KR20050081597A

KR20050081597A - 은행잎추출물을 유효성분으로 함유하는 발암억제효과를갖는 골다공증 치료제

Info

Publication number: KR20050081597A
Application number: KR1020040009924A
Authority: KR
Inventors: 정규혁; 오승민; 김연판
Original assignee: 한국 메디텍 제약 주식회사; 정규혁
Priority date: 2004-02-16
Filing date: 2004-02-16
Publication date: 2005-08-19
Also published as: WO2005077396A1

Abstract

본 발명은 은행잎추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증치료제에 관한 것으로 은행잎추출물은 쿠에르세틴(quercetin)과 캄페롤(kaempferol)등의 식물 에스트로겐(phytoestrogen)을 다량 포함하고 있으므로, 본 발명에 의한 은행잎추출물은 선택적 에스트로겐 수용체 조절 작용약으로 유방암 부작용이 없는 골다공증 치료제로 유용하게 사용될 수 있을 것이다.

Description

은행잎추출물을 유효성분으로 함유하는 발암억제효과를 갖는 골다공증 치료제 {Drug for osteoporosis having inhibition effect on cancer comprising ginkgo biloba extracts as the active ingredient}

본 발명은 은행잎추출물에 포함되는 식물 에스트로겐(phytoestrogen)을 유효성분으로 함유하는 골다공증 치료제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 조골세포(osteoblast)의 세포증식 촉진효과가 우수한 하기 일반식(I)로 표시되는 유도체가 포함된 은행잎추출물(이하 "MDG5031" 이라고 한다)을 유효성분으로 함유하는 골다공증 치료제에 관한 것이다.

골(骨)은 신체의 물리적 지지체로서 필요한 골량과 구조를 보존하는 역할을 하며, 칼슘(Ca²⁺)등의 보관고로서 칼슘 등의 혈중 농도 유지에 중요한 역할을 하고 있다.

이러한 기능을 수행하기 위하여 골은 항상 분해 작용과 재구축(remodeling)작용을 조정한다. 따라서 정상인 골은 골 흡수와 골 형성의 양자가 활발하게 진행되어, 대사적인 면에서 극에 다다르는 동적인 상태를 이룬다.

그러나, 골다공증(osteoporosis)은 위와 같은 정상 골 조직에서 칼슘이 감소되어 골의 치밀질이 엷어지고 그로 인해 골수강(骨髓腔)이 넓어지는 상태를 말하며, 이러한 증세가 진전될수록 골이 약해져 외부의 작은 충격에도 골절되기 쉽다. 유전적 요인, 영양섭취, 호르몬의 변화, 운동 및 생활 습관의 차이 등 여러 가지 요인들이 골량에 영향을 미치며, 노령, 운동 부족, 저체중, 흡연, 저칼슘 식이, 폐경, 난소 절제술등이 골다공증의 원인으로 알려져 있다. 한편 개인차는 있으나 골량은백인보다 흑인이 골 재흡수 수준(bone resorption level)이 낮아 더 높고, 대개 14-18세에 가장 높으며 노후에는 1년에 약 1%씩 감소한다고 한다. 특히 여성의 경우 골 감소는 30세 이후부터 지속적으로 진행되다가 폐경기에 이르면 호르몬 변화에 의해 급격히 진행된다. 즉, 폐경기에 이르면 에스트로겐 농도가 급속히 감소하여 B-임파구(B-lymphocyte)가 다량 생성되므로, 골수(bone marrow)에 B 세포 전구체(pre-B cell)가 축적이 된다. 이로 인해 IL-6의 양이 증가하여 파골세포의 활성을 증가시켜서 결국 골량이 감소하게 된다.

이와 같이 골다공증은 정도의 차이는 있지만 노년층, 특히 폐경기 이후의 여성에게는 피할 수 없는 증상이며, 선진국에서는 인구가 노령화됨에 따라 골다공증 및 그 치료제에 대한 관심이 증가하고 있다. 또한 전세계적으로는 골질환 치료와 관련하여서 약 1300억 달러의 시장을 형성하고 있고 앞으로 더욱 증가할 것으로 예상된다. 따라서 세계적인 각 연구 기관과 제약회사는 골질환 치료제 개발에 많은 투자를 하고 있다.

