 기준으로 예비처리한다. 이러한 처리는 분석동안 용균 완충액에 존재하는 환원제(DTT)의 방해를 방지할 수 있게 해준다. 분석 결과는 562nm에서 판독한다.
실시예 1: 상동성 재조합에 의한 XAC-1 pir 및 pir116 숙주 균주의 작제
사용한 균주는 E.콜리 균주 XAC-1이다((Normanly et al., 1980). 이 균주는 argE 유전자는 암버 코돈(TAG) 내에 글루타민-53(CAG)의 돌연변이를 함유하는 것이 바람직하다(Meinnel et al., 1992). argE 유전자는 argECBH 분기성 오페론에 속하는 것으로서, 아르기닌 생합성 효소, N-아세틸오르니티나제를 암호한다. 따라서, XAC-1은 아르기닌을 합성할 수 없고, 결과적으로 최소 배지에서 증식한다. 이러한 영양요구성은 균주가 억제인자 tRNA의 발현을 허용하는 플라스미드를 보유하는 경우에만 구제될 것이다. 따라서, 최소 배지에서 배양하면 이러한 플라스미드를 운반하는 박테리아 선발이 가능할 것이다. 또한, R6K 유래 플라스미드의 복제를 허용하기 위하여, XAC-1 게놈에 상동성 재조합에 의한 pir 유전자의 도입이 필요했다. pir 유전자(야생형 또는 돌연변이형)은 야생형 uidA 유전자와 pir(또는 pir116) 유전자가 중재된 카피 사이의 교환을 통해 uidA 유전자좌에 도입된다. uidA 유전자는 β-글루쿠로니드의 가수분해 효소인 β-글루쿠로니다제를 암호한다. 이 유전자는 β글루쿠로니드가 사용되지 않는 일반 합성 배지에서의 증식에는 필수성분이 아니기 때문에 아무 문제없이 불활성할 수 있다. 더욱이, β-글루쿠로니다제 활성은 가수분해시 청색 안료를 방출하는 발색성 기질, X-Gluc를 이용하여 모니터할 수 있다.
1) 카세트 "Km R -uidA::pir(또는 pir 116)를 운반하는 자살 벡터의 작제
본 실험에는 단일 박테리아 숙주를 수반하고 당해 균주의 게놈 변형을 최소화하는 전략을 사용했다. 자살 벡터(Blum et al., 1989)로는 파지 M13mp10(Messing et Vieira; 1982)을 사용했다. 복제에 필수성분인 유전자 II내의 암버 돌연변이는 이 M13의 숙주 범위를 암버 억제인자 tRNA를 생산하는 TG1(supE)과 같은 균주로 축소시킨다; 따라서, XAC-1과 같은 E.콜리 sup+ 균주에서는 복제될 수 없다.
Tn5의 카나마이신 내성 유전자 및 _uidA::pir 또는 pir116을 함유하는 3.8kb BamHI 카세트는 각각 M13wm34 및 33으로부터 정제했다(Metcalf et al., 1994). 이 카세트를 BamHI으로 선형화된 M13mp10에 클로닝했다. 재조합체 클론은 카나마이신이 보충된 LB 아가 배지에 평판배양하여 선발하고, 결찰 혼합물을 TG1로 전기침투시켰다. 수득되는 클론의 부합성은 제한효소 프로필로 분석한 뒤, pir116 돌연변이에 해당하는 영역의 서열분석을 통해 확인했다.
2) 상동성 재조합에 의한 pir 또는 pir116 유전자의 E.콜리 XAC1 게놈내로의 도입
채택한 전략과 수반되는 각종 사건은 도 3에 제시했다.
a) 제1 재조합 사건
각 RF(mp10-_uidA::pir 또는 pir116) 10, 100 또는 2000ng을 전기침투시켜 XAC-1 균주를 형질전환시켰다. 각 발현 혼합물 1/3은 카나마이신을 함유하는 LB 평판에 주입하고 37℃에서 하룻밤동안 항온배양했다. 이러한 mp10-_uidA::pir 또는 pir116 파지는 XAC-1(sup+) 균주에서 복제할 수 없다. 따라서, 카나마이신 내성("KmR") 마커는 유전자 uidA의 야생형 카피와의 상동성 재조합을 통해 박테리아 게놈에 통합되어서만 유지될 수 있다. XAC-1 전기침투의 결과는 표 1에 제시했다. 수득되는 형질전환율은 pUC4K 1㎍당 형질전환체 4.109 이었다.
표 1
작제물 형질전환 DNA의 양에 따라 수득되는 콜로니 수
10ng 100ng 2000ng
M13mp10-_uidA::pir
M13mp10-_uidA::pir116 0 16 124
이러한 시험 조건하에서, 통합체의 수는 DNA 양에 따라 비선형 방식으로 증가했다. 따라서, 형질전환율과 RF 크기(11.7kbp)가 주어지면, 재조합율을 대략적으로 추정할 수 있을 것이다. 100ng인 점을 보면, 재조합율은 약 10-6이었다.
b) 제2 재조합 사건
제2 재조합 사건은 데옥시콜레이트("DocR")에 대한 균주의 내성을 통해 선발된다.
이를 위해, 각 작제물의 통합체 5개를 0.2% 소듐 데옥시콜레이트가 보충된 2XTY 배지에서 배양했다. 2개의 독특한 집단이 나타났다. 어떤 클론은 37℃에서 약 8시간 후에 다소 육안관찰이 가능한 혼탁성을 나타냈다(pir 작제물에서 2개 클론과 pir116 작제물에서 3개 클론). 다른 클론들은 37℃에서 하룻밤 후만에도 농후한 배양물을 나타냈다. 이 클론들은 예상한 바와 같이 사실상 모두 카나마이신 감수성("KmS")이었다. 조사된 각 전기침투체마다, X-Gluc가 보충된 LB 배지에 50개의 KmS 자손을 스트리킹했다. 37℃에서 48시간 후, UidA+ 클론은 희미한 청색인 반면, 대립유전자 치환(case No.1, 도 3)이 일어난 클론(UidA-)은 이 배지에서 백색을 유지했다. 표 2에는 수득되는 이중 재조합체의 표현형 분석결과를 요약했다. 이중 재조합체의 18 내지 30% 정도는 대립유전자 치환을 일으켰다.
표 2
균주 DocR 중에서 KmS의 수 KmS 중에서 UidA-의 비율
XAC-1 pir-2 50/50 18
XAC-1 pir-3 50/50 24
XAC-1 pir-4 50/50 34
XAC-1 pir116-1 50/50 32
XAC pir116-4 35/50 30
3) 재조합 후 수득된 균주의 Pir+ 특성 조사
이중 재조합 후 수득되는 균주의 Pir+ 특성을 확인하기 위해, 각 작제물의 3개의 클론을 pBW30(Metcalf et al., 1994)으로 형질전환시켰다. 형질전환체가 모든 시험 균주에서 수득된다는 사실은 pir 및 pir116 유전자의 기능을 보유하는 것으로, XAC-1의 게놈에 통합되었음을 시사한다. 동일한 조건하에서, 모균주 XAC-1에 의해서는 형질전환체가 전혀 수득되지 않았다. 2개의 XAC-1pir 클론(B와 C) 및 2개의 XAC-1pir116 클론(E 및 D)을 가지고 연구를 진행했다.
4) 재조합 후 수득되는 균주의 PCR 증폭에 의한 조사
대립유전자 치환을 확인하게 위해, PCR 증폭을 이용하여 uidA 유전자좌의 어느 한쪽에 존재하는 게놈 영역을 조사했다. 올리고뉴클레오타이드 각 쌍은 pir의 내부 영역에 대응하는 제1 올리고뉴클레오타이드와 재조합시 제공되는 단편에는 없지만 염색체 uidA에 근접한 영역에 대응하는 제2 올리고뉴클레오타이드로 구성했다. 후자인 올리고뉴클레오타이드의 서열은 진뱅크에서 입수한 ECOUIDAA 서열(수탁번호: M14641)을 이용하여 분석했다. 이에 따라, 박테리아 게놈에 존재하는 pir 유전자의 정확한 위치를 확인할 수 있었다. 예상한 크기에 부합하는 증폭된 단편의 본성은 MluI 절단을 통해 확인했다.
실시예 2: 선택 마커 sup Phe를 운반하는 R6K 유래의 플라스미드 벡터의 작제
R6K 유래의 ori γ와 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 벡터를 작제했다(pXL2666). 균주 BW19610(pir116) 5(Mercalf et al., 1993) 내에 pXL2666 다량체의 존재가 관찰되었고, 이에 따라 본 출원인은 이러한 현상에 영향을 미치는 ColE1 유래의 cer 단편의 효과를 조사했다. 이어서, 벡터 ori γ-KmR-cer(pXL2730) 위에 페닐알라닌 억제인자 tRNA(sup Phe)의 발현 카세트를 도입시켰다. 이 벡터 pXL2760은 유전자 치료에 사용될 수 있는 벡터 작제의 기본으로 사용된다.
1) R6K 유래의 ori γ 및 카나마이신 내성 유전자를 함유하는 벡터의 작제 및 분석
a) 작제
작제된 제1 플라스미드 pXL2666에서, 카나마이신 내성 유전자는 pUC4K(Vieira and Messing; 1982)에서 유래하고, 417bp EcoRI-BamHI 단편을 함유하는 복제 오리진은 자살 벡터 pUT-T7pol(Herrero et al., 1990)에서 유래한다(도 4). 균주 BW19094 및 19610(Metcalf et al., 1994)으로 pXL2666를 전이시킨 결과, pir 균주에서의 플라스미드 양과 비교했을 때 pir116 균주에서의 플라스미드 양은 사실상 증가되는 것으로 나타났다. 하지만, 미분해 플라스미드의 전기영동 분석에서는, 이러한 증가가 몇몇 다량체 형태의 출현에 따라 병행되는 것으로 확인되었다. 이러한 현상은 플라스미드의 다중 카피들 간의 분자간 재조합과 관련이 있을 가능성이 높다. 따라서, 플라스미드 이량체의 분할을 시스 방식으로 허용하는 것으로 밝혀진 바 있는 자연 E.콜리 플라스미드, ColE1(Summers and Sherrat, 1984)의 cer 단편을 pXL2666에 클로닝하여 pXL2730을 작제했다. 사용된 단편은 ColE1 유래의 382bp HpaII 단편에 대응하는 것이다(Leung et al., 1985). 이 플라스미드는 특이적인 분자간 재조합 부위를 함유하는데, 기능성을 위해, 재조합효소 XerC 및 XerD 및 부속 인자 ArgR 및 PepA를 비롯한 숙주 단백질만을 필요로 한다(Stirling et al., 1988, 1989; Colloms et al., 1990). 관찰되는 효과 사실상 cer 단편에 의한 것인지를 확인하기 위하여, cer 단편에 165bp 결실이 있는 대조용 플라스미드 pXL2754를 작제했다. 이러한 결실은 다량체 분할에 있어서 cer의 작용을 폐지시키는 것으로 확인되었다(Leung et al., 1985). 이러한 플라스미드의 작제를 유도하는 다양한 클로닝 단계는 도 4에 제시했다.
b) 플라스미드 종들의 정량 및 정성 분석
(i) 아가로스 겔 전기영동 분석
작제된 여러 플라스미드들의 전기영동 분석은 다양한 플라스미드 종들이 사용된 균주에 따라 다양하게 나타날 수 있음을 입증했다. 미분해 플라스미드의 크기는 슈퍼코일형 DNA 마커에 상대적인 것으로 평가되었다. pir 균주(BW19094)에서 플라스미드 pXL2666, 2754 및 2730은 거의 대부분이 단량체 형태였다. 각각 주 밴드 위에 나타난 밴드들은 다소 작은 다양한 슈퍼코일형 토포이성체에 상응하는 것으로서, pXL2730에 DNA 자이라제를 작용시킨 후 관찰되는 프로필을 통해 확인했다.
pir116 균주(BW19610)에서는 이러한 프로필이 상이했는데, 단량체에서부터 다량체(2개, 3개 또는 4개 유닛)에 이르기까지 플라스미드 pXL2666 및 2754의 여러 종류가 관찰되었고, 주요 형태는 이량체였다. EcoRI으로 분해 후에는, 선형의 플라스미드 DNA만이 관찰되었다. 즉, 이러한 플라스미드는 플라스미드 다량체이거나 각종 토포이성체인 것이다. 하지만, 슈퍼코일형 DNA 마커에 따라 측정되는 형태의 크기는 단량체 플라스미드 완전 산물의 크기였으므로, 다량체일 가능성이 높다. 다량체의 형성은 도 균주 BW19094 및 BW19610이 엄격히 동질유전자는 아니지만(BW19610은 recA이다) pir116 돌연변이가 원인일 가능성이 가장 크다. pXL2730에 의해 수득되는 프로필은 상이했다: 즉 다량체 형태가 관찰되기는 하지만 주요 형태는 단량체 형태였다. 따라서, cer 단편은 recA와 무관하게 BW19610에서 본 출원인이 작제한 플라스미드 다량체의 분할을 용이하게 할 수 있다.
