KR20050037509A - 심층 여과를 이용한 생물학적 유체로부터 이상 프리온단백질의 포획, 농축 및 정량 - Google Patents

Abstract

이상 프리온 단백질이 실질적으로 없는 면역글로블린 및 특히 항-D 면역글로블린과 같은 생물학적 용액의 제조방법. 구체적으로 프리온을 응집시키고 생물학적 용액을 심층 여과하여 이상 및 원하는 경우 정상 프리온 단백질을 포획하고 제거하하는 방법이 제공된다. 프리온 단백질은 그 다음 심층 필터 및 필터 세척액으로부터 용출되고, 현재 사용가능한 분석법에 필요한 한계 검출에 충분할 정도로 농축될 수 있다.

Description

심층 여과를 이용한 생물학적 유체로부터 이상 프리온 단백질의 포획, 농축 및 정량{Capture, concentration and quantitation of abnormal prion protein from biological fluids using depth filtration}

전염성 해면 뇌병증 (Transmissible spongiform encephalopathies, TSEs)은 진행성 치매, 운동실조증, 중추신경계(CNS)에서 아밀로이드 플라크 형성 및 해면 퇴행에 의해 특성지어지는 신경퇴행성 질병의 집합이다 (Prusiner, S.B., 1993, Cev. Biol. Strand. 80, 31-44). 그러한 질병의 원인물질은 현재 이상 프리온 단백질로 이해된다. 인간의 크루츠펠트 제이콥 질병(CJD), 가축의 소과 해면 뇌병증(BSE) 및 양의 스크라피와 같은 TSE의 기본 사건은 정상 세포 프리온 단백질 PrP^c의 병인성 이성질체 PrP^sc로의 전환이다. 프리온-감염된 동물이 뇌에서 PrP^sc 의 축적은 감염성 프리온의 역가 상승과 연관되며, 프리온 질병의 진단 마커로서 사용된다. BSE의 인간으로의 종간 전달의 위협으로 인해, 다수의 가축이 뇌 또는 다른 적합한 재료에서 PrP^sc의 존재에 대해 시험되어야 했다. PrP^sc 및 PrP^c사이를 구별하는 이중결합 변형의 부존재하에서, PrP^sc는 PrP^sc가 PrP^c와 달리 부분 프로테아제 내성을 가진다는 사실을 이용하여 웨스턴 블로팅 또는 효소-연결 면역흡착 분석법(ELISA)에 의해 프로티나제 K(PK)-처리된 균질체에서 일상적으로 검출되었다. 그러나, 이들 현재 사용가능한 분석법은 PrP^sc 형태가 응집한다는 사실을 이용하지 못하고 있다. 현재 세제-내성 PrP^sc 응집체는 단백질 분해에 민감한 PrP^sc를 갖는 희귀 프리온 종에 대해서도 PrP^sc의 일반적인 생화학적 성질로 여겨진다. 이러한 응집은 프리온이 예컨대 착화제(complexing agent)를 포함하는 응집 보조제에 노출되었을 때 발생한다.

치명적 인간 신경퇴행성 질병 CJD는 또한 다양한 경로를 통해 이아트로제니컬하게(iatrogenically) 전달되었으며, 이는 병원성 물질이 혈액 제품을 통해 전달될 수 있다는 것을 제시한다. "변형(variant)" CJD(vCJD)로 명명된 인간 TSE의 새로운 형태의 동정, 소과 해면 뇌병증(BSE)의 병인물질과의 연관 확인 및 인간 조직에서 vCJD의 병인물질의 전파가 전통적 CJD의 것과 다를 수 있다는 증명은 혈액 또는 혈액 제품이 PrP^sc을 전달할 수 있다는 이론적 위험의 존재를 제시한다 (Turner et al., Blood Reviews 1998; 12:255-68 참조).

다수의 혈액 제품은 정상 및 특이적 면역글로블린, 응집인자 농축물 및 알부민 용액을 포함하는 인간 혈장의 헌혈 집합으로부터 의학적 용도로 제조된다. 현재 인간 또는 동물 소스로부터의 생약학적 제품이 TSE를 전달할 수 있다는 가능성에 대해 심각한 염려가 있다. 장관외 투여용 인간 혈장 제품은 질병 전달의 위험성을 동반한다. 현재의 혈장 스크리닝 기술 및 바이러스의 제거 또는 불활성화를 위한 공정단계들은 이들 제품의 안정성을 크게 개선시켰다 (Burnouf T, et al., Blood Reviews 2000; 14:94-110 참조). 그러나, 불활성화의 화학 및 물리적 수단에 매우 내성인 이상 PrP^sc에 대하여는 아직 적합한 스크리닝 시험법이 개발되지 않고 있다. 이들 혈장으로부터 유래된 제품에 의한 환자로 전달된 vCJD의 가능성을 결정하기 위해, 임상적으로 관련된 환경에서 PrP^sc의 전달성, 혈장 분획에 사용되는 절차가 혈장 제품으로부터 PrP^sc를 제거할 수 있는 정도, 및 이용가능한 분석법을 사용하여 병인성 PrP^sc가 생물학적 제품에서 검출되는 정도를 결정하는 것이 필요하다.

