KR20050074813A

KR20050074813A - 마이코플라즈마 및 유사 균종의 유전자형 감별을 위한올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와이를 이용한 균종 검출 방법

Info

Publication number: KR20050074813A
Application number: KR1020040002715A
Authority: KR
Inventors: 김철민; 박희경; 장현정; 김효명
Original assignee: 김철민; 박희경; 주식회사 진인
Priority date: 2004-01-14
Filing date: 2004-01-14
Publication date: 2005-07-19
Also published as: EP1713918A1; EP1713918A4; KR100615424B1; WO2005078102A1; US20070065828A1

Abstract

본 발명은 세포주 및 생물 의약품의 주요 오염원인 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 존재 여부 감시와 인체 감염 여부를 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마와 우레아플라즈마 등의 균주 감별을 위한 ITS 표적 염기 서열로부터 고안된 신규 올리고뉴클레오티드, 이를 프로브로 포함하는 마이크로어레이, 그리고 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

본 발명에 따르면, 생물 의약품 또는 저장 세포주의 주요 오염원이자 주요 인체 병원성으로 알려져 있는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 유전자형 감별을 위한 신규 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이를 제공함으로써 단일 검체로부터 여러 마이코플라즈마 및 그 유사 균종의 유전자형 검출이 가능한 신속하고 정확한 진단 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따르면, 인체 감염에 관여하는 마이코플라즈마 및 그 유사 균종의 감염 확산을 예방하기 위한 근원지의 추적이 가능할 뿐만 아니라, 유전자 치료 요법과 세포 치료 요법에 유용한 줄기 세포나 제대혈과 같은 저장 세포를 비롯하여 생물 의약품에 대한 오염 관리가 가능함으로써 점차 대량화되는 제품 생산의 유지와 관리에 대해 객관적인 신뢰성을 제공할 수 있는 검사법을 제공한다.

Description

마이코플라즈마 및 유사 균종의 유전자형 감별을 위한 올리고뉴클레오티드, 이를 포함하는 마이크로어레이와 이를 이용한 균종 검출 방법{Oligonucleotide for genotyping of Mycoplasma, microarray comprising the oligonucleotide, and method for detection of species using the microarray}

본 발명은 세포주 및 생물 의약품의 주요 오염원이자 인체 병원성과 관련된 마이코플라즈마와 그 유사 균종을 검출하는 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마와 우레아플라즈마의 균주 감별을 위한 ITS 표적 염기 서열로부터 고안된 마이코플라즈마의 속 특이적(genus specific) 및 종 특이적(species specific) 올리고뉴클레오티드, 이를 프로브로 포함하는 마이크로어레이, 그리고 이를 이용한 검출 방법에 관한 것이다.

마이코플라즈마는 세포벽이 없는 Mollicute과에 속하는 원핵 생물로, 돼지나 소와 같은 가축을 비롯하여 인체의 생식기나 호흡기에 감염되어 폐렴을 야기하는 원내 감염체였다. 그러나 근래에는 세포 배양 및 세포주의 주요 오염원으로 그 심각성이 더욱 부각되고 있다.

특히, 인간의 질병 예방 및 치료를 목적으로 하는 생물 의약품의 개발과 생산이 증가함에 따라, 이러한 생물 의약품은 그 제조 과정 중에 실험실내의 미생물 또는 임상 검체가 제공하는 여러 병원성 인자로부터의 감염이 문제되고 있다. 이러한 생물 의약품으로는 종양 세포 붕괴성 바이러스, 백신, 유전자 치료용 벡터, 재조합 단백질 등이 있으며, 이들은 세균, 곰팡이, 바이러스 그리고 마이코플라즈마와 유사 균종 등에 의해 오염되는 것으로 밝혀져 있다(Doblhoff-Dier et al., 2001). 이러한 오염의 원인은 배지 구성분이나 실험 기자재에 오염된 유기체, 또는 공기중에 산재하는 미생물과 바이러스의 교차 오염에 의한 것이다(Jung et al., 2003). 그리고 생물 의약품의 대량 생산을 위한 WCB(Working Cell Bank)를 이용한 제조 횟수가 거듭되면서 이미 감염된 WCB의 교차오염에 의한 경우도 있다(Wisher et al., 2002).

이러한 오염원 중, 세포 배양과 세포주의 약 15~35% 정도가 마이코플라즈마와 그 유사 균종에 의해 감염된 것으로 보고되고 있다(Hopert et al., 1993). 이는 제품 생산뿐만 아니라 세포 배양과 관련된 연구 분야에 있어서도 숙주 세포의 세포벽에 결합되어 DNA, RNA와 단백질 합성의 이상과 같은 세포의 특성을 변화시켜 신뢰할 수 없는 실험 결과를 유발한다는 데 그 심각성이 더욱 커지고 있다(Kong et al., 2001). 최근 유전자 치료 요법(gene therapy)과 세포 치료 요법(cell therapy)의 우수성이 강조되면서 이를 위한 저장 줄기 세포(stem cell)와 제대혈(cord blood)에 대한 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 오염 여부 조사는 더욱 중요하다고 하겠다. 따라서 신뢰할 수 있고 재현성있는 실험 결과뿐만 아니라 실제 상업화되고 있는 생물 의약품의 품질 관리와 유전자 치료 요법에 있어서 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 감염에 대한 검사는 필수 요건이라고 하겠다.

위와 같은 이유로 유럽 공동체에서는 모든 식의약품의 품질과 안전의 신뢰성을 보장하기 위한 GMP(Good Manufacturing Practice)와 QC(Quality Control)를 제시하기를 요구하고 있으며, MCB(Master Cell Bank)와 WCB와 같은 세포 은행에 대해 마이코플라즈마를 비롯한 바이러스, 세균과 곰팡이에 대한 검사를 필수적으로 요구하고 있다(Doblhoff-Dier et al., 2001).

현재까지 규명된 세포벽이 없는 100 여종의 세균에는 Acholeplasma, Enteroplasma, Mesoplasma, Mycoplasma, Ureaplasma와 Spiroplasma 등이 있으며, 이들은 계통 분류상 Mollicute과에 속한다. 이 중, 20여 종의 마이코플라즈마(Mycoplasma), 에콜레플라즈마(Acholeplasma)와 우레아플라즈마(Ureaplasma)가 세포 배양의 주 오염원이고, 그 중 마이코플라즈마 알기니(M. arginini), 마이코플라즈마 퍼멘턴스(M. fermentans), 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 마이코플라즈마 히요리니스(M. hyorhinis), 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis), 마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium), 마이코플라즈마 피룸(M. pirum), 에콜레플라즈마 라이드라위(A. laidlawii )가 95%를 차지하고 있다(Dorigo-zetsma et al., 1997). 그런데, 마이코플라즈마는 세포 외 배양이 까다롭고, 배양 중에도 탁도가 없기 때문에 기원이 서로 다른 마이코플라즈마 및 그 유사 균종의 오염원의 근원과 경로를 추적하고 오염을 제거할 수 있는 단서를 제공할 수 있도록 빠르고 정확한 유전자형 감별법이 시급히 요구되는 바이다.