(ii) DNA 토포이소머라제 처리후의 분석
pir116 대립유전자를 운반하는 균주에서 관찰되는 플라스미드 형태가 특이적인 토포이성체라는 이론을 반증하기 위하여, 각 플라스미드 제조물을 DNA 토포이소머라제의 작용에 노출시켰다. 실험 조건에서의 각 효소의 활성은 다음과 같다: E.콜리 DNA 토포이소머라제 I에 의한 DNA의 이완, 이완된 DNA의 E.콜리 DNA 자이레이즈에 의한 부(-)의 슈퍼코일화, 및 S.아우레우스 DNA 토포이소머라제 IV에 의한 슈퍼코일형 DNA의 이완 및 얽힌 DNA의 풀림. 이러한 DNA 토포이소머라제 IV의 작용은 고분자량 플라스미드 형태가 여러 플라스미드 분자의 얾힘에 의해 산출되는 것이 아님을 보여주었는데, 분자의 얽힘에 의한 것이었다면 플라스미드들은 결과적으로 단량체 종으로 전환되었을 것이기 때문이다. 이러한 효소의 기능은 물론 얽힌 DNA 분자로 구성된(도시되지 않음) 키네토플라스트 DNA 제조물을 가지고 조사했다. 여기서도 미처리 대조군에서보다 이동성이 떨어지는 종이 수득되므로, 이완 활성을 확인할 수 있었다. DNA 자이레이즈의 작용은 약간 이완된 토포이성체를 박테리아에서 추출된 보다 슈퍼코일형의 종으로 전환시켜주었다(주로 단량체 또는 이량체). 더욱이, 제조된 DNA는 주로 슈퍼코일형임을 확인할 수 있었다. 이와 같이 처리된 시료는 각 작제물의 주요 종에 대한 상기의 결과를 확인시켜주었다. DNA 토포이소머라제 I은 사실상 이완 DNA이지만, 일부만 이완되어 있었다. 이는, 조사된 플라스미드가 상기 효소의 결합이 유리한 단지 몇 개의 단일 가닥 영역을 함유하는 사실 때문일 수도 있다(Roca, 1995).
2) pXL2730에 선택 마커 sup Phe의 도입
본 연구에는 합성 억제인자 tRNA 유전자(Phe)의 발현 카세트를 이용했다(Kleina et al., 1990). 이것은 TAG 코돈에 대한 반응으로 폴리펩타이드 성장 사슬에 페닐알라닌을 도입시켰다. 더욱이, 이 카세트는 아르기닌 결손 배지에서 양호한 성장을 제공하기에 충분한 활성인 ArgE 단백질을 XAC-1에서 생성시켰다. sup Phe는, E.콜리 lpp 유전자의 프로모터 서열 Plpp 유래의 합성 프로모터에서부터 플라스미드 pCT-2-F(Normanly et al., 1986) 상에서 구성형적으로 발현되었다. 이 유전자 하류에서 전사는 E.콜리 오페론 rrnC(Normanly et al., 1986)의 합성 종결인자, TrrnC에 의해 종결되었다. 다양한 클로닝 단계는 도 5에 도시된다.
다양한 서브클로닝은 XAC-1에서 수행했다. 억제인자 tRNA 발현 카세트의 기능성은 따라서 유전자 lacZu118am의 암버 코돈 억제 현상이 있는 경우에만 존재하는, 상기 균주의 α-갈락토시다제 활성을 통해 조사했다. 마지막 단계는 pXL2730에 sup Phe 발현 카세트를 도입시키는 단계로 구성했다. cer 단편(B-1-b)에 의해 수득되는 결과는 pXL2666 보다 이 플라스미드를 선택하게 했다. 여기서, 후속 클로닝의 용이성을 위해, 특히 최종 클로닝(KmR의 상실) 동안 추가 선별이 가능하도록 하기 위해 카나마이신 내성 유전자는 유지시켰다.
실시예 3: 마우스 섬유아세포의 형질감염에 의한 유전자 치료법에 적용되는 플라스미드 벡터의 유효성
1) 리포터 벡터 pXL2774 작제
플라스미드 DNA 생산 시스템의 유전자 치료용으로서의 유효성을 시험하기 위해 진핵생물 세포에서 사용될 수 있는 리포터 유전자를 pXL2760에 도입시켰다. 여기에, 포티누스 피랄리스 루시퍼라제를 암호하는 유전자 luc를 사용했는데, 그 이유는 이 생물발광성 측정 시험이 매우 민감하고 넓은 범위에서 선형의 결과를 나타내며, 진핵생물 세포의 내인성 활성으로 인한 배경의 노이즈가 매우 적기 때문이다. luc 유전자는 높은 발현율을 제공하는 인간 시토메갈로바이러스 초기 유전자(CMV 프로모터)의 프로모터-인헨서 서열에 의해 조절된다. luc의 3' 말단에는 바이러스 SV40에서 유래하는 비해독 영역이 있는데, 여기에는 폴리아데닐화 시그널(폴리(A)+)이 함유되어 있다. 이용할 수 있는 제한부위의 수를 증가시키는 중간 클로닝 후 "CMV 프로모터-luc-폴리(A)+" 카세트를 KmR마커 대신에 최소 벡터 oriγ-cer-sup Phe(pXL2760)에 도입시켰다. 수득되는 플라스미드를 pXL2774로 불렀다. 도 6에는 다양한 클로닝 단계를 도시했다. 결찰 혼합물을 전기침투에 사용하여 XAC-1pir116을 형질전환시켰다. 박테리아의 선택 마커 발현을 허용하는 항온배양은 고영양 배지(SOC 배지)에서 수행했으며; 이에 따라 평판배양 전에 세포를 M9 배지로 2회 세척해야 했다. 이로써 최소 배지에 배양물 배경의 노이즈를 초래할 수도 있는 잔류 배지를 제거할 수 있었다.
전기침투된 세포의 평판배양에 선택한 배지는 M9 최소 배지로서, 이는 억제인자 tRNA를 발현하는 박테리아를 선발하고 이에 따라 본 발명의 플라스미드의 존재를 확인할 수 있게 해준다. X-Gal의 첨가는 청색 발색을 통해 억제인자 tRNA의 발현을 육안관찰할 수 있게 해준다. 37℃에서 약 20시간 후 배양접시를 분석했다. DNA가 무첨가된 대조군에서는 콜로니가 없었는데, 이로써 선발이 심지어 농후한 접종물에서도 정확하다는 것을 확인했다. 제한효소로 조사한 모든 클론(8)은 예상한 프로필에 대응하는 플라스미드를 운반하였다. 이와 같이 작제된 플라스미드, pXL2774는 특히 이온교환 단계(Promega 키트, Megapreps)를 수반하는 기술을 통해 M9 액체 배지 1 리터에서 배양된 클론(37℃에서 약 18시간)으로부터 제조했다. 수집된 DNA 양은 2mg이었다.
2) 포유동물 세포에 형질감염된 리포터 벡터 pXL2774의 분석
진핵생물 세포를 형질감염시키고 루시퍼라제를 발현시키는 pXL2774의 능력은 NIH3T3 마우스 섬유아세포 형질감염을 통해 평가했다. 참조 벡터로는 다른 레플리콘에 존재하는 pXL2774와 동일한 루시퍼라제 발현 카세트를 운반하는 플라스미드 pXL2622(이것은 프로메가의 pGL2 플라스미드의 SV40 프로모터를 CMV 프로모터로 대체시킨 플라스미드이다)를 선택했다. 이것은 앰피실린 내성 유전자를 운반하는 6.2kb ColE1 유도체이다. 이 플라스미드는 대조군으로 제공했다. 루시퍼라제 활성(RLU 또는 상대적 발광성 유닛으로 나타냄)은 표 3에 제시한 바와 같다.
"리포펙턴트 전하/DNA 전하" 비 6에서 최상의 결과가 수득되었다; 이러한 조건하에서, pXL2622와 2774는 동등한 것으로 나타난다.
표 3
pXL2622 pXL2774
전하비 웰당 단백질 1㎍당 RLU 평균 변동 계수(%) 웰당 단백질 1㎍당 RLU 변동 계수(%)
검출 불가능 검출 불가능
실시예 4: E.콜리에서 pCOR 플라스미드의 자살 벡터 본성의 확인
R6K 유래의 pCOR형 플라스미드의 비복제성은 JM109 E.콜리(Yanisch-Perron et al., 1985)를 이용한 플라스미드 pUC4K(ori ColE1-KmR, (Vieira and Messing, 1982)) 및 pXL2730(R6K-KmR 유래의 ori 감마, 실시예 2 참조)의 전기침투 실험을 통해 확인했다. 전기침투기로는 Biorad Gene Pulser를 사용했고, 이 제조사의 절차(Bacterial electro-transformation and pulse controller instruction manual. 카탈로그 번호 165-2098)에 따라서 일렉트로컴피턴트 JM109 세포를 제조하고 사용했다.
전기형질전환된 세포는 카나마이신(50mg/l)이 보충된 LB 배지에서 평판배양하고 37℃애서 하룻밤동안 배양했다. 수득된 결과는 다음과 같다.
결과
플라스미드 형질전환된 양(ng) 형질전환체 수 효능(형질전환체 수/플라스미드 ng)
pUC4K 0.01 >>2000 >2105
pXL2730 5 0 0
이러한 결과는 pri 유전자를 발현하지 않는 균주에서 R6K 유도체(pXL2730)의 형질전환 효능과 ColE1 유도체(pUC4K)의 형질전환 효능 사이에 최소 5로그의 차이가 있음을 보여준다. XAC-1pir116과 같은 pir+ 균주에서는 R6K 유래 플라스미드의 전기형질전환 효능은 통상적으로 108개 형질전환체/플라스미드(㎍)에 이르거나 그 이상이다.
실시예 5: E.콜리 균주 XAC-1pir116의 고밀도 배양에 의한 플라스미드 DNA(pXL2774) 생산: 발효법
5.1. 균주:
XAC-1pir116 E.콜리(실시예 1)에서 최소 플라스미드 pXL2774 생산; 이 플라스미드는 다음과 같은 인자를 함유한다: ori R6K-cer-tRNAamsupPhe 및 CMV 프로모터 조절하의 luc 리포터 유전자의 발현 카세트(실시예 3). 이러한 유형의 플라스미드 생산을 위한 고생산성 방법을 개발했다.
5.2. 배양배지 및 조건:
a) 증식배지:
접종 배양물(g/l)에 사용되는 배지 조성은 다음과 같다: Na2HPO4 6, KH2PO4 3, NaCl 0.5, NH4Cl 1, NH4H2PO4 3, 글루코스 5, MgSO4·7H2O 0.24, CaCl2·2H2O 0.015, 티아민 HCl 0.010.
유가 회분식 배양물(g/l)에 사용되는 복합 배지의 조성은 다음과 같다: KH2PO4 8, K2HPO4 6.3, Na2HPO4 1.7, (NH2)2SO4 0.74, NH4Cl 0.12, 효모 추출물 3, 글루코스 2, MgSO4·7H2O 2.4g/l, CaCl2·2H2O 0.015, 티아민 0.010, 염 용액(Fe, Mn, Co, Zn, Mo, Cu, B, Al).
유가 회분식 배지의 배양물에 정의된 배지 조성은 복합 배지와 동일하지만, 효모 추출물 대신에 2.5g/l NH4Cl 이 사용된다.
b) 유가 회분식 배양 조건:
배지 1 L를 함유하는 2L용 발효기(Setric France)를 이용하여 증식 및 플라스미드 DNA 생산을 위한 최적 조건에 관한 연구를 수행했다. 이 발효기에 증식 정지기 단계 초기에 도달한 접종 배양물 80ml을 접종했다.
발효 동안, pH는 10%(w/v) 암모니아 수용액을 이용하여 6.9 내지 7.0 사이로 자동 조정시키고, 온도는 37℃로 유지시켰으며, 0.2bar의 압력에서 75l/h(1.1vvm)로 통기시키고, 용존 산소는 교반속도의 반작용에 의해, 필요한 경우 순수 산소 주입을 통해 공기 포화율의 40%가 되도록 조정했다.
모든 변수(pH, 온도, 교반, OD, O2 및 기체 배출물 중의 CO2)를 종합하여, 휴렛-팍카드 9000에 연결된 HP3852 인터페이스를 통해 직접 계산했다.
공급 배지의 기본 조성은 다음과 같다: 탄소원 50%, 황산마그네슘 0.7%, 티아민 0.02%; 복합 배지에는 효모 추출물을 바람직하게는 5 내지 10% 사이의 농도로 첨가했다.
이러한 배양 조건을 800리터용 발효기에 맞추기 위해, 2회의 연속 접종 배양물로 구성되는 생산 순서를 실험실 규모에서 다음과 같이 수행했다: 접종물 I은 교반되는 원추형 플라스크에서 배양하고, 접종물 II는 2리터 발효기(회분식 배양)에서 배양한 뒤, 7리터 발효기에서 유가 회분식 생산 배양을 진행했다.
5.3 결과
다양한 배양 조건은 복합 배지, 특정 배지 및 다양한 증식 속도에서 조사했다. 모든 경우마다, 박테리아 균주가 1차 회분식 배양되어 탄소원이 소모되면 공급 배지는 사전프로그램된 추가 프로필에 연계된 연동식 펌프를 이용하여 발효기로 첨가했다. 이 프로필은 공급 속도가 용존 산소 농도 또는 일정 증식 속도로 조절되었던 종래 실험으로부터 추론된 것이다.
더욱이, 2리터 발효 조건을 배지의 과잉산소화 없이 800 리터 발효기로 용이하게 적응시키기 위해, 배양 말기의 최대 산소 요구량을 2.5 내지 3mM/min으로 조정했다. 이를 위해, 미생물의 증식 속도를, 필요한 경우 보충물의 공급 속도 변화를 통해 감소시켰다.
표 4에 제시된 바와 같이, 실험실 규모 및 800 리터 발효기 규모의 복합 배지 및 특정 배지에서 모두 매우 양호한 결과가 수득되었고; 더욱이 플라스미드 DNA 성장 및 생산 동력학은 전부 비슷했다(도 6 및 도 7 참조).
표 4
복합 배지 특정 배지
2L 또는 7L 발효기 800L 발효기 2L 발효기
발효 기간(hr) 40 39 48
μh-1 0.130 0.132 0.124
OD(600nm) 114 100 94
X(g/l) 44 37 30
플라스미드 DNA(mg/배지 L) 115 100 100
플라스미드 DNA(mg/Xg) 2.6 2.7 3.3
X=생체량(건조 세포 중량)
전체 결과를 종합하면 다음과 같다:
- 2L에서 800L로의 발효기 스케일의 변화는 아무런 문제없이 수행될 수 있다.
- 소비된 산소는 생산되는 생체량과 밀접한 상관성이 있다(1.08g/생산 생체량g).
- 선발 압력의 필요 없이 플라스미드가 최소 50세대까지 안정하다.
- 1L 당 건조 세포 40g을 초과하는 높은 생체량이 복합 배지에서 수득될 수 있다.