현재 골다공증 치료제로 사용하는 물질로는 에스트로겐(estrogen), 앤드로제닉 아나볼릭 스테로이드(androgenic anabolic steroid), 칼슘 제제, 인산염, 불소 제제, 이프리플라본(Ipriflavone), 비타민 D₃등이 있다. 또한 1995년 미국 머크사에서는 아미노비스포스포네이트(aminobisphosphonate)를, 1997년 미국 릴리사에서는 선택적인 에스트로젠 수용체 조절기(selective estrogen receptor modulator, SERM)로서의 역할을 하는 랄록시펜(raloxifen)을 골다공증에 대한 신약으로 개발하였다.

한편 종래 골다공증 치료제는 대부분 에스트로젠 계통의 물질로 장기 투여시 암, 담석, 혈전증 등의 부작용이 나타나는 것으로 알려져 있다. 그러나 골다공증은 약물의 단기 투여만으로는 치료할 수 없기 때문에 장기 투여가 필수적이다. 그러므로 개발자들은 약물을 장기 투여할 때에도 상기와 같은 부작용이 없고, 에스트로겐을 대체할 수 있을 만큼 우수한 약효를 갖는 새로운 물질을 개발하고자 한다. 현재 에스트로젠 대체 물질로 관심의 초점이 되고 있는 것 중의 하나가 바로 식물 에스트로겐(phytoestrogen)이다.

식물 에스트로겐은 1946년 베네트 등에 의해 최초로 보고 되었다. 이들은 '클로바 병(clover disease)[붉은 클로바종(red clover, Trifoloum subterraneum var. Dwalganup)에 속하는 식물을 먹은 양은 불임률이 30% 이상 증가되어, '클로바 병'이라 명명됨]'의 원인이 이 식물에 함유된 성분 중 에스트로겐과 유사한 이소플라보노이드(isoflavonoid)임을 밝혀 식물에서 얻어낸 이러한 화합물을 식물 에스트로겐이라 명명하였다.

식물 에스트로겐으로 알려진 물질로는 다이드제인(daidzein), 제니스테인(genistein) 등의 이소플라본(isoflanone)류 화합물, 쿠메스트롤(coumestrol)등의 쿠메스탄(coumestan)류 화합물, 엔테롤락톤(enteroactone)등의 리그난(ligan)계 화합물 및 엔테로디올(enterodiol)등의 페놀(phenol)계 화합물이 있다.

식물 에스트로겐은 일반적으로 동물의 에스트로겐과 유사한 작용을 나타내기 때문에, 에스트로겐 수용체에 결합하여 유방암 세포의 성장을 억제하며, 폐경기 이후 나타나는 심혈관 질환(cardiovascular disease) 및 기타 증상의 치료에 에스트로겐을 대체하여 사용한다.

여성들은 폐경후 에스트로겐 결핍 상태가 지속되면 심혈관 질환과 골다공증이 증가한다. 폐경후의 여성인구가 증가하면서 폐경후 골다공증은 의학 및 사회경제적으로도 많은 문제를 야기하고 있다. 폐경후 여성의 심혈관 질환과 골다공증을 예방하고 치료하기 위해서 호르몬 대체요법(hormone replacement therapy)을 시행하고 있으며 장기적인 호르몬대체요법으로 얻을 수 있는 이익이 위험보다 매우 많다는 것은 잘 알려져 있다. 그러나 많은 여성들이 호르몬 대체요법시 발생할 수 있는 월경의 재개와 장기적으로 투여하였을 때 유방암의 위험도가 증가할 지도 모른다는 막연한 불안감 때문에 호르몬대체요법의 시작을 주저하거나, 조기에 포기하는 경우도 있다.

따라서 골격과 심혈관에는 에스트로겐의 효과를 유지하고 자궁과 유방에는 영향을 주지 않는 이상적인 에스트로겐에 대한 연구가 지속적으로 이루어져 왔다. 이러한 이상적인 에스트로겐의 가능성은 유방암의 치료에 사용되었던 항에스트로겐 (anti-estrogen)으로부터 얻을 수 있었다. 항에스트로겐(Anti-estrogen)들은 조직에 따라 서로 다른 효과를 나타내는데 유방암에서는 에스트로겐의 작용을 억제하나 다른 조직에서는 완전한 또는 부분적인 에스트로겐 촉진제(agonist)의 작용이 있다는 것이 밝혀졌다. 에스트로겐 촉진제와 길항제(antagonist)는 에스트로겐 수용체와 결합을 하여 작용하기 때문에 이러한 물질을 선택적 에스트로겐 수용체 조절기(selective estrogen receptor modulator; SERM)라고 한다.

