KR20050042162A - 야생형 또는 변이체 ｅＮＯＳ를 사용한 위급한 사지 허혈에대한 유전자 요법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 세포에서 eNOS 활성을 조정하기 위하여 eNOS 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 사용하여 위급한 사지 허혈(CLI)을 예방, 진단 및 치료하기 위한 신규 방법을 제공한다. 야생형 및 변이체 eNOS 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 제공된다. 본 발명의 eNOS 변이체 폴리펩티드는 세포에서 포스포릴화된 포유동물 eNOS의 기능성 도메인 내의 부위에 상응하는 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다.

Description

야생형 또는 변이체 ｅＮＯＳ를 사용한 위급한 사지 허혈에 대한 유전자 요법 {GENE THERAPY FOR CRITICAL LIMB ISCHEMIA WITH WILD TYPE OR MUTANT ENOS}

본 발명은, 세포에서 eNOS 활성을 조정하기 위해 eNOS 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 사용하여, 위급한 사지 허혈(Critical Limb Ischemia; CLI)을 예방, 진단 또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위해, 야생형 및 변이체 eNOS 폴리펩티드 및 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 제공된다.

미국 인구에서 말초 동맥 폐색 질환(PAOD)의 이환율은 약 12％에 이르른다. 초기 PAOD(파행)은 운동시에 허혈성 근육 통증을 특징으로 한다. 진행된 PAOD에 기인하는 위급한 사지 허혈(CLI)은 안정(rest)시의 혈류 및 산소 전달 감소를 특징으로 하고, 그 결과 안정 시에 근육 통증 및 비-치료 피부 궤양 또는 괴저가 일어나며 [Rissanen 등, Eur.J.Clin.Invest. 31:651-666 (2001); Dormandy and Rutherford, J.Vasc.Surg. 31:S1-S296 (2000)], 1년에 백만명당 적어도 500 내지 1000명이 발병하는 것으로 추산된다.

PAOD 및 파행을 가진 환자의 치료는, 아테롬성경화증 위험 요인의 조절, 운동 및 일부 경우에 실라스토졸 또는 펜톡시필린으로의 의료 요법의 조절을 포함한다 [Robeer 등, Eur.J.Vasc.Endovasc.Surg. 15:36-43 (1998)]. 증상이 지속된다면, 파행, 안정시 통증 및/또는 비-치유 허혈성 궤양의 치료를 위하여 경피 경관 혈관성형술(PTA)이 사용될 수도 있다. PTA는 엉덩이 및 표면 대퇴부 동맥의 짧은 협착 또는 폐색에 가장 적합하다. 1년에 개통 비율은 80-90％이다. 더욱 광범성의 질병을 가진 환자에서는, 수술에 의한 재혈관신생이 추천된다. 대퇴부대동맥 (aortofemoral) 및 대퇴슬와부(femoropopliteal) 회로조성술은 각각 90％ 및 70％의 5년 개통 비율을 갖는다 [Dormandy and Rutherford, J.Vasc.Surg. 31:S1-S296 (2000)].

그러나, 수술적 및 중재적 재혈관신생 기술에서의 진보에도 불구하고, 허혈 통증 및 궤양을 나타내는 환자의 20 내지 30％가, 광범성의 말단 혈관 질병에 기인하여 수술적 재혈관신생 또는 혈관성형술을 위해 적절한 후보자가 되지 못하거나, 또는 이러한 치료법을 받지 못하며, 현재의 약물요법은 진행된 CLI를 가진 환자에서의 사지 구제에 거의 영향을 미치지 못하고 있다.

주요 절단을 하지 않은 환자의 생존 비율은 1년 후에 50％ 미만이다. 또한, 절단을 필요로 하는 노령의 환자들은 종종 건강이 좋지 않고, 비교적 높은 수술 위험 및 장기간의 불량한 예후를 갖는다 [Dormandy and Rutherfold, J.Vasc.Surg. 31:S1-S296 (2000)]. 안기오텐신-전환 효소 억제제 및 스타틴이 허혈의 실험 모델에서 혈류를 증대시키는 것으로 보고되어 왔으나, 현재 이용가능한 약물의 어느 것도 새로운 혈관 형성을 촉진시키지 못한다 [Fabre 등, Circulation 99:3043-3049 (1999); Kureishi 등, Nat Med 6:1004-1010 (2000)]. 따라서, CLI에 대한 개선된 치료적 접근법이 요구되고 있다.

허혈성 질환을 치료하기 위한 한가지 새로운 접근법은, 혈관 형성을 자극하는 성장 인자를 사용하여 혈관 성장을 증진시키는 것을 목표로 한다 [Rissanen 등, Eur.J.Clin.Invest. 31:651-666 (2001); Yla-Herttuala 등, Lancet 355:213-222 (2000); Isner 등, J.Clin.Invest. 103:1231-1236 (1999); Rutanen 등, Curr.Cardiol.Report 3:29-36 (2001)]. 혈관 성장은 맥관형성, 혈관신생 및 동맥형성으로 나뉠 수 있다. 맥관형성은, 맥관아세포/내피 전구체 세포(EPCs)로부터 혈관의 배 발생부위(in situ) 형성을 가리킨다. 혈관신생은, 분화된 내피 세포(ECs)의 증식 및 이행의 결과로서 기존의 모세관으로부터 새로운 혈관의 형성을 가리킨다 [Risau 등, Nature 386:671-674 (1997)]. 동맥형성은 기존의 세동맥 문합으로부터 근육 측지 혈관의 발생부위 형성을 가리킨다 [Schaper 등, Circ Res 79:911-919 (1996)]. 그러나, 내인성 혈관신생 및 동맥형성은 CLI에서 혈류 및 산소 전달의 감소를 충분히 보상하기에 부적합하다. 혈관 형성을 자극하기 위한 성장 인자의 전달이 잠재적으로 CLI의 치료를 위한 추가의 치료적 접근법일 수도 있긴 하지만, 연령, 아테롬성경화증 및 기타 심혈관 위험 요인에 의한 내피 기능의 손상이 성장 인자에 의한 혈관신생의 증대를 제한할 수도 있다는 것이 점점 증명되고 있다.

내피 질산 합성효소 (eNOS, 또한 ecNOS 또는 NOS 3이라고 불림)가 혈관신생의 중요한 조절인자/매개인자로서 관련되었다. 산화질소(NO) 공여체, 예컨대 니트로프루시드는 내피 세포 증식 및 이행을 촉진하는 반면, NOS 억제제는 이러한 과정을 억제한다 [Ziche 등, J.Clin.Invest. 9:2036-2044 (1994); Morbidelli 등, Am.J.Physiol. 270:H411-H415 (1996)]. 연구는 eNOS 결핍 생쥐(eNOS-KO)에서 손상된 혈관신생 및 상처 치유를 나타내었다. 체외배양된 대동맥을 사용하여, 리 (Lee) 등은 eNOS가 시험관내에서 내피 세포 이행, 증식 및 분화를 위해 필요하다는 것을 증명하였다. 이러한 연구결과는, eNOS-KO 생쥐에서 피하 이식된 마트리겔 플러그 내로 감소된 모세관 형성을 증명함으로써, 생체내에서 입증되었다. eNOS-KO 생쥐에서는 절제 상처 치유가 상당히 지연되었으며, 이것은 상처 회복과 관련된 혈관신생 과정에서 내피 NO의 역할을 강조한다 [Lee 등, Am.J.Physiol. 277:H1600-H1608 (1999)]. 수술에 기인하여 유도된 후사지(hindlimb) 허혈 후에 eNOS-KO 생쥐에서 상당히 손상된 혈관신생이 증명되었다. 수술에 기인한 후사지 허혈을 가진 토끼에 L-아르기닌 (NOS의 기질) 투여는 혈관신생을 상당히 개선시키며, 이것은 허혈-유도된 혈관신생에서 내피 NO의 역할을 입증한다 [Murohara 등, J.Clin.Invest. 101:2567-2578 (1998)].

언급된 바와 같이, 허혈에 대해 반응하는 혈관신생이 연령 및 내피 기능부전에 의해 손상될 수도 있다는 증거가 계속 증가하고 있다. 손상된 혈관신생이 동물 모델에서 관찰되었으며, 이것은 내피 NO의 방출 감소 및 성장 인자의 표현 저하로부터 일어나는 것으로 생각된다 [Rivard 등, Circulation 99:111-120 (1999); Van Belle 등, Circulation 96:2667-2674 (1997)]. 호모시스테인혈증 및 콜레스테롤과잉혈증과 같은 위험 요인들이, 가능하다면 내피 유래된 NO의 생체이용성을 감소시킴으로써, 후사지 허혈의 쥐 모델에서 혈관신생을 경감시키는 것이 밝혀졌다 [Duan 등, Circulation 102: 111370-111376 (2000)].

이와 같은 측면에서, CLI를 위한 효과적인 치료법이 요구되고 있다. CLI의 치료를 위해 허혈성 사지에서 NO 생체이용성을 증가시키는 유전자 요법 접근법의 발전은, 예를들어 손상된 혈관신생을 자극하고, 현존하는 미세혈관 기능부전을 경감시키고, 현존하는 혈관에서 혈관운동(혈관확장) 활성을 회복시키고, 현존하는 측지의 개조/성숙(동맥형성)에 기여하는 것을 포함하여, 여러 메카니즘을 통해 허혈을 전환시킬 수도 있다.

발명의 요약

본 발명은, eNOS 폴리펩티드 또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 CLI를 예방, 진단 및 치료하는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여, eNOS 활성과 연관된 질병 또는 질환을 경감시킬 수 있도록 세포에서 eNOS 활성을 조정할 수 있다. 특히, 본 발명의 방법을 사용하여, 허혈성 사지에서 감소된 NO 생성과 연관된 질병 또는 질환을 경감시킬 수 있도록 허혈성 사지에서 국소 NO 생성을 증가시킴으로써 세포에서 eNOS 활성을 조정할 수 있다. 따라서, 본 발명은, 치료가 필요한 환자에게 eNOS 폴리펩티드 또는 그의 변이체 또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 투여함으로써, 증가된 수준의 NO를 가진 효과적인 조직을 제공하는 유전자 요법을 제공한다.

하나의 측면에서, 본 발명은 포유동물 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유효량을 CLI의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 CLI의 포함하는 치료 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 CLI의 증상, 예를들어 미세혈관 기능부전, 궤양 치유 및 혈관신생의 치료 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은, eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유효량을 혈관신생의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 여기에서 eNOS 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 포스포릴화된 포유동물 eNOS 중의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인, 혈관신생의 치료 방법을 제공한다. 하나의 측면에서, 본 발명은, eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유효량을 미세혈관 기능부전의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하고, 여기에서 상기 eNOS 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 포스포릴화된 포유동물 eNOS 내의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인, 미세혈관 기능부전을 경감시키는 방법을 제공한다.

관련된 측면에서, 본 발명은 본 발명의 방법에서 사용하기 위한 eNOS 폴리펩티드 및 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 적절한 폴리뉴클레오티드는, 예를들어 야생형 또는 변이체 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 그의 변형체를 포함한다. 바람직하게는, 코딩된 eNOS 폴리펩티드는 포유동물 eNOS 폴리펩티드이고, 가장 바람직하게는 인간 eNOS 폴리펩티드이다. 하나의 측면에서, eNOS 폴리펩티드는 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS 폴리펩티드이다.

다른 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 인간 eNOS 폴리펩티드는, 서열 1의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 제1 돌연변이; 및 서열 1의 아미노산 잔기 1177에 상응하는 위치에서 제2 돌연변이를 갖는다.

다른 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩되는 인간 eNOS 폴리펩티드는, 서열 1의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 제1 돌연변이; 서열 1의 아미노산 잔기 1177에 상응하는 위치에서 제2 돌연변이; 및 서열 1의 아미노산 잔기 2에 상응하는 위치에서 제3 돌연변이를 갖는다.

바람직하게는, 서열 1의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 돌연변이는 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg 또는 His, 더욱 바람직하게는 Ala, Val, Leu 또는 Ile, 가장 바람직하게는 Ala 또는 Val으로의 아미노산 치환이고; 서열 1의 아미노산 잔기 1177에 상응하는 돌연변이는 Asp으로의 아미노산 치환이고; 서열 1의 아미노산 잔기 2에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 Ala으로의 아미노산 치환이다.

일부 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 인간 eNOS 폴리펩티드의 포스포릴화는, 참조 폴리펩티드에 비교하여 증가되거나 감소된다.

일부 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 인간 eNOS 폴리펩티드는, 참조 eNOS 폴리펩티드에 비교하여, 증가된 eNOS 활성을 갖는다. 바람직하게는, 인간 eNOS 폴리펩티드는 참조 eNOS 폴리펩티드에 비교하여 증가된 NO 생성, 칼모둘린에 대한 결합 친화성, 및/또는 환원효소 활성을 갖는다. 가장 바람직하게는, 인간 eNOS 폴리펩티드는 참조 eNOS 폴리펩티드에 비교하여 증가된 NO 생성을 갖는다.

일부 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 인간 eNOS 폴리펩티드는, 참조 eNOS 폴리펩티드에 비교하여 감소된 eNOS 활성을 갖고, 예를들어 참조 eNOS 폴리펩티드에 비교하여 폴리펩티드의 Ca⁺⁺ 칼모둘린 매개 자극에서 감소된 Ca⁺⁺ 의존성을 갖는다.

하나의 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드는 인간 eNOS 폴리펩티드의 아미노산에 실질적으로 상동성인 eNOS 폴리펩티드를 코딩한다.

하나의 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드는 서열 1의 아미노산 서열에 대해 95-99％ 서열 동일성을 가진 eNOS 폴리펩티드를 코딩한다.

다른 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드는 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 코딩하는 재조합 벡터이다. 하나의 측면에서, 핵산 서열은 적어도 하나의 조절 서열에 작동적으로 연결되고 그 결과 코딩된 eNOS 폴리펩티드가 세포에서 발현된다. 바람직하게는, 적어도 하나의 조절 서열이 프로모터, 예를들어 CMV 프로모터이다. 하나의 측면에서, 재조합 벡터는 플라스미드 벡터 또는 아데노바이러스 벡터이다.

다른 측면에서, 본 발명의 치료 방법에서, 치료는 치료가 필요한 환자의 세포에서 eNOS 활성을 조정하는 것이다. 바람직하게는, 세포는 내피 세포이고, 더욱 바람직하게는 인간 내피 세포이다.

다른 측면에서, 본 발명의 방법은, 인간 야생형 또는 변이체 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 치료가 필요한 환자에게 투여하기 전, 동안 또는 후에, 하나 이상의 혈관신생 인자를 투여하는 것을 더욱 포함한다. 본 발명의 방법에서 사용하기 위해 적절한 혈관신생 인자는 예를들어 HFG, VEGF, FGF, 내피 성장 인자, 표피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, TGF-알파, TGF-베타, PDGF, TNA-알파 또는 IGF, Del-1을 포함하지만, 이에 한정되지 않고, 바람직하게는 FGF이다.

하나의 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드는 생체 외에서 환자의 세포에 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 투여된다. 다른 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드는 환자의 병든 조직에 또는 환자의 말초 혈관 체계에 폴리뉴클레오티드를 도입함으로써 투여된다. 다른 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 폴리뉴클레오티드는 환자의 사지 근육으로의 근육내 주사 또는 동맥내 주사에 의해 투여된다.

다른 측면에서, 본 발명은 유효량의 eNOS 폴리펩티드를 위급한 사지 허혈(CLI)의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는 위급한 사지 허혈의 치료 방법을 제공하며, 여기에서 eNOS 폴리펩티드는 포유동물 세포에서 포스포릴화된 포유동물 eNOS 내의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 eNOS 폴리펩티드는 인간 eNOS이고, 서열 1의 아미노산 잔기 495 또는 1177에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다.

하나의 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 eNOS 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 잔기 495 또는 1177에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 갖는다.

하나의 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 eNOS 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 제1 돌연변이; 및 아미노산 잔기 1177에 상응하는 위치에서 제2 돌연변이를 갖는다.

하나의 측면에서, 본 발명의 방법에서 사용하기에 적절한 eNOS 폴리펩티드는 서열 1의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 제1 돌연변이; 서열 1의 아미노산 잔기 1177에 상응하는 위치에서 제2 돌연변이; 및 서열 1의 아미노산 잔기 2에 상응하는 위치에서 제3 돌연변이를 갖는다.

바람직하게는, 서열 1의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 돌연변이는 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Asn, Gln, Lys, Arg 또는 His으로의 아미노산 치환이고, 더욱 바람직하게는 Ala, Val, Leu 또는 Ile으로의 아미노산 치환; 가장 바람직하게는 Ala 또는 Val으로의 아미노산 치환이고; 서열 1의 아미노산 잔기 1177에 상응하는 돌연변이는 Asp으로의 아미노산 치환이고, 서열 1의 아미노산 잔기 2에 상응하는 위치에서의 돌연변이는 Ala으로의 아미노산 치환이다.

본 발명의 상기 및 기타 목적, 그의 다양한 특징 뿐만 아니라 본 발명 자체는, 첨부된 도면과 함께 본 명세서를 읽을 때, 하기 상세한 설명으로부터 더욱 충분히 이해될 수 있을 것이다.

도 1은 포유동물 eNOS의 다양한 기능성 도메인을 나타내는 도해이다. 기능성 도메인은, 이에 한정되지는 않지만 예를들어 (N-말단으로부터 C-말단으로 진행하여) 미리스토일화를 위한 공통 부위; 팔미토일화를 위한 2개의 부위; 산화효소 도메인; (예를들어 인간 eNOS의 Thr-495의) 포스포릴화를 위한 공통 서열을 포함하는 칼모둘린 결합 부위 (예를들어, 인간 eNOS의 아미노산 494-517); 및 환원효소 도메인을 포함한다. 인간 eNOS 폴리펩티드의 기능성 도메인은 예를들어 자기억제 루프 및 헴-결합 부위를 포함한다.

도 2는, 서열 1 (WT)에 의해 코딩된 야생형 인간 eNOS에 비교하여, 단일 또는 이중 돌연변이를 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체에 의하여 HEK 293 세포에서 NO 생성의 자극을 나타내는 막대그래프이다. 단일 돌연변이를 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체는, 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Thr-495에 상응하는 위치에서, Asp(T495D), Ala(T495A) 또는 Val(T495V)으로의 아미노산 치환을 갖는다. 이중 돌연변이를 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체는 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp으로의 제1 아미노산 치환, 및 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Thr-495에 상응하는 위치에서 Asp(T495D+S1177D), Ala(T495AV+S1177D) 또는 Val(T495V+S1177D)으로의 제2 아미노산 치환을 갖는다.

도 3은, 서열 1에 의해 코딩된 야생형 인간 eNOS (야생형)에 비교하여, 단일 돌연변이를 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체에 의해 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)에서의 NO 생성 자극을 나타내는 막대그래프이다. 단일 돌연변이를 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체는 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Thr-495에 상응하는 위치에서 Asp(T495D), Ala(T495A) 또는 Val(T495V)으로의 아미노산 치환을 갖는다.

도 4는, 수술 후 0, 1, 4, 7, 10, 14, 21 및 28일에서, 야생형 eNOS을 가진 생쥐(C57BL/6)에 비교하여, 야생형 eNOS가 결핍된 생쥐(ecNOS-KO)에서의 사지 관류의 레이저 도플러 영상 및 약식 도해이다.

도 5는, 수술 후 0 및 4일에서, 야생형 eNOS를 가진 생쥐(C57BL/6)에 비교하여, 야생형 eNOS가 결핍된 생쥐(ecNOS-KO)의 사지에서 전체 병리학적 변화를 나타내는 사진이다.

도 6은, 수술 후 10일에서, 야생형 eNOS를 가진 생쥐(C57B1/6)에 비교하여, 야생형 eNOS가 결핍된 생쥐(ecNOS-KO)의 사지에서 측지 형성의 정량적 측정을 나타내는 막대그래프이다.