- 플라스미드 DNA 생산량이 배지 1L 당 슈퍼코일형 DNA 100mg에 달한다.
- DNA 생산과 생체량 간의 매우 양호한 상관성이 존재한다. 생산량은 발효 기간에 상관없이 1mg의 플라스미드 DNA/OD 유닛, 또는 2.7mg의 플라스미드 DNA/생체량 g으로 추정된다.
- 또한, 특정 배지 사용시에도 아무런 생산성의 손실없이 높은 생체량(건조 세포 30g/l) 및 높은 플라스미드 DNA 생산량(100mg/l)을 수득할 수 있다.
실시예 6: 시험관내 및 생체내에서의 pXL2774의 동물세포로의 전이
6.1. pXL2774의 동물 세포로의 시험관내 전이
다양한 세포주를 형질감염시키는 최소 플라스미드 pXL2774의 능력은 인간 기원 세포 및 뮤린 기원 세포에 대하여 시험관내에서 조사했다. 대조군으로는 pXL2784 플라스미드를 사용했다. 이 플라스미드는 pXL2774와 동일한 진핵생물 발현 카세트(CMV 프로모터-루시퍼라제-폴리A)를 함유하지만, E.콜리에 카나마이신 내성을 부여하는 유전자를 함유하는 6.4kb ColE1 유도체이다.
조사된 세포는 다음과 같다:
세포 종류 ATCC 번호/참조문헌
3LL 마우스 폐암종
NIH 3T3 마우스 배아 섬유아세포 CCL92
293 타입 5 아데노바이러스로 형질전환된 인간 배아 신장 세포 CRL1573
HeLa 자궁 경부유래의 인간 암종 CCL2
Caco-2H460 인간 결장 선암 HTB37
H460 소세포가 전혀 없는 인간 폐암종 HTB177
ECV304 인간 제대 내피 세포 Takahashi et al., 1990
형질감염 조건은 다음과 같다:
D-1: 10% 태내 송아지 혈청(FCS)이 보충된 DMEM 배지(둘베코 변형 이글 배지)에서의 2㎠웰(24웰 평판) 당 100,000세포 밀도의 세포 접종.
D-3: 10% FCS가 보충되거나 보충되지 않은 배양배지 250㎕에서, DNA 0.5㎍, 150mM NaCl, 5% 글루코스 및 3nmol의 RPR120 535 리포펙턴트/DNA ㎍를 함유하는 형질감염 용액 10㎕를 이용한 세포의 형질감염. 2시간 동안 항온배양한 후, 배지를 10% FCS가 보충된 DMEM 배지 500㎕로 대체했다.
D-4: 배양 배지 재생.
D-5: PBS를 이용한 세포 세척, 그 다음 프로메가 용해 완충액(Promega Cell Lysis Buffer E153A) 100㎕를 이용한 용해. 통합 시간 10초 후, 용해물 10㎕를 가지고 루시퍼라제 활성 분석을 Lumat LB9501 조도계(Berthold)에서 수행했다. 사용된 반응물은 프로메가(Promega Luciferase Assay Substrate) 제품을 사용했다. 다음 표 5 내지 8에서 비교되는 결과는 용해물 10㎕의 RLU(상대적 광 유닛)(4웰 당 측정한 평균값)로 나타냈다. 변동 계수(CV)도 제시했다.
혈청 무첨가하에 형질감염의 결과는 다음과 같다.
세포 종류
혈청 첨가(10%)하에 형질감염 결과는 다음과 같다:
세포 종류
세포 종류
이러한 결과는 pXL2774가 시험관내에서 뮤린과 인간 기원의 다양한 세포 종류를 형질감염시킬 수 있는 능력이 있음을 보여준다. luc 리포터 유전자의 발현은 형질감염 효능이 최소한 루시퍼라제의 동일한 발현 카세트를 운반하는 ColEl 유래의 "표준" 플라스미드의 효능만큼은 양호하다는 결과를 보여줄 수 있었다.
6.2. 동물(마우스) 내 pXL2774의 생체내 전이
a) 모델 1: 마우스 두개 경골근에 존재하는 나출형 DNA
"5% 글루코스, 150mM NaCl"에 용해시킨 나출형 플라스미드 DNA를 OF1 마우스의 두개 경골근에 주사했다. 주사후 7일 후에 이 근육을 분리하고, 잘게 썬 후, 용해 완충액(Promega Cell Lysis Buffer E153A) 750㎕에서 파쇄한 뒤, 20,000xg의 속도로 10분 동안 원심분리했다.
상청액 10㎕에 시약(Promega Luciferase Assay Substrate) 50㎕를 첨가한 후 루시퍼라제 활성을 분석했다. 10초간 통합시킨 후 Lumat LB9501 조도계(Berthold)로 활성을 판독했다.
결과는 다음 표에 정리했다.
이와 같은 결과는 pXL2774와 같은 조건성 복제 플라스미드가 사실상 생체내에서 마우스 근육세포를 형질감염시킬 수 있으며 이러한 형질감염 효능은 루시퍼라제 유전자의 동일한 발현 카세트를 운반하는 ColE1 유래의 "표준" 플라스미드의 효능과 비슷하거나 심지어 우수한 것임을 보여주었다.
b) 모델 2: 3T3 HER2 종양 모델
이 모델은 다음과 같은 것이다:
- 스위스/누드 마우스 암컷 성체
- 옆구리에 107 3T3 HER2 세포를 피하 주사한 후에 유도된 실험용 종양.
- 세포 주사후 7일 후에 형질감염 혼합물을 주사했다.
주사된 용액: 먼저 DNA를 완충액에 용해시켰다. 모든 제품 첨가 후, 혼합물은 DNA 외에 물 또는 5mM HEPES 완충액 중의 NaCl(150mM) 및 5% D-글루코스를 함유한다.
- 주사 2일 후 종양 조직을 떼어내어 칭량한 뒤, 잘게 썰고, 용해 완충액(Promega Cell Lysis Buffer E153A) 750㎕에서 파쇄했다. 원심분리(20,000xg에서 10분) 후, 상청액 10㎕를 취하여 루시퍼라제 활성을 측정했다. 이 활성은 시약(Promega Luciferase Assay Substrate) 50㎕를 첨가한 후 수득되는 총 광방사율을 10초간의 통합 시간 후 Lumat LB9501 조도계(Berthold)에서 측정하여 확인했다.
활성 결과는 총 종양 용해 상청액에서 측정되는 RLU(상대적 광 유닛)로 나타냈다.
결과
이와 같은 결과는 pXL2774와 같은 조건성 복제 플라스미드가 사실상 생체내에서 마우스 종양 세포를 형질감염시킬 수 있으며 이러한 형질감염 효능은 루시퍼라제 유전자의 동일한 발현 카세트를 운반하는 ColE1 유래의 "표준" 플라스미드의 효능과 최소한 비슷한 것임을 보여주었다.
이러한 다양한 실험을 통해 조건성 복제 플라스미드, 보다 구체적으로 pXL2774가 사실상 유전자 치료법에 사용할 수 있는 필수요소인 동물세포 형질감염 특성을 보유하고 있음을 확인했다. 보다 상세하게는, 다음과 같은 결론을 확인했다:
1) 인간 또는 뮤린 기원의 다양한 세포 종류를 시험관내에서 효과적으로 형질감염시키는 pXL2774의 능력;
2) 마우스 근육을 생체내에서 형질감염시키는 pXL2774의 능력;
3) 마우스 내에 이식된 종양 세포를 생체내에서 형질감염시키는 pXL2774의 능력
이와 같이, 상기 전기형질감염, 발효 및 형질감염 실험들은 다음과 같은 실험 결과를 통해 조건성 복제 플라스미드가 유전자 치료법에 사용될 수 있는 벡터로서 유효함을 확인시켜주었다:
i) pir 유전자(조건성 복제 오리진)를 발현하지 않는 E.콜리 균주에서는 복제성이 검출되지 않는다.
ii) 이 플라스미드는 항생제를 함유하지 않는 특정 배지에서 공업적 생산과 비슷한 규모에서 생산될 수 있다.
iii) 이 플라스미드는 포유동물 세포를 시험관내에서, 특히 생체내에서 형질감염시킬 수 있다.
실시예 7: 재조합 단백질의 시험관내 생산
7.1. 발현 벡터의 작제
이러한 시도의 실현가능성을 확인하기 위해서, 전술한 기준(실시예 2 및 3)에 따르는 발현 벡터를 작제했다. 이러한 벡터 pXL3056은 다음과 같은 구성인자를 함유한다:
1) 조건성 복제 오리진(ori 감마), ColE1의 cer 단편 및 박테리아에서 선발가능케 해주는 유전자(sup)를 함유하는 박테리아 부분.
2) 문헌(Studier et al., 1990)에 기술된 시스템을 기반으로 하여, 박테리오파지 T7의 유전자 10의 프로모터, lacO 오퍼레이터, aFGF154(산성 섬유아세포 성장 인자, 154개의 아미노산을 함유하는 형태)를 암호하는 유전자(Jaye et al., 1986) 및 박테리오파지 T7의 TF 종결인자를 함유하는 발현 카세트. 이 발현 카세트는 WO96/08572에 기술된 pXL2434 플라스미드에 존재하는 것과 동일하다.
pXL3056의 구조는 도 8에 제시했다. aFGF 발현 카세트를 함유하는 pXL2434(1.1kb)의 EcoRI-BglII 단편을 pXL2979 조건성 복제 벡터(1.1kb 정제 단편)의 BglII 및 EcoRI 부위에 클로닝하여 pXL3056을 수득했다.
pXL2979는 3개 단편을 결찰시켜 제조한다: i) pXL2730의 AccI-XbaI 단편(ori 감마 및 cer를 제공하는 0.8kb), ii) pXL2755의 NarI-SalI 단편(sup Phe 유전자를 제공하는 0.18kb), iii) pXL2660의 SalI-SpeI 단편(카나마이신 내성 유전자를 제공하는 1.5kb).
pXL2660은 pUC4K(Vieira and Messing, 1982)의 1.2kb PstI 단편을, PstI으로 선형화한 pMTL22(Chambers et al., 1988)에 클로닝하여 수득한다.
7.2. 발현 균주의 생산
플라스미드 pXL3056 도입으로 XAC-1pir116 균주를 형질전환시켰다. 그 결과 수득되는 균주를 30℃에서 플라스미드 PT7pol23(Mertens et al., 1995)로 형질전환시켰다. T7 프로모터의 조절하에 당해 유전자를 발현하기 위해서는, 박테리아는 박테리오파지 T7의 RNA 폴리머라제의 발현을 허용하는 카세트를 자신의 게놈에, 또는 플라스미드 또는 박테리오파지에 함유해야 한다. 본 실시예에서는, 박테리오파지 T7 RNA 폴리머라제의 발현이 온도 유도성이고 pXL3056과 같은 R6K 유도체와 비슷한 플라스미드 pT7pol23을 사용했다. 하지만, 한 플라스미드만이 보존되고 온도 보다는 IPTG에 의해 T7 RNA 폴리머라제 생산이 유도되도록 하기 위해 람다 DE3(Studier et al., 1990)으로 XAC-1pir116 균주를 용원화시킬 수도 있다.
7.3. aFGF의 발현
XAC-1pir116 균주(pXL3056+PT7pol23)는 0.2% 카사미노산(DIFCO)과 카나마이신(25㎍/ml)이 보충된 M9 최소 배지에서 XAC-1pir116 균주(pXL3056+PT7pol23)를 600nm에서의 광학밀도가 0.6 내지 1.0이 될 때까지 30℃에서 배양했다. 배양물의 절반은 그 다음 42℃에 배치하고(T7 RNA 폴리머라제 유도), 나머지 절반은 30℃로 유지시켰다(음성 대조군). 이와 동일하게 T7 RNA 폴리머라제 없이 aFGF를 발현하는 대조군으로서 XAC-1pir116(pXL3056+pUC4K) 균주를 사용하여 실험했다.
수득되는 결과는 도 9에 제시했다. 이와 같은 결과는 aFGF 생산이, BL21(DE3)(pXL2434)(WO96/08572)에서 관찰되는 양과 비슷하거나 보다 우수함을 보여주었고, 이것은 조건성 복제 플라스미드가 시험관내에서, 특히 E.콜리내에서 재조합 단백질을 발현시킨다는 것을 분명하게 보여준다.
실시예 8: 야생형 또는 하이브리드 p53 단백질 또는 FGF1 인간 단백질을 발현하는 pCOR 벡터의 작제
본 실시예는 p53 단백질을 암호하는 핵산을 함유한, 본 발명에 따른 조건성 복제 벡터의 작제에 관한 것이다. 이러한 벡터는 결손형(돌연변이형, 결실형) 세포, 예컨대 특히 종양 세포에서 p53 타입의 활성을 복원시키는데 사용될 수 있다.
진핵생물 발현 카세트는 다음과 같은 구성인자를 함유한다:
1) CMV "인접 초기" 프로모터(위치 -522 내지 +72), 그 다음 타입 I 단순 헤르페스 바이러스의 티미딘 키나제 유전자의 리더 서열[문헌 McKnight, S.L.(1980) Nucleic Acids Res. 8:5949-5964에 기술된 서열과 비교했을 때 상기 유전자의 -60 내지 +1 위치];
2a) PCT/FR96/01111에 기술된 바와 같은 p53 변형체 또는 야생형 p53 단백질을 암호하는 핵산(V325K 변형체 = ATG와 코작서열을 보유한 V325);
2b) 문헌[Jaye M. Sciences 1986; 233(4763):451, 미국 특허 4,686,113 및 유럽 특허 259 475]에 기술된 바와 같은 인간 FGFa 또는 FGF-1을 암호하는 핵산;
2c) 인간의 섬유아세포 인터페론 분비 시그널(Taniguchi et al.)과 아미노산 21 내지 154로 이루어진, 인간 FGF-1의 자연발생의 절두형태(Jaye et al., 및 미국 특히 5,849,538) 간의 융합 유전자를 암호하는 핵산.
3) SV40의 폴리A 폴리아데닐화 서열.
