KR20050042517A - 히알루론산을 주재로 한 다공성 스폰지의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자연계에 널리 존재하는, 더욱 바람직하게는 생체내에 널리 존재하는 저분자 유기산의 안히드리드와 히알루론산을 이용하여 히알루론산 다공성 스폰지를 제조하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 의해 다공성 스폰지의 형태를 오랫동안 유지할 수 있으며, 기계적 강도가 향상되며, 세포나 조직배양의 조건인 pH 4.0 내지 7.4의 수용액 또는 세포배양 배지에서 용해되지 않고, 생분해 속도가 늦추어지며, 세포독성이 없고 생체친화성이 높은 히알루론산 다공성 스폰지를 제공할 수 있다.

Description

히알루론산을 주재로 한 다공성 스폰지의 제조방법 {The Method of Preparation of Porous Gel Sponge Using Hyaluronan and Anhydrides}

히알루론산은, β-D-N-아세틸글루코사민과 β-D-글루쿠론산이 교대로 결합된 직쇄상의 고분자로 분자량이 50,000 ~ 10,000,000Da 또는 그 이상인 다당류이다. 히알루론산은 생체 결합조직의 기본물질로, 주로 포유동물의 피부, 관절의 활액(synovial fluid), 눈의 초자체액(vitreous humor), 탯줄(umbilical cord), 혈청(serum), 닭 벼슬(cock's comb) 등에 분포해 있으며, 연쇄구균이나 간균류의 협막 등에도 존재하는 것이 알려져 있다. 히알루론산을 얻기 위한 일반적인 방법으로는 닭 벼슬, 탯줄 등에서 추출하는 방법과, 연쇄구균, 간균을 배양한 후 이것으로부터 추출 정제하는 방법 등이 있다.

천연 히알루론산은 분자량에 비례한 다분(polydisperse) 산성이지만, 종간 특이성을 갖지 않으며 또한 조직이나 장기특이성을 갖지 않아, 그 유래에 관계없이 생체에 이식 또는 주입한 경우에 우수한 생체적합성을 나타내는 것으로 알려져 있다. 그러나, 생체에 히알루론산을 천연 그대로 적용하는 경우에는, 체내에 존재하는 히알루로니다아제라는 효소에 의해 쉽게 분해되므로 생체조직 내에서의 반감기가 0.5 내지 3일 정도로 체내 체류시간이 비교적 짧아, 의용재료로 이용하기에는 한계가 있다. 이의 용도를 의용재료로 확장하기 위해서, 히알루론산을 여러종류의 화학수식제(chemical modifier)를 이용하여 가교결합(cross-linking)을 하거나 작용기를 붙이는 방법으로 변성하여 체내 지속성을 향상시키는 것이 시도되어 왔다.

여러 방법으로 히알루론산의 물리 화학적 또 생물학적 특성을 변성하여 다양한 용도로 사용하려는 시도들 중, 특히 여러 방법으로 제조된 다공성 스폰지(porous sponge)는 세포나 조직의 배양과 이식을 목적으로 하는 다공성 지지체나 상처 피복재, 치과용 매트릭스 등과 같은 의용재료, 약물전달 시스템의 담체 등과 같은 의약용 재료에 이용될 수 있다.

히알루론산을 이용하여 다공성 스폰지를 만드는 일반적인 방법들을 살펴보면, 순수한 히알루론산만으로 제조된 다공성 스폰지는 물에 쉽게 녹아 그 형태를 잃게 되므로, 히알루론산의 물에서의 불용성을 향상시키기 위해 여러 가지 가교제를 사용하고 있다. 이 중 대표적인 것은, 디비닐 술폰, 비스에폭시드 또는 포름알데히드와 같은 이작용성 가교제를 사용하여 수득한 고팽윤성의 가교된 히알루론산 겔이다 (USP 4,582,865, JP-B-6-37575, JP-A-7-97401 및 JP-A-60-130601).