이러한 SERM은 유전자 또는 세포에 따라 다른 작용을 하는 조직특이성(tissue specificity)을 보인다. SERM은 에스트로겐 수용체에 단순히 에스트로겐과 경쟁적으로 결합하여 에스트로겐 작용을 억제하기 보다는 에스트로겐 수용체와 결합한 후 전사과정에 영향을 주는 능동적인 역할을 한다고 알려져 있다. SERM의 다양한 작용은 여러 가지 종류의 SERM, 에스트로겐 수용체(ERα, ERβ), 호르몬과 반응하는 유전자 조절부위(ERE), 각종 전사인자와 조절단백질 등에 의해 결정된다. 에스트로겐 수용체(Estrogen Receptor-ER)는 리간드(ligand)에 의해 활성화되는 전사인자(transcription factor)로 작용을 한다. 에스트로겐 수용체에 SERM이 결합하여 수용체의 형태적 변화가 일어나고 활성화되면 에스트로겐 수용체-SERM 결합물이 유전자에 결합하여 전사를 시작한다. 이때 전사되는 양상은 세포와 유전자 조절부위(gene promoter)의 종류에 따라 다른 것으로 알려져 있다.

폐경후 여성에서 에스트로겐이 결핍되면 골교체율이 증가되고 골흡수가 골형성보다 많게되어 골량이 감소한다. SERM을 폐경후 여성에게 투여하면 척추의 골밀도가 1년후까지 증가하고 이후는 증가된 상태로 유지되며 고관절에서도 유사한 효과가 관찰된다. 폐경후 여성과는 대조적으로 SERM을 폐경전 여성에게 사용하면 요골, 척추, 고관절 골밀도가 감소하는 현상이 관찰된다. 따라서 골격에 대해서 SERM은 혈중 에스트로겐 농도가 낮을 때에는 에스트로겐과 유사한 작용을 하나 혈중 에스트로겐 농도가 높을 때에는 길항제 역할을 하는 것으로 보인다.

한편, 에스트로겐과 SERM의 일종인 타목시펜(tamoxifen), 랄록시펜(raloxifene) 모두 콜레스테롤을 저하시키는 효과를 가지고 있다고 알려져 있다. 폐경후 여성에게 랄록시펜을 투여하면 총 콜레스테롤과 LDL 콜레스테롤은 유의하게 감소하나 HDL 콜레스테롤과 중성지방의 농도에는 영향을 주지 않는다. 타목시펜을 장기적으로 투여 받는 유방암 환자에서 심혈관 질환이 약 50% 감소하는 현상도 관찰된다.

타목시펜과 랄록시펜은 유방암의 치료를 위한 항에스트로겐(anti-estrogen)으로 개발이 되었다. 또, 자궁에서 타목시펜은 에스트로겐 수용체에 부분적 촉진제로 작용하나 랄록시펜은 길항제로 작용을 한다.

그리고, 최근의 연구보고로는 제니스테인과 같은 식물 에스트로겐(phytoestrogen)이 에스트로겐 수용체(ERα, ERβ)의 발현 증가에 의한 골형성 증가에 영향을 미친다는 연구 결과등도 발표되었다.(Heim M. et al ,2003, Bonnelye ,et al, 2003)

본 발명은 은행잎추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증치료제에 관한 것으로 은행잎추출물은 쿠에르세틴(quercetin)과 캄페롤(kaempferol)등의 식물 에스트로겐(phytoestrogen)을 다량 포함하고 있으므로, 본 발명에 의한 은행잎추출물은 골다공증 치료제로 유용하게 사용될 수 있으며, 이미 인체에 대한 안전성이 확보되어 있어 안전한 골다공증치료제를 제공할 수 있다.

본 발명은 은행잎추출물에 포함되는 식물 에스트로겐(phytoestrogen)을 유효성분으로 함유하는 골다공증 치료제에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 조골세포(osteoblast)의 세포증식 촉진효과 및 발암억제효과가 우수한 일반식(I)로 표시되는 유도체가 포함된 은행잎추출물(이하 "MDG5031"라고 한다)을 유효성분으로 함유하는 골다공증 치료제에 관한 것이다.