이러한 구성인자들을 pCOR 벡터 pXL2988의 AscI-XbaI 단편 형태의 BssHII 및 SpeI 부위 사이에 배치했다. pXL2988은 트리뉴클레오타이드 GAA의 17 카피로 구성된 DNA 3중 나선을 형성할 수 있는 서열인 추가 구성인자가 감마 복제 오리진을 따라 인접 배치되는 것을 제외하고는 pXL2979(실시예 7.1)와 동일하다.
그 결과 수득되는 플라스미드는 pXL3029, pXL3030, pXL3179 또는 NV1FGF로 지칭했다(도 10).
이러한 작제물의 기능성은 p53-SAOS2 세포 배양물 중에서 p53 또는 p53superWT의 전사 활성인자 활성을 측정하거나 당해 기술분야에 공지된 ELISA 실험 등에 의한 FGF1 분비를 측정하여 시험관내에서 확인했다.
실시예 9: TEX1 작제(XAC1 pir116, endA - , traD - )
E.콜리 XAC-1pir116은 proB+ lacI373Zu118am을 운반하는 약 100kb의 원형 DNA 분자인 F' 에피좀을 함유한다. 다수의 웅성 E.콜리 실험 균주는 에피좀에 traD36 돌연변이를 보유하지만 XAC-1의 경우에는 F' 전이 성질에 영향을 미치는 돌연변이는 개시된 바가 없다. traD 유전자는 tra(전이) 오페론 중 하나의 5' 말단에 위치하며, DNA 전이 및 DNA 대사에 직접 관여하는 막 단백질을 암호한다(Frost et al., BBRC, 1994, 58:162-210). 이 유전자의 92%를 차지하는 traD 유래의 2kb 중심 단편은 pHP45Ω(Prentki and Krisch, 1984, Gene, 29:303-313) 유래의 2kb 오메가 인자(진뱅크 수탁번호 M60473)로 XAC-1pir116 endA-에서의 상동성 재조합을 통해 치환시켰다. 상기 오메가 인자는 짧은 역반복체가 인접된 aadA 항생제 내성 유전자를 함유한다. aadA 유전자는 아미노글리코사이드-3 아데닐트란스퍼라제를 암호하고 스트렙토마이신 및 스펙티노마이신("SpR")에 대한 내성을 부여한다. 오메가 단편을 사용한 이유는 조기에 RNA 및 단백질 합성을 종결시켜 전 traD 오페론을 불활성화시키기 때문이다. 이러한 새로운 pCOR 균주 XAC-1pir116 endA- traD::SpR을 TEX1로 지칭했다. 공급체가 TEX1인 경우에는 내재하는 어떤 플라스미드, 예컨대 pCOR 또는 pUC의 전이도 검출되지 않았다.
이러한 신규 pCOR 숙주 균주 TEX1을 발효 실험으로 평가했다. XAC-1pir116의 유가 회분식 발효에는 효모 추출물을 함유하는 복합 배지를 사용했다. pCOR 안정성(50세대 이상)은 비선택성 배지를 사용할 수 있게 해준다. 이러한 상황하에, XAC-1pir116은 40g/l 이상의 건조 세포 중량을 생산했고, 2L 발효기에서는 100mg/l의 pCOR pXL2774를 수득했다. pCOR 카피수는 세포 당 400 내지 500 카피로 추정되고 플라스미드 DNA 합성 속도는 발효 동안 일정했다. 이러한 결과는 대량제조에 적합한 800 리터 발효기에도 적용되었다. 또한, 효모 추출물이나 동물 기원의 임의의 원료 물질의 무첨가하에 발효가 수행되었다. 2L 배양물에 특정 배지를 사용한 경우에도 생산성의 상실없이 유사한 결과가 수득되었다(30g/l의 건조 세포 중량 및 100mg/l의 플라스미드 DNA).
실시예 10: 상동성 재조합에 의한 XAC-1pir116pir42 숙주 균주의 작제
1) 카세트 "KmR-uidA:pir116;pir42"를 운반하는 자살 벡터의 작제
실시예 1에 기술한 바와 같은 M13wm33 유래의 KmR-uidA::pir116 카세트(Metcalf W. et al. Gene, 1994, 138(1-2): p.1-7)를 PCR을 이용한 부위 지시성 돌연변이유발법(QuickChange 부위 지시성 돌연변이유발 키트, Stratagene, Ca, La Jolla)으로 변형시켜 pir116 유전자내에 pir42 돌연변이를 도입시켰다. 다른 클로닝/돌연변이유발 단계는 도 13에 제시했다.
돌연변이유발에 사용된 올리고뉴클레오타이드에는, ClaI 부위를 만들어 필요한 경우 제한효소 분석을 통해 pir42의 프로세싱을 용이하게 확인하기 위한 침묵 돌연변이와 함께 pir42 돌연변이를 함유했다.
사용된 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같은 것이다:
센스 올리고뉴클레오타이드 번호 11076(서열 7)
안티센스 올리고뉴클레오타이드 번호 11077(서열 8)
E.콜리 pCOR 숙주 TEX1의 게놈에 존재하는 pir116을 pir116pir42로 치환시키기 위해, 문헌[Blum et al., J.Bacteriol. 1989, 171, pp 538-46]에 기술된 방법을 기초로 하는 기술을 사용했다. 도 13에 제시한 재조합 박테리오파지 pXL3723은 비억제인자성 E.콜리 균주에서는 자살 벡터인데, 이는 바이러스 게놈 복제를 방해하는 M13 니카제(nickase)를 암호하는 유전자 II에 넌센스 돌연변이를 보유하기 때문이다.
XAC-1pir116의 작제에 대해 설명된 바와 같이 이중 재조합을 수행했다(실시예 1, 단계 2). 이중 상동성 재조합 사건이 진행된 클론은 TEX1 게놈에 pir42 돌연변이의 존재를 시험하는 PCR로 선별했다. 이중 재조합 후보 중에서 분리된 게놈 DNA를 PCR의 주형으로 사용했다. 그 다음, 각각 증폭된 고유 단편(모두 예상 크기를 지님)에 대해 서열분석을 수행했다. PCR 단편은 도 14에 제시했다.
PCR 프라이머는 다음과 같다:
프라이머 11088(서열 9): 5'-GAGATCGCTGATGGTATCGG-3'
프라이머 11089 (서열 10): 5'-TCTACACCACGCCGAACACC-3'
분석 결과, 조사된 6개의 이중 재조합체 중 1개가 대립유전자 교환이 이루어진 것으로 나타났다. 이러한 신규 균주를 TEX1pir42라 부르고 모균주 TEX1과 비교하여 pCOR 플라스미드 복제능력에 대한 평가를 추가로 실시했다.
2) TEX1pir42의 평가
pCOR 플라스미드를 사용하여 TEX1 및 TEX1pir42를 나란히 형질전환시키고 M9 선택배지 2ml에서 하룻밤동안 증식시켰다. 그 다음, 플라스미드 DNA를 Wizard SV plus minipreps 키트(Promega)로 추출하여 양 균주에 존재하는 pCOR 플라스미드의 상대적인 플라스미드 카피수와 지형을 평가했다.
pCOR 플라스미드 pXL3516(2.56kb)으로 형질전환된 TEX1pir42에서 카피수의 2배 증가가 재현적으로 수득되었다. TEX1pir42를 추가로 특성규명하기 위해, pXL3179 및 pXL2774와 같은 pCOR 플라스미드의 카피수와 지형을 플라스미드 DNA의 소량 정제(4 내지 6개 클론/균주)후 아가로스 겔 전기영동 분석을 통해 평가했다. 카피수는 EcoRI 제한효소로 선형화된 플라스미드를 가지고 평가했다. 지형 분석은 에티디움 브로마이드 무첨가하에 미분해 플라스미드를 가지고 실시했다. 아가로스 결 결과는 도 15에 제시하였고, 이를 통해 플라스미드 pXL3179가 TEX1 균주에서 생산될 때보다 TEX1pir42에서 생산될 때 플라스미드 카피수가 보다 높다는 것을 확인했다. 도 15에는 플라스미드 pXL3179의 지형도 제시되어 있는데, 이를 통해 플라스미드 카피수의 증가가 대부분 단량체 형태와 소수의 다량체 형태로 이루어짐을 확인했다. 이러한 pCOR 플라스미드에 의해 수득되는 결과는 표 5에도 정리했다. 상대적 카피수는 TEX1에 존재하는 동일한 플라스미드와 비교하여 계산했다. TEX1pir42에서 생성되는 플라스미드 pXL3179 및 2774에 의해 2 내지 3배 증가되는 플라스미드 카피수를 관찰했다.
표 5: TEX1pir42에서 생성되는 pCOR 플라스미드의 복제 및 카피수
플라스미드 크기(kb) 상대적 카피수*
pXL3179 2.4 x3
pXL2774 4.5 x2
*카피수는 TEX1에 존재하는 동일한 플라스미드에 대한 비교값이다.
실시예 11: 비교 실험: TEX1cop21(XAC-1endA- traD- pir116cop21)의 작제
1) TEX1cop21의 작제
TEX1cop21 균주는 실시예 10에서 TEX1pir42에 대해 기술한 것과 유사하게 작제했다. 지시성 돌연변이유발에 의해 pir116 유전자에 cop21을 도입시키는데 사용한 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
센스 올리고뉴클레오타이드: 11153(서열 11)
안티센스 올리고뉴클레오타이드: 11154(서열 12)
5'-G GCT ACT TAA GCG TAA GCT GGA CGT TAA CAA TTG CG-3'
cop21 돌연변이는 돌연변이에 인접된 HindIII 제한부위의 제거를 위해 TCA 세린 코돈 대신에 TCC 세린 코돈으로 도입시켰다.
지시성 돌연변이유발에 사용된 주형은 pXL3395(도 13 참조)였다. 결과적으로 수득되는 pXL3432라는 플라스미드를 사용하여 도 13에서 pir42에 대해 제시한 바와 유사한 방식으로 M13 자살벡터를 작제했다. 이 자살 벡터 pXL3749는 도 16에 제시했다.
pXL3749와 상동성 재조합 후 수득되는 E.콜리 클론을 PCR로 선별한 뒤, HindIII으로 제한분해하고 cop21 및 pir116 돌연변이의 모니터를 위해 서열분석했다. 조사된 6개의 이중 재조합체 중 1개의 클론에, 유전자 치환이 진행되어 있었다. 이와 같은 균주는 TEX1cop21이라 지칭했다.
2) TEX1cop21의 평가
TEX1cop21은 다양한 pCOR 플라스미드, 예컨대 2.5kb KmR pCOR 벡터인 pXL2979(실시예 7.1 참조)를 이용하여 형질전환시키고, 겔 전기영동으로 카피수 증가를 분석했다. 이러한 pXL2979를 이용한 실험은 도 17에 제시했다. 프로메가 미니프렙 키트를 가지고 제조한 각 균주마다 4개의 독립된 클론으로부터 수득한 플라스미드 DNA를 EcoRI으로 선형화하고 아가로스 겔에서 전기영동한 뒤 에티디움 브로마이드로 염색했다. 각 시료는 600nm에서의 광학 밀도로 측정한 바와 같이 유사량의 박테리아를 나타냈다. E.콜리 TEX1cop21, XAC1pir 및 TEX1에서 생산되는 pCOR 플라스미드 pXL2979에 대한 아가로스 겔 전기영동 결과는 도 17에 제시했다. 이를 통해, 플라스미드가 TEX1cop21 균주에서 생산될 때 TEX1에서와 비교했을 때 플라스미드 카피수의 증가가 없음을 확인했다.
실시예 12: TEX2pir42(XAC-1pir116pir42recA - )의 작제
먼저, TEX1의 recA-유도체를 작제했다. 그 다음, 결과적으로 수득되는 TEX2로 지칭한 균주에 pir42 돌연변이를 도입시켜 TEX2pir42를 수득했다.
1) TEX1의 recA- 유도체인 E.콜리 TEX2의 작제
5' 말단에 3개의 해독 종결 코돈(각 프레임에 하나씩)을 함유하는 결실된 recA 유전자를 PCR로 수득했다. 이러한 결실된 recA 유전자를 유전자 치환(Blum et al., J.Bacteriol., 1989, 171, pp.538-46)에 의해 TEX1 게놈으로 도입시켰다. 상동성 재조합을 위한 자살 벡터 작제는 도 18에 제시했다. recA 단편 증폭에 사용되는 PCR 프라이머는 다음 표 6에 제시했다:
표 6
상동성 재조합 발생에 필요한 RecA+ 표현형을 유지하기 위해, E.콜리 recA 돌연변이체에 보체역할을 할 수 있는 이종의 recA 유전자, 예컨대 박테리아 아그로박테리움 라디오박터의 recA 유전자와, 항생제 내성 유전자, 예컨대 앰피실린 내성 유전자를 함유하는 플라스미드를 이용하여 recA 기능을 E.콜리 TEX1에 제공했다. 유전자 치환 후에, 비선택성 배지(LB)에서의 희석배양을 통해 재조합 균주로부터 플라스미드를 제거했다. 플라스미드의 부재는 항생제 내성 상실로 선별했다.
결과적으로 수득되는 균주를 TEX2로 지칭했다. 유전자 치환은 도 19에서와 같이 PCR로 모니터했다. PCR 프라이머는 하기 표 7에 제시했다.
표 7
프라이머 11355-11354 프라이머 11355-11354
야생형 recA 1117bp 1089bp
결실된 recA 404bp 376bp
제1 프라이머는 recA 유전자의 서열을 기반으로 했다. 제2 프라이머는 자살 벡터 pXL3457에 존재하는 상동성 영역 외측에 인접한 서열(recA의 5' 또는 3' 인접)을 기반으로 했다. 이러한 두 올리고뉴클레오타이드의 서열은 recA 유전자좌를 함유하는 E.콜리의 서열에 따라 선택되었다(진뱅크 ECAE000354).
recA 결실된 균주에서 수득되는 PCR 단편은 하기 표 8에 제시한 바와 같이 야생형 균주에 의해 수득되는 PCR 단편에 비해 길이가 짧았다.