히알루론산의 테트라부틸암모늄염이 디메틸 술폭시드(DMSO)와 같은 유기 용매에 용해하는 특징을 이용한 히알루론산의 화학적 변성 방법도 제안되고 있다 (JP-A-3-105003). 히알루론산의 테트라부틸암모늄염을 디메틸 술폭시드 중에서, 트리에틸아민과 2-클로로-1-메틸피리디늄 요오드로 처리하여, 히알루론산의 카르복실기와 히드록실기 사이에서 에스테르 결합을 형성시키는 방법도 제안되어 있다 (EP-A-0341745A1).

또한, 공유 결합하는 화학 약품을 사용하지 않고, 히알루론산을 물에 불용화하는 접근으로서, 아미노기 또는 이미노기를 가지는 고분자와 히알루론산을, 히알루론산의 카르복실기와 고분자의 아미노기 또는 이미노기를 통해 이온 결합시켜 히알루론산-고분자 착물을 제조하는 방법도 제안되어 있다 (JP-A-6-73103).

또 가교제로 카보디이미드 또는 숙신이미딜활성에스테르를 사용한 방법이 제안되어 있다 (WO94/2517, USP 4,970,298).

히알루론산 수용액이 산성화, 예를 들어 pH 2.0 내지 2.7 의 범위로 되는 경우, 젤리화에 의해 이른바 퍼티겔(putty gel)을 형성하는 것은 알려져 있지만, pH 2.0 미만에서는 퍼티겔이 형성되지 않을 뿐 아니라 퍼티겔은 중성 수용액 중에 빠르게 용해하기 때문에, 본 발명에 따른 다공성 스폰지와는 차별화된다.

그러나, 디비닐 술폰이나 비스에폭시드, 알데히드 등을 가교제로 사용할 경우 미 반응한 잔류물에 의한 세포독성이 문제가 될 수 있어 사용농도나 처리 조건 등에 많은 제한이 있다. 또한 아미노기 성분을 갖는 생체재료 특히 콜라겐 기반 재료의 가교에 사용되고 있는 수용성의 카보디이미드는 체내에서 세포독성을 보이지 않으나 과량 사용되어야 가교효과를 나타낼 수 있으며 비싸다는 단점이 있다.

이에 본 발명자는 상기한 문제점을 해결하기 위해서 연구를 거듭한 결과, 히알루론산 수용액을 동결건조하여 스폰지를 제조한 다음, 이를 저분자 유기산의 안히드리드 (anhydride) 액에 침지시켜 유지한 후 안히드리드를 제거하여 다공성 스폰지를 제조하면 기계적 강도도 항상되며, 통상의 조직배양 조건인 pH 4.0 내지 7.4의 수용액에 용해하지 않고, 다공성 스폰지의 생분해 속도도 감소되며, 세포독성이 적은 히알루론산 다공성 스폰지를 제조할 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하게 되었다. 저분자 유기산의 안히드리드는 물과 반응하면 쉽게 유기산으로 분해가 되므로 다공성 스폰지에 소량 남아있어도 세포독성이나 기타 독성을 갖지 않는다.

본 발명의 목적은 다공성 스폰지의 형태를 오랫동안 유지할 수 있으며, 기계적 강도가 향상되며, 세포나 조직배양의 조건인 pH 4.0 내지 7.4 정도의 수용액 또는 배지에서 용해되지 않고, 생분해 속도가 늦어진 생체친화성이 높은 히알루론산 다공성 스폰지의 제조 방법을 제공하는 것이다.

상기의 목적을 이루기 위해 본 발명에 따른 히알루론산 다공성 스폰지의 제조 방법은 (1) 분자량 70,000 ~ 4,000,000 정도의 고분자 히알루론산의 알칼리 염을 pH 9.0 내지 14.0의 알칼리 용액에 녹여 0.5 ~ 5 중량% 농도(w/v)의 수용액을 만든 후 수용액의 pH를 5.5 내지 7.5로 조절하는 단계;