도 7은, 야생형 eNOS가 결핍된 생쥐(ecNOS-KO)의 사지에 대한 상이한 수술 절차를 나타내는 도해 (윗줄); 수술 후사지에서의 전체 병리학적 변화를 나타내는 사진 (가운데줄); 및 수술 후사지에서의 관류를 나타내는 레이저 도플러 영상(아랫줄)이다.

도 8은, 수술 후 0, 1, 3, 7, 17, 21 및 24일에서, 야생형 eNOS를 가진 생쥐(C57BL/6)에 비교하여, 야생형 eNOS가 결핍된 3, 6 및 12개월령의 생쥐(ecNOS-KO)의 사지에서 자발적인 혈류 회복에 대해 미치된 상이한 연령의 영향을 나타낸 막대그래프이다.

도 9는, 수술 후 10일에서, 야생형 eNOS가 결핍된 3, 6 및 11-12 개월령 생쥐(ecNOS-KO)의 사지에서 허혈 손상에 대해 미치는 상이한 연령의 영향을 나타내는 사진이다.

도 10은, 2) 루시퍼라제(Ad5.1Luc)를 코딩하는 아데노바이러스에 의한 감염에 비교하여; 1) 플라스미드 pLuc 단독의 주입에 의해 전달되고(pLuc), 일렉트로포레이션과 pLuc의 주입에 의해 전달되고(pLuc+EP), 추가로 히아룰로니다제 전처리 (pLuc+EP+Hyal)된 루시퍼라제를 코딩하는 플라스미드로부터, 루시퍼라제의 발현 수준을 검출함으로써, 상이한 근육내 유전자 전달 방법의 형질감염 효율을 나타내는 막대그래프이다.

도 11은, 루시퍼라제를 코딩하는 플라스미드 벡터 pLuc의 형질감염 효율에 대해 미치는 후사지 허혈의 영향을 나타낸 막대그래프이다. 플라스미드 벡터를 C57BL/6의 내전근 근육에 주입하고, 수술 및 플라스미드 벡터(PT)로의 전처리 전; 수술과 동일한 날(SDT); 및 수술후 3 및 7일에서 유전자 발현의 수준을 측정함으로써 형질감염 효율을 결정하였다.

도 12는, 2) 야생형 eNOS를 코딩하는 플라스미드 벡터에 비교하여; 1) 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)로의 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를, 야생형 eNOS (ecNOS-KO)가 결핍된 생쥐에 eNOS 유전자 전달한 후에 eNOS 발현을 나타내는, 웨스턴 블롯 및 ELISA의 막대그래프이다.

도 13은, 2) eNOS를 코딩하지 않는 플라스미드 벡터 또는 공 벡터(pNull)에 비교하여; 1) 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)에 대한 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를 사용하여, 수술 후 28일에 야생형 eNOS가 결핍된 6개월령 생쥐(ecNOS-KO)에서의 사지 구제에 대해 미치는 eNOS 유전자 요법의 효과를 나타내는 사진이다.

도 14는, 2) eNOS를 코딩하지 않는 플라스미드 벡터 또는 공 벡터(pNull)에 비교하여; 1) 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)로의 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를 사용하여, 수술 전(BOP) 및 수술 후 0, 1, 4, 7, 10, 14, 18, 21 및 28일 째에 야생형 eNOS가 결핍된 6개월령 생쥐(ecNOS-KO)에서 허혈 대 정상 혈액 관류 비율을 측정함으로써, eNOS 유전자 요법의 효과를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 15는, 2) eNOS를 코딩하지 않는 플라스미드 벡터 또는 공 벡터(pNull), 및 비처리된 반대측 다리(사지)에 비교하여, 1) 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)로의 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를 사용하여, 수술 후 28일 째에 야생형 eNOS가 결핍된 6개월령 생쥐(ecNOS-KO)에서 사지 및 근육 부피와 대체 지방 및 염증성 침윤물의 양을 측정함으로써, eNOS 유전자 요법의 효과를 나타내는 막대그래프이다.

도 16은, 2) eNOS를 코딩하지 않는 플라스미드 벡터 또는 공 벡터(pNull)에 비교하여, 1) 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)로의 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를 사용하여, 수술 후 28일째에 야생형 eNOS가 결핍된 6개월령 생쥐(ecNOS-KO)에서 궤양의 치유에 대해 미치는 eNOS 유전자 요법의 효과를 나타내는 사진이다.

도 17은, 2) eNOS를 코딩하지 않는 플라스미드 벡터 또는 공 벡터(pNull)에 비교하여, 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)에 대한 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를 사용하여, 수술 후 10일 째에, 야생형 eNOS가 결핍된 11-12개월령 생쥐(ecNOS-KO)에서, 사지 구제에 대해 미치는 eNOS 유전자 요법의 효과를 나타내는 사진이다.

도 18은, 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)으로의 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체(ecNOS)를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를 사용하여, 수술 후 10일 째에 야생형 eNOS가 결핍된 11-12개월령 생쥐(ecNOS-KO)에서 eNOS 유전자 요법의 효과를 나타내는, eNOS 발현의 막대그래프(윗줄); 혈류의 레이저 도플러 영상(가운데줄); 및 사지 괴사의 사진(아랫줄)이다. pNOS224의 유전자 발현은 사지 괴사 및 혈류의 변화와 상관관계를 갖고, 다시말해서 낮은 발현(#1201)에 비교하여, 발현(#1205)이 높을수록 유동이 빨라지고, 괴사 손상이 작아진다.

도 19는, 2) eNOS를 코딩하지 않는 플라스미드 벡터 또는 공 벡터(pNull)에 비교하여; 1) 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)으로의 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를 사용하여, 수술 후 1, 3, 7 및 10일째에, 야생형 eNOS가 결핍된 11-12 개월령 생쥐(ecNOS-KO)에서, 사지 구제에 미치는 eNOS 유전자 요법의 효과를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 20은, 2) eNOS를 코딩하지 않는 플라스미드 벡터 또는 공 벡터(pNull)에 비교하여; 1) 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)으로의 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를 사용하여, 수술 후 1, 3, 7 및 10일째에 야생형 eNOS가 결핍된 11-12개월령 생쥐(ecNOS-KO)에서, 허혈 대 정상 혈액 관류 비율에 의해 측정된, eNOS 유전자 요법의 효과를 도식적으로 나타낸 것이다.

도 21은, 2) eNOS를 코딩하지 않는 플라스미드 벡터 또는 공 벡터(pNull) 및 3) 수술받지 않은 ecNOS-KO 생쥐 대조와 비교하여; 1) 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 Asp(S1177D)으로의 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(pNOS224)를 사용하여, 수술 후 10일 째에 야생형 eNOS가 결핍된 11-12개월령 생쥐(ecNOS-KO)의 내전근 근육에서 eNOS 발현의 수준을 나타내는 막대그래프이다. 막대그래프의 오른쪽은 처리된 동물로부터의 각각의 발현 수준을 나타낸다.

도 22는, 쥐 CLI 모델을 나타내는 도식적인 표시 및 사진이다. 도식적인 표시는 대퇴부 동맥 및 분지의 수술적 결찰 및 제거를 나타내며, 이것은 진화된 수컷 성숙한 스프라그-돌리 쥐에서 더욱 높은 넓적다리 면적을 제공한다. 사진은, 수술 후 1, 4, 10 및 17일 째에 쥐 CLI 모델에서의 전체 병리학적 변화를 나타낸다.

도 23은, 쥐 CLI 모델의 정상 사지(영상의 왼쪽) 및 허혈성 사지(영상의 오른쪽)를 나타내는 쥐 CLI 혈관조영술 영상이다.

도 24는, 쥐 CLI 모델의 정상 사지(영상의 왼쪽) 및 허혈성 사지(영상의 오른쪽)에서 동맥형성의 혈관조영술 평가 점수를 나타내는 쥐 CLI 혈관조영술 영상이다.

도 25는, 수술 전(BO) 및 유전자 전달 후 0, 3, 7 및 10일 째에, 녹색 형광 단백질(Ad5EGFP)을 코딩하는 대조 아데노바이러스 벡터에 비교하여; 서열 1 (Ad5NOS1177D)에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 아데노바이러스 벡터를 사용한 eNOS 유전자 요법 후에, 쥐 CLI 모델에서의 혈류 회복을 도시적으로 나타낸 것이다.

도 26은, 서열 1 (Ad5NOS1177D)에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 아데노바이러스 벡터를 사용하는 쥐 CLI 모델에서의 유전자 요법의 효과를 측정하기 위해 사용된 전체 병리학적 단계 I-V를 기초로 한 괴사 점수를 나타내는 도표 및 사진이다.

도 27은, 수술 전(BO) 및 유전자 전달 후 3, 7 및 10일 째에, 녹색 형광 단백질(Ad5EGFP)을 코딩하는 대조 아데노바이러스 벡터에 비교하여; 서열 1 (Ad5NOS1177D)에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 아데노바이러스 벡터를 사용하는 쥐 CLI 모델에서 유전자 요법의 효과를 측정하기 위해 사용된, 전체 병리학적 단계 I-V를 기초로 한 괴사 점수를 나타낸 막대그래프이다.

도 28은, 실험의 마지막에서, 녹색 형광 단백질(Ad5EGFP)을 코딩하는 대조 아데노바이러스 벡터에 비교하여; 서열 1 (Ad5NOS1177D)에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 아데노바이러스 벡터를 사용한 쥐 CLI 모델에서, 유전자 요법의 효과를 측정하기 위해 사용된, 동맥형성의 측정을 기초로 한 혈관조영술 점수를 나타내는 막대그래프이다.

본 발명은 위급한 사지 허혈(CLI)의 치료를 위한 새로운 접근법을 제공한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 eNOS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용한 CLI의 예방, 진단 및 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 방법을 사용하여, eNOS 활성과 연관된 질병 또는 질환이 경감될 수 있도록 eNOS 활성이 세포에서 조정될 수 있다. 특히, 본 발명의 방법을 사용하여, 허혈성 사지에서 감소된 NO 생성과 연관된 질병 또는 질환을 경감시킬 수 있도록, 허혈성 사지에서 국소적 NO 생성을 증가시킴으로써 세포에서 eNOS 활성을 조정할 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물 및 방법은 병에 걸린 조직에서 증가된 수준의 NO를 제공하기 위한 새로운 치료적 접근법을 제공하며, 이에 의해 예를들어 증가된 NO 수준에 의해 경감되는 것으로 알려져 있는 1) 혈관신생의 자극; 2) 미세혈관 기능부전의 경감; 3) 현존하는 혈관의 혈관운동(혈관확장) 활성의 회복; 및 4) 현존하는 측지의 개조/성숙 (동맥형성)을 포함하는 다수의 메카니즘을 통해 CLI의 근원이 되는 병리생리학을 표적으로 한다. 그에 따라 얻어지는 피부 및 근육으로의 혈류 및 산소 전달 개선이, 안정시 통증을 경감시키고 허혈성 궤양을 치유하는 것으로 기대된다. 또한, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 변이체는, 변이체 eNOS 효소의 상당히 높은 비활성에 기인하여, 야생형 eNOS에 비해 더 높은 효능을 가질 수 있다. 또한, eNOS 폴리펩티드의 활성은 산화된 저-밀도 리포단백질(oxLDL)에 대해 내성인 칼슘 및 연령에 의해 엄격히 조절될 수 있다. 그 결과, 성장 인자와는 반대로, 유전자 요법 응용에서 본 발명의 eNOS 조성물을 사용할 때 "과다투여"에 기인한 독성은 무시할 수 있을 정도이다.

여기에 인용된 참고문헌들은 그 전체내용이 참고로 포함된다.

정의

여기에서 사용된 기술적 및 과학 용어는, 달리 정의되지 않는 한, 본 발명이 속하는 기술분야의 숙련가에 의해 일반적으로 이해되는 의미를 갖는다. 당 기술분야의 숙련가에게 알려진 다양한 방법을 참조한다. 참조되는 이러한 공지된 방법들을 설명하는 공보 및 기타 자료들은, 마치 이들이 완전히 설명된 것처럼, 그 전체내용이 참고문헌으로 포함된다. 재조합 DNA 기술의 일반적인 원리를 설명하는 표준 참고문헌은 문헌 [Sambrook,J. 등 (1989) Molecular Cloning,: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Planview, N.Y.; McPherson, M.J.,Ed. (1991) Directed Mutagenesis: A Practical Approach, IRL Press, Oxford; Jones, J. (1992) Amino Acid and Peptide Synthesis, Oxford Science Publications, Oxford: Austen, B.M. and Westwood, O.M.R.(1991) Protein Targeting and Secretion, IRL Press, Oxford]을 포함한다. 본 발명을 수행하는데 있어서 당 기술분야의 숙련가에게 공지된 어떠한 적절한 자료 및/또는 방법이라도 사용될 수 있으나; 바람직한 자료 및/또는 방법이 여기에 설명된다. 하기 설명 및 실시예에서 언급된 물질, 시약 등은 다른 지적이 없는 한 상업적 공급처로부터 입수될 수 있다.

여기에서 사용된 "폴리펩티드"란, 전체-길이 단백질 또는 그의 단편, 또는 펩티드를 가리킨다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 eNOS 단편 또는 펩티드는 eNOS 활성, 예를들어 NO 생성을 보유한다. 그러나, 참조 eNOS 폴리펩티드와 비교할 때 (예를들어, 전체-길이 또는 야생형 폴리펩티드에 비교할 때), eNOS 활성의 수준이 증가되거나 저하될 수도 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 "변형체"란, 각각 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 비교할 때 (예를들어, 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 비교할 때), 1차, 2차 또는 3차 구조에서 변할 수도 있는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 가리킨다. 예를들어, 아미노산 또는 핵산 서열은, 참조 아미노산 또는 핵산 서열과 상이한 돌연변이 또는 변형을 함유할 수도 있다. 일부 구현양태에서, eNOS 변형체는 상이한 이소형 또는 다형태성일 수도 있다. 변형체는 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 단리되거나 생성된 천연-발생, 합성, 재조합, 또는 화학적-변형된 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드일 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관한 "돌연변이"는, 각각 참조 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 비교할 때 (예를들어, 야생형 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 비교할 때), 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 1차, 2차 또는 3차 구조에 대한 천연-발생, 합성, 재조합 또는 화학적 변화 또는 차이점을 가리킨다. 이러한 돌연변이를 가진 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 당 기술분야에 공지된 방법을 사용하여 단리되거나 생성될 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이, "eNOS 폴리펩티드 변이체" 또는 그의 문법상의 균등물 (예를들어, eNOS 변이체, 변이체 eNOS, eNOS 변이체 폴리펩티드, 변이체 eNOS 폴리펩티드)은, 포유동물 eNOS의 기능성 도메인 내의 위치에 상응하는 아미노산 잔기에서 적어도 하나의 변형 또는 돌연변이를 가진 eNOS 폴리펩티드 또는 단편 또는 그의 변형체를 가리킨다. 바람직한 구현양태에서, 돌연변이는 인간 eNOS (서열 1)의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 아미노산 치환이고, 여기에서 아미노산 치환은 바람직하게는 Ala 또는 Val이다. 다른 바람직한 구현양태에서, eNOS 폴리펩티드 변이체의 활성은 참조 eNOS 폴리펩티드에 비교할 때 증가되거나 저하된다.

여기에서 사용된 것과 같이, eNOS 폴리펩티드의 "기능성 도메인"은 eNOS 활성과 연관된 폴리펩티드 내의 아미노산 잔기, 부위 또는 영역이고, 예를들어 이에 한정되지는 않지만 단백질-결합 도메인 (예를들어, 칼모둘린-결합 도메인, 키나아제-결합 도메인, 또는 리간드-결합 도메인), 포스포릴화 부위, 미리스톨화 부위, 환원효소 도메인 또는 활성 부위를 포함한다.

여기에서 사용된 것과 같이 "eNOS 활성"이란, 이에 한정되지는 않지만 NO 생성, 칼모둘린-결합, 혈관신생 자극, 미세혈관 기능부전 경감, 현존하는 혈관의 혈관운동(혈관확장) 활성 복원, 현존하는 측지의 개조/성숙 (동맥형성)에 기여를 포함하여, 세포 내에서 효소와 연관된 활성을 가리킨다. eNOS 활성은 폴리펩티드와 연관된 생물학적 또는 세포 활성일 수도 있고, 더욱 특별하게는, 이러한 활성은 eNOS 폴리펩티드의 기능성 도메인과 연관된다. eNOS 활성은 효소와 연관된 활성의 조정일 수도 있고, 이에 한정되지는 않지만 예를들어 상기 기재되거나 당 기술분야에 공지된 eNOS 활성의 조정을 포함한다.

여기에서 사용된 것과 같이, eNOS 활성에 관련된 "조정"이란, 이러한 활성의 증가, 저하, 유도 또는 억제를 가리킨다. 일부 구현양태에서, eNOS 활성의 이러한 증가, 저하, 유도 또는 억제는 참조 분자, 예를들어 eNOS 야생형 또는 변이체 폴리펩티드에 관련된다.

여기에서 사용된 것과 같이, "질병", "이상" 또는 "질환"이란, 상태를 경감시키기 위해 eNOS 활성이 조정될 수 있는 환자의 세포, 조직 또는 기관에서의 바람직하지 못한 상태를 가리킨다. 내피 NOS는, 이에 한정되지는 않지만 예를들어 혈관신생, 혈관확장, 면역 조절, 혈소판 응집 억제, 및 유연근의 이완을 포함한 다양한 생리학적 과정에 관여된다. 즉, 치료가 필요한 환자의 세포, 조직 또는 기관에서 eNOS 활성을 조정하는 것은 여기에 기재된 것과 같은 질병, 이상 또는 질환을 경감시킬 수 있다.

여기에서 사용된 것과 같이 "환자"는 포유동물, 바람직하게는 인간이다.

eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드

내피 산화질소 합성효소 (eNOS, 또한 ecNOS 및 NOS3으로 알려짐)는, NO 합성효소의 3개의 공지된 이소형의 하나이다. eNOS는 예를들어 혈관 내피, 심장 근세포, 혈액 혈소판, 다양한 유형의 유연근 및 면역 체계의 세포, 예컨대 T-세포, 호중구 또는 대식세포에서 발견된다. 본 발명의 방법에서 사용된 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 여기에 기재된 세포 또는 조직, 바람직하게는 내피로부터 생겨날 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용된 eNOS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 예를들어 인간, 생쥐, 기니아 피그, 개, 소, 돼지, 쥐 또는 토끼, 바람직하게는 인간과 같은 포유동물 원으로부터 생겨나거나 유래될 수 있다. 일반적으로, 본 출원은 인간 eNOS (서열 1)의 사용 및 그의 변이체에 관한 것이다. 그러나, 당업자라면, 본 발명의 개시내용이 상기 언급된 것과 같은 다른 종으로부터의 eNOS 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드 및 그의 변이체; 및/또는 인간 이외의 종을 치료하기 위한 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 사용에도 동일하게 적용된다는 것을 이해할 것이다.

(예를들어, 형질감염 또는 형질도입에 의해) 숙주 세포 내에 도입될 수 있고 그 안에 발현될 수 있는, eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 어떠한 형태라도 본 발명의 방법에서 사용하기에 적합하다.

본 발명의 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는, 예를들어 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 cDNA, 또는 eNOS 폴리펩티드를 중단없이 코딩하는 DNA를 포함한다. "중단없이 코딩하는" 폴리뉴클레오티드란, 인트론 또는 기타 비코딩 서열에 의해 중단되는 ORF에 비교하여, 연속되는 개방 판독 프레임("ORF")을 가진 폴리뉴클레오티드를 가리킨다.