표 8
recA 증폭용 PCR 프라이머
수득되는 PCR 프로필은 예상한 바와 같았고, TEX2 게놈에 절두형 recA 유전자의 존재를 입증했다. recA-표현형(UV광 감수성) 뿐만 아니라 TEX2의 표현형의 특성을 조사했다. TEX2의 표현형 특성은 예상한 바와 같이 TEX1 균주와 동일했다(즉 ara-, RifR, NalR, SpR, UidA-, Arg-, KmS, AmpS).
B) E.콜리 TEX2pir42의 작제
TEX2pir42 균주는 실시예 10에 기술된 전략에 따라 이중 상동성 재조합으로 제조했는데, 단 TEX2에서는 상동성 재조합에 필요한 recA+ 표현형의 유지를 위해 E.콜리 recA 돌연변이체에 보체역할을 할 수 있는 이종의 recA 유전자를 운반하는 플라스미드의 존재하에 재조합을 수행했다.
유전자 치환은 ClaI으로 절단한 PCR 산물의 제한분석으로 모니터했다(도 14 참조). 조사된 4가지 이중 재조합체 클론 중에서 2가지에 유전자 치환이 이루어져 있었다.
C) E.콜리 TEX2pir42의 평가
1) 실험실 규모의 플라스미드 생산 평가:
TEX2pir42를 pCOR 플라스미드 pXL3179(2.4kb)로 형질전환시켰다. 그 다음, 플라스미드 카피수, 배양조건 및 안정성(계대수) 개선의 재현성을 통해, TEX2pir42에서의 pXL3179의 생산에 대해 실험실 규모로 집중 연구했다. 모든 연구 결과, 동일 조건하에서 TEX1에서 pXL3179가 생산되는 것에 비해 플라스미드 카피수 증가가 2 내지 5배임이 일관되게 관찰되었다. 플라스미드 카피수는 TEX2pir42, 및 비교 실험으로서 TEX1pir42 및 TEX1에서의 pXL3179 생산에 대해 추가 조사했다.이 실험에서 플라스미드는 600nm에서의 OD를 기반으로 동일한 박테리아 생체량으로부터 추출하고 아가로스 겔 전기영동으로 분석했다. 전기영동 후 겔을 에티디움 브로마이드로 염색했다. 도 20에 나타낸 아가로스 겔 전기영동은 플라스미드가 TEX2pir42에서 높은 카피수로 생산됨을 분명하게 보였주었고, 바람직하게는 TEX1pir42 대신에 TEX2pir42에서 생산될 때 플라스미드 다량체가 감소됨을 보여주었다.
2) 발효기에서의 평가:
이와 같은 결과는 하기 기술되는 바와 같은 7리터 발효기 대용량에서 확인했다.
a) 발효 배지 조성
접종 배양물에 사용된 배지의 조성은 다음과 같다: Na2HPO4 6 g/l, KH2PO4 3g/l, NaCl 0.5g/l, NH4Cl 1g/l, NH4H2PO4 3g/l, 글루코스 5g/l, MgSO4·7H2O 0.24g/l, CaCl2·2H2O 0.015g/l, 티아민 HCl 0.010g/l.
유가 회분식 배양물(g/l)에 사용되는 배지의 조성은 다음과 같다: KH2PO4 8g/l, K2HPO4 6.3g/l, Na2HPO4 1.7g/l, NH4Cl 2.5g/l, 글루코스 10g/l, MgSO4·7H2O 2.6g/l, 티아민 0.011g/l, Biospumex36 소포제 0.1ml/l, 염혼합물(표 9 참조) 2.5ml/l.
표 9
염 혼합물 조성
공급 배지의 조성은 다음과 같다: 글루코스 50%, 마그네슘 0.7%, 티아민-HCl 0.02%, Biospumex36 소포제 1%.
b) 발효 변수
유가 회분식 배지 3L를 함유하는 7L 발효기에 1.2% 접종 배양물을 접종했다. 접종물은 다음과 같이 제조했다: 2L 플라스크 중의 접종 배지 250ml에 E.콜리 균주 TEX2pir42(pXL3179)의 동결 세포 현탁액 0.25ml를 접종했다.
이 플라스크를 220rpm에서 37℃하에 24시간 동안 항온배양했다. 24시간 후, 여러 변수를 측정했다: 잔류 글루코스: 0g/l, OD600nm 2.7 및 pH 6.24. 발효 동안 pH는 NH3을 이용하여 6.9 내지 7 사이로 자동 조절했다. 온도는 37℃로 유지시키고, 용존 산소는 교반속도에 대한 반작용으로 pO2를 45%로 조정했다.
1차적으로 박테리아 균주를 약 17시간 동안 회분식 배양하고 탄소원(글루코스)이 소모된 후에, 공급 배지를 첨가했다. 글리코스와 젖산염 및 아세트산염과 같은 산은 0에 가까운 농도로 유지시켰다.
c) 결과
최종 결과는 표 10에 제시했으며, 최적 조건하에 E.콜리 TEX1(pXL3179)을 이용하여 100리터 발효기에서 생산되는 양과 비교했다.
XAC-1pir116의 경우, TEX1에서 생산되는 pXL3179의 플라스미드 카피수 측면에서 볼 때 7리터 발효기와 800리터 발효기 사이에 차이가 없었다.
최적 조건에서 E.콜리 TEX1에 의해 100리터 발효기에서 생산되는 pXL3179의 양과 E.콜리 TEX2pir42를 사용하여 7리터 발효기에서 생산되는 플라스미드 pXL3179의 양을 비교했다. 그 결과, XAC-1pir116(실시예 5.3 참조)에서와 마찬가지로, TEX1에서는 7리터, 100리터, 또는 800리터 발효기에서 안정된 플라스미드 생산 속도가 관찰되었다.
표 10: pXL3179를 함유하는 TEX1 및 TEX2pir42 균주의 발효 특성
참조번호 발효시간(h) 최종OD(600nm) 세포 건조 중량 DNA 농도(mg/l) 추정 카피수(카피/박테리아)
TEX1(pXL3179) OpGen090 43.00 104 33.1 96 616-627
TEX2pir42(pXL3179) Op1328S5 48.47 72 72 205 1896-1904
TEX1과 비교했을 때 TEX2pir42에서는 박테리아당 플라스미드 pXL3179의 카피수가 3배 이상 많았다.
각각 다른 발효 시점에 해당하는 플라스미드를 동생체량(OD 600nm 근거)의 박테리아로부터 추출하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분석했다. 도 21은 발효 기간에 따른 플라스미드 카피수 증가를 분명하게 보여준다. 또한, 도 21은 Op1328S5 TEX2pir42에서 생산되는 pXL3179 플라스미드 지형이 거의 대부분 단량체 형태임을 보여준다.
결론적으로, 본 발명에 따른 E.콜리 숙주 균주 TEX2pir42는 pCOR 플라스미드, 예컨대 pXL3179의 플라스미드 카피수가 실험실 규모 및 발효기에서 TEX1과 비교했을 때 TEX2pir42에서 2 내지 5배의 예상치못한 증가를 제공했다. 또한, 플라스미드 카피수가 크게 증가한 반면, 이와 같이 생산된 플라스미드는 실험실 규모에서 뿐만 아니라 공업적 생산에 비견되는 대량 규모(7리터 발효기)에서도 단량체 지형을 보였다.
실시예 13: 신규 형광성 기반 선별 방법으로 확인되는 pir116의 새로운 카피수증가 돌연변이체
박테리아 숙주 세포에서 pCOR 플라스미드 카피수를 증가시키고자, pir 유전자의 카피수 변이된 변형체를 암호하는 pir116 유전자를 돌연변이시켰다. pCOR의 구체예들과 같이 지금까지 R6K 유래 플라스미드의 카피수를 증가시키는 돌연변이는 pir 유전자내에서 이루어진 것이다.
PCR에 의한 랜덤 돌연변이유발 후, 돌연변이된 pir116 유전자를 하기 기술되는 cobA 리포터 유전자를 함유하는 pCOR 벡터에 도입시켰다. 형광성 기반 선별 후, 선발된 돌연변이체 플라스미드의 카피수와 지형을 평가했다. 플라스미드 카피수를 증가시키는 pir116 유전자의 3가지 다른 돌연변이체를 수득했다. 이러한 신규 돌연변이체는 종래 개시된 바 없는 것이다.
고전적인 카피수 돌연변이체의 선별 방법은 항생제 내성을 기반하는 방법이다. 이 방법에서는 숙주 박테리아의 항생제에 대한 내성의 수준이 세포내 플라스미드에 존재하는 항생제 내성 유전자의 카피수의 함수이다. 플라스미드의 카피수 및 이에 따른 항생제 내성 유전자가 증가함에 따라 항생제 내성의 수준도 증가한다. 하지만, 이 방법은 pir116 돌연변이를 함유하는 숙주 세포에서의 R6K 유래 플라스미드에는 적용할 수 없었는데, 그 이유는 이들 세포의 플라스미드 기본 카피수가 너무 높기 때문이다(약 400카피/세포). 따라서, pir116 유전자의 카피수 증가 돌연변이를 확인하기 위해 형광성을 기반으로 하는 새로운 선별 방법을 개발했다.
이러한 신규 방법을 위해, 플라스미드 카피수 증가를 모니터하는 단순한 수단을 제공하기 위하여, pCOR 벡터에 cobA 유전자를 도입시켰다. cobA 유전자는 슈도모나스 데니트리피칸스로부터 수득했다(Crouzet et al., J. Bacteriol, 172:5968-79(1990)). 이 유전자는 유로젠 III 분자에 2개의 메틸기를 첨가하는 비타민 B12 경로의 효소인 유로III 메틸트란스퍼라제를 암호한다. E.콜리에서 과잉발현되면 cobA는 근자외선광에서 형광성인 적색 산물을 축적시킨다. UV에 노출되면 이 유전자를 과잉발현하는 박테리아 콜로니는 핑크에서 적색으로 변한다. 이 유전자가 pCOR계에서 플라스미드 카피수에 대한 리포터 유전자로서 작용할 수 있는지 측정하기 위해 조사했다.
먼저, UV광에 노출된 형질전환된 박테리아의 형광성 수준과 플라스미드 카피수 간의 관계를 평가하기 위해, 자신의 프로모터는 결실시키고 cobA를 함유하는 대조 플라스미드(pXL3767)를 작제했다. 이 플라스미드로 3가지 다른 숙주 균주(XAC1pir, XAC1pir116 및 TEX1pir42)를 형질전환시켰다. 이 균주는 XAC1pir에서의 pCOR 플라스미드 평균 카피수가 1이고 TEX1에서는 약 5 내지 10배 높고, TEX1pir42에서는 15 내지 30배 더 높은 결과를 보여주는 종래 실험을 기반으로 선발했다.
재조합 콜로니를 M9 최소 배지에 스트리킹하고 도 22에 도시한 바와 같은 투시장치에서 UV광에 노출시켰다. 그 결과, 각 콜로니의 형광성 강도가 플라스미드 카피 수에 정(+)의 상관성이 있어서, XAC1pir116은 XACpir 보다 형광성이 더 크고, TEX1pir42는 XAC1pir116 보다 형광성이 더 큰 것을 관찰했다.
도 22에 도시된 결과는 이러한 형광성 기반 분석법이 조사된 플라스미드 카피수 사이, 특히 균주 TEX1 및 TEX1pir42에서 관찰되는 플라스미드 카피수 사이를 쉽게 구별하는 방법임을 입증한다. 즉, 이 분석에서 관찰되는 적색 형광성 강도는 플라스미드 pCOR-cobA 카피수에 따라 증가했다.
형광성과 cobA 카피수 사이의 정(+)의 상관성을 입증한 후, 선별을 위해 돌연변이된 pir116 유전자를 도입시킨 플라스미드를 작제했다. 도 23에 도시한 바와 같이 구성 모듈이 여러 조합인 4개의 플라스미드를 작제하고 시험했다. 이러한 플라스미드 중 하나는 pir116과 pir116pir42 동질유전자 균주를 형질전환시켰을 때 상당히 다른 형광성 수준을 나타냈다. 이러한 플라스미드를 pXL3830이라 부르고 도 24의 일부로 제시했다.
선별과 평가 실험에는 대조용 플라스미드를 사용했다. 그 하나는 "야생형" pir116을 함유하는 기준 농도의 대조용 플라스미드 pXL3830으로서, 형광성 기준 농도 설정에 사용했다. 다른 하나는 pXL3830과 비교했을 때 4 내지 6배의 플라스미드 카피수 증가를 제공하는 이중 돌연변이 pir116-pir42를 함유하는 pXL3795로서 양성 대조군으로서 사용했다.
다양화 PCR 랜덤 돌연변이유발 키트(BD Biosciences Clontech, US, CA, Palo Alto)를 사용하여 pir116 유전자에 대해 랜덤 돌연변이유발을 수행했다. 염기쌍 1000개 당 평균 2개의 돌연변이가 도입된 "조건 1"을 사용했다. "조건 1"을 사용하여 진행된 예비 실험은 12개 돌연변이체의 서열분석 결과 실제로 pir116 유전자에 약 2개의 돌연변이가 일어난 돌연변이율을 나타냄을 확인했다. pir116 유전자는 올리고뉴클레오타이드 C8832(5'-CTTAACGGCTGACATGGGAATTC-3')(서열 23) 및 C8833 (5'-CGATGGGCGAGCTCCACCG-3')(서열 24)를 이용하여 EcoRI-SstI 단편으로서 증폭시켰다. EcoRI 및 SstI으로 절단한 후, pir116을 함유하는 돌연변이된 단편을 "야생형" pir116 유전자 대신에 pXL3830에 클로닝시켰다.
돌연변이된 pir116("pir116*")을 운반하는 플라스미드를 이용하여 pCOR 숙주 XAC1pir116의 모균주인 E.콜리 균주 XAC-1를 형질전환시켰다. UV광하에서 형광성 증가를 나타내는 형질전환체를 선별하고 XAC1(pXL3830) 및 XAC1(pXL3795) 대조군과 비교했다. 이중 평판은 후속 돌연변이를 최소화하기 위해 UV에 노출시키지 않았다. UV광 하에서 선발된 대표적인 선별 평판은 도 25에 제시했다.