(2) 상기 (1)단계의 히알루론산 수용액을 동결건조기의 선반에 넣고 선반의 온도와 진공챔버(vacuum chamber)의 진공도를 적절히 조절하여 24시간 이상 동결건조(lyophilization)하여 히알루론산 다공성 스폰지를 제조하는 단계;

(3) 상기 히알루론산 다공성 스폰지를 5 ~ 100부피% 농도(v/v)의 안히드리드 원액 또는 그 안히드리드를 구성하는 단위 유기산으로 희석한 안히드리드 용액에 침지하여 4℃ ~ 42℃의 온도에서 24시간 내지 72시간 또는 그 이상 유지하는 단계;

(4) 다공성 스폰지를 안히드리드 용액에서 꺼낸 후 이를 진공오븐 (vacuum oven)에 넣고 적정한 온도와 진공도를 유지하여 다공성 스폰지의 기계적 강도를 높이며 잔류 안히드리드를 제거하여 백색의 다공성 스폰지를 얻는 단계로 이루어짐을 특징으로 한다.

본 발명에 따른 히알루론산 다공성 스폰지는 조직공학의 지지체, 치과용 의용재료, 정형외과용 의용재료, 약물전달 시스템의 담체 등으로 이용될 수 있는 것으로 기대된다. 이는 생체 고분자로서 조직세포의 증식과 부착을 촉진하며, 효소나 기타 활성기(radical)에 의해 분해 되어도 유독한 물질을 생성하지 않고, 또한 세균의 침입에 대한 방어막(barrier)의 역할을 할 뿐 아니라, 세균 증식을 억제하며, 다른 약리활성 물질의 함유와 방출 조절이 용이한 특징을 갖는다.

종래의 방법들은 생체 적합성이 없는 이 작용성 가교제들을 사용하기 때문에 미 반응한 가교제들에 의한 세포 독성이 문제와 생체적합성의 감소가 필연적이지만, 본 발명의 히알루론산 다공성 스폰지의 경우 생체 내에 다량 존재하는 저분자 유기산의 안히드리드를 이용하기 때문에 생체적합성의 감소가 거의 없을 것을 기대할 수 있다.

이하, 본 발명의 히알루론산 다공성 스폰지의 제조 방법을 단계별로 보다 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(1) 분자량 70,000 ~ 4,000,000 정도의 고분자 히알루론산의 알칼리 염을 pH 9.0 내지 14.0의 알칼리 용액에 녹여 0.5 ~ 5 중량% 농도(w/v)의 수용액을 만든 후 수용액의 pH를 5.5 내지 7.5로 조절하는 단계;

히알루론산의 알칼리 염, 보다 일반적으로는 히알루론산의 나트륨 염이나 칼륨염이 물에 용해되기 위해서는 물과 히알루론산이 수소결합을 형성하여야 한다. 그러므로 물의 pH를 알칼리 상태로 하면 히알루론산과 결합하여 염을 이룬 나트륨이나 칼륨이 쉽게 해리되어 물과 히알루론산의 수소결합이 더 잘 일어나 히알루론산의 용해 속도가 빨라지게 된다. 녹이고자 하는 히알루론산의 농도와 비례하여 물의 알칼리도를 높이는 것이 좋으나 pH가 너무 높으면 히알루론산이 가수분해 될 염려가 있으므로 보통 pH 9.0 내지 12.0 정도가 되도록 하는 것이 좋다. 일반적으로 수산화 나트륨이나 수산화 칼륨을 이용하여 물의 알칼리도를 높인다. 히알루론산이 완전히 녹으면 희박염산 용액을 이용하여 히알루론산 수용액의 pH를 5.5 내지 7.5로 조절한다. 히알루론산 수용액의 pH를 중성으로 조절하지 않으면 다음 단계의 동결건조에 의해 수분이 줄면 히알루론산 수용액중의 수산화이온이 농축되어 pH가 급격히 높아져 히알루론산의 분해가 일어날 위험이 있으므로 동결건조 전에 pH를 중성으로 조절하는 것이 바람직하다.