여기에서 사용된 것과 같이, 용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬을 생성하는데 관련된 DNA의 단편을 의미하고; 이것은 코딩 영역 앞과 뒤의 영역 (리더 및 트레일러) 뿐만 아니라 각각의 코딩 단편(엑손) 사이의 개재 서열(인트론)을 포함할 수도 있다. 본 발명은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 단리된 유전자 (예, 게놈 클론)를 포함한다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드는 재조합 폴리뉴클레오티드, 천연 폴리뉴클레오티드, 또는 합성 또는 반-합성 폴리뉴클레오티드, 또는 이들의 조합일 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 RNA, PNA 또는 DNA, 예를들어 cDNA, 게놈 DNA, 및 합성 또는 반-합성 DNA 또는 이들의 조합일 수도 있다. DNA는 삼중, 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수도 있다. 이것은 헤어핀 또는 기타 2차 구조를 포함할 수 있다. RNA는 mRNA, 폴리아데닐화 RNA, 전체 RNA, 단일 가닥 또는 이중 가닥 RNA 등을 포함한다. 또한, DNA/RNA 이중나선이 본 발명에 포함된다.

본 발명의 하나의 구현양태에서, eNOS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 폴리뉴클레오티드의 서열을 갖고, 예를들어 인간 폴리뉴클레오티드이다. eNOS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 서열이 많은 종, 예를들어 인간 [Janssens 등 (1992), J.Biol.Chem. 267, 14, 519-522] 및 소 (USP 5,498,539)에 대해 알려져 있다. 본 발명의 천연 발생 폴리뉴클레오티드는 예를들어 야생형 폴리뉴클레오티드 서열의 대립 변형체인 코딩 서열을 가질 수도 있다. 당 기술분야에 알려진 바와 같이, 대립 변형체는 하나 이상의 뉴클레오티드의 치환, 결실 또는 첨가를 가질 수 있는 폴리뉴클레오티드 서열의 교체 형태이고, 일반적으로 코딩된 폴리펩티드의 기능을 실질적으로 변화시키지 않는다. 천연 발생 단일 뉴클레오티드 다형태성(SNPs)을 포함한 폴리뉴클레오티드가 또한 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

다른 구현양태에서, 본 발명의 방법에서 사용된 폴리뉴클레오티드는 천연 발생 eNOS 폴리뉴클레오티드의 변형체일 수도 있다. 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 관련되어 여기에서 사용된 용어 "변형체"는, 변형체가 야생형 eNOS 폴리펩티드 또는 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드의 하나 이상의 활성 또는 성질을 실질적으로 보유함을 의미한다. 다시말해서, 변형체는, 본 발명의 방법에 의해 CLI를 앓고 있는 환자의 세포, 조직 또는 기관 내에 도입될 때, CLI의 하나 이상의 증상을 상당한 정도까지 경감시키는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드이다. 변형체 폴리뉴클레오티드는 야생형 또는 변이체 eNOS 폴리펩티드를 코딩할 수도 있다.

다른 구현양태에서, 변형체 폴리뉴클레오티드는 야생형 또는 변이체 eNOS 폴리펩티드, 예를들어 하나 이상의 결실, 삽입, 첨가, 치환, 역전 또는 절단, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩티드를 코딩할 수도 있다. 이러한 변형체 폴리펩티드는 보존 또는 비-보존 아미노산, 바람직하게는 보존 아미노산으로의 하나 이상의 아미노산 치환을 함유할 수도 있다. 일반적인 전하, 소수성/친수성, 측쇄 잔기 및/또는 치환된 아미노산의 입체 벌크를 보존하는 일례의 보존적 치환은 예를들어 Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asn/Gln, Thr/Ser 및 Phe/Trp/Tyr을 포함한다.

본 발명의 방법에서 사용된 eNOS를 코딩하는 변형체 폴리뉴클레오티드는 예를들어 (i) 하나 이상의 뉴클레오티드가 다른 뉴클레오티드로 치환된 것 또는 달리 돌연변이된 것; 또는 (ii) 하나 이상의 뉴클레오티드가 변형되고, 예를들어 치환기를 포함하는 것; 또는 (iii) 폴리뉴클레오티드가 폴리뉴클레오티드의 반감기를 증가시키기 위한 화합물과 같은 다른 화합물과 융합된 것; 또는 (iv) 추가의 뉴클레오티드가 예컨대 리더 또는 분비 서열 또는 폴리펩티드의 정제를 위해 사용되는 서열을 코딩하는 서열과 같은 뉴클레오티드에 공유 결합된 것을 포함한다. 추가의 뉴클레오티드는 이종 공급원으로부터 유래되거나 또는 천연 유전자에 내인성일 수도 있다.

상기 유형(i)에 속하는 폴리뉴클레오티드 변형체는 예를들어 단일 뉴클레오티드 다형태성(SNPs), 대립 변형체 및 돌연변이체를 포함한 다형태성을 포함한다. 변형체 폴리뉴클레오티드는 예를들어 하나 이상의 첨가, 삽입, 결실, 치환, 전이, 변형, 역전, 염색체 전위, 대체 스플라이싱 사건으로부터 얻어진 변형체 등 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다.

상기 유형(ii)에 속하는 폴리뉴클레오티드 변형체는 예를들어 부착 또는 검출 마커 (아비딘, 비오틴, 방사능 원소, 형광 꼬리 및 염료, 에너지 전달 라벨, 에너지-방출 라벨, 결합 파트너 등)와 같은 변형, 또는 발현, 흡수, 분류, 표지화, 하이브리드화, 검출 및/또는 안정성을 개선시키는 잔기를 포함한다.

상기 유형(iii)에 속하는 폴리뉴클레오티드 변형체는 예를들어 폴리 A⁺ 꼬리, 5'캡 구조, 및 뉴클레오티드 유사체, 예를들어 이노신, 티오뉴클레오티드 등을 포함한다.

상기 유형(iv)에 속하는 폴리뉴클레오티드 변형체는 예를들어 각종 키메라, 하이브리드 또는 융합 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 예를들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 코딩 서열을 포함할 수 있고, 동일한 판독 프레임에 융합된 추가의 비-천연 발생 또는 이종 코딩 서열 (예를들어, 리더, 시그날, 분비, 표지, 효소, 형광, 항생물질 내성 및 기타 또는 진단 펩티드를 코딩하는 서열); 또는 코딩 서열 및 비-코딩 서열, 예를들어 5' 또는 3' 말단에 존재하거나 코딩 서열에 분산된 비번역 서열, 예를들어 인트론을 포함할 수 있다.

본 발명의 방법에서 사용된 폴리뉴클레오티드 변형체는 본 발명의 폴리펩티드의 동정 및/또는 정제를 위한 마커 서열에 프레임으로 융합된 코딩 서열을 가질 수도 있다. 마커 서열은 예를들어 세균 숙주의 경우에 마커에 융합된 성숙한 폴리펩티드의 정제를 제공하기 위한 헥사-히스티딘 꼬리 (예를들어, pQE-9 벡터에 의해 공급됨)일 수 있거나, 또는 포유동물 숙주, 예를들어 COS-7 세포가 사용될 때 예를들어 마커 서열이 헤마글루티닌(HA) 꼬리일 수도 있다. HA 꼬리는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유래된 에피토프에 상응한다 [Wilson, I. 등, Cell, 37:767 (1984)].

다른 유형의 폴리뉴클레오티드 변형체가 당업자에게 명백할 것이다. 예를들어, 폴리뉴클레오티드의 뉴클레오티드들은 원하는 목적, 예를들어 RNAse H와 같은 뉴클레아제에 대한 내성, 개선된 생체내 안정성 등에 의존하여 다양한 공지된 결합, 예를들어 에스테르, 술파메이트, 술파미드, 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸포스포네이트, 카르바메이트 등을 통해 연결될 수 있다. 예를들어 미국 특허 5,378,825호 참조. 원하는 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체, 예를들어 6-메르갑토구아닌, 8-옥소-구아닌 등이 혼입될 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 야생형 eNOS 폴리펩티드에 대해 또는 다른 유기체로부터의 폴리펩티드(오르소로그(ortholog))에 대해 실질적인 상동성을 갖는 한, 다른 유기체의 유전자 좌로부터 유래된 코딩 서열을 가질 수도 있다.

코딩 서열 또는 조절 서열에 위치한 다른 변형체 서열은 본 발명의 eNOS 폴리펩티드의 생성, 또는 기능 또는 활성을 증진시킬 수도 있다.

다른 변형체 폴리뉴클레오티드는, CLI 상태를 겪고 있는 환자에게 도입될 때 변형체 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드가 본 발명의 방법에서 CLI의 하나 이상의 증상을 경감시키는 능력을 보유한다면, eNOS를 코딩하는 야생형 폴리뉴클레오티드에 대해 다양한 정도의 서열 상동성 (동일성)을 갖거나, 야생형 eNOS 폴리펩티드에 대해 다양한 정도의 서열 상동성 (동일성)을 가진 폴리펩티드 변형체를 코딩한다. 다시말해서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드는 야생형 eNOS에 실질적으로 상동성이거나, 그것에 대해 실질적인 서열 상동성 (서열 동일성)을 나타낸다. 즉, 본 발명 내에서 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 및 그의 단편은, 야생형 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 대해 적어도 약 65-70％ 서열 상동성(동일성), 바람직하게는 약 70-75％, 75-80％, 80-85％ 또는 85-90％ 서열 상동성(동일성), 및 가장 바람직하게는 약 90-95％ 또는 95-99％ 서열 상동성(동일성)을 나타내는 폴리뉴클레오티드 또는 아미노산 서열을 함유할 수도 있다. 본 발명은 또한 낮은 정도의 서열 동일성을 갖지만, eNOS에 의해 나타나는 하나 이상의 기능 또는 활성을 수행하기에 충분한 유사성을 가진 폴리뉴클레오티드 및 폴리펩티드를 포함한다.

폴리뉴클레오티드 서열에 관련될 때, 용어 "실질적으로 상동성"은, 뉴클레오티드 서열이 적어도 약 90-95％ 또는 95-99％ 또는 그 이상의 동일성을 가짐을 의미한다.

본 발명에 따르면, 용어 "퍼센트 동일성" 또는 "퍼센트 동일한"은, 서열에 관련될 때, 설명되거나 청구된 서열("참조 서열")과 비교되어지는 서열("비교 서열")의 정렬 후에, 그 서열을 청구되거나 설명된 서열과 비교하는 것을 의미한다. 이어서, 하기 식에 따라서 퍼센트 동일성을 결정한다.

퍼센트 동일성 = 100 [1-(C/R)]

상기 식에서, C는 참조 서열과 비교 서열 사이의 차이점의 수/참조 서열과 비교 서열 사이의 정렬의 길이이고, 여기에서 (i) 비교 서열 내에 상응하는 정렬된 염기 또는 아미노산을 갖고 있지 않은 참조 서열 내의 각각의 염기 또는 아미노산, 및 (ii) 참조 서열 내의 각각의 간격, 및 (iii) 비교 서열 내의 정렬된 염기 또는 아미노산과 다른 참조 서열 내의 각각의 정렬된 염기 또는 아미노산이 차이점을 구성하며; R은 참조 서열 내의 염기 또는 아미노산의 수/비교 서열과의 정렬 길이이고, 참조 서열에서 발생된 간격은 염기 또는 아미노산으로 세어진다.

상기 계산된 퍼센트 동일성이 규정된 퍼센트 동일성보다 적은 정렬이 존재할 수도 있긴 하지만, 비교 서열과 참조 서열 사이에서 상기 계산된 퍼센트 동일성이 규정된 최소 퍼센트 동일성과 같거나 더욱 큰 정렬이 존재한다면, 비교 서열은 참조 서열에 대해 규정된 최소 퍼센트 동일성을 갖는다.

바람직한 구현양태에서, 비교 목적을 위해 정렬된 참조 서열의 길이는 참조 서열의 길이의 적어도 30％, 바람직하게는 적어도 40％, 더욱 바람직하게는 적어도 50％, 더욱 더 바람직하게는 적어도 60％, 더욱 더 바람직하게는 적어도 70％, 80％ 또는 90％이다.

퍼센트 동일성 또는 퍼센트 상동성을 위해 여기에 기재된 설명은 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열에 동일하게 적용되기 위한 것이다.

서열의 비교 및 2개 서열 사이의 퍼센트 동일성 및 유사성 결정은 수학적 연산방식을 사용하여 달성될 수 있다 [Computational Molecular Biology, Lesk, A.M.,ed. 및 Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed. Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A.M., 및 Griffin, H.G., eds. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G.,Academic Press, 1987; 및 Sequence Analysis Primer, Gribskov,M. 및 Devereux,J., eds. M.Stockton Press, New York, 1991].

이러한 수학적 알고리듬의 바람직한 비-제한적 예는 문헌 [Karlin 등 (1993), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 90:5873-5877]에 기재되어 있다. 이러한 알고리듬은 문헌 [Altschul 등 (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402]에 기재된 것과 같이 NBLAST 및 XBLAST 프로그램 (버젼 2.0)에 포함된다. BLAST 및 갭트(Gapped) BLAST 프로그램을 사용할 때, 각각의 프로그램의 디폴트 매개변수(예를들어 NBLASST)를 사용할 수 있다. 하나의 구현양태에서, 서열 비교를 위한 매개변수를 점수=100, 단어길이(wordlength)-12로 설정할 수 있거나, 또는 바꿀 수 있다 (예를들어 W=5 또는 W=20).

바람직한 구현양태에서, 문헌 [Needleaman 등, (1970) J.Mol.Biol. 48:444-453]의 알고리듬을 사용하여 2개의 아미노산 서열 사이의 퍼센트 동일성을 결정하며, 상기 알고리듬은 BLOSUM 62 매트릭스 또는 PAM250 매트릭스 및 16, 14, 12, 10, 8, 6 또는 4의 간격 가중치(gap weight) 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치(length weight)를 사용하는 GCG 소프트웨어 패키지에서 GAP 프로그램 내에 혼입된다. 또 다른 바람직한 구현양태에서, 2개의 뉴클레오티드 서열 사이의 퍼센트 동일성은, GAP 프로그램 I GCG 소프트웨어 패키지(Devereux 등, (1984), Nucleic Acids Res. 12(1): 387)를 사용하여 NW Sgapdna CMP 매트릭스 및 40, 50, 60, 70 또는 80의 간격 가중치 및 1, 2, 3, 4, 5 또는 6의 길이 가중치를 사용하여 결정된다.

서열 비교를 위해 사용되는 수학적 알고리듬의 다른 바람직한 비-제한적 예는, 마이어스 및 밀러(Myers and Miller) CABIOS(1989)의 알고리듬이다. 이러한 알고리듬은 CGC 서열 정렬 소프트웨어 패키지의 일부인 ALIGN 프로그램(버젼 2.0)내에 혼입된다. 아미노산 서열 비교를 위해 ALIGN 프로그램을 사용할 때, PAM 120 가중치 잔여 표, 12의 간격 길이 페널티 및 4의 간격 페널티를 사용할 수 있다. 서열 분석을 위한 추가의 알고리듬이 당 기술에 공지되어 있으며, 문헌 [Torellis 등(1994) Comput.Appl.BioSci. 10: 3-5]에 기재된 것과 같은 ADVANCE 및 ADAM 및 문헌[Pearson 등 (1988) PNAS 85:2444-8]에 기재된 FASTA를 포함한다.

본 발명에 따르면, 단백질 서열에 관련될 때, 용어 "실질적으로 상동성"은 아미노산 서열이 적어도 약 90-95％ 또는 97-99％ 또는 그 이상 동일함을 의미한다. 실질적으로 상동성인 아미노산 서열은, 고 엄격성 조건하에서 본 발명의 변이체 폴리펩티드를 코딩하는 서열의 핵산 서열에 하이브리드화되는 핵산 서열, 또는 그의 일부에 의해 코딩될 수 있다.

여기에서 사용된 "고 엄격성" 조건은 예를들어, 약 5×SSC, 0.5％ SDS, 100㎍/ml 변성 연어 정자 DNA 및 50％ 포름아미드를 함유하는 하이브리드화 용액 중에서, 42℃에서, 블롯을 긴 폴리뉴클레오티드 프로브와 함께 밤새(예를들어 12시간 이상) 배양함을 의미한다. 예를들어 5％ bp 미만의 불일치가 가능한 고 엄격성 조건하에서 블롯을 세척할 수 있고 (예를들어, 0.1×SSC 및 0.1％ SDS 중에서 65℃에서 30분동안 2회 세척), 이에 의해 예를들어 95％ 이상의 서열 동일성을 가진 서열을 선택할 수 있다.

고 엄격성 조건의 기타 비-제한적인 예는 30mM NaCl 및 0.5％ SDS를 함유하는 수성 완충액 중에서 65℃에서 최종 세척을 포함한다. 고 엄격성 조건의 다른 예는 7％ SDS, 0.5M NaPO₄, pH 7, 1mM EDTA 중에서 50℃에서 예를들어 밤새 하이브리드형성한 다음, 42℃에서 1％ SDS 용액으로 한번 이상 세척한다. 고 엄격성 세척이 5％ 미만의 불일치를 가능하게 하는 반면, 감소 또는 저 엄격성 조건은 20％ 이하의 뉴클레오티드 불일치를 가능하게 할 수 있다. 저 엄격성에서의 하이브리드형성은, 낮은 포름아미드 조건, 낮은 온도 및/또는 낮은 염 농도 뿐만 아니라 장기간의 배양 시간을 사용하는 것 이외에는 상기와 같이 달성될 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 본 발명과 상용가능한 임의의 크기, 예를들어 CLI 를 앓고 있는 환자 내에 도입될 때 치료 효과를 달성하기에 효과적인 임의의 바람직한 크기일 수 있다. 예를들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드 단편은 전체-길이 유전자 생성물보다 약간 작을 수도 있다. 예를들어, 본 발명의 폴리펩티드는 적어도 약 10, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600, 800, 1000 또는 1200개 아미노산을 포함할 수도 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 예를들어 융합 폴리뉴클레오티드 또는 게놈 서열의 일부인 폴리뉴클레오티드의 경우에 전체-길이 cDNA보다 더 길 수도 있다.

본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 원하는 방법에 따라 표지화될 수 있다. 예를들어, ³²P, ³⁵S, ³H 또는 ¹⁴C와 같은 방사능 트레이서를 사용하여 폴리뉴클레오티드를 표지화할 수 있다. 예를들어 방사능표지 뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드 키나아제 (포스파타제에 의한 포스포릴이탈반응과 함께 또는 이것 없이), 또는 리가제 (표지화되는 말단에 의존하여)를 사용하여 3' 또는 5'말단에서 말단 표지화와 같은 방법에 따라 방사능표지화를 수행할 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 면역학적 성질(항원, 합텐), 특정 시약에 대한 특이적 친화성 (리간드), 검출가능한 효소 반응을 완결시킬 수 있는 성질 (효소 또는 조효소, 효소 기질, 또는 효소 반응에 관련된 기타 물질), 또는 특징적인 물리적 성질, 예컨대 형광 또는 바람직한 파장의 빛의 방출 또는 흡수 등을 가진 잔기와 조합하는, 비-방사능 표지화를 사용할 수 있다.

eNOS 폴리펩티드

본 발명은 eNOS 폴리펩티드 및 그의 변이체에 관한 것이다.

인간 eNOS (예를들어 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS)의 적절한 돌연변이는, 예를들어 이에 한정되지 않지만 다음을 포함한다:

(a) 잔기가 다른 아미노산, 예를들어 Asp(S1177D)로 치환된, 아미노산 잔기 1177에 상응하는 포스포릴화 부위에서의 돌연변이(예를들어 WO 00/62605참조), 및/또는

(b) 잔기가 다른 아미노산, 예를들어 Ala(G2A)로 치환된 아미노산 잔기 2에 상응하는 미리스토일화 부위에서의 돌연변이 (예를들어, 문헌[Sessa 등 (1993), Circulation Research 72, 921-924] 참조), 미리스토일화 부위에서 돌연변이된 eNOS 폴리펩티드는 막에서가 아니라 세포의 세포질에 편재될 수 있다. 이러한 돌연변이체는 eNOS/NO 생성을 하향 조절하는 병리학적 자극(예를들어 oxLDL)에 대해 내성일 수 있다 (야생형 단백질에 비교하여). 이러한 성질은 외부 병리학적 자극이 존재하는 CLI의 치료에서 변이체 폴리펩티드 (또는 그것을 코딩하는 폴리뉴클레오티드)의 사용을 위해 유리할 수 있다.