다음의 공정도는 선별 실험의 결과를 요약 정리한 것이다.
리포터 유전자 coba를 함유하는 pCOR 플라스미드 상의 pir(pi 단백질)에 대한 랜덤 돌연변이유발
↓
2200개 클론이 시험됨
↓
24개 후보
↓
16개가 pir*의 플라스미드 카피수/지형/서열분석으로 확인되고 평가됨(겔)
↓
최상의 3개가 추가 연구에 선발됨
선발된 3개의 돌연변이체에 대한 평가결과는 도 26에 요약정리했다. 각 돌연변이체는 pir116 플라스미드와 비교했을 때 카피수의 증가를 나타냈다. 돌연변이체 114C와 100B의 경우에 플라스미드는 대부분 단량체 형태였다. 이러한 결과는 돌연변이체 201C와 같이 증가된 카피수와 높은 다량체 함량을 보유한 pir116pir42 플라스미드에 비해 장점일 수 있다.
각 돌연변이체의 pir116* 유전자를 서열분석했다. 각 클론에는 pir116 ORF에 비동일코드성의 단일 돌연변이가 함유되어 있었다. 이러한 돌연변이 3개는 모두 DNA 결합에 관여하는 pi 단백질의 C 말단에 영향을 미친다. 이러한 돌연변이에 대해서는 종래 개시된 바가 전혀 없다.
플라스미드 시스템에서 선별을 통해 검출되면, 그 다음 생산 시스템, 즉 E.콜리 pCOR 숙주 균주의 게놈에 pir116* 유전자를 도입시켜 돌연변이를 평가했다. 이러한 평가 전략에 대해서는 도 27에 요약정리했다.
이러한 평가를 위해, 도 26에서 확인된 돌연변이들을 함유하는 E.콜리 균주 3개를 각각 pXL3179 플라스미드로 형질전환시키고, 플라스미드 카피수와 지형에 대해 평가했다. 이 실험 결과는 도 28에 제시했다. 플라스미드 카피수는 201C 돌연변이체에서만 XAC1pir116에 비해 유의적으로 증가된 것으로 관찰되었다.
실시예 14: E.콜리에서 상동성 재조합을 통한 통합 도구로서 M13 유전자 III을 보유한 미니서클
1. 자살 벡터
E.콜리에서 이중 상동성 재조합에 의한 유전자 치환은 자살 벡터의 사용을 필요로 한다. 이 벡터들은 작제되어 이 벡터를 복제할 수 있는 숙주에서 생산되며, 이어서 이 벡터를 복제할 수 없는 숙주의 염색체로 재조합되는데 사용된다.
박테리오파지 M13은 rep 돌연변이체(Metcalf, W., W.Jiang, et al., Gene 138:1-7(1994)) 또는 M13 mp8 내지 11이 사용되는 경우에는 E.콜리의 비억제인자 균주(Blum, P. et al., J. Bacteriol., 171:538=46(1989))에서 사용될 수 있는 매우 유용한 유전자 도구이다. 하지만, 작제, 삽입 크기 및 불안정성 측면에서 임의의 문제점이 종종 나타난다. R6K 감마 DNA 복제 오리진을 운반하는 플라스미드는 공지된 자살 벡터(Miller, V. and J. Mekalanos, J.Bacteriol., 170:2575-83(1988))이지만, pi 단백질을 발현하여 상기 플라스미드의 복제가 일어나는 E.콜리 균주의 변형에는 유용하지 않다.
따라서, 신규의 역선택성 마커를 이용하여 보편적인 자살 벡터를 유전자조작하여, pir116 유전자의 돌연변이체(pir116*)가 상동성 재조합에 의해 박테리아 게놈에 삽입된 E.콜리 균주 작제에 사용했다. 여기에 제시된 전략은 돌연변이체 114C에 대해 실험되었지만, 다른 pir116* 돌연변이체를 보유하는 균주의 생산에도 사용된 바 있다.
2. 역선택성 마커
2차 재조합 사건이 진행된 박테리아의 선발에는 여러 마커가 사용될 수 있다. 이러한 사건은 이러한 마커의 상실을 유도하고, 몇몇 경우에는 염색체와 자살 벡터 사이의 재조합 후 유전자 치환을 일으키기도 한다. 예를 들어, SacB 유전자를 발현하는 박테리아가 슈크로스 함유 배지에 평판배양되면 바실러스 유래의 SacB 유전자에게 치명적 결과가 초래된다(Ried, J.L. and A. Collmer, Gene 57:239-46(1987)). 다른 예로서, 테트라사이클린 내성 유전자는 푸사르산에 대한 감수성을 부여한다(Bochner, B.R., et al., J.Bacteriol. 143(2): 926-3(1980)). 박테리오파지 M13에 의한 감염은 세정제 데옥시콜레이트에 대한 감수성을 부여한다(Blum, P., et al., J.Bacteriol. 161:538-46(1989)).
일부 E.콜리 균주에서는 효능 부족으로 인해, 이중 재조합체 선발을 위하여 정(+)의 선발법이 개발되었다. 박테리오파지 M13 유래의 유전자 III이 역선발성 마커로서 평가되었다. 이 유전자는 입자의 감염성을 담당하는 소량의 비리온 성분을 암호한다. 다중카피 플라스미드 pBR322로부터 과잉발현될 때, 유전자 III은 박테리아 막에 유전자 III 단백질을 삽입시켜 세포에 데옥시콜레이트 감수성을 부여한다(Boeke, J.D. et al., Mol Gen Genet 186:185-92(1982)). 하지만, 이 유전자가 E.콜리의 게놈에 단일 카피로 존재할 때 유효한 역선발성 마커로서 사용될 수 있는지에 대해서는 보고된 바가 전혀 없다. 따라서, 미니서클 자살 벡터를 이용하여 이 가설을 시험했다.
3. M13 유래의 유전자 III의 결실 형태의 PCR 증폭
작제되는 미니서클 벡터의 크기를 감소시키기 위하여, 데옥시콜레이트에 대한 감수성을 부여할 수 있는 유전자 III의 결실 형태(유전자 III')(Boeke, J.D., P.Model, et al., Mol Gen Genet 186:185-92(1982))를 선택했다. M13mp18 유래의 상기 유전자의 프로모터(Yanisch-Perron, C., J. Vieira, et al., Gene 33:103-19(1985))와 함께, BglII-XhoI 단편으로서 PCR 증폭시켰다(도 29 참조).
사용된 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
증폭된 단편은 T-A 클로닝에 의해 pGEMT-easy(Promega Corporation, USA, WI, Madison)에 클로닝하여 pXL4230을 제조했다(도 29). 삽입체의 뉴클레오타이드 서열은 진뱅크 기탁 번호 VB0018에 기술된 서열과 일치하는 것으로 밝혀졌다. pXL4230은 E.콜리 균주 DH10B(Invitrogen)에 형질전환되었을 때 데옥시콜레이트에 대한 감수성을 부여하여, 예상한 바와 같이 기능성임을 시사했다.
4. 미니서클 기반 자살 벡터
미니서클 플라스미드는 어떠한 복제 오리진을 함유하지 않기 때문에 보편적 자살 벡터로서 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상, 1차 상동성 재조합 사건의 선발을 위해 카나마이신 내성 유전자와 같은 선택성 마커가 첨가되어야 한다. 또한, 2차 재조합 사건이 일어나지 않은 박테리아의 역선발을 위해 유전자 III'를 상기 미니서클 벡터에 첨가했다. 이러한 재조합을 위한 미니서클 제조에 사용되는 플라스미드의 작제는 도 29에 도시했다.
미니서클은 박테리오파지 람다 인테그라제 유도 후 pXL4235와 같은 플라스미드로부터 이 플라스미드 상의 attP와 attB 사이에 재조합을 일으켜 제조했다(Darquet, A. M et al. , Gene Ther 4 (12): 1341-9(1997)). 이 재조합효소는 미국 특허출원 09/981,803에 기술된 E.콜리 균주 G6264에서 아라비노스 의존적 방식으로 PBAD의 조절하에 발현된다. 그 결과 얻어지는 미니서클에는 attL, 정제에 유용한 TH(3중 나선) 형성 서열, 선택성 마커 Tn903 카나마이신 내성 유전자, 역선택성 마커 유전자 III' 및 상동성 재조합을 위한 당해의 단편이 pXL4235의 다중 클로닝 부위에 클로닝되어 있다(도 29).
일 예로서, pir116의 카피수 증가 돌연변이를 발현하는 E.콜리 균주 제조에 사용된 작제물은 도 30에 제시했다. 이 균주는 pCOR 플라스미드 생산에 사용될 수 있다(Soubrier, F. et al., Gene Ther 6: 1482-1488 (1999)). pir과 박테리아 게놈 사이에는 상동성이 전혀 없기 때문에 pir116* 서열은 β-D-글루쿠로니다제를 암호하는 E.콜리 염색체 uidA 유전자에 삽입되었다. 이 유전자는 상동성 재조합이 일어날 수 있도록 E.콜리 게놈과 충분한 서열 유사성을 제공한다.
미니서클 정제 및 재조합의 프로토콜은 다음과 같이 실시되었다. 플라스미드 pXL4256(도 30)을 사용하여 E.콜리 균주 G6264를 형질전환시켜 G6656을 제조했다. 앰피실린(100mg/l)이 보충된 LB 배지 50ml에 G6656의 하룻밤 배양물 0.5ml을 접종하고 200rpm의 진탕하에 600nm에서의 광학밀도가 0.7에 도달할 때까지 37℃에서 항온배양했다. 미니서클 생산은 배지에 10% 아라비노스 멸균 용액 250㎕를 첨가하여 유도시켰다. 200rpm하에 37℃에서 30분간 배양한 후, 총 플라스미드 DNA를 위저드 플러스 미니프렙스 DNA 정제 시스템(Promega Corporation, USA, WI, Madison)을 사용해 추출했다.
플라스미드 DNA 제조물 6㎍을 0.8% 아가로스 정제용 겔에 장입시켰다. 분자량 표준물질로는 슈퍼코일형 DNA 래더(Promega Corporation, USA, WI, Madison)를 사용했다. 50V에서 하룻밤 동안 전기영동한 후, 슈퍼코일형 미니서클 작제물(5.1kb)을 추출하고 SV 겔 정제 키트를 사용하여 겔로부터 정제했다(Promega Corporation, USA, WI, Madison).
5. 미니서클 4256(uidA::pir116 * 미니서클 자살 벡터)을 이용한 이중 상동성 재조합
균주 작제를 위한 재조합 단계 및 이에 대응하는 표현형을 도 31에 설명했다.
제1 재조합 사건(통합)을 위하여, pCOR 숙주의 모균주인 E.콜리 균주 XAC1(Normanly, J et al., Proc Natl Acad Sci USA 83: 6548-52 (1986))에 정제된 미니서클 4256을 각각 0.2㎕, 1㎕ 및 5㎕ 전기침투시켰다. 37℃에서 하룻밤 항온배양한 후 카나마이신(50mg/l)이 보충된 LB 아가에서 카나마이신 내성 콜로니를 수득했다.
재조합되지 않은 pXL4256 오염물을 함유할 가능성이 있는 콜로니 수를 측정하기 위하여, 50개의 KmR 콜로니를 카나마이신 또는 앰피실린이 보충된 LB 아가에 병렬로 스트리킹했다. 50개 중 4개 만이 카나마이신 및 앰피실린 내성이었고, 플라스미드 제한 분석 결과 재조합되지 않은 pXL4256을 함유하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 전기침투에 의해 수득되는 50개 콜로니 중 46개가 사실상 미니서클 4256 통합체임을 시사한다.
제2 재조합 사건(절제)을 위해, 46개의 KmR 통합체를 모두 새로 제조한 1.5% 소듐 데옥시콜레이트("Doc"; Sigma)를 함유하는 LB 아가 평판에서 분리하여 37℃에서 하룻밤 동안 항온배양했다. 각 통합체 마다 데옥시콜레이트 내성(DocR) 콜로니는 몇 개(1 내지 15개)만이 수득되었다(도 32). 이러한 결과는 제2 재조합 사건과 같은 비교적 드문 사건의 선발 결과와 일치하였다. 15개 통합체로부터 수득되는 100개의 DocR 콜로니를 1.5% Doc 함유 LB 아가 및 카나마이신 함유 LB 아가에 대등하게 점적하여 DocR 및 KmS 이중 재조합체를 선별했다. 선별된 콜로니 중 86%는 KmS로서, 이 콜로니들이 자살 벡터를 상실했음을 시사했다.
대립유전자 치환을 선별하기 위해, 염색체 uidA 유전자좌를 PCR로 증폭시켰다. 대립유전자 치환이 일어난 경우에 예상되는 PCR 단편은 1.3kb이다. 야생형 uidA 유전자좌, 즉 통합된 pir116* 돌연변이가 없는 단편 크기는 0.85kb이다. 도 33의 패널 A에 제시된 결과는 대립유전자 치환이 이중 재조합체의 30%에서 발생했음을 시사한다. 이 클론들은 UidA-(베타 글루쿠로니다제 -)이고 Xgluc이 보충된 LB 아가에서 백색 콜로니를 제공하기 때문에 표현형 분석에 의해서도 상기 결과를 확인할 수 있었다.
상동성 재조합 부위에 근접한 영역에 있어서의 박테리아 게놈의 통합은 2개의 독립된 재조합체를 가지고 PCR로 조사했다. 제1 프라이머(seq6113 및 seq6115)는 pir 유전자의 서열을 기반으로 하고, 제2 프라이머(seq6112 및 seq6116)는 상동성 영역 외측에 인접된 서열(uidA의 인접 5' 또는 3')을 기반으로 한 서열을 갖고 있다. XAC1 DNA는 음성 대조군으로 사용한 반면, XAC1pir116 또는 TEX1(Soubrier, F. et al., Gene Ther 6:1482-1488(1999))은 양성 대조군으로 사용했다.