인간 혈장은 전체 혈액으로부터 큰 세포 분획들을 제거한 후에 얻어진다. 혈장 분획 산업계에 의해 수행된 최근 연구들은 인간 혈장 제품의 제조에 사용된 제조공정들이 PrP^sc를 감소시킬 수 있다고 증명하였다 (Foster P., Trans. Med. 1999, 9:3-14; Lee De et al., J. Virol. Methods 2000, 84:77-89; Foster P. et al., Vox Sang 2000, 78:86-95, 및 Lee D. et al., Transfusion 2001, 41:449-55). 이들 공정 단계들은 콘(Cohn) 분획, 심층(depth) 여과 및 크로마토그라피를 포함한다. Foster et al. (Vox Sang, 상기)은 심층 여과가 면역글로블린 및 알부민으로부터 상당한 양의 이상 프리온 단백질(PrP^sc)을 제거하는데 유효하다는 것을 증명하였다.

따라서, 유효하나 제품의 생물학적 활성 또는 식품 가치를 실질적으로 감소시키거나 제거하지 않는 동물 또는 인간 유래 의학적 제품 또는 식품으로부터 이상 감염성 프리온을 포획하고 제거하는 방법을 개발할 필요성이 있다. 현재 이상 프리온을 검출하고 정량하는 방법의 한계로 인하여, 시료로부터 이상 프리온 단백질(PrP^sc)을 상기 검출 한계까지 농축하고 검출하고 정확하게 정량하는 능력이 절실하게 필요하다.

본 발명은 6 미크론 미만의 포어 크기을 갖는 하나이상의 심층 필터로 예컨대 생물학적 활성 단백질과 같은 생물학적 제품을 포함하는 수성 액체의 심층 여과가 이상 감염성 프리온 단백질을 제거하는데 놀랍도록 효과적이라는 사실의 발견에 기초한다. 더 구체적으로, 본 발명자들은 응집 보조제의 처리후에, 6 미크론 미만의 포어 크기을 갖는 하나이상의 심층 필터로 예컨대 생물학적 활성 단백질과 같은 생물학적 제품을 포함하는 수성 액체의 심층 여과가 이상 감염성 프리온 단백질을 제거하는데 놀랍도록 효과적이라는 사실을 발견하였다.

본 발명은 생물학적 제품 또는 식품에 함유된 TSE와 연관된 PrP^sc를 포획하고, 제거하고, 농축하고 정확하게 정량하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명은 PrP^sc가 필터내 및 위에 포획될 수 있도록 PrP^sc의 응집을 유발하는 하나이상의 응집 보조제로 처리된 생물학적 제품에 함유된 TSE와 연관된 PrP^sc를 포획하고, 제거하고, 농축하고 정확하게 정량하는 방법을 제공한다. 그러한 응집을 유발하는 어떤 방법도 본 명세서에서 응집 보조제로 사용될 수 있다. 구체적으로, 예컨대 알코올과 같은 용매가 사용될 수 있다고 밝혀졌다. 본 발명의 방법에서, 생물학적 제품 또는 식품과 혼합된 용매 액체와 같은 응집 보조제는 0.1 미크론 내지 6 미크론의 범위의 필터 평균 포어 크기(pore diameter)을 갖는 양이온성 수지로 코팅될 수 있는 규조토 또는 비슷한 필터 물질로 함침된 셀룰로스 셀룰로즈 섬유의 마트릭스가 형성되어 있는 필터를 통하여 통과된다. 전형적으로 필터는 일회용 필터일 수 있다.

구체적으로, 본 발명은 예컨대 알코올-분획화된 면역글로블린 용액과 같은 예컨대 알코올과 같은 용매와 같은 하나이상의 응집 보조제로 처리된 생물학적 제품에서 TSE와 연관된 PrP^sc의 포획, 제거, 농축에 이은 정확한 정량 방법을 제공하며, 그 방법은 상기 생물학적 제품 또는 식품을 함유하는 용매 액체를 다공성 물질의 고체 입자를 포함하고 6 μm 미만의 보유(retention)을 제공하는 포어 크기을 갖는 마트릭스로 형성된 심층 필터를 통과시키는 것을 포함한다. 전형적으로 필터는 일회용 필터일 수 있다. 응집 보조제(들)의 처리는 미리 혼합된 하나이상의 보조제 또는 이들을 시리즈로 사용하여 성취될 수 있다.