(2) 상기 (1)단계의 히알루론산 수용액을 동결건조기의 선반에 넣고 선반의 온도와 진공챔버의 진공도를 적절히 조절하여 24시간 이상 동결건조하여 히알루론산 다공성 스폰지를 제조하는 단계;

히알루론산 다공성 스폰지의 공극의 크기는 히알루론산 수용액의 농도와 동결건조 조건에 의해 조절될 수 있다. 일반적으로 히알루론산의 농도가 높으면 공극의 크기가 작으며 더 조밀한 스폰지가 형성된다. 또한 동결건조시 동결 속도가 빠르면 작은 얼음 입자가 형성되므로 스폰지 공극의 크기가 작아지고 동결속도가 느리면 얼음입자가 커져 동결건조 후 공극의 크기가 큰 스폰지가 만들어 진다. 조직공학의 지지체로 사용 가능한 스폰지는 조직 세포가 스폰지 내부로 쉽게 침윤되고 부착되어야 하므로 공극의 크기가 직경 10 ~ 100마이크로미터 정도가 되는 것이 좋다. 히알루론산 0.5 ~ 2.0중량% 농도의 용액을 분당 1 ~ 2℃ 정도의 냉각속도로 동결하면 공극의 크기를 직경 10 ~ 100마이크로미터로 유지할 수 있다.

동결건조 중 건조 과정에서는 수분의 승화에 필요한 에너지는 선반을 가열함으로써 얻어질 수 있는데 과량의 열이 가해질 경우에는 스폰지의 재 융해나 콜랩스(collapse)가 일어날 수 있으므로 선반의 온도를 정밀하게 조절하여야 한다.

진공챔버의 진공도는 건조 중인 스폰지 온도의 얼음이 갖는 수증기 분압에 따라 설정되고 정밀하게 조절되어야 한다. 일반적으로 얼음의 수증기 분압보다 10 ~ 30 mTorr 정도 낮게 설정하여 동결건조를 수행하는 것이 바람직하다.

(3) 상기 히알루론산 다공성 스폰지를 5 ~ 100부피% 농도(v/v)의 안히드리드 원액 또는 그 안히드리드를 구성하는 단위 유기산으로 희석한 안히드리드 용액에 침지하여 4℃ ~ 42℃의 온도에서 24시간 내지 72시간 또는 그 이상 유지하는 단계;

본 발명에 사용된 안히드리드는 저분자의 유기산의 안히드리드로, 이 저분자 유기산은 생물학적 시스템 중에 광범위하게 존재하는 것이 바람직하다. 그 종류는 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면, 아세틱 안히드리드(acetic anhydride), 프로피오닉 안히드리드(propionic anhydride), 부티릭 안히드리드(butyric anhydride), 카프로익 안히드리드(caproic anhydride), 이소부티릭 안히드리드(isobutyric anhydride) 등을 사용하는 것이 바람직하다. 이들 안히드리드들은 일반적으로 축합반응을 촉진하는 역할을 하여 다공성 스폰지의 강도를 높인다. 이들 안히드리드들은 각 유기산에 섞어 부피%농도를 조정할 수 있다. 예건대, 아세틱 안히드리드는 아세트산, 프로피오닉 안히드리드는 프로피온산, 부티릭 안히드리드는 부티르산과 조합하여 5 ~ 100부피%농도로 사용하는 것이 바람직하다.

(4) 다공성 스폰지를 안히드리드 용액에서 꺼낸 후 이를 진공오븐 (vacuum oven)에 넣고 적정한 온도와 진공도를 유지하여 다공성 스폰지의 기계적 강도를 높이며 잔류 안히드리드를 제거하여 백색의 다공성 스폰지를 얻는 단계;

다공성 스폰지에 남아있는 저분자 유기산과 그 유기산의 안히드리드를 완전히 제거하기 위해 진공오븐에 넣고 절대압력 기준으로 10Torr 이하로 진공을 유지한 체 온도를 80℃ ~ 160℃로 유지한 체 24시간 이상, 더 바람직하게는 48시간 이상 건조한다. 진공도가 충분하지 않은 상태에서 온도가 급격하게 올라가면 스폰지의 분해 일어날 수 있으므로, 진공이 10Torr 이하가 되었을 때 온도를 올리는 것이 바람직하다. 또한, 오븐의 온도가 높아지면 축합반응에 필요한 에너지를 쉽게 공급 받을 수 있어 다공성 스폰지의 기계적 강도를 더 높일 수 있다.