PCR 프라이머에 사용된 올리고뉴클레오타이드는 다음과 같다:
Seq11088: 5'-GAGATCGCTGATGGTATCGG-3' (서열: 27)
Seq11089: 5'-TCTACACCACGCCGAACACC-3' (서열: 28)
Seq6112 : 5'-GACCAGTATTATTATCTTAATGAG-3' (서열: 29)
Seq6113 : 5'-GTATTTAATGAAACCGTACCTCCC-3' (서열: 30)
Seq6115 : 5'-CTCTTTTAATTGTCGATAAGCAAG-3' (서열: 31)
Seq6116 : 5'-GCGACGTCACCGAGGCTGTAGCCG-3' (서열: 32)
PCR 산물의 예상 크기는 프라이머 seq6112 및 seq6113을 사용할 때 0.83kb이고 프라이머 seq6114 및 seq6115를 사용할 때 0.88kb이다. 결과는 도 33의 패널 B에 제시했다. 미니서클 자살 벡터로 수득되는 2개의 이중 재조합체는 예상한 PCR 프로필을 나타냈다. 이러한 결과는 이중 상동성 재조합이 자살 벡터로서 미니서클 플라스미드를 이용하고 역선발성 마커로서 M13 유전자 III'를 이용하는 E.콜리에서 용이하게 달성될 수 있음을 입증한다. 이러한 유전자 치환 기술은 모든 미생물 유전자 배경에서 보편적으로 직접 수행될 수 있다.
<110> CENTELION <120> Circular DNA Molecule with Conditional Origin of Replication, Method for Preparing Same, and Use Thereof in Gene Therapy <130> N.94261 TJD <140> PCT/US03/32512 <141> 2003-10-14 <150> US 10/268,948 <151> 2002-10-11 <160> 39 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 389 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 1 tgtcagccgt taagtgttcc tgtgtcactg aaaattgctt tgagaggctc taagggcttc 60 tcagtgcgtt acatccctgg cttgttgtcc acaaccgtta aaccttaaaa gctttaaaag 120 ccttatatat tctttttttt cttataaaac ttaaaacctt agaggctatt taagttgctg 180 atttatatta attttattgt tcaaacatga gagcttagta cgtgaaacat gagagcttag 240 tacgttagcc atgagagctt agtacgttag ccatgagggt ttagttcgtt aaacatgaga 300 gcttagtacg ttaaacatga gagcttagta cgtgaaacat gagagcttag tacgtactat 360 caacaggttg aactgctgat cttcagatc 389 <210> 2 <211> 960 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 tatacagaat gatgaggttt ttttatgaga ctcaaggtca tgatggacgt gaacaaaaaa 60 acgaaaattc gccaccgaaa cgagctaaat cacaccctgg ctcaacttcc tttgcccgca 120 aagcgagtga tgtatatggc gcttgctccc attgatagca aagaacctct tgaacgaggg 180 cgagttttca aaattagggc tgaagacctt gcagcgctcg ccaaaatcac cccatcgctt 240 gcttatcgac aattaaaaga gggtggtaaa ttacttggtg ccagcaaaat ttcgctaaga 300 ggggatgata tcattgcttt agctaaagag cttaacctgc cctttactgc taaaaactcc 360 cctgaagagt tagatcttaa cattattgag tggatagctt attcaaatga tgaaggatac 420 ttgtctttaa aattcaccag aaccatagaa ccatatatct ctagccttat tgggaaaaaa 480 aataaattca caacgcaatt gttaacggca agcttacgct taagtagcca gtattcatct 540 tctctttatc aacttatcag gaagcattac tctaatttta agaagaaaaa ttattttatt 600 atttccgttg atgagttaaa ggaagagtta acagcttata cttttgataa agatggaaat 660 attgagtaca aataccctga ctttcctatt tttaaaaggg atgtgttaaa taaagccatt 720 gctgaaatta aaaagaaaac agaaatatcg tttgttggct tcactgttca tgaaaaagaa 780 ggaagaaaaa ttagtaagct gaagttcgaa tttgtcgttg atgaagatga attttctggc 840 gataaagatg atgaagcttt ttttatgaat ttatctgaag ctgatgcagc ttttctcaag 900 gtatttaatg aaaccgtacc tcccaaaaaa gctaaggggt gatatatggc taaaatttac 960 960 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 3 gaccagtatt attatcttaa tgag 24 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 4 gtatttaatg aaaccgtacc tccc 24 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 5 ctcttttaat tgtcgataag caag 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 6 gcgacgtcac cgaggctgta gccg 24 <210> 7 <211> 36 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 7 gtatatggcg cttgctctca tcgatagcaa agaacc 36 <210> 8 <211> 36 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 8 ggttctttgc tatcgatgag agcaagcgcc atatac 36 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 9 gagatcgctg atggtatcgg 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 10 tctacaccac gccgaacacc 20 <210> 11 <211> 36 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 11 cgcaattgtt aacgtccagc ttacgcttaa gtagcc 36 <210> 12 <211> 36 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 12 ggctacttaa gcgtaagctg gacgttaaca attgcg 36 <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 13 ccctctagat cgatagccat ttttactcct g 31 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 14 cgggatcctg attatgccgt gtctattag 29 <210> 15 <211> 36 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 15 cccaagcttc ttcgttagtt tctgctacgc cttcgc 36 <210> 16 <211> 35 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 16 ggtctagaac gtgaaagtgg tgaagaacaa aatcg 35 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 17 gcgacccttg tgtatcaaac 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 18 ggtattaccc ggcatgacag 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 19 gtggtggaaa tggcgatagg 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 20 gcgattttgt tcttcaccac 20 <210> 21 <211> 918 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 21 atgagactca aggtcatgat ggacgtgaac aaaaaaacga aaattcgcca ccgaaacgag 60 ctaaatcaca ccctggctca acttcctttg cccgcaaagc gagtgatgta tatggcgctt 120 gctctcatcg atagcaaaga acctcttgaa cgagggcgag ttttcaaaat tagggctgaa 180 gaccttgcag cgctcgccaa aatcacccca tcgcttgctt atcgacaatt aaaagagggt 240 ggtaaattac ttggtgccag caaaatttcg ctaagagggg atgatatcat tgctttagct 300 aaagagctta acctgctctt tactgctaaa aactcccctg aagagttaga tcttaacatt 360 attgagtgga tagcttattc aaatgatgaa ggatacttgt ctttaaaatt caccagaacc 420 atagaaccat atatctctag ccttattggg aaaaaaaata aattcacaac gcaattgtta 480 acggcaagct tacgcttaag tagccagtat tcatcttctc tttatcaact tatcaggaag 540 cattactcta attttaagaa gaaaaattat tttattattt ccgttgatga gttaaaggaa 600 gagttaatag cttatacttt tgataaagat ggaaatattg agtacaaata ccctgacttt 660 cctattttta aaagggatgt gttaaataaa gccattgctg aaattaaaaa gaaaacagaa 720 atatcgtttg ttggcttcac tgttcatgaa aaagaaggaa gaaaaattag taagctgaag 780 ttcgaatttg tcgttgatga agatgaattt tctggcgata aagatgatga agcttttttt 840 atgaatttat ctgaagctga tgcagctttt ctcaaggtat ttgatgaaac cgtacctccc 900 aaaaaagcta aggggtga 918 <210> 22 <211> 305 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 22 Met Arg Leu Lys Val Met Met Asp Val Asn Lys Lys Thr Lys Ile Arg 1 5 10 15 His Arg Asn Glu Leu Asn His Thr Leu Ala Gln Leu Pro Leu Pro Ala 20 25 30 Lys Arg Val Met Tyr Met Ala Leu Ala Leu Ile Asp Ser Lys Glu Pro 35 40 45 Leu Glu Arg Gly Arg Val Phe Lys Ile Arg Ala Glu Asp Leu Ala Ala 50 55 60 Leu Ala Lys Ile Thr Pro Ser Leu Ala Tyr Arg Gln Leu Lys Glu Gly 65 70 75 80 Gly Lys Leu Leu Gly Ala Ser Lys Ile Ser Leu Arg Gly Asp Asp Ile 85 90 95 Ile Ala Leu Ala Lys Glu Leu Asn Leu Leu Phe Thr Ala Lys Asn Ser 100 105 110 Pro Glu Glu Leu Asp Leu Asn Ile Ile Glu Trp Ile Ala Tyr Ser Asn 115 120 125 Asp Glu Gly Tyr Leu Ser Leu Lys Phe Thr Arg Thr Ile Glu Pro Tyr 130 135 140 Ile Ser Ser Leu Ile Gly Lys Lys Asn Lys Phe Thr Thr Gln Leu Leu 145 150 155 160 Thr Ala Ser Leu Arg Leu Ser Ser Gln Tyr Ser Ser Ser Leu Tyr Gln 165 170 175 Leu Ile Arg Lys His Tyr Ser Asn Phe Lys Lys Lys Asn Tyr Phe Ile 180 185 190 Ile Ser Val Asp Glu Leu Lys Glu Glu Leu Ile Ala Tyr Thr Phe Asp 195 200 205 Lys Asp Gly Asn Ile Glu Tyr Lys Tyr Pro Asp Phe Pro Ile Phe Lys 210 215 220 Arg Asp Val Leu Asn Lys Ala Ile Ala Glu Ile Lys Lys Lys Thr Glu 225 230 235 240 Ile Ser Phe Val Gly Phe Thr Val His Glu Lys Glu Gly Arg Lys Ile 245 250 255 Ser Lys Leu Lys Phe Glu Phe Val Val Asp Glu Asp Glu Phe Ser Gly 260 265 270 Asp Lys Asp Asp Glu Ala Phe Phe Met Asn Leu Ser Glu Ala Asp Ala 275 280 285 Ala Phe Leu Lys Val Phe Asp Glu Thr Val Pro Pro Lys Lys Ala Lys 290 295 300 Gly 305 <210> 23 <211> 23 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 23 cttaacggct gacatgggaa ttc 23 <210> 24 <211> 19 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 24 cgatgggcga gctccaccg 19 <210> 25 <211> 29 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 25 ggcagatctt aaaccgatac aattaaagg 29 <210> 26 <211> 36 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 26 ccgctcgagt tacgattggc cttgatattc acaaac 36 <210> 27 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 27 gagatcgctg atggtatcgg 20 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 28 tctacaccac gccgaacacc 20 <210> 29 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 29 gaccagtatt attatcttaa tgag 24 <210> 30 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 30 gtatttaatg aaaccgtacc tccc 24 <210> 31 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 31 ctcttttaat tgtcgataag caag 24 <210> 32 <211> 24 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 32 gcgacgtcac cgaggctgta gccg 24 <210> 33 <211> 12 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 33 agaaaaaaag ga 12 <210> 34 <211> 12 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 34 tctttttttc ct 12 <210> 35 <211> 14 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 35 aagaaaaaaa agaa 14 <210> 36 <211> 14 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 36 ttcttttttt tctt 14 <210> 37 <211> 12 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 37 tctttttttc ct 12 <210> 38 <211> 14 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 38 ttcttttttt tctt 14 <210> 39 <211> 17 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 39 aaaaaaggga ataaggg 17

Claims (49)

  1. 원핵생물 재조합 숙주 세포에서의 기능에, 이 숙주 세포에 외래인 복제 개시 단백질을 필요로 하는 조건성 복제 오리진 및 이종의 치료 유전자를 함유하는 염색체외 DNA 분자 및 조건성 복제 오리진을 활성화시키는 이종의 복제 개시 단백질을 함유하는 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  2. 제1항에 있어서, 조건성 복제 오리진이 박테리아 플라스미드이거나 박테리오파지에서 유래되는 것인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  3. 제2항에 있어서, 조건성 복제 오리진이 R2K, R6K, R1, pSC101, Rts1, F, RSF1010, P1, P4, 람다, Phi82 또는 Phi80에서 유래되는 것인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  4. 제3항에 있어서, 조건성 복제 오리진이 박테리아 플라스미드 R6K에서 유래되는 것인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  5. 제4항에 있어서, 숙주 세포가 추가로 암버 돌연변이를 함유하는 유전자를 포함하는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  6. 제1항에 있어서, 이종의 복제 개시 단백질이 유전자 pir116에 의해 암호되는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  7. 제6항에 있어서, 숙주 세포가 유전자 endA에 결손이 있는 것인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  8. 제7항에 있어서, 숙주 세포가 유전자 traD에 결손이 있는 것인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  9. 제8항에 있어서, 숙주 세포가 TEX1인 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  10. 제9항에 있어서, 숙주 세포가 추가로 돌연변이된 recA 유전자를 포함하는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  11. 제10항에 있어서, 이종의 복제 개시 단백질이 pir116pir42에 의해 암호되는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  12. 제11항에 있어서, 복제 개시 단백질이 서열 21에 기술된 서열에 의해 암호되는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  13. 제11항에 있어서, 숙주 세포가 TEX2pir42인 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  14. 원핵생물 숙주 세포에서의 기능에 이 숙주 세포에 외래인 복제 개시 단백질을 필요로 하는 조건성 복제 오리진 및 이종의 치료 유전자를 함유하는 플라스미드의 생산방법으로서,
    a) 생산될 플라스미드를 함유하는 TEX2pir42를 배양하는 단계; 및
    b) 상기 플라스미드를 분리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 생산방법.
  15. 제14항에 있어서, 복제 오리진이 서열 1을 함유하는 것이 특징인 생산방법.
  16. 제15항에 있어서, 플라스미드가 추가로 항생제 내성을 부여하지 않는 선택 유전자를 포함하는 것이 특징인 생산방법.
  17. 제16항에 있어서, 선택 유전자가 특정 코돈에 대한 억제인자 전사 RNA를 암호하는 것인 생산방법.
  18. 제17항에 있어서, 선택 유전자가 암버 전사 RNA의 억제인자이고, 숙주 세포가 추가로 암버 돌연변이를 함유하는 유전자를 포함하는 것인 생산방법.