용어 "제거" 또는 "포획"은 원하는 단백질을 함유하는 액체로부터 PrP^sc의 실제적이고 물리적인 제거를 의미한다. 실제적 목적에서, 그 원래 생물학적 상태에서 원하는 단백질의 회수는 적어도 50%, 바람직하게는 80% 초과, 더 바람직하게는 > 90%의 레벨로 실질적으로 유지되어야 한다.

본 발명의 방법을 이용하여, 이상 감염성 프리온 단백질의 제거는 적어도 10^2.5, 10³, 바람직하게는 10⁴, 더 바람직하게는 >10⁵의 정도로 성취될 수 있다.

생물학적 제품 또는 식품으로부터 감염성 PrP^sc를 제거하는 것 이외에, 본 발명은 하나 이상의 필터로부터의 용출 및, 그 이후에 이용가능한 분석법을 이용하여 PrP^sc를 정확하게 정량하기 위하여 예를 들어 고장 용액 (예: 고염도 용액)을 포함할 수 있는 용출 완충용액을 이용하여 포획(capture)되고 용출된 PrP^sc을 농축하는 것에 관한 것이다.

따라서, 본 발명은 생물학적 또는 식품 용액의 정제를 위하여 프리온을 응집시킨 후 여과하고, 필터로부터 프리온을 용출하고, 당업자가 사용가능한 분석방법을 이용하여 생물학적 시료 또는 식품 시료 중의 총 프리온 및 PrP^sc 모두를 정량할 수 있도록 PrP^sc를 농축하는 것을 제공한다. 본 발명은 또한 수많은 시료 중에서 PrP^sc를 신속하고 높은 효율로 시험할 수 있도록 한다.

본 발명은 또한 처리된 생물학적 또는 식품 용액에 관한 것이다.

인간 혈장의 공급원은 더 큰 세포 분획을 제거한 후의 전혈 (whole blood)이기 때문에, 본 발명자들은 분획화를 위한 혈장에서 TSE 감염원의 예상되는 상태를 모사하기 위해 접종물로서 온전한 세포 및 더 큰 단편이 제거된 스크래피(scrapie)-감염 햄스터의 뇌를 사용하였다. TSE 질병은 프로테아제-K-저항성의 형태적으로 비정상인 프리온 단백질(PrP^sc)에 의해 감염되는 것으로 여겨진다. 본 발명자들은 본 명세서에 vCJD의 구분 양상을 위한 마커로서 햄스터-적응 스크래피 PrP^sc의 분포를 결정하기 위한 in vitro 분석 방법을 개시한다.

TSE 감염원은 불활성화에 매우 저항성이 있으므로, 임의의 제품과 연관된 위험의 감소는 제품을 제조하는 동안의 감염 물질의 물리적 제거에 의존할 것이다. 혈장 제품의 제조에 사용되는 제법 기술은 침전 및 크로마토그래피에 의해 단백질을 분리하고 그 결과 생성된 단백질 용액을 각각 심층 여과 및 막 여과방법에 의해 투명하게 하고 멸균시키는 방법을 포함한다. 본 발명의 방법으로 변경함으로써 몇몇의 이러한 기술들은 TSE 감염원을 산물 스트림으로부터 제거할 수 있다.

본 명세서에서는 햄스터 PrP에 특이적인 단일클론 항체 3F4를 이용한 웨스턴 블랏을 이용하여 PrP 단백질을 검출하였다. 이 항체는 오직 인간, 햄스터, 및 고양이과 동물 유래의 잔기 109-112 PrP와 반응한다. 3F4 항체와의 배양은 최소 1 시간 동안 0.6 ㎍/ml의 농도에서 수행한 후에 과량의 항체는 세척하여 제거하고 그 막을 토끼 항-생쥐 서양고추냉이 퍼옥시다제 컨쥬게이트(1:1000 희석)와 함께 최소 1 시간 동안 배양하였다. TTBS로 광범위하게 세척한 후에, 막을 ECL법(enhanced chemiluminescence)을 이용하여 현상하였다.

본 출원의 양수인에 의한 RhoGAM^R RHO(D) Immune Globulin의 제조에서, PrP^sc를 면역글로불린의 제조에도 사용되는 심층 여과 단계 동안의 검출 한계까지 제거하였다.

웨스턴 블랏은 PrP^sc를 동정하고 특징화하기 위해 사용되는 방법이다. PrP^sc는 추출에 의해 분리되고 프로테아제 K 분해에 대한 부분적인 저항에 의해 분별된다. PrP^RES(프로테아제 분해에 저항성이 있는 PrP^sc)는 글리코실화 형태 및 단편의 이동 지점에 의해 동정된다. 이러한 분석방법의 민감도는 감염 분석방법에 비해 약 10의 3승 (3 log) 만큼 작다. 이러한 민감도 문제는 효소 분해된 산물을 원심분리하는 단계, 상등액을 제거하는 단계, 및 더 작은 부피 중의 프리온 물질을 재현탁하는 단계를 거침으로써 프리온 물질을 농축시키는 방법에 의해 부분적으로 극복된다. 본 발명자들은 프리온을 응집 보조제로 처리한 뒤 필터를 통해 여과한 다음 용출에 의해 작은 부피로 수집함으로써 용이하게 농축될 수 있다는 것을 보여주었다. 이러한 기술은 대규모로 프리온을 제품 스트림으로부터 제거하는데 사용될 수 있다.