(c) 포유동물 세포에서 포스포릴화되는 것으로 공지된 도메인에 있는 아미노산 잔기, 특히 아미노산 잔기 495에 상응하는 칼모둘린-결합 부위 (예, 서열 1의 아미노산 478-522)에서의 돌연변이. 바람직한 구현양태에서, 495에서의 아미노산 잔기는 Ala, Gly, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Tyr, Trp, Met, Ser, Cys, Glu, Gln, Lys, Arg 또는 His, 더욱 바람직하게는 Ala, Val, Leu 또는 Ile, 더욱 더 바람직하게는 Ala 또는 Val으로 치환된다. 이러한 변이체는 예를들어 동시-계류중인 출원 미국 일련번호 60/403,638호 (그 전체내용이 여기에 포함됨)에 언급되어 있다.

동시-계류중인 출원 미국 일련번호 60/403,638호는, eNOS에 존재할 때, 그의 활성을 증진시키는 다양한 다른 돌연변이를 개시하고 있다. 이러한 변이체는 그의 기능성 도메인 내의 다른 잔기에서 또는 eNOS 분자의 다른 기능성 도메인에서 상기 기재된 부위에 존재할 수 있다.

돌연변이가 도입될 수 있는 eNOS 폴리펩티드의 기능성 도메인은 특징결정되어있고 (도 1 참조), 예를들어 N-말단으로부터 C-말단으로 진행되어 미리스토일화를 위한 공통 부위; 팔미토일화를 위한 2개의 부위; 산화효소 도메인; (예를들어, 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Thr-495의) 포스포릴화를 위한 공통 배열을 포함하는 칼모둘린 결합 부위 (예를들어 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 아미노산 494-517); 및 (예를들어, 서열 1에 의해 코딩된 인간 eNOS의 Ser-1177의) 포스포릴화를 위한 공통 배열을 포함하는 환원효소 도메인을 포함한다.

또한, Thr-495의 치환 이외의 돌연변이가 칼모둘린 결합 부위, DPWKGSAAKGTGITRKKTFKEVANAVKISASLMGTVMAKRVKATI (예를들어, 서열 2)(서열 1의 아미노산 잔기 478-522)에서 일어날 수 있다. 특히, 포스포릴화 부위에 대한 N-말단인 잔기에서 다른 종에서의 필적하는 서열이 약간 상이할 수 있다 (도 1 참조, 서열 3-7). 이러한 요소에서의 각각의 아미노산은 다른 19개 천연 아미노산 또는 비-천연 아미노산의 어느 것으로 변화될 수 있다. 일부 구현양태에서, 돌연변이는 보존적 돌연변이, 예를들어 Gly/Ala, Val/Ile/Leu, Asp/Glu, Lys/Arg, Asp/Gln, Thr/Ser 또는 Phe/Trp/Tyr이 아니다. 하나의 구현양태에서, 서열 1의 Thr-495에 상응하는 아미노산 잔기의 C-말단 바로 가까이에 위치한, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드의 하나 이상의 잔기, 예를들어 잔기 496 및 498이 Arg 또는 Lys으로 대체된다.

본 발명은 또한, 하나 이상의 아미노산이 eNOS 폴리펩티드의 다른 기능성 도메인에서 변형되어진 eNOS 폴리펩티드를 포함한다. 예를들어, 하나 이상의 돌연변이가 하나 이상의 촉매 도메인 (예를들어, 산화효소 또는 환원효소 도메인) 또는 조절 영역 (예를들어, 자기억제 루프), 또는 여기에 기재되거나 당 기술분야에 공지된 임의의 기능성 도메인 내에 도입될 수 있다. 추가의 돌연변이는 여기에서 기재된 임의의 유형의 돌연변이일 수 있다.

여기에 기재된 2 이상의 돌연변이의 조합을 가진 폴리펩티드 변이체가 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다. 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 eNOS 폴리펩티드 변이체는 적어도 2개의 기능성 도메인에서 돌연변이를 갖고, 출발 또는 참조 폴리펩티드에 비교하여 더 많은 양의 eNOS 활성을 나타낸다. 원한다면, 이러한 추가의 돌연변이가 만들어지고 특징결정된 후에, 2개의 기능성 도메인의 하나 또는 상이한 기능성 도메인에서 제3 돌연변이가 만들어지고 특징결정될 때까지 계속 방법을 반복할 수 있다. 일부 구현양태에서, eNOS 폴리펩티드 변이체의 활성 (예를들어, NO 생성의 자극)이 추가의 돌연변이에 따라 계속 증가된다. 바람직한 구현양태에서, 인간 eNOS 변이체 폴리펩티드가 서열 1의 Thr-495에 상응하는 위치에서 (예를들어, Ala, Val, Leu 또는 Ile, 바람직하게는 Ala 또는 Val으로) 및 서열 1의 Ser-1177에 상응하는 위치에서 (바람직하게는 Asp으로) 아미노산 치환; 및 미리스토일화 부위에서 Gly-2에서의 아미노산 치환 (바람직하게는 Ala으로)의 조합을 포함한다. 가장 바람직한 구현양태에서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 S1177RD 돌연변이 및 G2A 돌연변이; S1177D 돌연변이 및 T495V 또는 T495A 돌연변이; G2A 돌연변이 및 T495V 또는 T495A 돌연변이; 또는 S1177D 돌연변이, G2A 돌연변이 및 T495V 또는 T495A 돌연변이를 코딩한다.

본 발명의 eNOS 폴리펩티드가 인간 이외의 포유동물로부터 유래될 때, eNOS에서의 필적하는 (균등한) 잔기가 변이될 수 있다. 이러한 유기체에서의 필적하는 잔기들이 잘 알려져 있다. 예를들어, 인간 단백질의 495 잔기는 생쥐 폴리펩티드의 잔기 494, 기니아 피그 폴리펩티드의 잔기 498, 개, 소 또는 돼지 폴리펩티드의 잔기 497, 쥐 폴리펩티드의 잔기 22, 또는 토끼 폴리펩티드의 잔기 40에 상응한다.

이러한 변이체의 생성 방법은 표준 방법이고 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 이러한 방법은 예를들어 상동성 재조합, 부위특이적 돌연변이유발, 카세트 돌연변이유발, 및 PCR-기본 돌연변이유발을 포함한다. 예를들어 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning, CSH Press (1989) 및 Kunkel 등 (1985) PNSA 82, 488-492] 참조. 이러한 돌연변이를 위한 출발 물질은 동물, 예를들어 인간, 생쥐, 기니아 피그, 개, 소, 돼지, 토끼, 쥐, 양, 말, 비-인간 영장류 또는 기타 동물로부터의 eNOS cDNA일 수 있다.

상기 기재된 것과 같은 변이체가 증가된 eNOS 활성을 나타내는지를 결정하기 위하여, 다양한 표준 분석이 사용될 수 있다. 다양한 eNOS 활성의 분석을 수행할 수 있거나; 또는 본 발명의 유전자 요법을 사용할 때 CLI의 하나 이상의 증상을 경감시키기 위하여 변이체 eNOS 폴리뉴클레오티드의 능력을 직접적으로 결정할 수 있다(실시예 참조).

eNOS는 L-Arg을 많은 생리적 반응에 관여하고/하거나 조절 기능을 하는 기체상 제2 메신저 분자인 NO로 전환한다. 어떠한 메카니즘에 구속되기를 원하지 않지만, eNOS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 병에 걸린 세포 또는 조직 내에 도입될 때 eNOS에 의해 매개된 하나 이상의 활성이 CLI의 증상을 경감시키는데 기여하는 것으로 제안된다. 예를들어, eNOS는 직접적으로 또는 간접적으로 (예를들어, 효소에 의해 생성된 NO를 통해) 혈관신생의 자극; 미세혈관 기능부전의 경감; 혈관확장의 자극; 측지 혈관 발생의 자극; 말초 사지 혈류의 증진; 사지 괴사의 억제; 피부 궤양화의 억제; 피부 궤양 치유의 증진 또는 혈소판 유착 및 응집(예를들어, 혈전 형성을 유도할 수 있음)의 억제 또는 예방; 내피 세포 증식 및 이행의 자극; 백혈구 활성화 및 유착 또는 유연근 증식의 억제; 면역 반응의 조정; 및 초과산화물 음이온의 제거를 매개한다. 이들 및 기타 eNOS 활성을 분석하기 위한 방법은 통상적이고, 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를들어, 측지 혈관-의존성 허혈성 사지에서 증가된 모세관 밀도 또는 혈관운동 반응성에 의해 증명되는 것과 같이, 허혈성 괴사의 억제를 측정하기 위한 방법 (예를들어 [Murohara 등 (1998) J.Clin.Invest., 101, 2567-2568] 참조)을 참조한다. 또한 본 명세서의 실시예를 참조한다.

eNOS 활성을 시험하기 위한 동물 모델은 표준 모델이고 당 기술분야에 공지되어 있다. 예를들어 문헌[Murohara 등(1998 상동); Couffinhal 등 (1998); Am J.Pathol 152, 1667-1669; Couffinhal 등, (1999) Circulation 99, 3188-3198]; 및 본 명세서의 실시예 참조. 이러한 분석은 예를들어, eNOS 결핍성 생쥐에서 수술이 시행될 때, 수술로 인한 후사지 허혈의 생쥐 및 토끼 모델을 포함한다. 후사지 혈류 및 모세관 밀도를 측정하기 위한 방법이 당 참고문헌에 기재되어 있다.

eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하기 위한 재조합 벡터

본 발명은 또한 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 재조합 벡터, 본 발명의 재조합 벡터를 함유하는 숙주 세포, 및 본 발명의 폴리펩티드의 제조에 관한 것이다.

본 발명은 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 삽입된 재조합 벡터에 관한 것이다. 이러한 폴리뉴클레오티드는 천연 공급원으로부터 직접적으로 단리될 수 있고, 적절한 발현 벡터 내에 클론화될 수도 있거나, 천연 발생 또는 변이체 폴리뉴클레오티드 서열을 갖도록 폴리뉴클레오티드를 인공적으로 조작할 수도 있다. DNA를 변이하고 클로닝하고 발현하기 위한 방법, 또는 여기에 언급된 다른 분자 생물학적 절차는 통상적이며, 다양한 교과서 및 기타 참고문헌에 기재되어 있다. 예를들어 문헌 [Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Wu 등, Methods in Gene Biotechnology (CRC Press, New York, NY, 1997), Recombinant Gene Expression Protocols, in Methods in Molecular Biology, Vol.62, (Tuan,ed., Humana Press, Totowa, NJ, 1997), 및 Current Protocols in Molecular Biology (Ausabel 등, Eds.), John Wiley & Sons, NY (1994-1999)] 참조.

본 발명은, 상기와 같은 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 적절한 발현 조절 서열(들) (예를들어, 프로모터 및/또는 인핸서)에 작동적으로 결합되도록 삽입된 발현 벡터(예를들어 플라스미드 또는 바이러스 발현 벡터)를 함유하는 재조합 구조물에 관한 것이며, 그 결과 코딩된 eNOS 폴리펩티드가 발현된다.

여기에 기재된 바와 같이, 생체내 유전자 요법 또는 생체외 (세포 기재) 유전자 요법의 방법에서 이러한 구조물이 사용될 수 있다.

예를들어 구성 또는 조절가능한 프로모터, 또는 진핵 세포 또는 바이러스에서 유전자 발현을 제어하는 것으로 공지된 기타 서열(예, 인핸서)과 같은 적절한 발현 제어 서열들이, 인간 세포와 같은 포유동물 세포를 위해 선택될 수 있다. 이러한 다양한 발현 제어 서열은 당업자에 의해 알려져 있다. 내인성 또는 이종 발현 제어 서열이 사용될 수 있다. 발현 제어 서열은 조직-특이적일 수 있다. 하나의 구현양태에서, 고-발현 유전자로부터 발현 제어 서열이 유래된다. 발현 제어 서열은 바람직한 유전자로부터 예를들어 CAT(클로람페니콜 트랜스퍼라제) 벡터 또는 선택가능한 마커를 가진 기타 벡터를 사용하여 선택될 수 있다. 이러한 선택을 위한 2개의 적절한 벡터는 pKK232-8 및 pCM7이다.

본 발명의 재조합 벡터에서 사용될 수 있는 적절한 프로모터는 예를들어 진핵 프로모터: 초기 즉시형 CMV, HSV 티미딘 키나아제, 초기 및 후기 SV40, 아데노바이러스 프로모터, 레트로바이러스로부터의 LTR, 및 생쥐 메탈로티오네인-I을 포함한다. 적절한 벡터 및 프로모터의 선택은 당업자의 수준 내에 있다.

본 발명의 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열의 전사는, 발현 벡터 내에 인핸서 서열을 삽입함으로써 증가될 수 있다. 인핸서는 시스-작용 DNA 요소이고, 보통 전사를 증가시키기 위해 프로모터에서 작용하는 10 내지 300개 염기쌍을 갖는다. 대표적인 예는, 복제 개시점 bp 100-270의 후방에 있는 SV40 인핸서, 사이토메갈로바이러스 초기 프로모터 인핸서, 복제 개시점의 후방에 있는 폴리오마 인핸서, 및 아데노바이러스 인핸서를 포함한다.

일반적으로, 재조합 발현 벡터는 복제 개시점을 포함한다. 발현 벡터는 번역 개시를 위한 리보솜 결합 부위, 전사 종결 서열, 폴리아데닐화 부위, 스플라이드 공여체 및 수용체 부위, 및/또는 5' 플랭킹 또는 비-전사 서열을 함유할 수도 있다. 필요한 비전사 유전 요소를 제공하기 위하여, SV40 스플라이스 및 폴리아데닐화 부위로부터 유래된 DNA 서열이 사용될 수 있다. 벡터는 발현을 증폭시키기 위해 적절한 서열을 포함할 수도 있다. 또한, 발현 벡터는 바람직하게는, 디히드로폴레이트 환원효소 또는 진핵 세포 배양액을 위한 네오마이신 내성과 같은 형질전환된 숙주 세포의 선택을 위해 표현형 특징을 제공하기 위하여 하나 이상의 선택가능한 마커 유전자를 함유한다.

많은 수의 적절한 재조합 발현 벡터가 당업자에게 알려져 있으며, 다수가 통상적으로 입수가능하다. 적절한 벡터는 염색체, 비염색체 및 합성 DNA 서열, 예를들어 SV40의 유도체; 바쿨로바이러스; 효모 플라스미드; 플라스미드와 바이러스 DNA의 조합으로부터 유래된 벡터; 및 백시니아, 아데노바이러스, 아데노-결합된 바이러스, TMV, 계두 바이러스 및 가성광견병 바이러스와 같은 바이러스 DNA를 포함한다. 그러나, 복제가능하고 숙주내에서 생존가능한 이상 어떠한 다른 벡터라도 사용할 수 있다. 적절한 클로닝 및 발현 벡터는 예를들어 Sambrook 등에 의해, 그리고 여기에 언급된 기타 참고문헌에 의해 설명된다.

유전자 요법을 위해 특히 유용한 재조합 벡터는 선택된 주요 폴리뉴클레오티드를 보유하거나 발현하도록 구성된 재조합 레트로바이러스를 포함한다. 사용될 수 있는 레트로바이러스 벡터는 EP 0 415 731호; WO 90/07936호; WO 94/03622호; WO 93/25698호; WO 93/25234호; 미국 특허 5,219,740호; WO 93/11230호; WO 03/10218호; 문헌 [Vile 및 Hart, Cancer Res. 53:3860-3864 (1993); Vile and Hart, Cancer Res. 53:962-967 (1993); Ram 등, Cancer Res. 53:83-88 (1993); Takamiya 등, J.Neurosci.Res. 33:493-503 (1992); Baba 등, J.Neurosurg. 79:729-735 (1993)]; 미국 특허 4,777,127호; GB 특허 번호 2,200,651호, EP 0 345 242호 및 WO 91/02805호에 기재된 것을 포함한다.

상기 기재된 레트로바이러스 벡터 구조물과 함께 사용하기에 적절한 패키징 세포 주는 쉽게 제조될 수 있고 (예를들어, PCT 공보 WO 95/30763호 및 WO 92/05266호 참조), 재조합 벡터 입자의 생성을 위한 생성인자 세포 주(또한, 벡터 세포주라고 불리워짐)를 발생시키기 위해 사용될 수도 있다. 본 발명의 바람직한 구현양태 내에서, 패키징 세포 주가 인간(예컨대 HT 1080 세포) 또는 밍크 모 세포주로부터 만들어지고, 이에 의해 인간 혈청에서 불활성화를 견딜 수 있는 재조합 레트로바이러스를 생성할 수 있다.

본 발명은 또한 알파 바이러스-기본 벡터를 사용한다. 이러한 벡터는 예를들어 신드비스(Sindbis) 바이러스 벡터, 셈리키(Semliki) 포레스트 바이러스 (ATCC VR-67; ATCC VR-1247), 로스 리버(Ross River) 바이러스 (ATCC VR-373; ATCC VR-1246) 및 베네주엘란 말 뇌염 바이러스 (ATCC VR-923; ATCC VR-1250, ATCC VR-1249; ATCC VR-532)를 포함한 다양한 종류의 알파 바이러스로부터 구성될 수 있다. 이러한 벡터 체계의 대표적인 예는 미국 특허 5,091,309호; 5,217,879호; 및 5,185,440호; 및 PCT 공보 번호 WO 92/10578호; WO 94/21792호; WO 95/27069호; WO 95/27044호; 및 WO 95/07994호에 기재된 것을 포함한다.

적절한 벡터는 또한 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터와 같은 파르보바이러스일 수 있다. 대표적인 예는 WO 93/09239호 (Srivastava), 문헌[Samulski 등, J.Vir. 63:3822-3828 (1989); Mendelson 등, Virol. 166: 154-165 (1988)]; 및 [Flotte 등, PNAS 90:10613-10617 (1993)]에 개시된 AAV 벡터를 포함한다.

바람직한 구현양태에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 각종 개질된 아데노바이러스 벡터 (예를들어, Ad5 또는 Ad2), 특히 비-복제 벡터 및/또는 헬퍼 비의존성 바이러스가 당 기술분야에 잘 알려져 있다. 아데노바이러스 벡터의 대표적인 예는 문헌 [Berkner, Biotechniques 6:616]; [Rosenfeld 등, Science 252: 431-434 (1991)]; WO 93/19191; [Kolls 등, PNAS 215-219 (1994)]; [Kass-Eisler 등, PNAS 90:11498-11502 (1993)]; [Guzman 등 Circulation 88:2838-2848 (1993)]; [Guzman 등, Cir.Res. 73:1202-1207 (1993)]; [Zabner 등, Cell 75:207-216 (1993)]; [Li 등, Hum.Gene Ther. 4:403-409 (1993)]; [Cailaud 등, Eur.J.Neurosci. 5:1287-1291 (1993)]; [Vincent 등, Nat.Genet. 5:130-134 (1993)]; [Jaffe 등, Nat.Genet. 1:372-378 (1992)]; 및 [Levrero 등, Gene 101:195-202 (1992)]에 기재된 것을 포함한다. 본 발명에서 사용가능한 일례의 아데노바이러스 유전자 요법 벡터는 WO 94/12649, WO 93/03769; WO 93/19191; WO 94/28938; WO 95/11984 및 WO 95/00655호에 기재된 것을 포함한다. 문헌[Curiel, Hum.Gene Ther.3: 147-154 (1992)]에 기재된 바와 같이, (예를들어, 표적화) 아데노바이러스에 연결된 DNA의 투여가 사용될 수도 있다.