  19. 원핵생물 재조합 숙주 세포에서의 기능에 pi 단백질을 필요로 하는 조건성 복제 오리진 및 이종의 치료 유전자를 함유하는 염색체외 DNA 분자 및 pi 단백질을 암호하는 이종의 pir 유전자를 포함하는 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  20. 제19항에 있어서, 이종의 pir 유전자가 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 것인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  21. 제20항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이가 카피 조절 영역 및/또는 DNA 결합 영역, 및/또는 류신 지퍼유사 모티프, 또는 단백질 Π의 다른 영역을 암호하는 pir 유전자의 동일 암호 영역 또는 다른 암호 영역에 존재하는 것이 특징인, 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  22. 제20항에 있어서, 이종의 pir 유전자가 카피수 조절 영역 및 류신 지퍼 유사 모티프에 돌연변이를 함유하는 것이 특징인, 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  23. 제22항에 있어서, 추가로 pir 유전자 DNA 결합 영역에 돌연변이를 함유하는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  24. 제20항에 있어서, 이종의 pir 유전자가 카피수 조절 영역 및 DNA 결합 영역에 돌연변이를 함유하는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  25. 제20항에 있어서, 이종의 pir 유전자가 DNA 결합 영역 및 류신 지퍼 유사 모티프에 돌연변이를 함유하는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  26. 제19항에 있어서, 이종의 pir 유전자가 플라스미드에 존재하는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  27. 제19항에 있어서, 이종의 pir 유전자가 숙주 세포의 게놈에 존재하는 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  28. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 유전자 endA 결손형인 것이 특징인, 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  29. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 유전자 traD 결손형인 것이 특징인, 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  30. 제20항에 있어서, 숙주 세포가 추가로 돌연변이된 recA 유전자를 함유하는 것이 특징인, 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  31. 원핵생물 숙주 세포에서의 기능에, 이 숙주 세포의 외래 복제 개시 단백질을 필요로 하는 조건성 복제 오리진과 이종의 치료 유전자를 함유하는 플라스미드 생산방법으로서,
    (a) 제20항에 기재된 원핵생물 재조합 숙주 세포를 플라스미드 생산 조건하에서 배양하는 단계; 및
    (b) 플라스미드를 분리하는 단계를 포함하는 것이 특징인 플라스미드 생산방법.
  32. 제31항에 있어서, 플라스미드가 추가로 항생제 내성을 부여하지 않는 선택 유전자를 함유하는 것이 특징인 플라스미드 생산방법.
  33. 제32항에 있어서, 선택 유전자가 특정 코돈에 대한 억제인자 전사 RNA를 암호하는 것인 플라스미드 생산방법.
  34. 제33항에 있어서, 선택 유전자가 암버 전사 RNA의 억제인자이고 숙주 세포가 추가로 암버 돌연변이를 함유하는 유전자를 포함하는 것이 특징인 플라스미드 생산방법.
  35. (a) 표적 서열에 적어도 하나의 돌연변이를 도입시키는 단계;
    (b) 이와 같이 돌연변이된 표적 서열로, 유로III 메틸트란스퍼라제를 암호하는 뉴클레오타이드 서열을 함유한 플라스미드를 포함하고 이 플라스미드의 카피수가 상기 표적 서열에 의해 영향을 받는 숙주 세포를 형질전환시키는 단계;
    (c) 상기 뉴클레오타이드 서열이 발현되는 조건하에서 상기 숙주 세포를 증식시켜 숙주 세포 배양물을 생산하는 단계;
    (d) 이러한 숙주 세포 배양물을 UV광에 노출시키는 단계; 및
    (e) 숙주 세포 배양물에서 생성되는 형광성을 검측하는 단계를 포함하는, 플라스미드 카피수증가 돌연변이 측정방법.
  36. 제35항에 있어서, 뉴클레오타이드 서열이 슈도모나스 디니트리피칸스(Psuedomonas denitrificans) 유래의 cobA 유전자인 것이 특징인 플라스미드 카피수증가 돌연변이 측정방법.
  37. 제35항에 있어서, 추가로 단계 (e)에서 측정된 형광성을 비돌연변이성 표적 서열을 함유하는 숙주 세포 배양물에서 생성되는 형광성과 비교하는 단계를 포함하는 것이 특징인, 플라스미드 카피수증가 돌연변이 측정방법.
  38. 하나 이상의 돌연변이를 함유하는 이종의 pir 유전자 함유 플라스미드.
  39. 제38항에 있어서, 하나 이상의 돌연변이가 카피 조절 영역 및/또는 DNA 결합 영역, 및/또는 류신 지퍼유사 모티프, 및/또는 단백질 Π의 다른 영역을 암호하는 pir 유전자의 동일 암호 영역 또는 다른 암호 영역에 존재하는 것이 특징인, 플라스미드.
  40. 제38항에 있어서, 이종의 pir 유전자가 카피수 조절 영역 및 류신 지퍼 유사 모티프에 DNA 돌연변이를 함유하는 것이 특징인, 플라스미드.
  41. 제40항에 있어서, 추가로 pir 유전자 DNA 결합 영역에 돌연변이를 함유하는 것이 특징인 플라스미드.
  42. 제38항에 있어서, 이종의 pir 유전자가 카피수 조절 영역 및 DNA 결합 영역에 돌연변이를 함유하는 것이 특징인 플라스미드.
  43. 제38항에 있어서, 이종의 pir 유전자가 DNA 결합 영역 및 류신 지퍼 유사 모티프에 돌연변이를 함유하는 것이 특징인 플라스미드.
  44. 제24항에 있어서, DNA 결합 영역의 돌연변이가 114C 돌연변이인 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  45. 제24항에 있어서, DNA 결합 영역의 돌연변이가 100B 돌연변이인 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  46. 제24항에 있어서, DNA 결합 영역의 돌연변이가 201C 돌연변이인 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  47. 제42항에 있어서, DNA 결합 영역의 돌연변이가 114C 돌연변이인 것이 특징인 원핵생물 재조합 숙주 세포.
  48. 제42항에 있어서, DNA 결합 영역의 돌연변이가 100B 돌연변이인 것이 특징인 플라스미드.
  49. 제42항에 있어서, DNA 결합 영역의 돌연변이가 201C 돌연변이인 것이 특징인 플라스미드.
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Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7038026B2 (en) 2000-05-26 2006-05-02 Centelion Purification of a triple heli formation with an immobilized oligonucleotide
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US7279313B2 (en) * 1995-09-15 2007-10-09 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
FR2822476B1 (fr) * 2001-03-23 2004-04-02 Aventis Pharma Sa Procedes de purification et de detection de sequences cibles d'adn double brin par interaction triple helice
EP1737945B1 (en) 2004-04-19 2011-01-26 Aventis Pharma S.A. Method for purifying plasmid dna
JP4581851B2 (ja) * 2004-07-27 2010-11-17 セイコーエプソン株式会社 電気光学装置の駆動回路及び駆動方法、電気光学装置並びに電子機器
FR2920158B1 (fr) 2007-08-24 2010-03-12 Centre Nat Rech Scient Production de plasmides et expression de proteines recombinantes dans des cellules cultivees sans antibiotiques
EP2221066A1 (en) 2009-02-18 2010-08-25 Sanofi-Aventis Use of VgII3 activity modulator for the modulation of adipogenesis
EP2471909A1 (en) * 2010-12-30 2012-07-04 SIRION BIOTECH GmbH Nucleic acid molecules for generating adenoviral vectors
JP5863338B2 (ja) 2011-08-25 2016-02-16 株式会社東芝 プラスミド型ベクター、遺伝子プロモーター活性の検出方法、及びアッセイキット
AU2013309488A1 (en) 2012-08-29 2015-03-05 Nature Technology Corporation DNA plasmids with improved expression
WO2014077863A1 (en) 2012-11-19 2014-05-22 Nature Technology Corporation Replicative minicircle vectors with improved expression
ES2739288T3 (es) 2013-09-13 2020-01-30 California Inst Of Techn Recuperación selectiva
JP6262877B2 (ja) * 2014-11-18 2018-01-24 国立研究開発法人科学技術振興機構 環状ｄｎａの増幅方法
JP7014721B2 (ja) 2015-09-18 2022-02-01 ディーエヌエーアールエックス インビボでの核酸発現のためのシステム及び方法
AU2016366549B2 (en) 2015-12-11 2022-11-10 California Institute Of Technology Targeting peptides for directing adeno-associated viruses (AAVs)
JP2020511521A (ja) * 2017-03-23 2020-04-16 ディーエヌエーアールエックス ｉｎ ｖｉｖｏでの核酸発現のためのシステム及び方法
EP3768846B1 (en) 2018-03-21 2023-06-21 Aldevron, L.L.C. Viral and non-viral nanoplasmid vectors with improved production
KR102520700B1 (ko) * 2018-07-30 2023-04-10 오리시로 제노믹스 가부시키가이샤 무세포계에서 dna를 편집하는 방법
CN113396221A (zh) * 2019-01-18 2021-09-14 詹森生物科技公司 作为非抗生素选择标记的β-半乳糖苷酶α肽及其用途
WO2023069895A1 (en) * 2021-10-18 2023-04-27 Modernatx, Inc. Markerless dna production
WO2023241567A1 (zh) * 2022-06-13 2023-12-21 南京金斯瑞生物科技有限公司 一种可提高无筛选标签质粒制备效率的野生型-突变体π蛋白切换表达系统

Family Cites Families (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4190495A (en) * 1976-09-27 1980-02-26 Research Corporation Modified microorganisms and method of preparing and using same
US4727028A (en) * 1981-06-22 1988-02-23 Eli Lilly And Company Recombinant DNA cloning vectors and the eukaryotic and prokaryotic transformants thereof
US4654307A (en) 1983-02-17 1987-03-31 The Research Foundation Of State University Of New York Novel bacteria containing a plasmid having a tRNA code
US4761367A (en) 1984-11-07 1988-08-02 The University Of North Carolina At Chapel Hill Vectors suitable for detection of eukaryotic DNA regulatory sequences
US5859208A (en) 1988-07-06 1999-01-12 Fiddes; John C. Human basic fibroblast growth factor analog
US5198343A (en) * 1986-08-05 1993-03-30 Transgene, S.A. Method for expressing a heterologous protein in a dapD- mutant of E. coli and the strain obtained
US5510099A (en) 1987-05-01 1996-04-23 Stratagene Mutagenesis testing using transgenic non-human animals carrying test DNA sequences
RU2107725C1 (ru) * 1989-02-24 1998-03-27 Монсанто Компани Способ модификации фрагмента днк, кодирующего инсектицидный белок bacillus thuringiensis, фрагмент днк, кодирующий инсектицидный белок bacillus thuringiensis (варианты), фрагмент днк, содержащий структурный ген, кодирующий инсектицидный белок (варианты), и фрагмент днк, содержащий структурный ген, кодирующий слитый белок
US5693622A (en) 1989-03-21 1997-12-02 Vical Incorporated Expression of exogenous polynucleotide sequences cardiac muscle of a mammal
US5512463A (en) * 1991-04-26 1996-04-30 Eli Lilly And Company Enzymatic inverse polymerase chain reaction library mutagenesis
TW201794B (ko) * 1991-05-03 1993-03-11 American Cyanamid Co
US5714323A (en) 1991-08-30 1998-02-03 The University Of Medecine And Dentistry Of New Jersey Over expression of single-stranded molecules
US5444149A (en) 1992-05-11 1995-08-22 Duke University Methods and compositions useful in the recognition, binding and expression of ribonucleic acids involved in cell growth, neoplasia and immunoregulation
US5434065A (en) 1993-05-06 1995-07-18 President And Fellows Of Harvard College In vivo selection of microbial virulence genes
EP1179350A3 (en) 1993-08-12 2003-01-02 Cytotherapeutics, Inc. Encapsulated cell system for implantation into the human CNS
US5679647A (en) * 1993-08-26 1997-10-21 The Regents Of The University Of California Methods and devices for immunizing a host against tumor-associated antigens through administration of naked polynucleotides which encode tumor-associated antigenic peptides
US5700657A (en) 1993-12-13 1997-12-23 Genzyme Corporation Vectors and vector systems including genes encoding tumor suppressor proteins and producer cells transformed thereby
IL109558A (en) 1994-05-04 2004-08-31 Yissum Res Dev Co DNA structures Derived from the SV40 virus that include DNA sequences External
AU2946695A (en) 1994-07-08 1996-02-09 Schering Corporation Method for identifying nucleic acids encoding c-fos promoter activating proteins
DE4428402A1 (de) 1994-08-11 1996-02-15 Boehringer Mannheim Gmbh Gentherapeutisches Verfahren unter Verwendung von DNA-Vektoren ohne Selektionsmarker-Gen
US5792647A (en) 1995-02-13 1998-08-11 The Johns Hopkins University Bacterial catabolism of chitin
US6825012B2 (en) * 1995-02-23 2004-11-30 Gencell S.A. DNA molecules, preparation and use in gene therapy
US6254874B1 (en) 1995-04-13 2001-07-03 President And Fellows Of Harvard College Attenuated auxotrophic microorganisms having a combination of non-attenuating mutations and method for making same
JP3530676B2 (ja) * 1995-04-26 2004-05-24 キヤノン株式会社 光受容部材の製造方法、該光受容部材、該光受容部材を有する電子写真装置及び該光受容部材を用いた電子写真プロセス
US7364894B2 (en) * 1995-09-15 2008-04-29 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
US7279313B2 (en) * 1995-09-15 2007-10-09 Centelion Circular DNA molecule having a conditional origin of replication, process for their preparation and their use in gene therapy
FR2738842B1 (fr) * 1995-09-15 1997-10-31 Rhone Poulenc Rorer Sa Molecule d'adn circulaire a origine de replication conditionnelle, leur procede de preparation et leur utilisation en therapie genique
US5851808A (en) 1997-02-28 1998-12-22 Baylor College Of Medicine Rapid subcloning using site-specific recombination
US5874259A (en) 1997-11-21 1999-02-23 Wisconsin Alumni Research Foundation Conditionally amplifiable BAC vector
JP2006526592A (ja) 2003-06-05 2006-11-24 センテリオン 血管由来の欠損に関連する高コレステロール血症または糖尿病の治療のための、線維芽細胞成長因子をコードするプラスミド

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