제조예: 은행잎추출물의 제조

한국 중부지방에서 8월 내지 9월에 수확한 푸른잎 의 Ginkgo biloba leaves(은행잎)를 상수로 3회 세척하고 정제수로 2회 더 세척 분리한후 자연 건조시킨다.

건조된 원재료(은행잎)100kg을 에탄올 100L와 정제수 100L(혼합용매 1:1)를 가하고 섭씨 60~70도로 가온 추출한다.

2회 반복추출하여 합하고 수회 세척된 규조토를 깔아 준비된 감압누체 여과기로 여과하고 에탄올로 세척한다(이때 추출물에서 이물 및 지질을 제거) 여과액을 고형분 28~30% 선에 도달할 때 까지 감압농축한다.

농축분을 고진공건조기(6~10 Torr의 진공도)로 감압 건조 한후 분쇄기로 분쇄한다.

이때 얻어진 수득량은 7kg 이며 추출물의 조성은 총 깅고플라본 배당체(Total Flavone Glycosides)로 24.7%(HPLC법)이며 퀘르세틴(Quercetin) 15.26%, 캠페롤(Kaempferol)8.06%, 이소람네틴(Isorhamnetin) 1.42%, 총 테르펜 락톤 (Total terpen lactones) 은 7.64% 이다.

실험예 1) MDG5031의 에스트로겐 작용에 의한 골다공증 치료효과

본 발명에 의한 MDG5031이 에스트로겐과 같은 효과를 나타내어 골다공증 치료제로서 작용이 가능한지를 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 실시하였다. MDG5031의 에스트로겐 효과를 확인하기 위하여 MCF-7세포(Human breast cancer cell)를 서울대학교 의과대학 암 연구소의 한국 세포주 은행으로부터 분양 받아서 사용하였으며 에스트로겐 작용에 의한 골다공증 효과는 E-SCREEN assay에 의한 세포증식효과실험과 에스트로겐성 유전자 발현(pS2) 측정 실험을 이용하여 관찰하였다.

한편 MDG5031은 쿠에르세틴(quercetin)과 캄페롤(kaempferol)등의 식물 에스트로겐(phytoestrogen)을 다량 포함하고 있는 복합 물질이므로 단일 물질과 달리 몰농도를 구할 수 없다. 그러므로 무게농도로 실험을 하였으며 농도를 통일하기 위해 실험에 사용한 다른 단일 물질들도 몰농도가 아닌 MDG5031과 같은 무게농도로 실험하였다.

1-1) E-SCREEN assay에 의한 에스트로겐 작용(골다공증 치료효과)실험

E-SCREEN assay는 시험물질의 에스트로겐 효과를 관찰하기 위해 개발된 방법으로 MCF-7세포에 투여한 물질에 의해 세포증식효과가 나타나는지를 관찰하여 에스트로겐 효과를 평가한다. 이 MCF-7세포에 MDG5031를 처치하고 6일 후에 나타나는 각 세포의 세포증식 정도를 측정하여 확인하였다. 그 결과 [표 1]에서 보는 바와 같이 MDG5031에 의한 용량-의존적인 세포증식을 보였으며, 특히 250 ㎍/ml 농도에서 세포증식 효과를 비교하는 RPE(Relative proliferative effect) 값이 최고치를 나타냈다. 또한 본 시험계에서 RPE값이 8이상으로 나타나면 부분 효능제(partial agonist)로서의 에스트로겐작용이 있다고 할 수 있는데 MDG5031은 그 이상의 값을 나타내므로 에스트로겐성 물질로서 체내에서 작용할 수 있음이 확인되었다. 그리고 이미 골다공증에 유효하다고 알려진 은행잎 추출물의 주성분 쿠에르세틴과 비교한 결과 MDG5031이 더욱 높은 세포 증식 효과를 나타내어 작용이 더 강한 것을 알 수 있었다. 이상의 결과로, MDG5031은 체내에서 에스트로겐성 물질로 작용하여 에스트로겐 공급 효과를 나타냄으로써 골다공증을 치료할 수 있는 것으로 확인하였다.