이러한 방법은 생물학적 매트릭스 중에서의 PrP^sc의 존재를 결정하기 위한 웨스턴 블랏 및 임의의 다른 프리온 검출 분석방법의 사용에 주로 영향을 미칠 것이다. 본 발명은 발전된 검출을 신속하게 가능하게 하기 위해 TSE 물질이 정량적으로 농축되는 것을 가능하게 한다. 생물학적, 식품, 또는 화장품 용액을 PrP^sc에 대해 정제하고자 할 때, 본 발명은 생물학적, 식품, 또는 화장품 용액을 필터의 큰 명목상의 공극 크기를 통해 쉽게 여과시킬 수 있다는 점에 있어서 장점을 갖는다.

본 발명의 방법은 PrP^sc를 제거하고, 용출하고, 더욱 정량함으로써 생물학적 제품, 식품, 및 화장품의 처리에 유용하며, 이는 적용되는 응집 보조제(들), PrP^c에 의존한다. 그렇게 처리될 수 있는 생물학적 제품으로는 전혈, 혈청, 및 혈장과 같은 혈액 및 혈액 성분, 소변, 뇌척수액, 및 항체 및 면역글로불린과 같은 혈액-유래 생물학적 제품이 있다. 그러한 항체 중 하나는 단일클론 항-D 면역글로불린 또는 RhoGAM^R Rho(D) Immune Globulin (인간)이라고 알려져 있는 IgG 면역글로불린이다. 이러한 폴리클로날 면역글로불린은 엄마가 인간 유래의 Rho(D) 면역글로불린을 주사 맞은 신생아의 용혈성 질환의 예방에 사용된다. 그러한 제품은 본 출원의 양수인으로부터 입수할 수 있는 RhoGAM^R 이며, 그것은 면역화 되지 않은 Rho (D) 음성 엄마가 적혈구에 존재하고 Rho(D) 양성 갓난아기로부터 '입수된' Rho(D) 항원에 반응하는 것을 차단함으로써 작용한다. 따라서, 엄마에 의한 항-Rho (D) 생성을 차단함으로써, 이후에 이러한 엄마의 Rho (D) 양성 갓난아기는 신생아 용혈성 질환으로부터 보호된다. 이러한 성공적인 제품은 현재 콘 (Cohn) 알콜 분획화 형태의 공정에 의해 생산된다.

RhoGAM^R Rho (D) Immune Globulin (인간)은 항체 매개 면역 억제를 이루기 위한 최초의 성공적인 예방용 특정 항체였다. RhoGAM^R은 항-Rho (D)를 투여 단위당 300 마이크로그램의 항-D 활성의 투여량으로 함유하는 IgG 면역글로불린 용액이다. RhoGAM^R은 비면역화된 Rho (D) 음성 임부에게 적절한 시간에 투여되어 그녀의 Rho (D) 양성 후손의 이후의 질병을 예방할 수 있다. 그 질병은 신생아 용혈성 질환 또는 보다 구체적으로는 Rh-태아적아구증 (Erythroblastosis fetalis)라고 부른다.

더 작은 투여량의 항-Rho(D)인 RhoGAM^R Rho (D) Immune Globulin (인간) Micro-Dose (항-Rho (D) 50 마이크로그램)가 또한 12 주 임신기간 또는 더 일찍 낙태 및 유산을 겪은 여성을 치료하기 위한 용도로서 본 출원의 양수인에 의해 판매되고 있다. 총 투여량이 수여자를 Rho (D) 양성 적혈구 15 mL 이하로 보호하는 반면, 더 적은 투여량은 Rho (D) 양성 적혈구 2.5 mL 이하로 보호를 제공한다. RhoGAM^R은 26 내지 28주 임신기간에 출생전 예방용으로서 사용된다. 다른 적응증은 임신 계속중 임의의 임신 기간 중의 유산 위험, 13 주의 임신기간 또는 그 이후에 유산 또는 임신의 종결, 비정상적 외상 또는 유전자 양수진단, 융모막 융모 샘플링 법(Chorionic Villus Sampling, CVS), 및 경피적 제대혈액천자(PUBS)를 포함한다.