현재까지 알려진 마이코플라즈마 검출 방법으로는 배양법, DNA 염색법(DNA fluorochome stain), 면역형광염색법(immunofluorescence), 중합효소연쇄반응 (polymerase chain reaction, PCR)이 있다(Dorigo-zetsma et al., 1997). 마이코플라즈마 배양법은 세포 외 배양이 까다롭고 혈청과 같은 보충물 첨가에 따른 배지 제조가 복잡하며, 배양에 소요되는 기간도 균종에 따라 4일 ~ 3주 정도 요구되는 단점이 있다(Jensen et al., 2003). 마이코플라즈마의 DNA 염색법(DNA fluorochome stain)으로는 Hoechest 33258 염색법이 있는데, 이는 검사자의 주관적인 판단에 의한 오판의 위험과 까다로운 배양 조건을 우선 만족해야 한다는 단점이 있다 (Chen et al., 1997). 효소면역법(ELISA)과 같은 면역형광염색법(immunofluorescence)은 연쇄상 구균 (Streptococcus milleri group)과 황색 포도상 구균(Staphylococcus aureus)과 같이 마이코플라즈마와 유사한 항원을 가진 경우 위양성을 나타낼 수 있어서 그 특이성이 부족한 방법이다(Hopert et al., 1993). 중합효소 연쇄반응은 마이코플라즈마의 다양성을 포함하는 16S/23S intergenic spacer region (ITS)과, 169 kDa의 P1 cyadhesion proteine 발현에 관련된 유전자가 많이 이용되고 있다(Uphoff et al., 2002). P1 유전자는 표면 항원 유전자로 다양성을 나타내는 여러 subtype이 있으며, 이는 마이코플라즈마의 동정을 위해 면역반응을 이용한 혈청학적 검사 및 제한효소 절편 길이의 다양성(restriction fragment length polymorphism, RFLP)을 이용한 유전형 감별을 위한 표적 유전자로도 많이 이용되고 있다(Campo et al., 1998). 그러나, 현재까지 여러 문헌에서 사용된 중합효소 연쇄반응 프라이머의 대부분은 원핵 생물의 공통서열인 16S rRNA를 기초로 고안되었으며, 2차 PCR 또는 nested PCR을 이용한 높은 민감도로 인해 공기 중에 산재하는 마이코플라즈마의 교차오염과 마이코플라즈마와 분류학적으로 유사한 세균과 증폭 가능성을 배제할 수 없다는 단점이 있다(Uphoff et al., 2002).

이러한 기존 진단법의 한계를 극복하기 위하여 최근 DNA 혼성화 원리를 이용한 프로브(probe) 분석법이 시도되기 시작하였고, 이는 유전자 서열 분석에 기초한 혼성화 원리에 의해 단시간내에 가장 많은 종류의 유전자 분석이 가능한 방법이며, 특이적 프로브와 표적 DNA간의 적절한 혼성화 조건에 의해 단일 염기서열에 의해서도 특이적 검출이 가능한 유전형 감별의 유용성이 강조되고 있다 (Gohlman et al., 2000).

본 발명에서는 유전자형 감별에 있어 중요한 마이코플라즈마와 그 유사 균종을 검출할 수 있는 ITS 유래의 올리고뉴클레오티드를 제공하였고, 이를 프로브로 포함하는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 감별 진단용 마이크로어레이를 개발하였다.

본 발명에서는 당업계에서 일반적으로 포괄하여 통칭하는 마이코플라즈마(Mycoplasma)에 그 기원이 서로 같은 에콜레플라즈마(Acholeplasma) 및 우레아플라즈마(Ureaplasma)를 포함하여 유사 균종으로 표기하였다.

따라서, 본 발명의 주된 목적은 마이코플라즈마 및 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 ITS 염기 서열로부터 고안된 마이코플라즈마의 올리고뉴클레오티드를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 또 다른 목적은 마이코플라즈마 및 그 유사 균종의 균주 감별을 위해 현재 알려지지 않은 6종의 마이코플라즈마 즉, 마이코플라즈마 보비스(M. bovis), 마이코플라즈마 클로아케일(M. cloacale), 마이코플라즈마 팔코니스(M. falconis), 마이코플라즈마 파우시움(M. faucium), 마이코플라즈마 스퍼마토필룸(M. spermatophilum)과 마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae)에 대한 ITS 염기 서열을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 마이코플라즈마 및 그 유사 균종의 속 특이적 및 종 특이적인 올리고뉴클레오티드를 프로브로 포함하는 마이크로어레이 구성을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 마이크로어레이를 이용한 마이코플라즈마 및 그 유사 균종의 검출 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 마이코플라즈마 및 그 유사 균종의 속 특이적 및 종 특이적인 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라즈마(Mycoplasma), 에콜레플라즈마(Acholeplasma)와 우레아플라즈마(Ureaplasma)를 각각 또는 동시에 검출하는 진단 키트를 제공하는데 있다.

또한, 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마와 우레아플라즈마는 세포주 등의 주요 오염원으로 동시에 검출해야하므로, 이를 동시에 검출할 수 있는 진단 키트를 제공하는데 있다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 마이코플라즈마 균주 감별을 위한 ITS (internal transcribed spacer) 표적 DNA를 제공한다.

서열번호 1 내지 6은 본 발명에서 새로이 염기 서열 분석에 의해 확보된 마이코플라즈마 보비스(Mycoplasma bovis), 마이코플라즈마 클로아케일(Mycoplasma cloacale), 마이코플라즈마 팔코니스(Mycoplasma falconis), 마이코플라즈마 파우시움(Mycoplasma faucium), 마이코플라즈마 스퍼마토필룸(Mycoplasma spermatophilum) 및 마이코플라즈마 균주 감별을 위한 마이코플라즈마 시노비에(Mycplasma synoviae)의 ITS 염기서열이다.

본 발명의 ITS 표적 DNA는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 프로브나 프라이머를 고안하는데 사용되거나, 직접 PCR 증폭되어 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별에 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 7 내지 21의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 속 특이적(genus specific) 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 22 내지 27의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 에콜레플라즈마 속 특이적(genus specific) 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 28 내지 127의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 종 특이적(species specific) 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 128 내지 133의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 에콜레플라즈마 종 특이적(species specific) 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 제공한다.

본 발명의 올리고뉴클레오티드는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 16S rRNA와 23S rRNA 사이에 존재하는 ITS (internal transcribed spacer) 염기 서열의 다중 서열 정렬(Multiple alignment)에 의거하여 고안하였다. 상기 올리고뉴클레오티드는 마이코플라즈마와 그 유사 균종 감별을 위한 특이적 핵산 분자 증폭 방법에 유용한 프라이머 서열로 사용될 수 있고, 마이코플라즈마와 그 유사 균종 감별을 위한 혼성화 방법에 유용한 프로브 서열로도 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 그리고 우레아플라즈마의 종과 속 특이적 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 프로브(probes)를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명의 마이크로어레이에서, 상기 프로브는 DNA, RNA 또는 PNA(Peptide Nucleic Acid), LNA(Locked Nucleic Acid), HNA(Hexitol Nucleic Acid) 등 핵산 유사체일 수 있으며, 상기 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘 또는 젤(gel)일 수 있다. 본 발명의 마이크로어레이는 통상의 핀 마이크로어레이(pin microarray), 잉크젯(ink jet), 포토리소그래피(photolithography), 또는 전기어레이(electric array) 방법으로 제작될 수 있다.