각종 절차에 의하여, 적절한 DNA 서열을 벡터 내에 삽입할 수도 있다. 일반적으로, 당 기술분야에 공지된 표준 절차에 의하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제 부위(들) 내에 DNA 서열을 삽입할 수 있다. 이러한 절차 및 기타 절차는 당업자의 범위 내에 있는 것으로 생각된다. 이러한 기술 및 여기에 언급된 기타 분자 생물학 기술의 종래 절차는 다수의 쉽게 입수가능한 출처, 예를들어 문헌[Sambrook 등, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 제2판, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989)]에서 찾아볼 수 있다. 또한, 예를들어 아데노바이러스 유전자 전달 비히클의 구성을 위해 유용한 구제 재조합 기술에 관하여 문헌 [Graham 등 (1988) Virology 63, 614-617]를 참조한다. 본 발명은 또한 상기 기재된 것과 같은 구조물로 형질전환, 형질감염, 형질도입된 (또는, 바이러스로 감염된) 숙주 세포, 및 상기 세포의 자손에 관한 것이며, 특히 이 경우에 이러한 세포는 CLI의 치료가 필요한 환자 내에 이식 (또는 재-이식)될 수 있는 안정한 세포 주를 생기게 한다.

세포-기본 유전자 요법을 위해 적절한 숙주는 골격근 세포, 유연근 세포, 골수-유래 간 세포, 내피 자손 세포, 섬유아세포, 수지상 세포, 제대혈 유래 세포 및 내피 세포를 포함하지만 이에 한정되지 않는다. 시험관내에서 숙주 세포 내에 구조물을 도입하는 것은 적절한 방법, 예를들어 칼슘 포스페이트 형질감염, DEAE-덱스트란 매개 형질감염, 리포펙션, 유전자 총 또는 일렉트로포레이션에 의해 수행될 수 있다 [Davis, L.Dibner, M.,Battey, I., Basic Methods in Molecular Biology (1986)]. 적절한 숙주 계통의 형질전환 및 적절한 세포 밀도로 숙주 계통을 성장시킨 후에, 원한다면 적절한 수단 (예를들어, 온도 변이 또는 화학적 유도)에 의해 선택된 프로모터를 유도할 수 있고, 세포를 적절한 기간동안 배양할 수 있다. (원한다면) 프로모터를 활성화하고, 형질전환체를 선택하고, 본 발명의 유전자를 증폭시키고/거나, 세포-기본 유전자 요법에서 사용하기 위한 세포의 수를 확대시키기 위해 적절하게 개질된 통상적인 영양 배지에서, 조작된 숙주 세포를 배양할 수 있다. 온도, pH 등과 같은 세포 배양 조건은 발현을 위해 선택된 숙주 세포에서 앞서 사용된 것이고, 당업자에게 명백할 것이다.

eNOS 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드를 사용한 CLI 유전자 요법

진행된 말초 동맥 폐색 질병(PAOD)에 기인한 위급한 사지 허혈(CLI)은, 다른 요인들 중에서, 진행형 미세순환계 기능부전 및 혈관신생의 손상을 특징으로 한다. 본 발명은, 이에 한정되지 않지만 예를들어 미세순환계 기능부전 또는 손상된 혈관신생, 백혈구의 활성화, 혈소판 응집, 모세관의 막힘, 내피세포 기능부전, 감소된 산화질소 이용성, 내피 손상, 자유 라디칼의 방출, 조직 손상, 괴사, 안정시 통증, 증가된 발목 또는 발가락 수축혈압 및/또는 피부 궤양화를 포함하는 하나 이상의 CLI 증상을 경감시키기 위해, 야생형 또는 변이체 eNOS 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 사용하여, CLI를 앓고 있는 환자 (예를들어, 폰테인(Fontaine) 단계 III 또는 IV PAOD의 환자)를 치료하기 위한 유전자 요법에 관한 것이다. 이러한 요법의 긍정적인 결과는 손상된 조직 및 그 근처에서 개선된 혈관신생 및/또는 혈관 확장 및/또는 상처 치유이다.

본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 치료가 필요한 환자에게 전달하는 것은 생체내 (예를들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 환자에게 직접 투여) 또는 생체외 (예를들어, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 세포, 예를들어 치료되어질 환자로부터 취해진 세포 또는 그로부터 유래된 세포주, 또는 치료되어질 환자로부터 유래되지 않은 세포 또는 세포주 내에 도입한 다음, 형질감염된 세포를 환자에게 도입함)에서 수행될 수 있다.

본 발명의 방법은, 유전자 전달 비히클 및/또는 형질감염된 세포에서 eNOS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유효량을 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함한다. 여기에서 "유효량"이란, 하나 이상의 CLI 증상, 예를들어 본 명세서에 기재된 증상을 상당히 또는 검출가능한 정도로 감소 또는 억제할 수 있는 양을 의미한다.

생체외 (세포-기본) 유전자 요법의 방법이 통상적이다. 발현가능한 eNOS 유전자를 함유하는 적절한 세포가 상기 기재되어 있다. 이들은 다양한 적절한 통상적인 방법, 예를들어 주입, 이식(grafting), 정맥내 투여, 이식(transplantation), 이식(implantation), 담체에 의해 캡슐화된 세포의 전달, 또는 생체내 투여를 위해 여기에 기재된 다양한 방법에 의하여 환자에게 도입될 수 있다. 다른 전달 증진 방법이 사용될 수도 있다. 이들은 히아룰로니다제 주입, 일렉트로포레이션 및 소노포레이션(sonoporation)을 포함하지만, 이에 한정되지 않는다. 생체내 투여를 위하여, eNOS (때때로 "유전자 전달 비히클"이라 일컬어짐)을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 상기 구조물을 다양한 통상적인 절차를 사용하여 그것을 필요로 하는 환자에게 투여할 수 있다. 구조물을 국소적으로 또는 전신적으로 전달할 수 있다. 생체내 전달의 적절한 경로는 당업자에게 알려져 있으며, 이에 한정되지는 않지만 혈관내, 근육내, 복강내, 피내, 동맥내 및 경구 방법을 포함한다. 전형적인 방법을 위하여, 예를들어 [Jolly, Cancer Gene Therapy 1:51-64 (1994) Kimura, Human Gene Therapy 5:845-852 (1994); Connelly, Human Gene Therapy 1: 185-193 (1995); 및 Kaplitt, Nature Genetics 6:148-153 (1994)]를 참조한다.

유전자 전달 비히클은, 통상적인 방법을 사용하여, 통상적인 제약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 제약학적 조성물로 제형될 수 있다. 세포 막을 거쳐 약제의 전달을 증진시키거나(침투를 촉진하거나) 또는 분해를 막는 제제 및 부형제가 당 기술분야에 알려져 있다. 예를들어, 리포좀이 SF-콜 또는 DC-콜과 같은 콜레스테롤 유도체를 함유하는 양이온성 리포좀인 리포좀 매개 형질감염; 제형된 DNA (예를들어, PINC); 및 리포펙타민으로의 형질감염 등을 포함한 다양한 통상적인 절차에 의해, 전달 비히클 (예를들어 폴리뉴클레오티드의 생체내 또는 생체외 전달)을 표적 세포에 전달할 수도 있다. 전형적인 방법은 예를들어 USP 5,656,565; 문헌[Mannino 등 (1988) Bio Techniques 6, 682-690] 및 그것의 참고문헌; 및 문헌[Gao 등 (1991) Biochem Biophys Res Comm 179, 280-285]에 기재되어 있다.

하나의 구현양태에서, CLI를 앓고 있는 환자에게 투여된 유전자 전달 비히클을, 질병 상태가 발현되는 부위에 국소적으로 투여한다. 이러한 국소 전달은 예를들어 비-질병 관련 세포 또는 조직에서 NO의 유도로부터 발생되는 원하지 않는 효과(예, 부작용)을 피할 수 있다. 예를들어, 본 발명의 폴리뉴클레오티드는, 한쪽 또는 양쪽 대퇴부 동맥의 인접한 부위내에 삽입된 카테터에 의해 전달될 수도 있고, 이에 의해 대퇴부 동맥으로부터 혈류를 받는 골격근의 세포 내로 전달된다. (예를들어 USP 5,792,453호 참조). 단리된 조직 관류, 예를들어 단리된 사지 관류(ILP)에서와 같이 말초 혈관 체계 내로 또는 병에 걸린 조직, 예컨대 골격근 내로의 직접적인 주입이 사용될 수 있으며, 여기에서 대퇴부 동맥과 대퇴부 정맥 사이에서 폐쇄된 회로가 발생된다 (예를들어, WO 01/03728호 참조).

다른 구현양태에서, 치료적 폴리뉴클레오티드가 전신적으로 투여되지만, 이들이 통상적인 방법을 사용하여 주요 세포, 조직 또는 기관에 표적화되도록 변형된다. 예를들어, 폴리뉴클레오티드를 조직-특이적 발현 조절 요소, 예컨대 프로모터 또는 인핸서 요소의 제어하에 놓을 수 있다.

예를들어, 조직-특이적 내피 전사 제어 서열을 아데노바이러스 구조물과 같은 구조물 내에서 본 발명의 eNOS 유전자와 같은 트랜스유전자에 융합함으로써, 트랜스유전자 발현이 내피 세포로 제한될 수 있다. 내피 특이적 프로모터의 예는 예를들어 타이-2 프로모터 [Schlaeger 등 (1997) Proc Natl Acad Sci 1; 94(7): 3058-63], 내피 프로모터 [Lee 등 (1990) J.Biol.Chem. 265:10446-10450] 및 eNOS 프로모터 (Zhang 등 (1995) J Biol.Chem. 270(25): 15320-6]를 포함한다. 또한 Flt-1 및 Flk-1 프로모터가 사용될 수도 있다 (예를들어, [Bu 등 (1997) J.Biol.Chem. 272:3216-32622] 참조). 기타 가능한 프로모터는 합성 및 천연 골격근-특이적 프로모터 (예를들어 문헌[Hauser 등 (2000) Mol.Therapy 2:16-24]참조); Spc5-12 합성 프로모터 ([Li 등, Nature (1999) 17-241-245] 및 특허 WO 99/02737를 포함한다.

아데노바이러스 단독에 연결되거나 연결되지 않은 (예를들어 표적화된) 다양이온성 축합 DNA (예를들어 [Curiel, Hum. Gene Ther. 3:147-154 (1992)]참조); 리간드-결합 DNA (예를들어, [Wu, J.Biol.Chem. 264:16985-16987 (1989)]참조); 진핵 세포 전달 비히클 세포 (예를들어, 미국 일련번호 08/240,030 (1994년 5월 9일 출원) 및 미국 일련번호 08/404,796); 광중합된 히드로겔 물질의 침착; 손으로 잡고 쓰는 유전자 전달 입자 총 (예를들어 미국 특허 5,149,655호에 기재됨); 이온화 방사선 (미국 특허 5,206,152호 및 WO 92/11033에 기재됨); 핵 전하 중화 또는 세포 막과의 융합을 포함한, 다른 유전자 전달 비히클 및 방법이 사용될 수 있다. 추가의 접근법이 문헌[Philip, Mol.Cell Biol. 14:2411-2418 (1994)] 및 [Woffendin, Proc.Natl.Acad.Sci. 91:1581-1585 (1994)]에 기재되어 있다.

나출형(naked) DNA를 사용할 수도 있다. 일례의 나출형 DNA 도입 방법이 WO 90/11092호 및 미국 특허 5,580,859호에 기재되어 있다. 생체분해성 라텍스 비드를 사용하여 섭취 효율을 개선시킬 수 있다. 비이드에 의한 엔도사이토시스 개시 후에, DNA 코팅된 라텍스 비이드가 세포내에 효율적으로 수송된다. 소수성을 증가시키고 이에 의해 엔도솜의 붕괴 및 세포질 내로의 DNA 방출을 촉진하기 위해, 비이드 처리에 의해 방법을 더욱 개선시킬 수도 있다. 유전자 전달 비히클로서 작용할 수 있는 적절한 리포좀이 예를들어 미국 특허 5,422,120호, PCT 특허 공개 WO 95/13796호, WO 94/23697호 및 WO 91/14445호 및 EP 0 524 968호에 기재되어 있다. 또한, 사용을 위해 적절한 비-바이러스성 전달 방법은 문헌 [Woffendin 등, Proc.Natl.Acad.Sci. USA 91(24): 11581-11585 (1994)]에 기재된 접근법과 같은 기계적 전달 시스템을 포함한다. 또한, 코딩 서열 및 그의 발현 생성물은 광중합된 히드로겔 물질의 침착을 통해 전달될 수 있다. 코딩 서열의 전달을 위해 사용될 수 있는 다른 통상적인 유전자 전달 방법은 예를들어 손으로 잡고 쓰는 유전자 전달 입자 총(예를들어 미국 특허 5,149,655호에 기재됨)의 사용; 및 전달된 유전자를 활성화시키기 위한 이온화 복사선의 사용 (예를들어 미국 특허 5,206,152호 및 PCT 특허 공개 WO 92/11033호에 기재됨)을 포함한다.

폴리(N-비닐 피롤리돈) 및 폴리(비닐 알콜)과 같은 PINC ("보호 상호작용 비축합") 중합체는 (i) 급속 뉴클레아제 소화로부터 플라스미드를 보호하고, (ii) 골격근과 같은 표적 조직에서 원상태의 플라스미드를 분산 및 유지하고 (iii) 근육 세포에 의한 플라스미드의 섭취를 촉진시키기 위하여, 플라스미드 DNA와 착물을 형성하도록 계획되었다 (Mumper 등, 1996, Rolland and Mumper, 1998). 멈퍼(Mumper) 등 (1998)은, PINC 형성이 골격 근에 대한 형질감염 효율(10 내지 15배) 및, 쥐에서 혈청 알칼리성 포스파타제(SEAP), 인간 성장 호르몬 및 인간 IGF-1을 포함한 다수의 상이한 트랜스유전자를 코딩하는 플라스미드 DNA의 발현 지속기간(28일)을 모두 향상시킨다는 것을 밝혀내었다. 앰브루지즈(Abruzzese) 등(2000)은, 일렉트로포레이션과 조합된 PINC 형성이, 쥐 골격근으로부터 에리트로포이에틴 및 혈관 내피 성장 인자(FGG)와 같은 재조합 단백질의 생성 및 분비를 100배 증가시킨다는 것을 밝혀내었다. 훼웰(Fewell) 등(2001)은, 면역-결핍 생쥐의 후사지 근육 내에 주입 후에 PINC와 함께 제형된 플라스미드를 사용하여, 인간 인자 IX의 장기간 지속 발현 (120일 까지)을 증명하였다.

다른 측면은, eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 추가로, eNOS의 투여 전, 투여 동안 또는 투여 후에 하나 이상의 혈관신생 조절인자를 폴리펩티드로서 또는 이러한 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드로서 투여하는 것을 더욱 포함한다. 많은 혈관신생 조절인자가 당업자에게 알려져 있다. 이들은, 이에 한정되지는 않지만 성장 인자, 전사 인자, 혈관활성 물질, 화학유인 분자를 포함한다. 성장 인자는 예를들어 HGF, VEGF (예를들어, VEGF-2, VEGF-121, VEGF-145 또는 VEGF-165), FGF (예를들어, FGF-1, -2, -4, -5), 내피 성장 인자, 표피 성장 인자, 혈소판-유래 내피 성장 인자, TGF-α, TGF-β, PDGF, TNF-α 또는 IGF, 발생적으로 조절된 내피 세포 좌-1 (Del-1)을 포함한다. 또한, 잠재적인 혈관신생 조절인자는, 이에 한정되지는 않지만, 전사 인자 (예를들어, EPAS, HIF), 혈관활성 물질 (예를들어, 칼리크레인, C-유형 심방 나트륨배설촉진 펩티드(CNP), B1 수용체 작동물질) 및 화학유인 인자 (예를들어, GM-CSF, MCP-1, IL-8) 및 기타 펩티드 (예를들어, PR-39)를 포함한다. 이러한 혈관신생 인자를 단독으로 또는 eNOS 폴리펩티드와 함께 제조하고, 투여하고, 투여 효과를 시험하기 위한 방법은 통상적이다. (예를들어, 문헌 [Papapetropoulos 등 (1997) J Clin Invest 100, 3131-3139, Brock 등 (1991) Am J Pathol 138, 213-221] 및 [Ku 등, (1993) Am J Physiol. 265, H586-592], WO 01/03728, 및 그것의 참고문헌을 참조한다).

이러한 성장 인자들은 통상적인 절차를 사용하여 적절한 발현 벡터 내에 (개별적인 벡터 내에 또는 본 발명의 eNOS 폴리뉴클레오티드를 발현하는 벡터 내에) 클론화될 수 있다. (예를들어, VEGF를 사용한 근육내 유전자 요법에 의해 혈관신생을 유도하기 위한 방법에 관하여 문헌[Rivard 등 (1999) Am J Pathol 154, 355-363] 참조). 클론화된 혈관신생 인자들은, 보유된 기능이 야생형 혈관신생 인자의 혈관신생 기능인 것 이외에는, eNOS를 코딩하는 폴리뉴클레오티드에 관해 여기에 언급된 기능적 변형체 또는 단편의 형태를 취할 수 있다.

혈관신생 인자-코딩 서열의 단계 및 상류에서, 숙주 세포로부터 폴리펩티드의 분비를 돕거나 세포 막에 대한 부착을 수월하게 하는 서열을 융합하는 것이 유리할 수 있다. 이러한 적절한 리더 서열은 당업자에게 잘 알려져 있다.

일부 구현양태에서, 유전자 전달 방법은 골격근 주입에 의한다. 허혈성 다리에서 새로운 혈관 형성을 자극하기 위해서는 전-혈관신생 유전자의 골격근 주입이 편리하며, 유전자 전달을 위해 비교적 비-공격성의 접근법이다. 골격근은 다중핵의 분열종료 근원섬유로 이루어지고, 따라서 형질도입된 유전자의 효과적인 장기간 발현을 잠재적으로 촉진한다. 새로운 혈관 형성의 과정이 단지 1 내지 2주일을 필요로 하기 때문에, 일시적 유전자 발현이 치료적 혈관신생을 위해 충분하다. 새로 형성된 혈관은 생존 연속을 위해 성장 인자의 더욱 장기간 발현을 필요로 할 수도 있지만, 생체내 데이타는, 일단 혈류가 새로 형성된 모세관/동맥을 통해 이루어지면 치료적 트랜스유전자의 계속된 발현없이도 새로운 혈관이 열린 채로 유지된다는 것을 제안한다(1).

일부 구현양태에서, 유전자 전달의 방법은 아데노바이러스에 의한다. 아데노바이러스는, 다량으로 쉽게 생성될 수 있기 때문에, 혈관신생 유전자 요법 실험에서 사용되어 왔다. 바이러스는 다양한 기원 (기관 및 종)의 분리 및 비-분리 세포를 형질감염하였고, 일시적 트랜스유전자 발현을 가능하게 한다. 아데노바이러스의 형질도입 효율은 콕사키(Coxsackie)-아데노바이러스 수용체(CAR) 및 α_v인테그린의 존재에 의존할 수 있다. 또한, 성숙한 근원섬유의 근육 부착판 및 세포외 기질이 근육으로의 효과적인 바이러스 유전자 전달을 막는 물리적 장벽으로서 작용할 수도 있다. 즉, 소화 효소에 의한 부착판 및 세포외 기질의 투과성은 바이러스 유전자 전달을 증진시킬 수 있다. 또한, 히아룰로니다제로의 전처리는 바이러스 또는 플라스미드 전달을 사용한 트랜스유전자 발현을 증가시킬 수 있다 (미국 특허 6,258,791호). 또한, CLI를 가진 환자 및 실험 동물의 골격근에서 발생하는 염증 및 허혈성 손상 및 근원섬유 재생은 바이러스성 유전자 전달을 더욱 촉진할 수도 있다.