FDA 및 생물학적 제제국 (Bureau of Biologics)에 의해 사용 승인된 대부분의 면역글로불린 주사 가능한 물질은 1940년대 동안 Harvard의 Dr. E. Cohn이 개발한 알콜 분획화 방법에 의해 생산되었으며, 그 방법은 본 명세서에 참조로 통합되어 있는 Cohn et al., J. Am. Chem. Soc. 68, 459 (1946)에 기재되어 있다. 이 방법은 간염 감염성, HIV 및 사용 가능한 가장 감도가 높은 시험에 의해 결정되는 다른 혈액 유래 병원체에 음성인 혈장의 신중한 선택과 결합된다. 이러한 방법에 의해 생산되는 제품이 정말로 안전하다는 것은 그 제품을 투여 받은 수백만의 비감염된 수여자에 의해 용이하게 입증될 수 있다. 본 발명자들은 이제 PrP^sc가 심층 여과를 이용한 검출 한도로 제거하고 그러한 검출에 충분한 수준으로 용출하고 농축할 수 있도록 충분한 수의 PrP^sc 입자를 응집시킨다는 점에 있어서 상기 참조된 Cohn 방법에 적용되는 알콜이 응집 보조제로서 작용하기에 충분하다는 것을 발견하였다.

적용되는 용매 조성물은 IgG 입자에 대해서 최소한의 영향을 미치지만, PrP^sc가 사용 가능한 분석방법을 이용한 검출 수준 이하로 제거될 수 있도록 PrP^sc를 충분히 응집시킨다.

도 1은 항-Rh 글로불린을 얻기 위해 인간 혈장을 분획하는 방법을 도시한 플로우 시트이다. 상기 분획 공정동안 프리온 단백질을 포획하기 위해 재료를 여과할 수 있다.

그러므로, 본 발명의 목적은 프리온 응집 보조제 및 막 또는 심층 여과를 이용하여 PrP^sc를 제거하는 방법, 바람직하게는 PrP^c를 생물학적 용액 및 식품 용액으로부터 제거하는 방법을 제공하는 것이다. 바람직하게는 심층 여과가 사용된다.

또한, 본 발명의 목적은 그 단백질의 특성 또는 생물학적 활성에 허용되지 않는 영향을 미치지 않으면서 단백질 함유 액체, 구체적으로는 인간 혈장으로부터 유래된 것으로부터 PrP^sc를 제거하는 방법, 바람직하게는 PrP^c를 제거하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 본 명세서에 개시한 방법을 이용하여 임의의 생물학적 유체로부터 PrP^sc를 포획하고, 농축시키고, 검출하여 정확한 정량을 하는 것이다.

본 발명의 목적은 비정상적인 감염 프리온이 제거된 순수한 주사용 면역 글로불린을 제공하는 것이다. 그러한 실질적으로 순수한 제품은 본 발명의 처리방법을 이용하여 생성된다.

본 발명의 또 다른 목적은 일시적, 평방 스퀘어(square foot), 및 단백질 수율 요구의 측면에 있어서 합리적인, 비정상적인 감염성 프리온으로부터 면역글로불린을 정제하기 위한 사용 가능한 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 단일 용도의 필터일 수 있고, 처리 스트림으로부터 제거된 PrP^SC가 처리될 수 있는 심층 필터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 심층 필터로부터 PrP^SC을 용출하고, 상기 필터를 세척함으로써 농축된 PrP^SC 용액을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 생물학적 유체 및 인간 혈액을 포함한 다양한 생물학적 재료와 혈장 유래 산물에 있는 PrP^SC를 평가하기 위한 신속한 분석법을 제공하는 것이다. 예를 들어 웨스턴 블롯과 같은 분석법을 사용하는 것은 비-프리온-응집되고, 비-여과된 생물학적 용액에서는 얻을 수 없는 충분한 수준의 프리온을 필요로 한다. 본 발명의 방법은 통상의 이용가능한 분석법으로 프리온이 검출될 수 있도록 프리온을 포획, 용출 및 농축하는 실용적인 방법을 제공한다. 본 발명의 신규한 포획 및 용출 방법을 사용하면 감도를 약 10³ 배 증가시켜 검출 분석법을 행하는데 필요한 부피를 감소시킬 수 있다.

본 발명의 방법은 비정상 프리온 단백질이 실질적으로 정제된 면역글로불린(바람직하게는 단일클론)을 제조하는데 사용된다. 상기 실질적으로 정제된 면역글로불린은 예를 들면 단일클론 또는 폴리클로날 항-D 면역글로불린, 예를 들면 RhoGAM^? 또는 MICRhoGAM^?이다. 상기 면역글로불린 제제는 약 4.0 내지 6.0중량%의 면역글로불린과 약 80 내지 200 ppm의 폴리소르베이트 80을 함유하고, 더욱 바람직하게는 약 5.0중량%의 면역글로불린과 약 130ppm의 폴리소르베이트 80을 함유한다.