본 발명의 마이크로어레이는 생물 의약품 또는 세포주의 주요 오염원이자 주요 인체 병원성으로 알려져 있는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 유전자형 감별을 위한 신규 올리고뉴클레오티드를 포함하고 있을 뿐만 아니라, 이들을 한 세트로 하여 하나의 지지체 위에 부착하여 단일 검체로부터 여러 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 유전자형 검출이 가능한 진단 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA를 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA를 제 11항에 따른 마이크로어레이상의 프로브와 혼성화시키는 단계, 상기 형성된 하이브리드의 시그날을 검출하는 단계를 포함하는 마이코플라즈마와 그 유사 균종 검출 방법을 제공한다.

본 발명의 검출 방법에서, 상기 시료는 생물 의약품, 저장 세포주 또는 인체 조직일 수 있으며, 핵산의 분리는 통상의 DNA 또는 RNA 분리방법이나 키트를 사용하여 수행될 수 있으며, DNA 증폭은 통상의 Taq polymerase를 이용한 PCR 방법으로 수행될 수 있으며, 시그날 검출은 통상의 Cy5 또는 Cy3 등 형광 염료 결합 및 시그날 검출용 스캐너를 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 본 발명의 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 종과 속 특이적 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 진단키트에서, 상기 올리고뉴클레오티드는 방사성(radioactive) 또는 비방사성(non-radioactive) 표지될 수 있으며, 비방사성 표지는 통상의 바이오틴(biotin), Dig(digoxigenin), FRET(fluorescence resonance energy transfer), 형광(Cy5 또는 Cy3) 표지 등을 포함한다. 또한, 상기 올리고뉴클레오티드는 프로브 또는 프라이머로 사용될 수 있으며, 별도의 표적 DNA 증폭을 위한 프라이머가 포함될 수 있다.

바람직하게는, 본 발명의 진단키트에서 상기 올리고뉴클레오티드는 마이크로어레이에 프로브로 부착될 수 있으며, 이 경우 본 발명의 진단 키트에는 상기 마이크로어레이 외에 혼성화 반응용액, 표적유전자를 증폭하기 위한 프라이머가 포함된 PCR 키트, 비혼성화 반응 DNA 세척용 용액, 커버슬립, 염료, 비염료 결합 세척용 용액 및 사용설명서 등을 더 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다.

본 발명은 인체 병원성에 중요한 마이코플라즈마와 그 유사 균종 및 세포주와 생물 의약품내에 존재하는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 오염 여부를 감시하는 방법에 관한 것으로, 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드를 이용한 유전자적 검출 방법으로 구성되며, 자세하게는 하기 단계로 구성된다:

(ⅰ) 필요한 경우, 상기 세포주 및 생물 의약품내에 존재하는 다중 핵산의 분리,

(ⅱ) 필요한 경우, 하나 이상의 적합한 프라이머 쌍으로 상기 세포주 및 생물 의약품내의 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 및 우레아플라즈마의 표적 서열 또는 그 일부의 증폭,

(ⅲ) 단계 (ⅰ) 및/또는 (ⅱ)에서 확보된 다중 핵산과, 표 2 내지 표 3에 나타낸 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 및 우레아플라즈마의 속·종 특이적 올리고뉴클레오티드 즉, 프로브 서열, 프로브 역서열 또는 프로브 상보 서열로 반응할 수 있는 하나 이상의 프로브의 혼성화,

(ⅳ) 단계 (ⅲ)에서 형성된 하이브리드의 검출,

(ⅴ) 단계 (ⅳ)에서 수득된 혼성화 시그날로부터, 상기 세포주 및 생물 의약품내의 마이코플라즈마와 그 유사 균종 오염의 가능성에 관한 추정.

본 발명자들은 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드의 고안을 위해, 다수 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 및 우레아플라즈마의 ITS 염기 서열을 분석함으로써 상기 언급된 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 매우 특이적이며 민감한 혼성화 검정법을 개발할 수 있는 근거가 되는 서열들을 획득할 수 있었다. 또한, 본 발명에서는 새로운 6종의 마이코플라즈마의 ITS 염기 서열을 분석함으로써 보다 많은 마이코플라즈마 균주 감별을 위한 매우 특이적이고 민감한 검출을 허용하는 프로브의 고안이 더욱 가능해졌다.

표 1은 마이코플라즈마 균주 감별을 위한 표적 서열 중, 새로 분석한 6종의 ITS 염기 서열로 서열 번호 1 내지 6에 해당한다. 또한, 본 발명의 마이코플라즈마 균주 감별을 위한 구체적 프로브 선정은 마이코플라즈마 ITS 염기 서열의 다중 서열 정렬(Multiple alignment)에 의거하여 고안하였다. 도 1 및 2는 본 발명의 바람직한 실시예인 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 속과 종 특이적 프로브 선정을 위한 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 및 우레아플라즈마의 ITS 염기 서열의 다중 서열 정렬에 해당하는 도면으로, 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 속 특이적 올리고뉴클레오티드 서열은 도 1a 내지 1f의 상자로 표시한 보존적인 염기 서열 지역에서 고안하였고, 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 종 특이적 올리고뉴클레오티드 서열은 도 1a 내지 1f의 상자로 표시한 지역 외의 다형성 염기 서열 지역에서 고안하였다. 에콜레플라즈마의 속 특이적 올리고뉴클레오티드 서열은 도 2a 내지 2c의 상자로 표시한 에콜레플라즈마만의 보존적인 염기 서열 지역에서 고안하였고, 에콜레플라즈마 종 특이적 올리고뉴클레오티드 서열은 도 2a 내지 2c의 상자로 표시한 지역 외의 다형성 염기 서열 지역에서 고안하였다.

바람직한 구현 예에서 본 발명은, 단계 (ⅱ)에서 하나 이상의 적합한 프라이머 쌍으로 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 PCR 증폭을 확인하였다. 도 3은 MP16SF-2와 MP23SR-2의 프라이머 쌍에 의한 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 ITS 표적 서열의 증폭 여부를 확인한 도면으로, 1번은 마이코플라즈마 알기니(M. arginini), 2번은 마이코플라즈마 알쓰리티디스(M. arthritidis), 3번은 마이코플라즈마 퍼멘턴스(M. fermentans), 4번은 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis), 5번은 마이코플라즈마 히요리니스(M. hyorhinis), 6번은 마이코플라즈마 뉴롤리티쿰(M. neurolyticum), 7번은 마이코플라즈마 오팔레센스(M. opalescens), 8번은 마이코플라즈마 오레일(M. orale), 9번은 마이코플라즈마 피룸(M. pirum), 10번은 마이코플라즈마 페네트랜스(M. penetrans), 11번은 마이코플라즈마 풀모니스(M. pulmonis), 12번은 마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium), 13번은 마이코플라즈마 클로아케일(M. cloacale), 14번은 마이코플라즈마 팔코니스(M. falconis), 15번은 마이코플라즈마 파우시움(M. faucium), 16번은 마이코플라즈마 히오시노비에(M. hyosynoviae), 17번은 마이코플라즈마 뮤리스(M. muris), 18번은 마이코플라즈마 프리마튬(M. primatum), 19번은 마이코플라즈마 스퍼마토필룸(M. spermatophilum), 20번은 마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae), 21번은 마이코플라즈마 뉴모니에(M. pneumoniae), 22번은 마이코플라즈마 제니타리움(M. genitalium), 23번은 마이코플라즈마 보비스(M. bovis), 24번은 우레아플라즈마 우레알리티쿰(U. urealyticum), 25번은 에콜레플라즈마 라이드라이(A. laidlawii)에 대한 PCR 증폭 산물의 확인 도면이다.