다른 구현양태에서, 골격근으로의 유전자 전달을 위해 플라스미드 벡터가 사용된다. 일렉트로포레이션, PINC 및 PVP와 같은 플라스미드 중합체 제형, 및 나출형 DNA에 의한 근원섬유 접근 및 침투를 증가시키기 위해 히아룰로니다제 또는 콜라게나제와 같은 화합물로의 전-처리를 포함하여, 골격근으로의 비-바이러스성 유전자 전달 효율을 증가시키기 위한 여러가지 접근법이 개발되었다. 플라스미드 DNA의 화학적 형성은 생체내 안정성 뿐만 아니라 표적 조직으로의 섭취를 상당히 개선시켰다. (i) 고속 뉴클레아제 소화로부터 플라스미드를 보호하고, (ii) 골격근과 같은 표적 조직에서 원상태 플라스미드를 분산 및 유지시키고, (iii) 근육 세포에 의한 플라스미드의 섭취를 촉진시키기 위하여, 폴리(N-비닐 피롤리돈) 및 폴리(비닐 알콜)과 같은 PINC ("보호성 상호작용 비축합") 중합체가 플라스미드 DNA와 착물을 형성하도록 설계되었다. 최근들어, PINC 형성은 생체내에서 여러 트랜스유전자의 발현 수준 및 지속기간을 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 플라스미드를 재투여하는 능력이 또한 증명되었다.

일부 구현양태에서, 국소적, 카테터 매개 VEGF-아데노바이러스 유전자 요법이 유전자 전달을 위해 사용된다.

하기 샘플들은 예증에 의해 주어진 것이고 본 발명을 어떠한 방식으로도 제한하기 위한 것이 아니다.

실시예 1: eNOS 폴리펩티드 변이체 및 재조합 플라스미드 및 바이러스 벡터

시험관내 및 생체내에서, 세포에서 eNOS 야생형 및 폴리펩티드 변이체의 플라스미드 벡터 전달 및 발현을 위하여, 단일 또는 이중 변이체를 가진 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 플라스미드 벡터를 생성하였다. eNOS 폴리뉴클레오티드 서열에서 직접적으로 쿤켈(Kunkel) 부위특이적 돌연변이유발을 사용하여 변이체를 생성하였다 [Kunkel, T.A.PNAS 1985; 82:488-492]. 서열결정에 의해 돌연변이를 입증하였다. 야생형 변이체 구조물의 cDNA를 플라스미드 벡터, p셔틀(Shuttle)-CMV 내에 클론화하여, CMV 발현 카세트 내에 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 위치시켰다. 그 결과, 이러한 구조물에서 폴리뉴클레오티드가 CMV 프로모터에 작동적으로 연결되고, 그 결과 프로모터가 세포에서 코딩된 eNOS 폴리펩티드 변이체의 발현을 진행시켰다.

단일 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체에서, 인간 eNOS의 칼모둘린 결합 부위에서 위치 495에 상응하는 Thr (도 1 참조)을 Ala, Asp 또는 Val (각각 변이체 T495A, T495D, T495V로 명명됨)으로 치환하였다. 이중 아미노산 치환을 가진 eNOS 폴리펩티드 변이체에서, 위치 1177에 상응하는 Ser을 Asp로 치환하고, 추가로 위치 495에 상응하는 Thr을 Ala, Asp 또는 Val (각각 T495A+S1177D, T495D+S1177D, T495V+S1177D로 명명됨)으로 치환하였다. 이러한 돌연변이는 서열결정에 의해 입증되었고, HEK 293 세포에서 NO 생성을 증가시키는 능력에 대해 시험하였다 (실시예 2 및 도 2).

상기 기재된 단일 및 이중 돌연변이를 가진 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 아데노바이러스 벡터를 문헌 [He 등 (1998) PNAS 95(5), 2509-2514]에 기재된 방법에 따라 생성하고, 시험관내 및 생체내에서 세포 내에 eNOS 야생형 및 폴리펩티드 변이체의 바이러스 벡터 전달을 위해 사용하였다. eNOS 폴리펩티드 변이체(상기 기재됨)를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 보유한 p셔틀 벡터를, E1 및 E3-결실된 Ad5 게놈을 함유한 플라스미드와 함께, 이.콜리 BJ5183 내에 동시-형질전환하였다. 아데노바이러스 벡터 주쇄는 아데노바이러스 5로부터 유래되었다. 이러한 벡터 주쇄에서, 아데노바이러스 서열의 E1 영역을 뉴클레오티드 454 및 3333 사이에서 결실시키고, 부분 E3 결실 (뉴클레오티드 30004 내지 30750)을 645bp 외래 DNA로 대체하였다. 폴리뉴클레오티드에 의해 코딩된 폴리펩티드의 발현을 위하여 CMV 프로모터 (-632 내지 +7에서) 및 SV 40 폴리아데닐화 시그날이 폴리뉴클레오티드에 작동적으로 연결되도록, E1-결실 부위에서 폴리뉴클레오티드를 삽입할 수 있다.

이어서, eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 재조합 아데노바이러스 플라스미드를 선택하고, 제한 엔도뉴클레아제 분석에 의해 확인하였다. 상응하는 바이러스를 플라스미드로부터 잘라낸 재조합 아데노바이러스 게놈과 함께 293 세포의 형질감염에 의해 구제하였으며, 이어서 바이러스를 293 세포에서 증폭시키고, 표준 CsCl 구배 정제에 의해 정제하고, HAEC에서 NO 생성을 위한 시험에 사용하였다 (실시예 3 및 도 3).

추가로, eNOS 폴리펩티드 변이체 NOS1177D (Sessa 등, 예일 유니버시티(Yale University)에 의해 제공됨)는 서열 1의 환원효소 도메인에서 아미노산 잔기 1177에 상응하는 위치에서 Asp으로의 아미노산 치환을 갖는다. 세포에서 이러한 eNOS 폴리펩티드 변이체의 활성을 시험하기 위하여, 이러한 변이체를 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 아데노바이러스 주쇄 (실시예 1에서 상기 기재됨) 내에 E1 위치가 결실된 위치에서 삽입하였다. 얻어진 재조합 벡터 Ad5NOS1177D는 eNOS 폴리펩티드 변이체 NOS1177D를 코딩한다. 재조합 벡터 Ad5NOS1177D를 팩키징 세포 내에 형질감염하였으며, 얻어진 바이러스를 플라그 정제하고, 2회 증폭시켰다. 3L-생체반응기에서 HEK293 세포의 대규모 감염을 접종하기 위하여 제2 증폭으로부터의 바이러스를 사용하였다. 얻어진 바이러스를 2회의 CsCl 구배 분리에 의해 정제하고, 10mM 트리스 pH 8.0, 2mM MgCl₂ 및 4％ 슈크로스에 대해 투석하였다. HAEC에서 NO 생성을 시험하기 위하여 분취량의 정제된 재조합 바이러스를 사용하였다 (실시예 3, 5 및 7 참조).

Ad5EGFP는 대조군이고, 리포터 유전자, 녹색 형광 단백질(GFP)을 코딩하는 아데노바이러스 벡터이다. 이것은 콜레트럴 테라퓨틱스(Collateral Therapeutics)에 의해 제조된 다음, HEK293 세포에서 증폭되고 FPLC에 의해 정제되었다. 정제된 바이러스를 PBS pH 7.2 및 2％ 슈크로스에 대해 투석하였다. 분취량의 정제된 대조 바이러스를 이후의 실험을 위한 대조로서 사용하기 위하여 -80℃에서 보관하였다 (실시예 5 및 7 참조).

실시예 2: HEK 293 세포에서 eNOS 폴리펩티드 변이체의 활성 검출 및 측정

HEK 293 세포에서 eNOS 폴리펩티드 변이체의 활성을 시험하고 측정하기 위하여, eNOS 폴리펩티드 변이체를 코딩하는 플라스미드 벡터(실시예 1에 기재됨)를 사용하여, HEK 293 세포에서 폴리펩티드 변이체를 전달하고 발현하였다. 먼저,10％ FBS (세라케어), 2mM 추가의 L-글루타민 및 50㎍/ml 겐타마이신을 함유하는 생육 배지(알파 MEM (기브코 12561-056))의 웰 당 2ml 중에서 HEK 293 세포를 6-웰 플레이트에 도말하였다. 세포가 약 75％ 융합성일 때, 이들을 T495A, Thr495D 또는 T495V eNOS 폴리펩티드 변이체 (실시예 1에서 상기 기재됨)를 코딩하는 플라스미드 셔틀 벡터 또는 야생형 인간(WT) eNOS (서열 1) 또는 양쪽 모두로 형질감염하였다.

WT eNOS 또는 변이체 eNOS를 코딩하는 플라스미드 셔틀 벡터 8㎍, 60㎕ 리포펙타민 2000 (인비트로겐) 및 200 I 옵티멤(OptiMEM) (기브코)를 혼합하고, 실온에서 30분간 배양한 후에, HEK 293 세포를 함유한 각각의 웰에 111㎕의 혼합물 + 420㎕ 옵티멤을 첨가함으로써 형질감염을 수행하였다. 37℃에서 2.5시간동안 배양한 후에, 2ml의 생육 배지를 각각의 웰에 첨가하였다.

2일 후에 (세포를 37℃, 5％ CO₂에서 배양함), 화학발광을 사용하여 세포에 의한 NO 생성을 측정한 후에, 세포를 용해시키고, 하기 기재된 바와 같이 ELISA 분석을 사용하여 용해물을 eNOS 단백질 함량에 대해 분석하였다. 상이한 플라스미드 사이의 형질감염 효능에서의 변동을 보정하기 위하여, eNOS 단백질의 양으로 NO 생성을 표준화하였다.

NO 생성의 측정

배지를 제거하고, 각각의 웰을 2ml NO 분석장치 완충액 (5mM Na HEPES, 140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl₂, 10mM 글루코스, 10mM CaCl₂, 5mM L-아르기닌, pH 7.5)로 2회 세척하였다. 이어서, 완충액을 100U/ml 초과산화물 디스뮤타제 및 40ng/ml VEGF를 함유하는 1ml의 NO 분석장치 완충액으로 대체하였다. 웰을 파라핀으로 덮고, 37℃에서 30분동안 배양한 후에, 제조업자의 지시에 따라 NO의 측정을 위하여, 세포 위의 완충액 0.8ml를 시에멘스 NOA280 화학발광 검출기 내에 주입하였다. 인증된 NO 기체를 표준으로 사용하였다. NO 측정을 완결한 후에, 세포 위의 남은 완충액을 제거하고, 세포를 0.6ml 용해 완충액 (0.5％ NP-40, 50mM 트리스-HCl pH7.5, 1㎍/ml 펩스타틴 A, 1 ㎍/ml 류펩틴, 5 ㎍/ml 아프로티닌, 24 ㎍/ml 페파블록 SC (뵈링거 만하임))에 용해시키고, -20℃에서 보관하였다.

eNOS 단백질의 측정:

96-웰 ELISA 플레이트 (코스타 3590)를 50mM Na 탄산염 완충액 pH 9.5중의 5㎍/ml의 코팅 항체 (토끼 다클론성 항-eNOS) 웰 당 100㎕로 코팅하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 키홀 림페트 헤모시아닌에 결합된 인간 eNOS의 잔기 599 내지 614에 상응하는 펩티드로 면역화된 토끼로부터 다클론성 항체(바브코)를 수집하고, 단백질 G 세파로스(아머샴)를 사용하여 정제하였다. 플레이트를 PBS+0.01％ 트윈 20 중에서 0.5％ I-블록 (트로픽스)의 200㎕/웰로 차단하고, 4℃에서 밤새 배양하였다. 이어서, 플레이트를 웰 당 350㎕의 PBS+0.5ml/L 트윈 20으로 3회 세척하였다. eNOS를 함유하는 HEK 293 세포 용해물을 플레이트에 첨가하고, 용해 완충액으로 60㎕/웰의 최종 부피까지 5-배 또는 10-배 희석하고, 실온에서 1.5 내지 2시간 동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 웰 당 350㎕의 PBS + 0.5ml/L 트윈 80으로 3회 세척하였다.

참고문헌 2에 기재된 것과 같이 유로피움-표지화된 검출 항체, 단클론성 항-eNOS 항체 (형질도입 랩 N30020)를 다음과 같이 첨가하였다: 왈락 분석 완충액(왈락/퍼킨엘머(Wallac/PerkinElmer) 1244-111)중의 125ng/ml 유로피움-표지화 항체, 100㎕/웰. 플레이트를 실온에서 1.5시간동안 배양하였다. 이어서, 플레이트를 웰당 350㎕의 PBS+0.5 ml/L 트윈 20으로 3회 세척하였다. 왈락 증진 용액 (왈락/퍼킨엘머 1244-105)을 첨가하였다, 100㎕/웰. 플레이트를 플레이트 밀봉제로 덮고 4℃에서 밤새 보관한 다음, 10분동안 혼합한 후에 플레이트를 왈락 1420 빅터(VICTOR)² 다표지 카운터 (퍼킨엘머 라이프 사이언스)에서 판독하고, 615nm에서 시간-분해 형광을 검출하였다 [Aberie S 등, Nitric Oxide 1, 226 (1997); Meurer J 등, Methods in Enzymology 359, 433-444 (2002)].

결과는, eNOS 폴리펩티드 변이체가 HEK 293 세포에서 NO의 생성을 자극하고, 단일 변이체 T495A 및 T495V 및 이중 변이체 T495A+S1177D 및 T495A+S1177D가 야생형 eNOS에 비교하여 증가된 수준의 NO 생성을 자극한다는 것을 나타낸다 (도 2).

실시예 3: HAE 세포에서 eNOS 폴리펩티드 변이체의 검출 및 측정

웰 당 350,000개 인간 대동맥 내피 세포(HAEC)를 10％ FBS를 함유하는 4ml의 EGM 성장 배지(캠브렉스) 중에 6 웰 플레이트에 도말하였다. 세포를 5％ CO₂중에서 37℃에서 배양하였다. 그 다음날, 야생형 또는 변이체 eNOS(Thr495Ala, Thr495Asp, Thr495Val 또는 Ser1177Asp)를 코딩하는 아데노바이러스 (웰 당 2×10⁷ 총 바이러스 입자, 웰 당 약 2×10⁷ 감염성 입자)를 각각의 웰에 첨가하였다. 바이러스로 4시간 배양 후에, 배지를 제거하고, 0.1％ 젤라틴 및 30μM 세피아프테린 (시그마)로 보충된 2ml의 EBM 성장 배지(캠브렉스)로 대체하였다. 20시간 후에, 화학발광을 사용하여 세포에 의한 산화질소 생성을 측정한 후, 세포를 용해시키고 용해물을 하기 기재된 바와 같이 ELISA를 사용하여 eNOS 단백질 함량에 대해 분석하였다. 상이한 eNOS 변이체를 보유하는 상이한 아데노바이러스 구조물에 의한 형질감염 효능 차이의 결과로서, 발현 수준에서의 변동을 보정하기 위하여, 산화질소 생성을 eNOS 단백질의 양으로 표준화하였다.

결과는, eNOS 폴리펩티드 변이체가 HEK 293 세포에서 NO의 생성을 자극하고, 야생형 eNOS에 비교하여 단일 변이체 T495A 및 T495D가 증가된 수준의 NO 생성을 자극한다는 것을 나타낸다 (도 3). 이 연구의 결과는, NO 방출을 자극하기 위하여 세포가 VEGF로 자극되는 반면 실시예 2에 기재된 연구에서 칼슘 이오노포어가 사용된다는 점에서, 실시예 2에 기재된 것과 상이하다. 또한, 아데노바이러스 감염은 플라스미드 DNA로의 형질감염에 비교하여 세포당 더 많은 eNOS 단백질 (더 많은 산화질소)을 생성하였다. 그 결과, 이 연구에서 eNOS의 과다 발현이 eNOS 폴리펩티드 변이체에 대해 관찰되는 NO 활성의 수준에 기여할 수도 있다.

인간 대동맥 내피 세포는 내인성 야생형 eNOS를 함유하지만, 과다-발현된 변이체 eNOS로부터 생성된 NO의 양은 내인성 eNOS의 수준의 약 20배이다. 실시예 2 및 3에 기재된 데이타에서, 산화질소 생성을 eNOS 단백질의 양으로 표준화하고, 따라서 eNOS 폴리펩티드 변이체가 동일한 범위에서 활성을 갖는다. 아데노바이러스 벡터 및 플라스미드 벡터 및 상이한 세포 유형을 사용하여 상이한 eNOS 폴리펩티드 변이체들 사이에서 검출된 NO 생성의 수준은, 보조인자 이용가능성과 같은 세포에서의 다른 제한 인자에 기인할 수 있다.

따라서, HAEC에서 eNOS 폴리펩티드 변이체를 더욱 시험하면, 상이한 세포 유형에서 eNOS 발현 및 활성의 효과를 더욱 명료하게 할 수 있다.

실시예 4: eNOS-KO 생쥐 CLI 모델의 생성

CLI의 동물 모델을 발생시키기 위하여, 3 내지 12개월령 야생형(WT) 및 eNOS 결핍 (eNOS-KO) 수컷 생쥐 (하기 재료 및 방법 참조)에서 대퇴부 동맥의 단측면 수술 절제를 수행하였다. 수술 전 및 수술 후 1, 4, 7, 10, 14, 21 및 28일 째에, 레이저 도플러 관류 영상화(LDPI) 시스템을 사용하여, 외면 후사지 혈류의 변화를 측정하였다 (도 4). 수술 후 1, 5 및 10일 째에 허혈성 사지에서 정량적 혈관조영술을 수행하였다. WT 생쥐에서, 폐색 후 1주일에 혈류가 상당히 손상되었으나, 28일에 예비-허혈성 기준선 수준의 80％로 회복되었다. 그러나, eNOS-KO 생쥐에서, 후사지 혈류의 회복이 부재하였으며 (도 4), 허혈성 사지 괴사와 연관되었다 (도 5). 인정된 혈관조영술 점수 지표를 사용하여 다수의 큰 측지 동맥을 평가하였으며, 10일 째에 eNOS-KO 생쥐에서보다 WT(C57B1/6)에서 2.6배 더 높았다 (도 6). 수술 후 28일 째에, eNOS-KO 생쥐는 괴사 사지의 자가절단에 기인하여 그들의 하부 허혈성 후사지를 소실하였다. 반대로, 야생형 생쥐의 어느 것도 사지 괴사 징후를 나타내지 않았다.

이러한 결과는, 사지 허혈에서의 혈관신생 및 조직 관류에서 내피-유래 NO의 중요한 역할을 증명하였다.

CLI 모델의 정제

허혈 손상의 심각성은 동맥 절제의 위치 및 길이에 의존하고, 또한 대퇴부 정맥이 그대로 남아있는지 또는 제거되었지의 여부에 의존하는 것으로 보였다. 전체 대퇴부 동맥 및 정맥의 절제는 심각한 허혈 및 eNOS-KO 생쥐에서 전체 사지의 급속히 소실을 일으켰다. 대퇴부 동맥 단독의 제거(대퇴부 정맥은 그대로 남아있음)는 더욱 점진적인 허혈성 괴사를 유발하였다. 대퇴부 동맥 단독의 단편 절제는 인간 CLI와 유사하게 덜 광범위한 허혈성 괴사 (발가락 또는 말단 사지 소실)를 일으켰다.

혈류 및 사지 구제에 대해 미치는 개재의 효과를 연속하여 연구하기 위하여 이 모델을 사용하였다.

CLI에 대한 연령의 영향

상기 기재된 CLI 모델을 사용하여, 혈류의 회복 및 허혈성 손상의 정도가 동물의 연령에 주로 의존된다는 것을 관찰하였다. 대퇴부 동맥의 단편 절제를 수행할 때, 유동 회복 및 허혈성 괴사 정도의 개선은 어린 eNOS-KO 생쥐에서보다 더욱 나이가 많은 동물에서 훨씬 더 컸다. 연령 3개월에서 eNOS-KO 생쥐는 WT 대조군과 동일하게 거동하였다. 혈류의 완전 회복은 전체 병리학적 변화가 없이 14일째에 관찰되었다. 6개월령의 동물은 상당히 손상된 혈류 회복 및 발가락에 대한 자극적 변화를 가졌으며, 그 결과 일부 경우에 발가락이 소실되었다 (도 8). 11-12개월령에서, 발은 수술 후에 즉각적인 변색을 나타내었으며, 생쥐는 수술 후 첫번째 날에 급속히 진행되는 괴사를 발현하였고, 그 결과 90％의 동물에서 10일째에 사지가 소실되었다 (도 9).