상기한 면역글로불린 제제는 일반적으로 예를 들어 알코올과 같은 응집 보조제를 사용하여 인간 혈장을 분획하는 단계에 의해 만들어지는데, 상기 분획은 여과 단계; 생성된 침전물 II를 재현탁하는 단계; 상기 재현탁된 침전물 II를 부형제를 함유한 고이온강도의 완충액과 혼합하는 단계; 및 면역글로불린에 나노여과를 수행하는 단계를 포함한다.

알코올은 바람직하게는 메탄올이고, 여과 단계는 분획 공정의 상징액 III에 대해, Cuno Zeta Plus 90S 심층 필터와 같은 심층 필터를 사용하여 수행된다.

본 발명의 방법은 예를 들어 알코올과 같은 응집 보조제의 존재 하에 인간 혈장을 분획하는 단계를 포함하는, 실질적으로 비정상 프리온 단백질이 정제된 항-D 항체를 제조하는 방법을 개시하고 있는데, 여기서 분획은 여과 단계를 포함한다. 여과 단계는 약 0.6 내지 6 미크론 범위의 포어 크기를 갖는 Cuno Zeta Plus 90S 심층 필터와 같은 심층 필터를 사용할 수 있다. 상기 방법에서 "상등액 III"으로 언급된 생성 상등액은 침전물(상기 방법에서 "침전물 II"로 언급됨)을 형성하도록 처리되고, 그런 다음 이것은 재현탁되고, 처리 보조제와 혼합되며, 생성된 항-D- 항체에 나노여과가 행해진다. 처리 보조제로는 고이온강도의 완충액과 비이온 부형제, 예를 들면 150mM NaCl-글리신 완충액과 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다.

또한 응집된 비정상 및 정상 프리온 단백질을 형성하기에 충분한, 용매와 같은 응집 보조제와 생물학적 산물을 혼합하는 단계; 및 이와 같이 얻은 혼합물을 심층 필터로 여과하는 단계에 의해, 실질적으로 비정상 프리온 단백질이 정제된 생물학적 산물을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 상기 생물학적 산물이란 혈액 또는 혈액 제품, 뇌척수액 또는 뇨이다. 산물이 혈액일 경우, 혈액은 먼저 임상적으로 원심분리하여, 응집 보조제와 혼합하기 전에 혈액으로부터 적혈구와 혈소판을 제거한다. 여과 단계 후 적혈구와 혈소판은 다시 혈액에 첨가될 수 있다. 심층 필터는 예를 들어 Cuno Zeta Plus 90S 심층 필터를 포함한다. 응집 보조제는 약 2% 내지 약 100% 농도의 예를 들어 알코올, 예를 들어 에탄올 또는 메탄올과 같은 용매일 수 있다.

또한 생물학적 용액중의 비정상 프리온 단백질을 정량하는 방법이 개시되어 있다. 상기 방법은 생물학적 용액을, 비정상 프리온 단백질을 응집시키기에 충분한 용매와 같은 응집 보조제와 혼합하는 단계, 상기 혼합물을 심층 필터로 여과하는 단계, 용출 완충액으로 필터를 세척하여 심층 필터로부터 비정상 프리온 단백질을 용출해내는 단계, 선택적으로 상기 용출 완충액을 원심분리와 같은 방법으로 농축하는 단계, 및 비정상 프리온 단백질을 용출 완충액에 대해 분석하는 단계를 포함한다. 생물학적 용액은 혈액 또는 혈액 제품(예를 들어 면역글로불린), 뇌척수액, 또는 뇨일 수 있다.

본 발명은 프리온(정상 및/또는 비정상)이 용출, 포획, 농축 및 검출되도록 액체 내 프리온을 응집시키기 위한 하나 이상의 응집 보조제를 사용한다. 한 계열의 응집 보조제는 생물학적 액체와 같은 액체중의 비정상 감염 프리온(PrP^SC) 뿐 아니라 정상 프리온을 응집시키고, 그런 다음 상기 프리온 응집물은 제거되고, 용출되고, 농축되고, 비정상, 정상 프리온 중 어느 하나 또는 두가지 모두 본 발명의 방법으로 정확히 정량될 수 있다.

본 발명은 또한 착화제인 응집 보조제를 사용하는 것을 개시하고 있는데, 상기 착화제는 착화제의 성질에 따라 정상 프리온 또는 비정상 프리온을 응집시킨다. 이러한 착화제는 예를 들어 Cu²⁺, Ni, Zn 및 Ag와 같은 금속 이온을 포함한다.

본 발명은 상당한 수율 손실이 없고, 면역글로불린 서브클래스, 면역글로불린 응집물 수준 또는 면역글로불린 안정성에 중대한 변화없이, 예를 들어 면역글로불린 또는 항체와 같은 글로불린 단백질 분자를 포함하는 생물학적 액체에도 심층 필터와 같은 필터가 사용될 수 있도록 한다.