또한, 바람직한 구현 예에서 본 발명은, 단계 (ⅲ)에서 지지체를 구성하고 있는 프로브 구성의 다양성과 하나 이상의 프로브들의 조합인 것을 특징으로 한다. 보다 자세하게는, 동시에 다수의 마이코플라즈마와 그 유사 균종을 검출할 수 있는 동일한 혼성화 및 세척 조건하에서, 상기 프로브들이 그들의 표적 부위들에 동시에 혼성화하도록 최적화된 것을 특징으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명의 지지체에 부착된 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 프로브 세트를 포함하는 마이크로어레이는 단 1회의 실험으로 하나의 검체로부터 동시에 여러 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별이 가능한 신속하고 정확한 마이크로어레이를 제공한다.

본 발명에서 사용된 ‘프로브’라는 용어는 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 및 우레아플라즈마의 표적 서열에 상보적인 서열을 갖는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 말한다. 또한, 본 발명의 올리고뉴클레오티드는 표적 서열의 두 가닥 중 어느 하나와 혼성화되어야 하므로 상기 서열번호들의 센스(sense), 안티센스(antisense), 그리고 상보적(complement) 염기서열을 모두 포함할 수 있다. 본 발명의 프로브로 사용되는 올리고뉴클레오티드는 리보뉴클레오티드(RNA), 데옥시뉴클레오티드(DNA), 펩타이드뉴클레오티드(PNA) 및 이노신과 같은 변형된 뉴클레오티드와 같이 그들의 혼성화 특징을 본질적으로 변화시키지 않는 기를 포함하는 뉴클레오티드일 수 있다. 보다 바람직하게는 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 및 우레아플라즈마의 속 특이적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 서열번호 7 내지 27의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 원칙으로 한다. 또한, 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 및 우레아플라즈마의 종 특이적인 서열을 포함하는 올리고뉴클레오티드로 서열번호 28 내지 133의 염기서열을 포함하는 1종 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 것을 원칙으로 한다.

도 4는 본 발명의 바람직한 실시예인 마이크로어레이의 도면으로서, 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다. 도면에서, 프로브에 해당하는 각 균주 이름과 서열 번호를 표기하였고, MP-C와 AP-C는 각각 마이코플라즈마(Mycoplasma) 및 우레아플라즈마(Ureaplasma) 속과 에콜레플라즈마(Acholeplasma) 속을 의미하는 임의명이다. 이것은 본 발명에서 고안한 신규 올리고뉴클레오티드 중 대표적인 프로브 구획의 한 예에 불과하므로 각 프로브 구성 및 구획의 위치(layout)는 변동될 수 있다.

본 발명에서 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 표적 서열 중, 새로 분석한 6종의 ITS 염기 서열은 표 1과 같으며, 본 발명에서 새로 개발된 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 및 우레아플라즈마의 균주 감별을 위한 속 특이적, 종 특이적 프로브용 신규 올리고뉴클레오티드는 표 2 내지 표 3과 같다.

* Mixed Base의 Code Name

M : A + C, W : A + T, Y : C + T, R : A + G

K : G + T, V : G + A + C, N : A + G + C + T

이하, 실시 예를 기초로 하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 단, 이들 실시 예는 본 발명의 예시일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 만으로 제한되는 것은 아니다.

실시 예 1: 마이코플라즈마 및 그 유사 균종의 배양 및 DNA 분리

본 연구에 사용된 균주는 1종의 에콜레플라즈마(Acholeplasma)와 23종의 마이코플라즈마(Mycoplasma) 그리고, 1종의 우레아플라즈마(Ureaplasma)를 포함한 총 25종을 ATCC(American Type Culture Collection, U.S.A)에서 구입하였다. 마이코플라즈마의 배양을 위한 배지와 배양 조건은 ATCC에서 제공하는 각 매뉴얼에 따라 선택하였다. 배양된 균주는 집락을 백금이로 따서 1.5㎖ 튜브에 넣고 인스타진 매트릭스(InstaGene matrix, Bio-Rad, USA)를 100㎕ 가하여 부유시킨 후, 항온 수조에서 56℃로 30분간 반응하였다. 이후 10초 동안 진탕한 후 100℃에서 8분간 열처리하고 다시 10초간 진탕한 후, 12,000rpm에서 3분간 원심 분리하여 상층액을 새 튜브로 옮기고, -20℃에 냉동 보관하였다. 이를 PCR 반응의 주형 DNA로 사용하였다.

사용된 표준 균주는 다음과 같다:

에콜레플라즈마 라이드라이(A. laidlawii) (ATCC 25937)

마이코플라즈마 알기니(M. arginini) (ATCC 23838)

마이코플라즈마 알쓰리티디스(M. arthritidis) (ATCC 19611)

마이코플라즈마 보비스(M. bovis) (ATCC 27368)

마이코플라즈마 클로아케일(M. cloacale) (ATCC 35276)

마이코플라즈마 팔코니스(M. falconis) (ATCC 51372)

마이코플라즈마 파우시움(M. faucium) (ATCC 25293)

마이코플라즈마 퍼멘턴스(M. fermentans) (ATCC 19989)

마이코플라즈마 제니타리움(M. genitalium) (ATCC 33530)

마이코플라즈마 호미니스(M. hominis) (ATCC 23114)

마이코플라즈마 히요리니스(M. hyorhinis) (ATCC 17981)

마이코플라즈마 히오시노비에(M. hyosynoviae) (ATCC 25591)

마이코플라즈마 뮤리스(M. muris) (ATCC 33757)

마이코플라즈마 뉴롤리티쿰(M. neurolyticum) (ATCC 19988)

마이코플라즈마 오팔레센스(M. opalescens) (ATCC 27921)

마이코플라즈마 오레일(M. orale) (ATCC 23714)

마이코플라즈마 페네트랜스(M. penetrans) (ATCC 55252)

마이코플라즈마 피룸(M. pirum) (ATCC 25960)

마이코플라즈마 뉴모니에(M. pneumoniae) (ATCC 15531)

마이코플라즈마 프리마튬(M. primatum) (ATCC 15497)

마이코플라즈마 풀모니스(M. pulmonis) (ATCC 14267)

마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium) (ATCC 23064)

마이코플라즈마 스퍼마토필룸(M. spermatophilum) (ATCC 49695)

마이코플라즈마 시노비에(M. synoviae) (ATCC 25204)

우레아플라즈마 우레알리티쿰(U. urealyticum) (ATCC 27618)

실시 예 2: 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 프로브 고안

본 발명에 사용된 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 프로브 선정은 마이코플라즈마 및 에콜레플라즈마, 우레아플라즈마의 ITS 염기 서열의 다중 서열 정렬(Multiple alignment) 결과에 의거하였다. 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 16S rRNA는 74~97%의 높은 유사성을 나타내는데 반해 ITS는 마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium)과 마이코플라즈마 히오시노비에(M. hyosynoviae ) 그리고, 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)와 마이코플라즈마 팔코니스(M. falconis)를 제외한 나머지 종에 대해 25.4~78.8%의 유사성을 나타내었다. 즉, ITS는 16S rRNA보다 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 프로브 고안에 유용한 다형성(polymorphism) 지역을 포함하고 있다. 그러나, ITS 유사성이 비교적 높은 마이코플라즈마 살리바리움(M.salivarium)과 마이코플라즈마 히오시노비에(M. hyosynoviae) 그리고, 마이코플라즈마 호미니스(M. hominis)와 마이코플라즈마 팔코니스(M. falconis)는 그들 종간의 제한되고 엄격한 프로브 고안으로 그 특이성을 보완하였다.