RPE = [(S-1)/(E-1)] ×1 로써 S는 샘플의 증식량이고 E는 양성대조군(E₂)의 증식률로서 E₂의 10^-10mg/ml의 증식률을 100으로 한 상대값이다.

E-Screen assay에 의한 MCF-7세포의 증식 결과

MCF-7의 증식률 (RPE %)
농도(ug/ml)	MDG5031	쿠에르세틴
50	11.8	13.0
100	18.9	17.8
250	24.6	21.8

1-2) 에스트로겐성 유전자발현(pS2)측정에 의한 에스트로겐 작용(골다공증 치료효과) 실험

MDG5031의 에스트로겐 효과를 유전자 수준에서 확인하기 위한 방법으로서 에스트로겐 수용체와 에스트로겐성 물질이 결합하면 발현되는 유전자인 pS2를 측정하는 시험법(pS2 gene expression assay)을 이용하여 그 효과를 확인하였다. 이 gene들의 활성은 외부에서 에스트로겐이 세포내로 유입되면 에스트로겐 수용체와 결합하여 일어나는 유전자발현 변화로서 처리한 약물이 에스트로겐으로서 작용하는지를 직접적으로 관찰할 수 있다. pS2 gene expression assay는 RT-PCR (Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction)법에 의해 수행하였으며, MCF-7 세포에 MDG5031과 그 주요구성성분인 쿠에르세틴을 투여하여 발현되는 pS2 mRNA의 양적인 변화를 공시험 대조군 및 양성 대조군과 비교 관찰하였다. 양성 대조군으로는 E₂(17β-estradiol)를 사용하였는데 각 물질마다 150㎍/ml의 농도로 실험하였다. 도 1에서 보는 바와 같이 MDG5031에 의한 pS2 mRNA의 발현(밀도)이 그 주요 구성성분인 쿠에르세틴 보다도 2배 이상 높은 것으로 나타났으며 E₂에 가까운 밀도를 보여주고 있어 에스트로겐 수용체와의 결합에 의한 에스트로겐 효과가 강함을 알 수 있다. 이것은 MDG5031이 직접적으로 에스트로겐 수용체와 결합하여 pS2 mRNA의 발현에 영향을 주어서 나타나는 결과이므로 MDG5031이 E₂(17β-estradiol)과 동일하게 에스트로겐 조절기전(estrogen-regulated pathway)에 의해 에스트로겐으로서 작용함으로써 체내에서 에스트로겐 효과를 나타내어 골다공증 치료제로서 역할을 할 수 있음을 알 수 있다.

실험예2) 선택적 에스트로겐 수용체 조절기(SERMs)작용에 의한 골다공증 치료 효과

우리 체내의 조직에는 에스트로겐 수용체 ERα와 ERβ가 체내 장기에 따라 서로 다르게 분포되어 있는데 선택적 에스트로겐 수용체 조절기(SERM)는 각각의 에스트로겐 수용체(ERα와 ERβ)와 결합함으로써 체내 장기에 따라 서로 다른 효과를 나타내게 된다. 또한 이러한 약물류는 체내 에스트로겐 농도에 따라 에스트로겐 촉진제 또는 길항제(antagonist)로서 에스트로겐 수용체와 결합을 하여 작용하기도 한다.

폐경후 여성에서 에스트로겐이 결핍되면 골교체율이 증가되고 골흡수가 골형성 보다 많게 되어 골량이 감소하여 골다공증이 유발되게 되는데, 현재 개발된 랄록시펜과 같은 SERM을 폐경후 여성에게 투여하면 척추의 골밀도 증가와 고관절에서도 유사한 효과가 관찰된다. 따라서 본 발명에 의한 MDG5031이 선택적인 에스트로겐 수용체 조절기로서 골다공증 치료제로 작용이 가능한지를 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 실시하였다.