본 발명의 방법은 실질적으로 비정상 감염 프리온(PrP^SC) 및 필요하다면 정상 프리온(PrP^C)이 실질적으로 없는 생물학적 액체를 생성한다. 본 발명의 응집 및 여과 방법은 사실상 응집 보조제가 그렇게 하도록 적당히 선택되면 모든 가능한 카테고리의 프리온, 즉 정상 및 비정상 프리온 모두를 산물로부터 제거할 수 있다.

본 발명의 방법은 특히 전혈, 혈액 성분(예를 들어 혈청, 혈장), 뇨, CSF, 또는 예를 들어 알부민, 면역글로불린(예를 들어 IgG) 및 그 단편을 포함한 액체와 같은 임의의 생물학적 액체, 인자 IX, 트롬빈, 피브로넥틴, 피브리노겐, 인자 VIII 및 인자 II, VII, IX 및 X와 같은 혈액 응집 인자 및 혈장으부터 유래한 다른 단백질를 처리하는데 적용될 수 있다. 또한 혈장, 인자 XI, 인자 XIII, 헤모글로빈, 알파-2-마크로글로불린, 햅토고빈(haptogobin), 트랜스페린(transferrin), 아포리포프로틴, 프로틴 C, 프로틴 S, C-1-에스테라제 저해제, 효소(예를 들어 스트렙토키나제), 인터-알파-트립신 저해제, 성장 호르몬 및 폰 빌레브란트(Von Willebrand) 인자를 처리하는데도 이용할 수 있다. 상기한 것들의 자연발생 및 재조합 유사체도 처리할 수 있다. 또한 본 발명은 식품, 음료수, 화장품 등을 포함한 다른 천연 제품의 처리에도 적용할 수 있다. 또한 헤파린과 호르몬과 같은 다른 비-혈장 동물-유래 제품에도 적용할 수 있다.

전술된 바와 같이, 본 발명의 방법을 이용하여 처리될 수 있는 생물학적 액체는 전혈(whole blood)과 같은 혈액 및 혈액 성분 및 및 혈청 및 혈장을 포함하는 이의 성분, 뇨, 뇌척수액, 생물학적 제품 (예를 들면, 항체 및 면역글로불린)을 포함한다. 본 발명에서 처리 및 여과된 인간 혈장은 전술한 바와 같이 인용된 Cohn 등의 분획법("Cohn 방법"라고 함)에 의하거나, 뱃치 또는 컬럼 교환 크로마토그래피에 의하거나, 친화성 크로마토그래피에 의하여 얻을 수 있다. 면역글로불린, 특히 RhoGAM Rho(D) Immune Globulin(인간)과 같은 항-D 면역글로불린의 제조 방법에 있어서, 출원인은 Van Holten 등이고 2000년 8월 1일자로 특허허여된 미국 특허 제6,096,872호를 참조하며, 상기 특허는 인용되어 본 명세서에 통합된다.

Cohn, 미국 특허 제2,390,074호의 내용은 인용되어 본 명세서에 통합되어 있는데, 상기 특허는 감마 글로불린이 형성되는 혈액 분획법이 개시되어 있다. Cohn 방법에 의하여 형성된 감마 글로불린은 19S 글로불린, 플라스미노겐 및 지질류를 함유한다. 상기 감마 글로불린은 홍역 및 파상풍과 같은 질병에 대한 예방에는 매우 적합하지만, 19S 글로불린, 플라즈미노겐 및 지질류의 존재는 불필요한 오염물이며, 태아 적혈구 상의 Rh-인자의 면역을 억제함에 있어서 이의 효과를 저하시킬 수 있다.

본 발명의 입증가능한 방법에 의하여 제조된 실질적으로 순수한 항-Rh 글로불린은 알부민, 플라스미노겐, 알파, 베타 및 감마 글로불린 및 다양한 지질류를 함유하는 인간 혈장으로부터 제조된다. 보다 상세하게, 본 발명의 항-Rh 글로불린은 감마 글로불린이다.

항-Rh 글로불린을 얻기 위한 인간 혈장의 분획은 전술한 바와 같은 Cohn 등의 방법은 물론, Pollack 등이 출원인인 미국 특허 제3,449,314호에 따라 수행된다. 상기 특허의 교시 내용은 인용되어 본 명세서에 통합된다. 도 1의 흐름도를 참조하면, 인간 혈장을 분획하는 능력은 혈장 중 다양한 성분의 용해도에 의존한다. 상기 분획의 각 단계에서, 분획물을 분리하는 것 및 항-Rh 글로불린 중 바람직하지 못한 성분을 최대한 분리하는 것은 침전물의 pH, 온도, 농도 및 상기 시스템의 이온 농도를 임계적으로 조절함으로써 결정된다.