본 발명에 사용된 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 프로브는 5' 말단에 15개의 염기를 갖는 길이의 dT 스페이서 및 15-25개의 염기서열을 갖는 프로브를 합성하여 고안하였다. 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 프로브는 표 2 내지 표 3의 염기서열에 한정된 것이 아니라 이를 포함한 염기 서열로 이루어진 프라이머 및 프로브로 고안하여 이용할 수 있다.

1. 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 균주 감별을 위한 프로브 고안

① 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 속 특이적 감별을 위한 프로브 고안

모든 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 속과 혼성화 반응을 하도록 마이코플라즈마 ITS의 보존적인 염기서열로 표 2의 서열 번호 7과 8의 프로브를 고안하였다. 또한, 마이코플라즈마 ITS를 표적으로한 각 그룹별에 따른 보존적인 염기서열을 하기와 같이 고안하였다. 그 중, 그룹 Ⅰ(M. arginins. M. arthritidis, M. cloacale, M. falconis, M. faucium, M. hominis, M. hyosynoviae, M. orale, M. salivarium)을 검출하는 서열 번호 9, 10의 프로브를 고안하였고, 그룹 Ⅱ(M. bovis. M. fermentans, M. opalescens, M. primatum, M. spermatophilum, M. synoviae)를 검출하는 11, 12, 13, 14의 프로브를 고안하였으며, 그룹 Ⅲ(M. muris, M. penetrans, U. urealyticum)를 검출하는 서열 번호 15, 16의 프로브를 고안하였다. 그룹 Ⅳ(M. neurolyticum, M. pulmonis)를 검출하는 서열 번호 17, 18, 19의 프로브를 고안하였으며, 그룹 Ⅴ(M. genitalium, M. pirum, M. pneumoniae)를 검출하는 서열 번호 20, 21의 프로브를 고안하였다.

② 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 종 특이적 감별을 위한 프로브 제작

마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 각각의 균에서만 특이적으로 혼성화 반응을 하는 프로브는, 각각의 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의의 ITS 부분의 종 특이적인 염기서열을 근거로 하여 표 3의 서열번호 28내지 127에 해당하는 프로브로 모두 25종의 마이코플라즈마를 균주를 감별하는 100종류의 프로브를 고안하였다.

2. 에콜레플라즈마 균주 감별을 위한 프로브 제작

① 에콜레플라즈마 속 특이적 감별을 위한 프로브 제작

모든 에콜레플라즈마에서 혼성화 반응을 하도록 에콜레플라즈마의 ITS1과 ITS2를 동시에 표적으로한 보존적인 염기서열로 표 2의 서열 번호 22에 해당하는 프로브를 고안하였다. 또한, 에콜레플라즈마 ITS1과 ITS2를 각각 표적으로한 보존적인 염기서열을 하기와 같이 고안하였다. 그룹 Ⅰ은 ITS1을 표적으로 하여 서열 번호 23, 24, 25에 해당하는 프로브를 고안하였으며, 그룹 Ⅱ는 ITS2를 표적으로 하여 서열 번호 26, 27에 해당하는 프로브를 고안하였다.

② 에콜레플라즈마 종 특이적 감별을 위한 프로브 제작

에콜레플라즈마 각각의 균에서만 특이적으로 혼성화 반응을 하는 프로브는, 각각의 에콜레플라즈마의 ITS 부분의 종 특이적인 염기서열을 근거로 하여 표 3의 서열번호 128내지 133에 해당하는 프로브를 고안하였다.

실시 예 3: 표적 DNA 준비

1. 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 표적 DNA 준비

마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 표적 DNA의 증폭을 위해 각각 바이오틴이 표지화된 5'biotin-GTG(C/G)GG(A/C)TGGATCACCTCCT-3' (MP16SF-2)와 5'-biotin-GCATCCACCA(A/T)A(A/T)AC(C/T)CTT-3' (MP23SR-2), 그리고 5'-biotin-AAAGTGGGCAATACCCAACGC-3' (M78)과 5'-biotin-CCACTGTGTGCCCTTTGTTCCT-3' (R34)를 사용하여 187~290bp 크기의 ITS 부위를 선택적으로 증폭하였다(Tang et al., 2000.). 실시 예 1에서 분리된 각종 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 표준 균주를 상기 프라이머를 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR은 94℃에서 3분간 열변성시킨 후 94℃에서 30초, 55℃에서 2분, 72℃에서 2분씩 30회 반응시킨 후, 마지막으로 72℃에서 10분간 연장하였다. 반응 후 2% 아가로스 젤로 전기 영동을 실시하여 PCR 반응 산물의 크기를 확인하였다. 도 3은 다수 마이코플라즈마의 ITS 표적 서열 증폭이 가능한 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 여부를 확인한 도면이다.

실시 예 4: 지지체에 프로브 부착

실시 예 2에서 고안된 프로브 중, 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마 및 우레아플라즈마의 각 종에 대해 대표적인 한 종의 프로브를 선정하였다. 이를 각각 384-well 마이크로플레이트에 옮겨서 Spotting 용액을 첨가하여 50pmole로 희석하였고, 마이크로어레이(Cartesian Technologies, USA)를 이용하여 슬라이드 글라스에 프로브를 부착시켰다. 도 4에 표기한 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별 프로브는 순서대로 각각 서열번호 7, 28, 30, 33, 38, 41, 49, 52, 58, 61, 69, 75, 83, 85, 87, 30, 90, 92, 96, 100, 105, 110, 114, 120, 122, 22, 128, 7에 해당된다. 한 종류의 프로브 당 두 개의 점(spot)을 지지체에 부착시킨 후, 실온에서 24시간 정치 또는 50℃의 건조기(dry oven)에 약 5시간 정치하여 지지체 위의 표면에 고정시켰다.

실시 예 5: 고정되지 않은 프로브의 세척

지지체 표면에 부착되지 않은 프로브를 제거하기 위해 0.2% SDS(Sodium dodecyl sulfate) 용액에 세척한 후, 증류수로 세척하였다. Sodium borohydride 용액에서 5분간 정치 후 끓는 증류수로 세척하였다. 0.2% SDS와 증류수를 이용하여 한 번 더 세척한 후 원심분리기를 이용하여 지지체 표면을 건조시켜 마이크로어레이 제작을 완료하였다.

실시 예 6: 혼성화 반응 (Hybridization)

실시 예 3에서 제조된 바이오틴으로 표지화된 표적 DNA를 단일 가닥으로 사용하기 위해 100℃에서 변성시킨 후, 4℃로 냉각시켰다. 2㎕의 표적 DNA를 포함하는 혼성화 반응 용액 10㎕를 제작하였다. 프로브 부착과 세척을 마친 슬라이드에 혼성화 반응 용액을 분주하고 커버 슬립을 덮은 뒤 25℃에서 1 시간 반응시켰다.