다리 소실 결과로서, 정량적 혈관조영술 또는 LDPI 유동과 같은 일부 실험 종결점이 모든 실험 군에서 평가될 수 없었다. 이러한 경우에, 수술 후 1, 4, 7, 10, 14, 21 및 28일째에 동물의 남아있는 발가락과 다리의 수를 세어서 치료 효능을 결정하였다.

유전자 전달의 최적화

일부 연구에서, 세포로의 유전자 전달을 위하여 일렉트로포레이션과 조합된 플라스미드 DNA (pDNA)가 사용되었다. 1) DNA 농도, 2) 주입 부피, 부위 및 수, 3) 일렉트로포레이션 조건, 4) 수술에 대한 치료 시기 및 5) 히아룰로니다제 전처리의 사용을 최적화하기 위하여 연구를 수행하였다 (도 10 및 11).

WT 생쥐에서 pLuc, 리포터 유전자 루시퍼라제를 함유하는 플라스미드를 사용하여 유전자 전달을 최적화하였으며, 주입 후 4일째에 내전근 근육 균등물에서 루시퍼라제 활성을 결정함으로써 측정하였다. eNOS-KO 생쥐에서 pNOS224 (NOS1177D 유전자를 함유한 플라스미드)를 사용하여 최선의 프로토콜을 시험하였다. 이러한 실험에서, 웨스턴 블롯 및 eNOS 특이적 ELISA에 의하여 eNOS 수준을 결정하였다 (도 12).

실시예 5: eNOS-KO 생쥐 CLI 모델에서 NOS1177D 처리의 효능

A. 6개월령 eNOS-KO 생쥐에서 괴사 방지 및 유동 증가

6개월령 수컷 eNOS-KO를 사용하여 이 연구를 수행하였다. 단편 대퇴부 동맥 절제 후에 생쥐들을 2개의 상이한 처리 군(각각의 군에서 n=8)으로 랜덤하게 분포시켰다. 하나의 군에 공 벡터를 주입하고, 다른 군에 상부 다리(내전근 및 사두근 근육)의 2개 부위에서 수술 후 3일째에 일렉트로포레이션과 조합하여 pNOS224 (NOS1177D 유전자 함유)를 주입하였다. LDPI 유동 측정 및 다리 사진을 수술 후 1, 4, 7, 10, 14, 21 및 28일 째에 얻었다. 연구 종료까지, pNOS1177D 처리된 동물 (4/8)에 비하여, 공 벡터 처리된 군 (8/8)에서 허혈성 괴사로 인하여 다리 소실의 비율이 상당히 높았다 (p<0.05).

28일 째에, 동물을 희생시키고, 처리 효과의 조직형태학적 평가를 위해 사지를 수집하였다. 연구 종료까지, pNOS224 처리된 동물(4/8)에 비하여, 공 벡터 처리된 군(8/8)에서 다리 소실이 상당히 컸다 (P<0.05) (도 13). 또한, pNOS 처리된 동물에서의 궤양 치유에서 장점이 관찰되었다 (도 14).

B. 11-12개월령 eNOS-KO 생쥐에서의 사지 구제

11-12개월령 eNOS-KO 생쥐를 사용하여 두번째 연구를 수행하였다. 이 연령 군에서의 허혈성 손상의 심각성 및 빠른 발전으로 인하여, 유전자 전달 프로토콜을 변형시켰다. 플라스미드 DNA를 3개 부위(내전근, 사두근, 장딴지근 근육)에서 수술과 동일한 날짜에 주입하고, 벡터 주입 전 20분에 유전자 전달 부위에서 히아룰로니다제로 근육을 전처리하였다. 공 벡터 처리된 군에서, 수술 후 10일까지 심각한 괴사 및 자가절단으로 인하여 모든 동물들이 허혈성 후사지를 소실하였다. 반대로, pNOS1177D 처리 군에서, LDPI 측정된 유동에서 상당한 개선이 존재하였으며, 모든 사지의 구제와 함께 허혈성 괴사의 심각성이 현저히 감소되었다 (도 15, 16 및 18-21).

프로토콜에서의 이러한 변화는 유전자 발현에서 상당한 개선을 가져왔다 (도 17).

C. 결론

결론적으로, 수술로 인한 후사지 허혈 후에 eNOS-KO 생쥐에서 NOS1177D로의 처리는, 유동을 증대시키고 허혈성 괴사를 감소/예방하여 사지를 구제하였다. 이러한 결과는, 내인성 NO 이용가능성이 심각하게 손상된 질병 상태 하에서, NOS 유전자 전달이 치료적 장점을 갖는다는 개념을 입증하였다.

실시예 6: eNOS의 유전자 결핍을 갖지 않는 쥐에서 새로운 위급한 사지 허혈 모델의 발생 및 eNOS 유전자 요법의 효능 시험

eNOS 결핍성이 아닌 동물 모델에서 NOS1177D의 효능을 평가하기 위하여, 내부 및 외부 대퇴부 동맥 및 윗쪽 대퇴부 부위를 제공하는 모든 곁 가지의 결찰 및 제거를 사용하는 CLI의 새로운 모델을, 수컷 성숙한 스프라그-돌리(Sprague-Dawley) 쥐에서 발생시켰다 (도 22). 도 22 및 도 23은 수술 후 1, 4, 10, 17 및 28일째에 쥐 CLI 모델에서 전체 병리학적 변화를 나타낸다.

또한, CLI 쥐 모델에서 동맥형성의 채점 방법을 개발하였다. 도 24는 쥐 CLI 모델에서 정상 사지(왼쪽 영상) 및 허혈성 사지(오른쪽 영상)의 혈관조영술을 나타내고, 도 25는 쥐 CLI 모델의 정상 사지(왼쪽 영상) 및 허혈성 사지(오른쪽 영상)에서의 동맥형성의 혈관조영술 점수를 나타낸다. 동맥형성을 정량화하기 위하여, 혈관조영술 영상의 대퇴골의 내부 1/4, 가운데 및 외부 1/4로부터 출발한 3개의 직선을 정상 및 허혈성 사지의 중간 대퇴부 부위에 그리고, 치료(예를들어, 플러스 또는 마이너스 eNOS 유전자 요법)를 볼 수 없는 2명의 격리된 조사자에 의하여 이러한 선들을 교차하는 전체 동맥 수를 계산하였다. 변동을 최소화하기 위하여, 혈관조영술 점수를 왼쪽 대 오른쪽 후사지의 전체 대동맥 수의 비율로서 표현하였다.

수술적 및 eNOS 유전자 요법 프로토콜

쥐를 2개의 군으로 분포시키고, 수술 후 즉시, 3개 부위 (내전근, 사두근-안쪽 넓은근 및 장딴지근 근육)에서 500㎕의 PBS 중의 1×10¹¹ 바이러스 입자로 근육내 주사하였으며, 각각의 허혈성 후사지에서 3회 주사를 위해 총 3×10¹¹ 바이러스 입자를 사용하였다. 네가티브 대조군으로서 9마리의 쥐에 Ad5EGFP (실시예 1에 기재됨)을 주입하고, 처리군으로서 9마리의 쥐에 Ad5NOS1177D (실시예 1에 기재됨)를 주입하였다. 유전자 전달 후 1, 4, 7, 10, 14 및 21일째에, 혈류 회복을 측정하기 위하여 레이저 도플러 관류 영상화(LDPI)를 사용하였다. 동시에 수술된 후사지의 사진을 취함으로써 허혈성 조직 손상을 평가하였다. 처리 기간의 마지막에 혈관조영술을 수행하였다.

NOS1177D를 받은 쥐에서, 유전자 요법 후 1일 째에 수술전 수준의 31％로부터 10일 째에 57％이하까지 혈류가 회복되었다. EGFP 대조 유전자를 받은 대조군 동물에서, 후사지 혈류는 단지 작은 회복(1일째에 30％ 대 10일째에 37％)을 나타내었으며, 2개 군 사이에서 10일째에 p=0.0226이었다 (도 25).

NOS 처리된 군의 괴사 점수는 도 26에 나타낸 것과 같이 전체 병리학적 단계 I-V를 기초로 하였다. 결과는, NOS 1177D 유전자 전달이, 증가된 eNOS 발현을 위한 경향과 함께 허혈성 괴사의 상당한 예방을 가져온다는 것을 나타낸다 (10일째에 점수는 NOS 처리군에서 1.89 대 대조군에서 2.89였다, p=0.014) (도 27).

또한, 유전자 전달 후 14일째에 수행된 하부 후사지의 혈관조영술은, Ad5EGFP-처리된 쥐에 비교하여 Ad5NOS1177D-처리된 쥐에서 더 많은 측지 혈관을 나타내었다 (혈관조영술 점수는 1.21 대 0.88이었다, p=0.0147) (도 28).

따라서, 결과는, 쥐 CLI 모델에서의 eNOS 유전자 요법이 허혈성 괴사를 예방할 수 있고, 이러한 효과가 처리된 후사지에서 생체내에서 eNOS 폴리펩티드 변이체의 증가된 발현과 상관관계가 있음을 나타낸다.

재료 및 방법

생쥐 후사지 수술

모든 실험을 위하여, 3-12개월령, 20 내지 55g 중량의 eNOS-KO 수컷 생쥐(잭슨 래보러토리(Jackson Laboratory, 미국 미들이스트 바 하버)를 사용하였다. 수술 절차 및 사지 관류의 레이저 도플러 측정을 위하여, 동물을 1.5％ 이소플루란으로 마취하였다. 생쥐에서 단측면 후사지 허혈을 발생시키기 위하여 수술에 의한 개재를 수행하였다. 대퇴부 동맥 위에 겹친 좌측 후사지의 윗부분에서 피부 절개(2mm)를 수행하였다. 대퇴부 동맥의 근접한 부분을 단리하고, 모든 곁가지를 결찰시켰다. 대퇴부 동맥 및 정맥을 결찰하고 해부하여 대부분의 심각한 허혈 손상을 도입하였다. 다른 경우에, 정맥을 사용하지 않은 채로 대퇴부 동맥을 단리하고 해부하거나, 또는 동맥의 단편 만을 절제하였다 (도 1 참조). 수술용 스테이플을 사용하여 겹쳐진 피부를 닫았다.

생쥐 후사지 혈류의 레이저 도플러 관류 영상(LDPI) 분석

허혈(좌측) 및 정상(우측) 후사지 양쪽의 관류를 평가하기 위하여 LDPI를 사용하였다. 후사지로부터 과량의 털을 제거하였다. 스캐닝을 개시하기 전에, 37℃에서 가열 판 위에 생쥐를 놓고, 온도 변동을 최소화하였다. 기재된 각각의 시점을 위하여, 다리의 동일한 영역 위에서 연속적 측정을 수행하기 위하여 LDPI를 사용하였다. 주변 빛 및 온도를 포함한 변수를 최소화하기 위하여, 좌측 대 우측 후사지 관류의 비율로서 관류를 표현하였다. 관류 분석을 마취상태 하에서 수술 전; 수술 직후; 및 수술 후 4, 7, 10, 14, 21 및 28일에 결정하였다.

생쥐 골격근 유전자 전달

수술 후 3일째에, 생쥐를 1.5％ 이소플루란으로 마취하고, 80㎍의 pNOS224 또는 50㎕ PBS 중의 공 플라스미드 벡터를 수술된 후사지의 대내전근 및 사두근 내에 근육내 주사한 다음, 캘리퍼 전극을 사용하여 일렉트로포레이션하였다(200V/cm, 20ms, 1Hz, 8펄스).

히아룰로니다제로의 전처리를 위하여, 50㎕ PBS 중의 20유닛의 물질을 대내전근, 사두근 및 장딴지근 내에 주입하고, 2시간 후에 각각의 근육에 80㎍의 pNOS224 또는 50㎕ PBS 중의 공 플라스미드 벡터를 동일한 부위에 주입한 다음, 캘리퍼 전극을 사용하여 일렉트로포레이션하였다 (200 V/cm, 20ms, 1Hz, 8펄스).

아데노바이러스 주입을 위하여, 대내전근 근육 내에 50㎕ 주입 부피로 1× 10¹¹vp를 사용하였다.

형질감염 효율 연구를 위한 생쥐 골격근 균질화

웨스턴, ELISA 또는 효소 활성 분석을 위해 처리하기까지 근육 단편을 절제하고 -80℃에서 보관하였다. 조직을 입방체 모양으로 만들고, 25mM 트리스 pH 7.8, 10％ 글리세롤, 0.2％ NP40, 로쉐 프로테아제 억제제 미니-정제 (1mM EDTA 및 세린 및 시스테인 프로테아제의 억제제 함유)를 함유하는 용해 완충액 중에서 키네마틱(Kinematic) 폴리트론 균질화기를 사용하여 균질화하였다. 효소 활성을 위한 보조인자를 첨가하였다: 각각 4μM FAD, FMN, BH₄, 3mM DTT, 3mM CaCl₂, 0.125M 칼모둘린. 대부분의 내전근 근육은 25 내지 75mg 중량이었다. 최대 속도에서 에펜도르프 원심분리기를 사용하여 5 내지 10분의 원심분리 후에, 상층액을 얻고, 두알 (Duall) 분쇄 유리 균질화기를 사용하여 펠릿을 다시 50 내지 75㎕의 용해 완충액으로 균질화하였다. 두번째 원심분리 후에, 2개의 상층액을 합하였다. 세번째 원심분리 결과, 250 내지 750㎕의 최종 부피와 함께 ml 당 100mg 근육의 최종 농도가 얻어졌다.

eNOS 특이적 ELISA

R & D 시스템스로부터의 특이적 ELISA를 사용하여 eNOS 단백질의 농도를 결정하였다. 100㎕ 분석 희석제의 첨가에 의하여 포획 항체를 활성화하였다. 근육 균질화물 또는 eNOS 표준의 50 내지 100㎕ 분취량을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 실온에서 2시간동안 서서히 혼합하거나 -4℃ 에서 밤새 보관하였다. R & D 시스템스로부터의 세척 완충액을 사용하여 각각의 웰을 3회 세척하였다. 고추냉이 퍼옥시다제 접합된 항체의 200㎕ 분취량을 2시간동안 첨가하였다. 완전 세척후에, 200㎕ 색 시약 분취량을 첨가하였다. 30분후에, 0.5N 황산으로 반응을 중지시키고, 450nm에서 판독하였다. 제공된 eNOS 표준으로부터의 표준 곡선을 사용하여 eNOS 농도를 계산하였다.

NOS 활성 분석

각각의 근육 균질화물 또는 표준의 60㎕ 분취량을, NADPH, 아르기닌 및 ¹⁴C-아르기닌을 함유하는 반응 혼합물 20㎕와 37℃에서 1시간동안 조합하였다. NADPH의 최종 농도는 0.2mM이었고, ¹⁴C-아르기닌의 5μC는 20μM이었다. 각각 2mM EDTA 및 EGTA를 함유하는 0.1M 아세트산나트륨 pH 5.2 완충액 중에 현탁된 AG-50W-수지를 통하여 반응물을 여과함으로써 반응을 중단하였다. 왈락 마이크로 베타(Wallac Micro Beta) 중에서 마이크로신트-40을 사용하여 생성물 ¹⁴C-시트룰린을 계수하였다.

상이한 NOS 이소형의 결정을 위한 생쥐 골격근 용해물의 웨스턴 블롯

SDS-PAGE:

각각의 샘플에 대하여, 30㎕의 근육 균질화물을 100mM 디티오트레이톨을 함유하는 10㎕ 4× 샘플 완충액 (인비트로겐 목록 번호 NP0007)에 첨가하였다. 100℃에서 7 내지 8분동안 가열한 후에, 각각의 샘플을 10％ 트리스-글리신 SDS-PAGE 겔(BMA PAGEr 목록 번호 59102)에 부하하였다. 필요한 경우에, 재조합 인간 eNOS를 함유하는 (40㎕의 1× 샘플 완충액 중의) 1㎕의 HEK 세포 용해물을 포지티브 대조로서 첨가하였다. 미리염색된 단백질 마커 (10㎕의 인비트로겐 LC5725)를 겔의 하나의 레인에 부하하였다. 버렉스(Berlex) 매질 준비 부서에 의해 제공된 1× 래믈리 주행 완충액(Laemmli Running Buffer)중에서 130V (일정 전압)에서 1.5시간동안 겔을 주행시켰다.

니트로셀룰로스 상으로의 블롯팅:

노벡스/인비트로겐 장치(장치를 전달 완충액에 미리 침지하였다)를 사용하여, 20V(일정)에서 2시간동안 니트로셀룰로스 상에 단백질을 전달하였다 (전달 완충액 = 100ml 10× 전달 완충액, 버렉스 매질 준비에 의해 제공됨 + 200ml 메탄올 + 700ml H₂O). 블롯팅 후에, 니트로셀룰로스를 20ml TBS + 5％ 탈지 건조유 중에서 4℃에서 밤새 저장하였다 (TBS=0.02M 트리스-HCl, 0.12M NaCl, pH 7.5).

항체를 사용한 단백질 검출 (모든 단계는 실온에서 수행됨):

블롯을 제1 항체 (항-eNOS 또는 항-bNOS 생쥐 단클론성 BD/TBS 중에 1:2000으로 희석된 형질도입 랩 + 0.1％ 트윈 20 + 5％ 탈지 건조유) 중에 1시간 15분동안 배양하였다. 이어서, 블롯을 다음과 같이 세척하였다: TBS + 0.1％ 트윈 20중에서 1회 10분 및 2회 5분 세척. 이어서, 제2 항체 (퍼옥시다제-접합 염소 항-생쥐 IgG, 케미콘 인터내셔날 AP308P 또는 로셰 1814168, TBS + 0.1％ 트윈 20 + 5％ 탈지 건조유 중에 1:3000으로 희석됨)에서 1시간동안 블롯을 배양하였다. 상기 기재된 바와 같이 세척하고 추가로 TBS (트윈 부재)에서 5분 세척한 후에, 블롯을 ECL 시약 중에서 1시간동안 배양하였다 (아머샴 파르마시아 RPN 2106). 이어서, 블롯을 사란 랩(Saran Wrap)으로 덮고, 아머샴 파르마시아 하이퍼필름 ECL (RPN 1674A)에 대해 1 내지 5분간 노출시키고, 필름을 현상하였다.

내피 NO 방출 (NO-분석장치)

10％ FBS를 함유한 클론틱스(Clonetics) 성장 배지(EGM) 4ml중에 6웰 플레이트 상에 350,000 HAEC/웰을 도말하였다. 다음날, 야생형 또는 변이체 eNOS를 코딩하는 아데노바이러스 (웰 당 2×10⁹ 총 바이러스 입자, 웰 당 약 2×10⁷ 감염성 입자) (Gly2 및/또는 Ser1177 위치에서)를 각각의 웰에 첨가하였다. 바이러스와 함께 4시간 배양 후에, 배지를 제거하고 0.1％ 젤라틴 및 30μM 세피아프테린으로 보충된 2ml의 클론틱스 기본 배지(EBM)로 대체하였다. 다음날 아침, 배지를 100㎍/ml 산화된 LDL(인트라셀 RP-047)을 갖거나 갖지 않는 2ml 새로운 EBM-젤라틴-세피아프테린으로 대체하였다. 6시간 후에, 배지를 제거하고, 각각의 웰을 2ml NO 분석장치 완충액 (5mM Na HEPES, 140mM NaCl, 5mM KCl, 1mM MgCl₂, 10mM 글루코스, 10mM CaCl₂, 5mM L-아르기닌, pH 7.5)으로 2회 세척하였다. 이어서, 완충액을 100U/ml 초과산화물 디스뮤타제 및 40ng/ml VEGF를 함유한 NO분석장치 완충액 1ml로 대체하였다. 웰을 파라핀으로 덮고, 37℃에서 30분동안 배양한 후에, 셀 위의 완충액 0.8ml를 NO 측정을 위하여 시에멘스 NOA280 화학발광 검출기 내에 주입하였다. 산화질소 측정을 완결한 후에, 셀 위의 나머지 완충액을 제거하고, 세포를 0.3ml eNOS ELISA 용해 완충액 중에서 용해시켰다. -20℃에서 밤새 보관한 후에, eNOS ELISA를 사용하여 용해물(각각 5 내지 20㎕)을 eNOS 단백질에 대해 분석하였다. 상이한 변이체 아데노바이러스 사이에서 발현 수준 변동을 보정하기 위하여, 산화질소 생성을 eNOS 단백질의 양에 대해 표준화하였다.