2-1) Competitive binding assay에 의한 선택적 에스트로겐 수용체 결합성 측정 실험

MDG5031이 선택적인 에스트로겐 수용체(ER) 조절기로서 작용하는지를 보기 위해 에스트로겐 수용체 ERα와 β에 대한 친화력을 조사하였다. 실험은 MCF-7세포를 이용하여 먼저 각 세포에 2,4,6,7-[³H]E₂와 MDG5031을 투여한 후 3시간 배양하여 실험하였다. 그 결과 [표 2]에서 보는 바와 같이 약물을 처치하지 않은 대조군에 대한 상대비(%)를 관찰한 결과 MDG5031의 ER에 대한 결합력이 농도 의존적으로 증가하였으며 주요 성분인 쿠에르세틴에 비해 1.5배 이상 더 강한 결합력이 있음이 관찰되었다. 또한 MDG5031은 ERα와 β모두에 대해 결합력이 있는 것으로 나타나 에스트로겐 수용체 조절기로서 작용함을 알 수 있었다. 그리고 MDG5031의 에스트로겐 수용체에 대한 친화력은 ERα보다 ERβ에 대해 더 큰 것으로 나타났다. 따라서 MDG5031은 이미 개발된 랄록시펜과 동일한 작용기전인 에스트로겐 수용체 조절기로서의 기전에 의해 골다공증 치료제로 작용할 수 있음을 확인하였다.

Competitive Binding Assay에 의한 MCF-7의 ER의 결합력 결과

MCF-7세포의 [³H]E₂ 에 대한 특이 결합력[대조군에 대한 상대비 (%)]
MDG5031			쿠에르세틴
농도(ug/ml)	ERα	ERβ	ERα	ERβ
1	100.5	96.7	108.5	83.1
10	98.9	93.7	107.1	82.0
100	83.1	63.3	94.0	70.5
150	74.3	46.4	83.4	63.1

실험예 3) 조골세포(Osteoblast)의 세포증식 및 분화작용에 의한 골다공증 치료효과

본 발명에 의한 MDG5031이 조골세포의 세포증식효과에 영향을 주는지를 확인하기 위하여 사람의 유사조골세포주(human osteoblast-like cell line)인 Saos-2 세포주를 서울대학교 의과대학 암 연구소의 한국 세포주 은행으로부터 분양 받아서 사용하였다. 식물 에스트로겐의 일종으로서 골다공증 치료작용이 있다고 알려진 제니스테인(genistein)을 비교 물질로 하여 조골세포의 증식효과를 관찰하였다. 조골세포 증식의 측정은 세포증식과 관련된 대사계로서 mitochondria의 active "succinate-tetrazolium reductase" system의 효소활성화에 의해 기질인 tetrazolium salt가 분해되는 정도를 측정하는 WST-1 assay와 세포분화과정에서 증가되는 Alkaline phosphatase(ALP)활성의 변화를 측정하는 방법에 의해 실험하였다. 식물 에스트로겐의 일종으로서 골다공증 치료제로 많이 연구되어지는 제니스테인(genistein)과 쿠에르세틴을 비교물질로 하여 효과를 관찰하였다.

3-1) 약물의 농도에 따른 세포증식실험 : WST-1 Assay

조골세포와 유사한 성질을 나타내는 Saos-2 세포주를 사용하여 대사작용이 왕성한 세포의 mitochondria의 active "succinate-tetrazolium reductase" system에 의한 tetrazolium salt의 분해되는 정도를 측정하여 세포증식률을 비교하였다. 약물에 의해 나타나는 세포증식률은 약물을 처치하지 않은 대조군의 흡광도에 대한 백분율로서 계산하였다. [표 3]에서 보는 바와 같이 MDG5031 투여에 의한 조골세포증식 효과는 쿠에르세틴 보다는 약간 높고 제니스테인과는 유사하게 하였다. 특히 MDG5031 투여농도 150㎍/ml에서 최고 108.9%의 가장 높은 증식효과가 나타나 MDG5031이 조골세포의 증식을 촉진시킴에 의해 나타나는 골다공증 치료효과가 있는 것으로 판단되었다.

WST-1 assay를 이용한 MDG5031의 Saos-2세포증식효과

Soas-2 세포증식률 (대조군과의 백분율, %)
농도(㎍/ml)	MDG5031	쿠에르세틴	제니스테인
100	102.6	96.2	106.6
150	108.9	96.5	107.0
200	104.0	96.7	107.4

3-2) Alkaline phosphatase(ALP) 활성검색 실험

조골세포는 세포분화시 특이적으로 Alkaline phosphatase(ALP)활성을 나타낸다. ALP가 p-nitrophenylphosphate를 p-nitrophenol과 phosphate로 분해시키는 것을 이용하여 405nm에서의 대조군의 흡광도에 대한 각각의 물질의 흡광도의 비로 계산하여 ALP활성을 측정함으로써 조골세포에 대한 영향을 관찰하였다.