실시 예 7: 결합되지 않은 DNA의 세척

혼성화 반응을 하지 않은 잔여의 DNA를 세척하기 위해 2x SSC(300mM NaCl, 30mM Na-Citrate, pH 7.0)를 이용하여 커버 슬립을 제거한 후에 2x SSC 세척 용액과 0.2x SSC 용액 순으로 슬라이드를 세척하였다. 원심분리기를 이용하여 세척한 슬라이드를 완전하게 건조시켰다.

실시 예 8: 염료 결합 및 분석

PCR 산물과 프로브와의 결합 유무를 확인하기 위해, Cy5-streptavidin 또는 Cy3-streptavidin(Amersham pharmacia biotech, USA)을 6x SSC와 BSA(Bovine Serum Albumin)를 이용하여 희석한 후 약 40㎕를 슬라이드에 분주하여 커버 슬립을 덮고 빛을 차단한 후 50℃에서 약 20분간 반응시켰다. 반응 후 슬라이드를 2x SSC 용액을 이용하여 커버 슬립을 제거한 후, 2x SSC, 그리고 0.2x SSC 용액을 사용하여 세척하였다. 분석을 위해 비공초점 레이져 스캐너(non-confocoal laser scanner)인 GenePix 4000A(Axon Instruments, USA)를 이용하여 결과를 분석하였다.

도 5는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 각 프로브들의 특이적 혼성화 반응 결과를 화상 분석하고 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 그림으로, 대표적인 11종의 마이코플라즈마와 그 유사 균종에 대한 결과이다.

도 5a는 마이코플라즈마 클로아케일(M. cloacale) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 85)에서 혼성화 결과를 나타냈고, 도 5b는 마이코플라즈마 팔코니스(M. falconis) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 87)에서 혼성화 결과를 나타냈고, 도 5c는 마이코플라즈마 히오시노비에(M. hyosynoviae) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 90)에서 혼성화 결과를 나타냈고, 도 5d는 마이코플라즈마 뉴롤리티쿰(M. neurolyticum) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 49)에서 혼성화 결과를 나타냈고, 도 5e는 마이코플라즈마 오팔레센스(M. opalescens) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 52)에서 혼성화 결과를 나타냈고, 도 5f는 마이코플라즈마 페네트랜스(M. penetrans) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 69)에서 혼성화 결과를 나타냈고, 도 5g는 마이코플라즈마 피룸(M. pirum) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 61)에서 혼성화 결과를 나타냈고, 도 5h는 마이코플라즈마 살리바리움(M. salivarium) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 83)에서 혼성화 결과를 나타냈고, 도 5i는 마이코플라즈마 스펄마토필룸(M. spermatophilum) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 100)에서 혼성화 결과를 나타냈고, 도 5j는 우레아플라즈마 우레알리티쿰(U. urealyticum) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 7)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 122)에서 혼성화 결과를 나타냈다. 도 5k는 에콜레플라즈마 라이드라위(A. laidlawii) 속에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 22)와 종에 특이적으로 반응하는 프로브(서열 번호 128)에서 혼성화 결과를 나타냈다.

이상에서 살펴 본 바와 같이, 본 발명에 따르면, 생물 의약품 또는 세포주의 주요 오염원이자 주요 인체 병원성으로 알려져 있는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 유전자형 감별을 위한 신규 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이크로어레이를 제공함으로써 단일 검체로부터 동시에 다수의 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 유전자형 검출이 가능한 신속하고 정확한 진단 방법을 제공한다. 또한, 본 발명에 따르면, 인체 병원성에 관여하는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 감염 확산을 예방하기 위한 근원지의 추적이 가능할 뿐만 아니라, 유전자 치료 요법과 세포 치료 요법에 유용한 줄기 세포나 제대혈과 같은 세포를 비롯하여 생물 의약품에 대한 마이코플라즈마 오염 관리가 가능함으로써 점차 대량화되는 제품 생산의 유지와 관리에 대해 객관적인 신뢰성을 제공할 수 있는 검사법을 제공한다. 또한, 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 신규 올리고뉴클레오티드의 고안을 위해, 다수 마이코플라즈마의 ITS 염기 서열을 분석함으로써 상기 언급된 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 균주 감별을 위한 매우 특이적이고 및 매우 민감한 혼성화 검정법을 개발할 수 있는 근거가 되는, 표적 서열들의 프로브와 이를 포함한 마이크로어레이등의 진단 키트를 제공한다.

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도 1a 내지 1f는 마이코플라즈마 및 우레아플라즈마의 속 특이적 프로브 선정을 위한 각각의 ITS 지역의 다중 서열 정렬 도면이다.

도 2a 내지 도2c는 에콜레플라즈마의 속 특이적 프로브 선정을 위한 각각의 ITS 지역의 다중 서열 정렬 도면이다.

도 3은 다수 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 ITS 표적 서열 증폭이 가능한 프라이머 쌍에 의한 PCR 증폭 여부를 확인한 도면이다.

도 4는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 유전자형 감별을 위한 프로브를 한 세트로 하여 하나의 지지체를 구성하고 있는 마이크로어레이의 도면이다.

도 5a 내지 5k는 마이코플라즈마와 그 유사 균종의 유전자형 감별을 위한 각 프로브들의 특이적 혼성화 반응에 대한 화상 분석 결과와 그에 대한 화소 세기를 수치화하여 분석한 결과이다.