이하 본 발명의 실시예 및 비교예들을 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다. 그러나 본 발명이 이들 실시예들에만 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1 ~ 4]

히알루론산 나트륨 (극한점도로부터의 환산 분자량 1 X 10⁶ Da) 0.24g을 상온에서 0.05mol/l 농도의 수산화나트륨용액 20ml에 녹여 0.6중량% 농도의 수용액을 만든다. 이 히알루론산 수용액을 희박 염산용액을 이용하여 pH를 6.8로 조절하였다. 이것을 각각 5ml씩 취하여 4개의 직경 60㎜의 페트리디쉬에 부어 수용액의 두께가 약 2㎜ 정도가 되게 하였다. 이들 페드리디쉬들을 모두 동결건조기의 선반에 옮기고 분당 1.0℃의 냉각속도로 -40℃까지 동결하고 30분간 유지하였다. 동결건조기 진공챔버를 감압하여 챔버의 압력을 100mTorr로 설정하고 선반의 온도를 -38℃로 설정하여 600분 동안 유지하였다. 80분간 선반의 온도를 분당 0.1℃의 속도로 서서히 올리며, 챔버압력은 분당 2mTorr의 속도로 올려, 선반온도 -30℃, 진공도 260mTorr가 되게 설정 하였다. 선반온도 -30℃, 진공도 260mTorr에서 360분간 유지하여 동결건조를 계속하였다. 다시 50분간 선반의 온도를 분당 0.2℃의 속도로 서서히 올리며, 챔버압력은 분당 10mTorr의 속도로 올려, 선반온도 -20℃, 진공도 760mTorr가 되게 설정 하였다. 선반온도 -20℃, 진공도 760mTorr에서 120분간 유지하며 동결건조를 계속하였다. 다시 50분간 선반의 온도를 분당 0.2℃의 속도로 서서히 올리며, 챔버압력은 분당 23mTorr의 속도로 올려, 선반온도 -10℃, 진공도 1910mTorr가 되게 설정 하였다. 선반온도 -10℃, 진공도 1910mTorr에서 120분간 유지하며 동결건조를 계속하였다. 다시 100분간 선반의 온도를 분당 0.4℃의 속도로 올리고, 챔버압력은 30mTorr로 설정하였다. 선반온도 30℃, 진공도 30mTorr에서 180분간 유지하여 동결건조를 완료하였으며, 두께 2㎜, 직경 60㎜를 갖는 미백색의 다공성 스폰지를 1차로 얻었다. 이것 들을 다음 표 1에 기재된 바와 같이 각각 5부피%, 20부피%, 50부피%, 100부피% 농도의 아세틱 안히드리드 (acetic anhydride) 용액에 24시간 동안 침지하여 상온에서 유지한 후, 이 스폰지를 진공오븐으로 옮기고 진공오븐을 감압하여 진공도 20mmHg가 되었을 때 진공오븐을 가열하기 시작하였다. 진공오븐의 온도는 90℃로 설정하여 유지하였으며, 24시간 경과 후 미백색의 다공성 스폰지들을 취하였다. 이렇게 취한 스폰지들을 모두 2등분 한 후 각각 pH 4.1과 7.4의 완충용액에 담가 72시간 동안 방치한 후 취하여 과량의 수분을 제거한 후 무게를 측정하여 스폰지겔 중의 수분함량을 계산한 후 평균하여 함수율로 다음 표 1에 기재하였다.

또, 스폰지의 안정성을 확인하기 위해 완충용액에 침지된 스폰지의 형태를 면밀히 관찰하여 물에 용해되는지의 여부를 판단하였으며, 그 결과를 다음 표 1에 기재하였다.