[표 4]에서 보는 바와 같이 MDG5031의 투여에 의해 Saos-2세포의 ALP 활성이 100㎍/ml 투여농도에서 최고 147.2 %가 증가되었으며 쿠에르세틴이나 제니스테인에 비해 ALP 활성이 높게 나타났다. 따라서 MDG5031이 조골세포의 분화를 촉진시켜 나타나는 골다공증 치료효과가 있음을 알 수 있었으며 쿠에르세틴이나 제니스테인보다 그 효과가 강한 것으로 판단되었다.

ALP 활성검색을 이용한 MDG5031의 Saos-2세포분화효과

Saos-2 세포분화율 (대조군과의 백분율, %)
농도(㎍/ml)	MDG5031	쿠에르세틴	제니스테인
50	136.0	109.0	120.9
100	147.2	117.7	118.0
150	138.5	126.4	115.1

실험예 4) MDG5031의 유방암 억제 효과

폐경기 여성의 골다공증 치료를 위해 사용하는 여성호르몬제제는 일반적으로 유방암 등 암발생의 위험성이 있다. MDG5031은 선택적 수용체 조절기(SERM)로서의 작용이 있는 것으로 나타나 에스트로겐 수용체(ER)와 직접적으로 결합하여 나타나는 에스트로겐 작용에 의한 골다공증 치료 효과를 가지는 ERβ에 대한 친화력으로 E₂(17β-estradiol)와 서로 경쟁함에 의해 유방암을 억제시킬 수 있다.

따라서, 본 발명에 의한 MDG5031이 에스트로겐성 물질 투여에 의한 부작용으로서 유발되는 유방암 발생 억제 효과를 가지고 있는지를 관찰하기 위해 E₂존재 하에서 유방암세포 증식억제효과와 에스트로겐 수용체 유전자 발현억제효과를 실험하였으며 세포사멸 효과를 관찰하였다.

4-1) 유방암세포 증식억제효과 실험

MDG5031의 발암 억제 효과를 실험하기 위해 강한 에스트로겐 효과를 보이는 E₂(17β-estradiol)와 MDG5031을 10에서 500㎍/ml까지의 농도로 MCF-7세포(human breast cancer cell)에 서로 병용 투여한 후 E₂에 의한 세포 증식에 대한 MDG5031의 억제효과를 E-SCREEN assay 방법으로 측정하였다. 그 결과 [표 5]에서 보는 바와 같이 MDG5031을 100㎍/ml, 250㎍/ml 및 500㎍/ml 농도로 투여한 경우에서 E₂(17β-estradiol) 10^-10M만을 단독 처리하여 나타난 세포증식률(RPE %)에 비해 농도 의존적으로 세포증식률이 현저히 저하 되었다. MDG5031의 고용량인 500㎍/ml을 투여한 군에서는 항암제인 타목시펜의 발암억제효과가 가장 잘 나타나는 농도인 0.37㎍/ml에서 나타나는 억제작용과 유사한 강한 발암억제효과를 가지고 있는 것으로 나타났다.

E-Screen assay에 의한 MCF-7세포의 증식 억제효과

실 험 물 질	MCF-7의 증식률 (RPE %)
E₂(10^-10M)	100.0
E₂(10^-10M)+타목시펜(0.37㎍/ml)	10.0
E₂(10^-10M)+MDG5031(10㎍/ml)	100.3
E₂(10^-10M)+MDG5031(100㎍/ml)	66.3
E₂(10^-10M)+MDG5031(250㎍/ml)	47.4
E₂(10^-10M)+MDG5031(500㎍/ml)	16.4

4-2) 에스트로겐성 유전자 발현억제에 의한 유방암 억제효과 실험

MDG5031의 발암억제효과를 유전자 수준에서 확인하기 위해 에스트로겐 수용체 매개 반응성을 시험할 수 있는 루시퍼레이즈 활성측정 방법에 의해 실험하였다. 이 실험은 에스트로겐 수용체 결합인자(ERE)에 에스트로겐성 물질이 결합하면 유전자(gene)의 발현에 의해 루시퍼레이즈가 활성화되어 발광을 나타내는 정도를 측정하는 방법이다. [표 6]에서 보는 바와 같이 E₂(17β-estradiol) 투여에 의해서 발현되는 에스트로겐성 유전자의 발현을 MDG5031이 현저히 억제하는 것으로 나타났다. 항암제인 타목시펜 및 은행잎 추출물의 주성분인 쿠에르세틴과 비교할 때 타목시펜 보다는 약하나 쿠에르세틴 보다는 작용이 현저히 강한 것으로 나타났다. 따라서 MDG5031이 발암억제작용을 가져 부작용 위험 없이 골다공증 치료제로서 사용이 가능한 것으로 나타났다.