<110> GENEIN CO., LTD. KIM, Cheol-Min PARK, Hee-Kyung <120> Oligonucleotide for genotyping of Mycoplasma, microarray comprising the oligonucleotide, and method for detection of species using the microarray <130> PN053079 <160> 133 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 344 <212> DNA <213> M.bovis <400> 1 ttctacggag tacacttgtc ttttatcact ataaaaaaaa gacttataac caaaattact 60 agacctatat ttatttataa acgtcatggc ttttattaat aggtcaaaag ctatatatct 120 agttttgaga gaacattctc tcatatgttc tttgaaaact gaatagtaaa atatttttcg 180 atatttacaa cgacatcaaa aatcaaatta atggttaatt tgttttgatt catcgagtaa 240 gtcatattta atatgattca ttgaaatgtc ttaaaataca catctaaaac taacaacaat 300 aggaaaatac tacttttaaa taaggaagag tttttggtgg atgc 344 <210> 2 <211> 196 <212> DNA <213> M.cloacale <400> 2 cttctacgga gtacaattct cactgttatg gaattaaatt tgtatccagt tttgagagaa 60 ctttctctca attttgttct ttgaaaactg aatatagaca ttgaaatcaa taaattaata 120 tttcaaatgt ttagatcaac ctatagaata ttcaagacat atacaaaaat aggtcatact 180 tatatttata aatact 196 <210> 3 <211> 196 <212> DNA <213> M.falconis <400> 3 ctttctacgg agtacaactt ctgttatgga ataatatttg tatccagttt tgagagtact 60 aactctcttt ttgttctttg aaaactgaat atcgacattg aaaaattatt aattaatatt 120 tcaaagttta gatcaaccta tagaatacaa aaatatagac aacaataggt catacaacaa 180 acataacaaa acaact 196 <210> 4 <211> 239 <212> DNA <213> M.faucium <400> 4 gaatggtggc ttcgagacta aaagttatgg aaaaacatcg tatccagttt tgagagaact 60 aaacttctct cttttgttct ttgaaaactg aatatagaca ttgaaaatta aaaaattaat 120 atttcaaagt ttagatcaac ctatagaata caaaatcaat acaataggtc aatactatac 180 aattgcataa caaaaaatac tattaaacaa gataagagtt tttggtggat gcaattgta 239 <210> 5 <211> 340 <212> DNA <213> M.spermatophilum <400> 5 gtggggatgg atcacctcct ttctacggag tacaaacata cattcaaatt ttgactgaat 60 gttattaacc ttattttttc actaggcctt tttaatatat tttgttatgt gacttttatg 120 gcctaaaagt cttatatcta gttttgagag gacatcctct ctaattgttc tttgaaaact 180 gaatagtaaa ttttttgata tttacaacga catctaaata attgaattaa gtcaatttgt 240 ttagatttca tcgagatagt cattttaaaa aaatgattca ttgaaatgtc ttaaaataca 300 catcaaaaca aacaatctat acaataggaa tttatatact 340 <210> 6 <211> 322 <212> DNA <213> M.synoviae <400> 6 tccttacgga gtacattaat tttacaaaag gcatttttat taactgaaag cttttagaga 60 aaaattctaa aagcggttgt gtatcgcttt ttttgccttg ggctattgta tttagttttg 120 agagaacaac ctctcttaaa attgttcttt gaaaactaaa tagtaataaa gatattacaa 180 cgacatcaaa aatataaatt aattaaggtt aatttgtttt gataccgagt ttaaattatt 240 gaataataat ttattaaaat gtctttgaat acatcataac aatataacaa taggacatat 300 tgatactaac ttttaaaaaa gt 322 <210> 7 <211> 15 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting Mycoplasma <400> 7 ttctttgaaa actga 15 <210> 8 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting Mycoplasma <400> 8 rwtctttvaa aactrratwn 20 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. arginini, etc. <400> 9 mwtygtrtcc agttttgaga g 21 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. arginini, etc. <400> 10 tttagatcaa cctatagaat a 21 <210> 11 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. bovis, etc. <400> 11 rtatytagtt ttgagagrrc a 21 <210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. bovis, etc. <400> 12 wwtrattyat traaatgtct t 21 <210> 13 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. bovis, etc. <400> 13 ggkyaatttg tttwgat 17 <210> 14 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. bovis, etc. <400> 14 ratatttaca mcgmcayc 18 <210> 15 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. muris, etc. <400> 15 cctcctttct atcggagtam a 21 <210> 16 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. muris, etc. <400> 16 cggattctat ttagttttga g 21 <210> 17 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. neurolyticum, etc. <400> 17 taaaatagat accttaakat a 21 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. neurolyticum, etc. <400> 18 gtatyyagtt ttgaaag 17 <210> 19 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. neurolyticum, etc. <400> 19 cttgccaawt agwtwt 16 <210> 20 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. genitalium, etc. <400> 20 awacracaat ctttctagtt c 21 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. genitalium, etc. <400> 21 aataagttac taagggctta t 21 <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting Acholeplasma <400> 22 tcatcatatt cagttttg 18 <210> 23 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting Acholeplasma <400> 23 gggcctrtag ctcagytggt t 21 <210> 24 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting Acholeplasma <400> 24 agagcrcwcg cytgataagc g 21 <210> 25 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting Acholeplasma <400> 25 wgrggtcgat ggttcragtc c 21 <210> 26 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting Acholeplasma <400> 26 tcatcatatt cagttttgar r 21 <210> 27 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting Acholeplasma <400> 27 agtctttgaa aagtagataa a 21 <210> 28 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. arginini <400> 28 agattatatc atacaataga 20 <210> 29 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. arginini <400> 29 gagtacataa atgttatgga a 21 <210> 30 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. arthritidis-faucium <400> 30 tgaagcccga tggtggcttc g 21 <210> 31 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. arthritidis-faucium <400> 31 tgagagaact aaacttctct c 21 <210> 32 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. arthritidis-faucium <400> 32 gaatacaaaa tcaatacaat a 21 <210> 33 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. fermentans <400> 33 atgtactatt aacttatttc ac 22 <210> 34 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. fermentans <400> 34 tacaaaagag tactttttaa a 21 <210> 35 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. fermentans <400> 35 tttttatggg tctaaagctt t 21 <210> 36 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. fermentans <400> 36 gaacaatatt tttttctctc a 21 <210> 37 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. fermentans <400> 37 ataacaaact ataacaatag g 21 <210> 38 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hominis <400> 38 atttatctct cggttcttt 19 <210> 39 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hominis <400> 39 atatttatat tttataagac a 21 <210> 40 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hominis <400> 40 attgatatat taattaatat t 21 <210> 41 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyorhinis <400> 41 gaatagcaaa taacaatatg att 23 <210> 42 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyorhinis <400> 42 cggagtacat tagtcttaat t 21 <210> 43 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyorhinis <400> 43 ttacataatc gattcgtgtc t 21 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyorhinis <400> 44 agctttaagt tctcaattat a 21 <210> 45 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyorhinis <400> 45 ttcatattta ttatttcaac g 21 <210> 46 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyorhinis <400> 46 aacgatcttt tttataaccg a 21 <210> 47 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyorhinis <400> 47 ttaaatttct aaaatagatt a 21 <210> 48 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyorhinis <400> 48 agatatttat ctttagcaat a 21 <210> 49 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. neurolyticum <400> 49 ggttattatg ggcttgcta 19 <210> 50 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. neurolyticum <400> 50 ggttatttaa aaatcctttt a 21 <210> 51 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. neurolyticum <400> 51 taattttttc tttctaatta a 21 <210> 52 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. opalescens <400> 52 catcataatg taaccaatac 20 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. opalescens <400> 53 acaaaaatca ttatttttaa t 21 <210> 54 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. opalescens <400> 54 tttaatgatt attaaccttt t 21 <210> 55 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. opalescens <400> 55 ttatgtgctt tgtttttatg g 21 <210> 56 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. opalescens <400> 56 tatggtctac aaagcttata t 21 <210> 57 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. opalescens <400> 57 gataaaaaac aatcataaat t 21 <210> 58 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. orale <400> 58 cataaatagt taatggctca 20 <210> 59 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. orale <400> 59 atagagacaa atacaaaaac a 21 <210> 60 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. orale <400> 60 ggtcaaaaat acttatacgt a 21 <210> 61 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pirum <400> 61 tagttctttg tgtgaataac a 21 <210> 62 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pirum <400> 62 ctttatacac cttattacaa t 21 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pirum <400> 63 taaaatccaa tttaaatgtt a 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pirum <400> 64 gcaaatttga tgtcaacatt t 21 <210> 65 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pirum <400> 65 aattaatctc tcctattact t 21 <210> 66 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pirum <400> 66 ttaaagtagt agagatggtt c 21 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pirum <400> 67 caaatatcaa atgctaatgg a 21 <210> 68 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pirum <400> 68 atgctaatgg atatcaaaaa a 21 <210> 69 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. penetrans <400> 69 aagagtaagt tctaggtcg 19 <210> 70 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. penetrans <400> 70 cattaaagct aagtaacaaa t 21 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. penetrans <400> 71 tcctaaactg aaatttatct 20 <210> 72 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. penetrans <400> 72 ttatataaga gtaagttcta g 21 <210> 73 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. penetrans <400> 73 atttttctct caagatagtt c 21 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. penetrans <400> 74 tctaatcata cttgttattt t 21 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pulmonis <400> 75 aatttttgat ccgagtcatt 20 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pulmonis <400> 76 catttttcta tcaatagtta t 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pulmonis <400> 77 tatgtgtatc ttgccaatta g 21 <210> 78 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pulmonis <400> 78 ttctatcttt caaaacaaat a 21 <210> 79 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pulmonis <400> 79 tataaattaa tatgataacg t 21 <210> 80 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pulmonis <400> 80 tcatcaaaat gtaaaatttt t 21 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pulmonis <400> 81 aaaaataaaa tagatacctt a 21 <210> 82 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pulmonis <400> 82 aaataaattt caacaatagg a 21 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. salivarium <400> 83 taatggattt aattttcgtg 20 <210> 84 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. falconis <400> 84 gagtacaact tctgttatg 19 <210> 85 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. salivarium <400> 85 tatcaaatca atataatatt t 21 <210> 86 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. cloacale <400> 86 agtacaattc tcactgttat g 21 <210> 87 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. cloacale <400> 87 tagaatattc aagacatata c 21 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. falconis <400> 88 agaatacaaa aatatagaca a 21 <210> 89 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. falconis <400> 89 attgaaaaat tattaattaa t 21 <210> 90 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyosynoviae <400> 90 ctagactaaa gttaatggta c 21 <210> 91 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. hyosynoviae <400> 91 aattatcaaa ttaatatttc a 21 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. muris <400> 92 tatagaaaac ccccacatca 20 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. muris <400> 93 tattagaata ttttaaatat t 21 <210> 94 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. muris <400> 94 gattattaca ccatattaga a 21 <210> 95 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. muris <400> 95 tcaataaacc taaataaaaa a 21 <210> 96 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. primatum <400> 96 gtagacataa ccccagcta 19 <210> 97 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. primatum <400> 97 caaacgtcta tcgcttttta g 21 <210> 98 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. primatum <400> 98 tcatgggctt ttaatagggt c 21 <210> 99 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. primatum <400> 99 accccaactc ccatcaaaaa t 21 <210> 100 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. spermatophilum <400> 100 ttcatcgaga tagtcatttt a 21 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. spermatophilum <400> 101 caaacataca ttcaaatttt 20 <210> 102 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. spermatophilum <400> 102 ttttgactga atgttattaa c 21 <210> 103 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. spermatophilum <400> 103 tttgttatgt gacttttatg g 21 <210> 104 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. spermatophilum <400> 104 aaaacaaaca atctatacaa t 21 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. synoviae <400> 105 ttggcttggg ctattgtatt 20 <210> 106 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. synoviae <400> 106 gcggttgtgt atcgcttttt t 21 <210> 107 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. synoviae <400> 107 acctctctta aaattgttct t 21 <210> 108 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. synoviae <400> 108 ccgagtttaa attattgaat a 21 <210> 109 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. synoviae <400> 109 catcataaca acataacaat a 21 <210> 110 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pneumoniae <400> 110 gtaaattaaa cccaaatccc 20 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pneumoniae <400> 111 atctttaata aagataaata c 21 <210> 112 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pneumoniae <400> 112 ctaaacaaaa catcaaaatc c 21 <210> 113 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. pneumoniae <400> 113 aaagaacatt tccgcttctt t 21 <210> 114 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. genitalium <400> 114 caccccttaa ttttttcgg 19 <210> 115 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. genitalium <400> 115 aatggagttt ttatttttta ttta 24 <210> 116 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. genitalium <400> 116 cccaaatcaa tgtttggtct c 21 <210> 117 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. genitalium <400> 117 caactaacac acttggtcag t 21 <210> 118 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. genitalium <400> 118 agaatgtttt tgaacagttc 20 <210> 119 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. genitalium <400> 119 tagttccaaa aataaatacc a 21 <210> 120 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. bovis <400> 120 tataaccaaa attaaaagac cta 23 <210> 121 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting M. bovis <400> 121 gtcatggctt ttattaatag g 21 <210> 122 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting U. urealyticum <400> 122 cattaagttg tcagtgaa 18 <210> 123 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting U. urealyticum <400> 123 taatttacgt actaataagt g 21 <210> 124 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting U. urealyticum <400> 124 tttattaaaa tccatatgaa t 21 <210> 125 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting U. urealyticum <400> 125 aagccacttt tttaaaaatt t 21 <210> 126 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting U. urealyticum <400> 126 ccataataat taatttatta t 21 <210> 127 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting U. urealyticum <400> 127 attatcaaca aatctttcta a 21 <210> 128 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting A. laidlawii <400> 128 aacacttagc acaagatgac 20 <210> 129 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting A. laidlawii <400> 129 ctttctaagg agaaaggcta a 21 <210> 130 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting A. laidlawii <400> 130 atgactacta gtaagtagta a 21 <210> 131 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting A. laidlawii <400> 131 gtagtaatat tctctaaatt t 21 <210> 132 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting A. laidlawii <400> 132 ttaaagtaat ttaagtgttt c 21 <210> 133 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Probe for detecting A. laidlawii <400> 133 taaatgatgt ctgaaaagaa a 21