또한, 세포독성 여부를 다음과 같이 확인하였다. 이들 다공성 스폰지 각각 50mg을 취한 후 기계적으로 분쇄하고, 이들을 각각 2ml의 세포배양 배지(10부피%의 우태혈청이 포함된 DMEM)에 혼합하여 냉장실(4℃)에 7일간 유지하여 다공성 스폰지 성분이 충분히 추출될 수 있게 하였다. 7일 후 원심분리를 하여 스폰지를 제거하고 상층액만 취하여 이를 각각 6-웰 디쉬의 웰에 넣었다. 각각의 웰에 1X10⁴ 세포를 접종하여 배양을 시작하였으며, 배양 시작 후 2일, 4일, 6일, 8일 후에 현미경 상에서 세포 밀도를 관찰하여 세포독성 여부를 확인하였다. 다공성 스폰지에 노출되지 않은 10부피%의 우태혈청이 포함된 DMEM에서 증식하는 세포군을 대조구로 하였다. 이렇게 측정한 세포독성 결과를 다음 표 1에 기재하였다.

[실시예 5 ~ 8]

실시예 1 ~ 4에 있어서 히알루론산 농도가 1.2중량%가 되게 0.48g의 히알루론산 나트륨을 사용하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하였다.

[실시예 9 ~ 12]

실시예 1 ~ 4에 있어서 5℃, 72시간의 조건으로 아세틱 안히드리드 용액에 침지하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하였다.

[실시예 13 ~ 16]

실시예 1 ~ 4에 있어서 프로피오닉 안히드리드 용액에 24시간 동안 침지하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하였다.

[비교예 1]

실시예 1 ~ 4에 있어서 아세틱 안히드리드 용액에 침지하는 단계와, 진공오븐에서의 처리 단계를 생략하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하여 1차 스폰지만 취하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.

[비교예 2]

실시예 1 ~ 4에 있어서 순수 아세트산에 침지하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4와 동일한 조작을 실시하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.

[비교예 3]

실시예 5 ~ 8에 있어서 순수 아세트산에 침지하였다. 그리고 실시예 5 ~ 8과 동일한 조작을 실시하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.

[비교예 4]

실시예 13 ~ 16에 있어서 순수 프로피온산에 침지하였다. 그리고 실시예 13 ~ 16과 동일한 조작을 실시하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.

[비교예 5]

실시예 1 ~ 4에 있어서 100부피%의 아세틱 안히드리드 용액에 침지하였으나,진공오븐에서 강화, 건조하는 단계를 생략하고, 송풍건조 하였다. 그리고 실시예 1 ~ 4과 동일한 조작을 실시하였으며, 세포독성 시험은 수행하지 않았다.

	히알루론산 농도(중량%)	안히드리드 및 유기산	혼합비	함수율(평균)	72시간 후 스폰지의 용해 여부○: 비용해△: 일부용해X: 완전용해		세포독성 ○: 있음X: 없음
					pH 4.1	pH 7.4
실시예 1	0.6	아세틱 안히드리드/아세트산	100:0	0.983	○	○	X
실시예 2			50:50	0.986	○	○	X
실시예 3			20:80	0.991	○	○	X
실시예 4			5:95	0.992	○	○	X
실시예 5	1.2	아세틱 안히드리드/하세트산	100:0	0.979	○	○	X
실시예 6			50:50	0.981	○	○	X
실시예 7			20:80	0.988	○	○	X
실시예 8			5:95	0.989	○	○	X
실시예 9	0.6	아세틱 안히드리드/하세트산	100:0	0.987	○	○	X
실시예 10			50:50	0.991	○	○	X
실시예 11			20:80	0.992	○	○	X
실시예 12			5:95	0.993	○	○	X
실시예 13	0.6	프로피오닉 안히드리드/프로피온산	100:0	0.985	○	○	X
실시예 14			50:50	0.989	○	○	X
실시예 15			20:80	0.992	○	○	X
실시예 16			5:95	0.992	○	○	X
비교예 1	0.6	-	-	-	X	X	-
비교예 2	0.6	아세트산 100%	-	-	X	X	-
비교예 3	1.2	아세트산 100%	-	-	X	X	-
비교예 4	0.6	프로피온산 100%	-	-	X	X	-
비교예 5	0.6	아세틱 안히드리드/아세트산	100:0	-	○	△	-