루시퍼레이즈(luciferase)활성측정에 의한 에스트로겐성 유전자 발현억제효과

Relative luciferase activity
시 험 물 질	측 정 값
E₂(10^-11M)	11.6
E₂(10^-11M)+타목시펜(0.37㎍/ml)	0.52
E₂(10^-11M)+MDG5031(500㎍/ml)	6.4
E₂(10^-11M)+쿠에르세틴(27㎍/ml)	9.8

4-3) 세포사멸기전에 의한 유방암 억제효과 실험

MDG5031이 세포사멸기전에 의한 발암억제효과가 있는 지를 보기 위해 인체 유방암 세포인 MCF-7세포의 DNA손상에 의한 세포사멸을 실험하였다. 100개의 MCF-7세포 중 세포사멸에 의한 DNA 손상이 나타난 세포수를 세어 세포사멸 정도를 확인하였다. MCF-7세포의 사멸이 나타난 세포수가 대조군 또는 E₂투여군에 비해 MDG5031투여군에서는 3배 정도 높은 세포 사멸 효과를 관찰할 수 있었다. 따라서 MDG5031이 발암억제 효과가 있음을 확인하였다.

세포사멸기전에 의한 유방암 억제효과

실험물질	100개 세포당 사멸세포 수
대조군	2.4
E₂(2.7*10^-3㎍/ml)	2.9
MDG5031(500㎍/ml)	7.4

이상의 실험결과로 보아 본 발명의 MDG5031은 에스트로겐 수용체 조절기로서 작용하여 은행잎 추출물의 주성분인 쿠에르세틴 보다 골다공증 치료효과가 현저히 우수하며 유방암 억제작용을 가지고 있어 골다공증 치료를 위한 에스트로겐제제 투여에 의해 우려되는 발암 억제 효과도 강한 것으로 나타났다.

본 발명의 은행잎추출물은 약제학적으로 적당한 담체와 혼합하여 통상의 방법으로 정제 캅셀제 등 경구제제로 제제화 할 수 있으며, 골다공증 치료효과를 기대하기 위해서는 은행잎추출물로서 1일 80mg~500mg을 3회 투여하는 것이 바람직하다.

본 발명은 은행잎추출물을 유효성분으로 함유하는 골다공증치료제에 관한 것으로 은행잎추출물은 쿠에르세틴(quercetin)과 캄페롤(kaempferol)등의 식물 에스트로겐(phytoestrogen)을 다량 포함하고 있으며 이들 식물 에스트로겐의 복합 작용에 의해 에스트로겐 수용체 조절기로서 작용하여 발암 억제 효과를 가지는 골다공증 치료제로서 사용될 수 있다.

도 1은 에스트로겐 수용체와 에스트로겐성 물질이 결합하면 발현되는 유전자인 pS2를 측정하는 시험법(pS2 gene expression assay)의 결과로, 은행잎추출물에 의한 pS2 mRNA의 발현(밀도)이 골다공증 치료효과가 있다고 알려진 쿠에르세틴 보다 2배 이상 높은 것으로 나타났으며 E₂(17β-estradiol)에 가까운 밀도를 보여주고 있어 에스트로겐 수용체와의 결합에 의해 강한 에스트로겐으로서 작용함으로써 체내에서 골다공증 치료에 유효하게 작용할 수 있음을 보여주는 그림이다.

Claims

은행잎추출물을 유효성분으로 함유하는 발암 억제 효과를 갖는 골다공증치료제.
제 1항에 있어서, 상기 은행잎추출물이 하기식(I)로 표시되는 쿠에르세틴(quercetin), 캄페롤(kaempferol)을 포함하는 것을 특징으로 하는 골다공증치료제.

[화학식 1]