플라스미드 구조물

1. pGL3-대조. 이 플라스미드에서 반디불 루시퍼라제 유전자의 발현은 SV40 프로모터/인핸서 (프로메가)에 의해 유도된다. 플라스미드 주쇄는 pGL3-기본 주쇄이다.

2. pcDNA3.1/eNOS224. eNOS224 유전자의 발현은 pcDNA3.1의 CMV 프로모터에 의해 유도되고, eNOS 폴리펩티드 변이체 S1177D를 코딩한다.

3. pcDNA3.1/히그로는 pcDNA3.1d (프로메가)를 위한 대조 플라스미드이다.

형태학적 분석

모의 PAOD에 대해 좌측 대퇴부 동맥이 결찰된 eNOS-KO 생쥐를 수술 후 28일에 희생시켰다. 후사지에서 피부를 벗겨내고, 고정시키고, 2일동안 석회질제거된 용액에 놓아둔 다음, 처리 효과의 형태학적 평가를 위해 체계적인 랜덤 방식으로 차단하였다. 간략하게, 엉덩이 관절에서 다리를 탈구시키고, 4mm 간격으로 절개하였다. 모든 단편들을 단일 카세트에 위치시키고, 탈수시키고, 블록의 절단면에서 각 단편의 측면에 끼워넣었다. 5마이크론 두께 단편을 절단하고, C.A.S.T. 입체해석학 시스템을 사용하여 형태학적 평가를 위해 헤마톡실린 및 에오신(H & E)으로 염색하였다.

치료된 다리 및 치료되지 않은 다리 모두가 유사한 유형의 병리학적 변화를 나타내었다. 가장 지속적인 변화는, 근육 부피가 지방 세포로 대체된 근육 섬유의 소실이었다. 이러한 변화는 큰 근육 군에 지속적으로 존재하고, 활성 근육 퇴화의 증거와 보통 연관되지 않는다. 그러나, 일부 경우에, 퇴화되는 근육 섬유 주위 뿐만 아니라 대체 지방 주위에서 다수의 급성 및 만성 염증성 세포 침윤물에 의해 증명되는 바와 같이 활성 조직 파괴가 계속 진행된다. 정상으로 보이는 근육, 지방 대체 조직 및 염증성 세포 침윤물의 면적은 현미경 하에서 쉽게 확인되었다. 이러한 조직에 의해 차지된 각각의 슬라이드 상의 면적을 개별적으로 정량화하였다. 슬라이드 위의 다른 모든 영역(예컨대, 뼈, 피부, 연결 조직 등)을 "기타"로 표시된 부류에 함께 분류하였다. 각각의 영역의 부피를 각각의 다리의 전체 부피 퍼센트로서 계산하였다. 양쪽 군에 대한 이러한 입체해석학 연구 결과를 ANOVA에 의해 비교하였다 (도 21).

하기 매개변수에서 통계적으로 중요한 변화가 존재하였다: eNOS-처리된 사지의 전체 부피는 공 벡터-처리된 사지에 비해 훨씬 컸지만 수술되지 않은 (대조) 사지와 다르지 않았다. 건강한 근육의 부피％는 eNOS 벡터에 비해 공 벡터에서 상당히 저하되었다. 그에 상응하여, 대체 지방의 양은 eNOS-처리된 사지에 비하여 공 벡터 처리된 사지에서 상이하지 않았다. 염증의 양은 공 벡터 군에서 증가되었으나, 의미있는 값에 이르지 않았다 (P=0.0525).

이러한 변화는, 대퇴부 동맥 결찰 후 즉시 근육 섬유가 소실되고 소실된 섬유가 지방 조직으로 대체된다는 것을 시사한다. 그러나, 일부 부위에서, 심지어 지방 조직도 이용가능한 혈류에 의해 지지되지 않을 수 있고, 따라서 활성 염증성 세포 침윤물에 의해 증명되는 바와 같이 조직 괴사가 계속되었다. eNOS 처리는 이러한 병리학적 변화를 경감시켰다.

본 출원은 2002년 8월 16일에 출원된 미국 가출원 일련번호 60/403,637호 (여기에서 참고문헌으로 포함됨)를 우선권으로 주장한다.

<110> Dole, William P. 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355 360 365 Asp Pro His Arg Tyr Asn Ile Leu Glu Asp Val Ala Val Cys Met Asp 370 375 380 Leu Asp Thr Arg Thr Thr Ser Ser Leu Trp Lys Asp Lys Ala Ala Val 385 390 395 400 Glu Ile Asn Val Ala Val Leu His Ser Tyr Gln Leu Ala Lys Val Thr 405 410 415 Ile Val Asp His His Ala Ala Thr Ala Ser Phe Met Lys His Leu Glu 420 425 430 Asn Glu Gln Lys Ala Arg Gly Gly Cys Pro Ala Asp Trp Ala Trp Ile 435 440 445 Val Pro Pro Ile Ser Gly Ser Leu Thr Pro Val Phe His Gln Glu Met 450 455 460 Val Asn Tyr Phe Leu Ser Pro Ala Phe Arg Tyr Gln Pro Asp Pro Trp 465 470 475 480 Lys Gly Ser Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe 485 490 495 Lys Glu Val Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr 500 505 510 Val Met Ala Lys Arg Val Lys Ala Thr Ile Leu Tyr Gly Ser Glu Thr 515 520 525 Gly Arg Ala Gln Ser Tyr Ala Gln Gln Leu Gly Arg Leu Phe Arg Lys 530 535 540 Ala Phe Asp Pro Arg Val Leu Cys Met Asp Glu Tyr Asp Val Val Ser 545 550 555 560 Leu Glu His Glu Thr Leu Val Leu Val Val Thr Ser Thr Phe Gly Asn 565 570 575 Gly Asp Pro Pro Glu Asn Gly Glu Ser Phe Ala Ala Ala Leu Met Glu 580 585 590 Met Ser Gly Pro Tyr Asn Ser Ser Pro Arg Pro Glu Gln His Lys Ser 595 600 605 Tyr Lys Ile Arg Phe Asn Ser Ile Ser Cys Ser Asp Pro Leu Val Ser 610 615 620 Ser Trp Arg Arg Lys Arg Lys Glu Ser Ser Asn Thr Asp Ser Ala Gly 625 630 635 640 Ala Leu Gly Thr Leu Arg Phe Cys Val Phe Gly Leu Gly Ser Arg Ala 645 650 655 Tyr Pro His Phe Cys Ala Phe Ala Arg Ala Val Asp Thr Arg Leu Glu 660 665 670 Glu Leu Gly Gly Glu Arg Leu Leu Gln Leu Gly Gln Gly Asp Glu Leu 675 680 685 Cys Gly Gln Glu Glu Ala Phe Arg Gly Trp Ala Gln Ala Ala Phe Gln 690 695 700 Ala Ala Cys Glu Thr Phe Cys Val Gly Glu Asp Ala Lys Ala Ala Ala 705 710 715 720 Arg Asp Ile Phe Ser Pro Lys Arg Ser Trp Lys Arg Gln Arg Tyr Arg 725 730 735 Leu Ser Ala Gln Ala Glu Gly Leu Gln Leu Leu Pro Gly Leu Ile His 740 745 750 Val His Arg Arg Lys Met Phe Gln Ala Thr Ile Arg Ser Val Glu Asn 755 760 765 Leu Gln Ser Ser Lys Ser Thr Arg Ala Thr Ile Leu Val Arg Leu Asp 770 775 780 Thr Gly Gly Gln Glu Gly Leu Gln Tyr Gln Pro Gly Asp His Ile Gly 785 790 795 800 Val Cys Pro Pro Asn Arg Pro Gly Leu Val Glu Ala Leu Leu Ser Arg 805 810 815 Val Glu Asp Pro Pro Ala Pro Thr Glu Pro Val Ala Val Glu Gln Leu 820 825 830 Glu Lys Gly Ser Pro Gly Gly Pro Pro Pro Gly Trp Val Arg Asp Pro 835 840 845 Arg Leu Pro Pro Cys Thr Leu Arg Gln Ala Leu Thr Phe Phe Leu Asp 850 855 860 Ile Thr Ser Pro Pro Ser Pro Gln Leu Leu Arg Leu Leu Ser Thr Leu 865 870 875 880 Ala Glu Glu Pro Arg Glu Gln Gln Glu Leu Glu Ala Leu Ser Gln Asp 885 890 895 Pro Arg Arg Tyr Glu Glu Trp Lys Trp Phe Arg Cys Pro Thr Leu Leu 900 905 910 Glu Val Leu Glu Gln Phe Pro Ser Val Ala Leu Pro Ala Pro Leu Leu 915 920 925 Leu Thr Gln Leu Pro Leu Leu Gln Pro Arg Tyr Tyr Ser Val Ser Ser 930 935 940 Ala Pro Ser Thr His Pro Gly Glu Ile His Leu Thr Val Ala Val Leu 945 950 955 960 Ala Tyr Arg Thr Gln Asp Gly Leu Gly Pro Leu His Tyr Gly Val Cys 965 970 975 Ser Thr Trp Leu Ser Gln Leu Lys Pro Gly Asp Pro Val Pro Cys Phe 980 985 990 Ile Arg Gly Ala Pro Ser Phe Arg Leu Pro Pro Asp Pro Ser Leu Pro 995 1000 1005 Cys Ile Leu Val Gly Pro Gly Thr Gly Ile Ala Pro Phe Arg Gly 1010 1015 1020 Phe Trp Gln Glu Arg Leu His Asp Ile Glu Ser Lys Gly Leu Gln 1025 1030 1035 Pro Thr Pro Met Thr Leu Val Phe Gly Cys Arg Cys Ser Gln Leu 1040 1045 1050 Asp His Leu Tyr Arg Asp Glu Val Gln Asn Ala Gln Gln Arg Gly 1055 1060 1065 Val Phe Gly Arg Val Leu Thr Ala Phe Ser Arg Glu Pro Asp Asn 1070 1075 1080 Pro Lys Thr Tyr Val Gln Asp Ile Leu Arg Thr Glu Leu Ala Ala 1085 1090 1095 Glu Val His Arg Val Leu Cys Leu Glu Arg Gly His Met Phe Val 1100 1105 1110 Cys Gly Asp Val Thr Met Ala Thr Asn Val Leu Gln Thr Val Gln 1115 1120 1125 Arg Ile Leu Ala Thr Glu Gly Asp Met Glu Leu Asp Glu Ala Gly 1130 1135 1140 Asp Val Ile Gly Val Leu Arg Asp Gln Gln Arg Tyr His Glu Asp 1145 1150 1155 Ile Phe Gly Leu Thr Leu Arg Thr Gln Glu Val Thr Ser Arg Ile 1160 1165 1170 Arg Thr Gln Ser Phe Ser Leu Gln Glu Arg Gln Leu Arg Gly Ala 1175 1180 1185 Val Pro Trp Ala Phe Asp Pro Pro Gly Ser Asp Thr Asn Ser Pro 1190 1195 1200 <210> 2 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Ala Ala Lys Gly Thr Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Val Met Ala 20 25 30 Lys Arg Val Lys Ala 35 <210> 3 <211> 37 <212> PRT <213> Bos taurus <400> 3 Ala Thr Lys Gly Ala Gly Ile Thr Arg Lys Lys Thr Phe Lys Glu Val 1 5 10 15 Ala Asn Ala Val Lys Ile Ser Ala Ser Leu Met Gly Thr Leu Met Ala 20 25 30 Lys Arg Val Lys Ala 35 <210> 4 <211> 38 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4 Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met 20 25 30 Ala Lys Arg Val Lys Ala 35 <210> 5 <211> 38 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 5 Gly Thr Asn Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys 1 5 10 15 Leu Ala Glu Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met 20 25 30 Ala Lys Arg Val Lys Ala 35 <210> 6 <211> 37 <212> PRT <213> Rattus rattus <400> 6 Asp Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu Ile Arg Phe Thr Val Leu 1 5 10 15 Val Lys Ala Val Phe Phe Ala Ser Val Leu Met Arg Lys Val Met Ala 20 25 30 Ser Arg Val Arg Ala 35 <210> 7 <211> 37 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Asn Glu Lys Leu Arg Pro Arg Arg Arg Glu Ile Arg Phe Arg Val Leu 1 5 10 15 Val Lys Val Val Phe Phe Ala Ser Met Leu Met Arg Lys Val Met Ala 20 25 30 Ser Arg Val Arg Ala 35 <210> 8 <211> 37 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Asp Glu Lys Arg Arg Pro Lys Arg Arg Glu Ile Pro Leu Lys Val Leu 1 5 10 15 Val Lys Ala Val Leu Phe Ala Cys Met Leu Met Arg Lys Thr Met Ala 20 25 30 Ser Arg Val Arg Val 35

Claims (41)

1. 포유동물 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유효량을 위급한 사지 허혈(Critical Limb Ischemia; CLI)의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하는, 위급한 사지 허혈의 치료 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 인간 eNOS 폴리펩티드인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 인간 eNOS 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 1인 방법.
4. 제3항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 포스포릴화된 상기 인간 eNOS 내의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
5. 제4항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
6. 제4항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 1177에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
7. 제4항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 아미노산 495에 상응하는 위치에서 제1 돌연변이 및 서열 1의 아미노산 1177에 상응하는 위치에서 제2 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
8. 제4항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 아미노산 495에 상응하는 위치에서 제1 돌연변이, 아미노산 1177에 상응하는 위치에서 제2 돌연변이, 및 서열 1의 아미노산 2에 상응하는 위치에서 제3 돌연변이를 포함하는 것인 방법.
9. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 상기 돌연변이가 Ala, Val, Leu 또는 Ile로의 아미노산 치환인 방법.
10. 제6항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 잔기 1177에 상응하는 위치에서 상기 돌연변이가 Asp로의 아미노산 치환인 방법.
11. 제8항에 있어서, 아미노산 잔기 2에 상응하는 위치에서 상기 돌연변이가 Ala로의 아미노산 치환인 방법.
12. 제4항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드의 포스포릴화가 참조 eNOS 폴리펩티드에 비하여 증가되거나 감소되는 것인 방법.
13. 제4항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 참조 eNOS 폴리펩티드에 비하여 칼모둘린에 대해 증가된 결합 친화성을 갖는 것인 방법.
14. 제4항에 있어서, Ca++ 의존성이, 참조 eNOS 폴리펩티드에 비하여, 상기 eNOS 폴리펩티드의 Ca++ 칼모둘린 매개 자극에서 감소되는 것인 방법.
15. 제4항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 참조 eNOS 폴리펩티드에 비하여 증가된 eNOS 활성을 갖는 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 상기 활성이 NO의 생성인 방법.
17. 제15항에 있어서, 상기 활성이 환원효소 활성인 방법.
18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열이 인간 eNOS의 아미노산 서열이거나 이로부터 유래되는 것인 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 참조 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 1이거나 이로부터 유래되는 것인 방법.
20. 제4항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드의 아미노산 서열이 인간 eNOS의 아미노산 서열에 실질적으로 상동성인 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드의 아미노산 서열이 서열 1의 아미노산 서열에 대해 95-99％ 서열 동일성을 갖는 것인 방법.
22. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 상기 eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 재조합 벡터이고, 상기 폴리펩티드가 세포내에서 발현되도록 상기 서열이 적어도 하나의 조절 서열에 작동적으로 연결되는 것인 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 핵산 서열이 프로모터에 작동적으로 연결되는 것인 방법.
24. 제23항에 있어서, 상기 재조합 벡터가 바이러스 벡터인 방법.
25. 제24항에 있어서, 상기 바이러스 벡터가 아데노바이러스 벡터인 방법.
26. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 처리가 상기 환자의 세포 내에서 eNOS 활성을 조정하는 것을 포함하는 방법.
27. 제26항에 있어서, 상기 세포가 내피 세포인 방법.
28. 제26항에 있어서, 상기 세포가 골수 유래 세포인 방법.
29. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 방법이 상기 폴리뉴클레오티드의 투여 전, 투여 동안 또는 투여 후에, 상기 환자에게 하나 이상의 혈관신생 인자를 투여하는 것을 더 포함하는 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 혈관신생 인자가 HGF, VEGF, FGF, 내피 성장 인자, 표피 성장 인자, 혈소판-유래 성장 인자, TGF-알파, TGF-베타, PDGF, TNA-알파 또는 IGF, Del-1으로 구성된 혈관신생 인자의 군에서 선택되는 것인 방법.
31. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 투여가 생체외에서 상기 환자의 세포에 상기 폴리뉴클레오티드를 도입하는 것을 포함하는 방법.
32. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 투여가 상기 환자의 병에 걸린 조직에 상기 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것을 포함하는 방법.
33. 제1항 또는 제4항에 있어서, 상기 투여가 상기 환자의 말초 혈관 체계에 상기 폴리뉴클레오티드를 전달하는 것을 포함하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 상기 전달이 상기 환자의 사지 근육으로의 근육내 주사 또는 동맥내 주사에 의한 것인 방법.
35. eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유효량을 혈관신생의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 eNOS 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 포스포릴화된 포유동물 eNOS 내의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인, 혈관신생의 치료 방법.
36. eNOS 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 유효량을 미세혈관 기능부전의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 eNOS 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 포스포릴화된 포유동물 eNOS 내의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인, 미세혈관 기능부전의 경감 방법.
37. eNOS 폴리펩티드의 유효량을 위급한 사지 허혈(CLI)의 치료가 필요한 환자에게 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 eNOS 폴리펩티드가 포유동물 세포에서 포스포릴화된 포유동물 eNOS 내의 아미노산 잔기에 상응하는 위치에서 적어도 하나의 돌연변이를 포함하는 것인, 위급한 사지 허혈의 치료 방법.
38. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 잔기 495에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이가 Ala, Val, Leu 또는 Ile으로의 아미노산 치환인 방법.
39. 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가 서열 1의 아미노산 1177에 상응하는 위치에서 돌연변이를 포함하고, 상기 돌연변이가 Asp로의 아미노산 치환인 방법.
40. 제1항 및 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가

    i) 아미노산 495에 상응하는 위치에서 제1 돌연변이 (상기 제1 돌연변이는 Ala, Val, Leu, 또는 Ile으로의 아미노산 치환임); 및

    ii) 서열 1의 아미노산 1177에 상응하는 위치에서 제2 돌연변이 (상기 제2 돌연변이는 Asp로의 아미노산 치환임)

    를 포함하는 것인 방법.
41. 제1항 및 제35항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 eNOS 폴리펩티드가

    i) 아미노산 495에 상응하는 위치에서 제1 돌연변이 (상기 제1 돌연변이는 Ala, Val, Leu, 또는 Ile으로의 아미노산 치환임);

    ii) 서열 1의 아미노산 1177에 상응하는 위치에서 제2 돌연변이 (상기 제2 돌연변이는 Asp로의 아미노산 치환임); 및

    iii) 서열 1의 아미노산 2에 상응하는 위치에서 제3 돌연변이 (상기 제3 돌연변이는 Ala로의 아미노산 치환임)

    를 포함하는 것인 방법.