Claims

서열번호 1 내지 6 중 어느 하나의 염기서열을 포함하는 마이코플라즈마 균주 감별을 위한 ITS(internal transcribed spacer) 표적 DNA.
서열번호 7 내지 21 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 마이코플라즈마 속 특이적 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
서열번호 28 내지 127 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 마이코플라즈마 종 특이적 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
서열번호 22 내지 27 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 에콜레플라즈마 속 특이적 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
서열번호 128 내지 133 중 어느 하나의 염기서열이나 이에 상보적인 염기서열을 포함하는 에콜레플라즈마 종 특이적 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드.
제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 마이코플라즈마 및 에콜레플라즈마의 종과 속 특이적 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 프로브(probes)를 지지체에 부착하여 포함하는 마이크로어레이.
제 6항에 있어서, 상기 프로브는 DNA, RNA, 또는 PNA, LNA, HNA를 포함하는 핵산유사체인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
제 6항에 있어서, 상기 지지체는 슬라이드글라스, 플라스틱, 멤브레인, 반도체 칩(semiconductive chip), 실리콘 또는 젤(gel)인 것을 특징으로 하는 마이크로어레이.
시료에 존재하는 핵산을 분리하는 단계, 상기 분리된 핵산 중 표적 DNA를 증폭하는 단계, 상기 증폭된 DNA를 제 6항에 따른 마이크로어레이상의 프로브와 혼성화시키는 단계, 상기 형성된 하이브리드의 시그날을 검출하는 단계를 포함하는 마이코플라즈마 검출 방법.
제 2항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 마이코플라즈마, 에콜레플라즈마와 우레아플라즈마의 종과 속 특이적 균주 감별을 위한 올리고뉴클레오티드 중 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 마이코플라즈마 진단 키트.