이상에서 설명한 바와 같이, 히알루론산 용액을 동결건조하여 1차로 제조한 다공성 스폰지를 생체에 널리 분포되어 있는 저분자 유기산의 안히드리드 용액에 침지하고, 진공오븐에서 가온하며 진공건조하여 다공성 스폰지를 제조함으로써, 통상의 세포배양 중의 조건인 pH 4.0 내지 7.4의 수용액 상에서 스폰지의 형상을 오랫동안 유지할 수 있으며, 기계적 강도가 강화되며, 세포독성이 거의 없어 생체 적합도가 높은 히알루론산 다공성 스폰지를 만들 수 있다.

Claims (4)

1. 히알루론산을 주재로한 다공성 스폰지의 제조방법에 있어서,

   (1) 분자량 70,000 ~ 4,000,000 정도의 고분자 히알루론산의 알칼리 염을 pH 9.0 내지 14.0의 알칼리 용액에 녹여 0.5 ~ 5 중량% 농도(w/v)의 수용액을 만든 후 수용액의 pH를 5.5 내지 7.5로 조절하는 단계;

   (2) 상기 (1)단계의 히알루론산 수용액을 동결건조기의 선반에 넣고 선반의 온도와 진공챔버의 진공도를 적절히 조절하여 24시간 이상 동결건조(lyophilization)하여 히알루론산 다공성 스폰지를 제조하는 단계;

   (3) 상기 히알루론산 다공성 스폰지를 5 ~ 100부피% 농도(v/v)의 안히드리드 원액 또는 그 안히드리드를 구성하는 단위 유기산으로 희석한 안히드리드 용액에 침지하여 4℃ 내지 42℃의 온도에서 24시간 내지 72시간 또는 그 이상 유지하는 단계;

   (4) 다공성 스폰지를 안히드리드 용액에서 꺼낸 후 이를 진공오븐 (vacuum oven)에 넣고 적정한 온도와 진공도를 유지하여 다공성 스폰지의 기계적 강도를 높이며 잔류 안히드리드를 제거하여 백색의 다공성 스폰지를 얻는 단계;

   로 이루어짐을 특징으로 하는 히알루론산 다공성 스폰지의 제조방법.
2. 제 1항에 있어서, 상기한 (3)단계에서의 안히드리드 원액이 아세틱 안히드리드(acetic anhydride), 프로피오닉 안히드리드(propionic anhydride), 부티릭 안히드리드(butyric anhydride), 이소부티릭 안히드리드(isobutyric anhydride), 카르로익 안히드리드(caproic anhydride) 중에서 선택된 1종임을 특징으로 하는 히알루론산 다공성 스폰지의 제조방법.
3. 제 1항에 있어서, 상기한 (3)단계에서의 유기산에 희석한 안히드리드 용액을 만드는데 이용되는 유기산이 아세틱 안히드리드에 대하여 아세트산(acetic acid), 프로피오닉 안히드리드에 대하여 프로피온산(propionic acid), 부티릭 안히드리드에 대하여 부트르산(butyric acid), 이소부티릭 안히드리드에 대하여 이소부트르산(isobutyric acid), 카르로익 안히드리드에 대하여 카프르산(caproic acid)임을 특징으로 하는 히알루론산 다공성 스폰지의 제조방법.
4. 제 1항에 있어서, 상기한 (4)단계에서 진공오븐의 압력을 20mmHg이하로 유지하고, 온도를 80℃ 내지 160℃로 유지하여, 히알루론산 다공성 스폰지의 기계적 강도를 높이고 잔류한 안히드리드를 제거하는 것을 특징으로 하는 히알루론산 다공성 스폰지의 제조방법.