다양한 응집 보조제가 본 발명의 생물학적 액체 중 프리온 잔류물(prions resident)의 응집에 사용될 수 있다. 사용가능한 다양한 종류의 응집 보조제가 있는데, 이들 모두 프리온의 특성(예를 들면, 크기)을 응집없이 변화시키는 원리 또는 상기 프리온을 함유하는 환경에 악영향을 주는 원리에 따라 작용한다.

몇몇 응집 보조제는 비정상 프리온 및 정상 프리온 모두를 응집시키는 것으로 이해될 수 있다. 이와 같은 종류의 응집 보조제는 아세톤 및 알콜과 같은 저유전 상수를 갖는 유기 용매를 포함하는데, 이들은 단백질을 침전시킨다고 공지되어 있고 혈장의 분획에 사용되어 온 것이다. 보다 상세하기로는, 본 발명의 방법에 사용된 유기 용매는 완전히 수혼화성(water-miscible)인 각종 알콜류 및 단백질과 반응하지 않는 알콜류를 포함하는데, 상기 알콜류는 예를 들면, 에탄올, 메탄올, 이소프로필, 이소프로판올, n-프로판올, 이소프로필 에테르, 케톤류, 알데히드류 등 및 아세톤을 포함하고, 바람직하게는 메탄올이다. 처리하고자 하는 생물학적 물질과 혼화성이 있는 한도에서 사용될 수 있는 상기 종류의 응집 보조제와 유사한 다른 응집 보조제는 암모늄 설페이트, 카프릴산 및 트리클로로아세트산(TCA), 디알데히드류, 헤테로폴리산류 및 락테이트 모노히드레이트 C₁₈H₂₁N₃O₄ H₂O를 포함한다.

또한, 몇몇 응집 보조제는 비정상 프리온을 응집시켜, 그 결과 이를 분리할 수 있고, 천연 상태에는 정상 프리온을 잔류시킬 수 있거나, 그 반대가 가능할 것으로 이해될 수 있다. 이와 같은 종류의 응집 보조제는 착제(complexing agents)이다. 상기 착제는 프리온 단백질과 결합하고, 헤테로폴리몰리브데이트류, 헤테로폴리텅스테이트류, 소듐 포스포텅스테이트(NaPTA)(이들 모두는 비정상 프리온만을 응집시킴) 및 항체(모노클로날 또는 폴리클로날) 및 펩티드류와 같은 생물학적 제제를 포함하는데, 상기 항체는 이들의 특이성, 효소(예를 들면, 플라스미노겐(이는 정상 프리온만을 응집시킴)) 및 펩티드류에 따른 기능을 가지며, 상기 펩티드류는 이들의 조성에 따라 선택적 기능을 갖는다. 착제인 다른 응집 보조제는 금속 이온 Cu²⁺를 포함하는데, 이는 정상 프리온을 응집시킨다. 이와 유사한 다른 금속 이온은 Ni, Zn 및 Ag를 포함할 수 있다. 상기 시약은 기질과 결합 시 프리온 포획 메카니즘으로서 사용될 수 있다. 한 구현예에서, 상기 착제는 순차적으로 사용될 수 있는데, 예를 들면 Cu₂₊이온이 생물학적 용액과 혼합된 다음 여과에 의하여 정상 프리온을 분리하고, 이로부터 얻은 생물학적 용액을 NaPTA로 여과하여 포획될 수 있도록 비정상 프리온을 착화시킨 후, 용리 및 농축시킨 다음 공지된 검사법을 이용하여 검출하는 것을 고려할 수 있다.

응집 보조제 메탄올은 다른 유기 용매에 비하여 상대적으로 낮은 독성 및 높은 취급 안정성(예를 들면, 폭발 위험성)을 가지는 바, 면역글로불린 용액으로부터 프리온을 분리하는데 바람직하다. 상기 용매를 사용하는 경우, 상기 용매는 통상적으로 생물학적 액체의 약 2 부피% 내지 약 100 부피%의 농도로 생물학적 액체와 혼합된 상태로 존재한다. 상기 용매 농도 범위의 하한은 프리온을 응집시키기 위하여 필요한 최소 농도에 의하여 결정되고, 상기 용매 농도 범위의 상한은 생물학적 액체와 필터 매질의 통합성에 의하여 결정된다.

상기 제안된 바와 같은 응집 보조제를 이용하는 방법은 프리온(이들을 이용하는데 사용된 응집 보조제 및 방법에 따라 PrP^SC 및 PrP^C 중 어느 하나 또는 모두임)단백질의 응집을 초래하며, 응집체와 같이 본 발명의 방법을 이용하는 것은 여과를 이용하여 제거될 수 있음을 발명자들은 발견하였다. 그리고 나서, 필터 및 필터 세척물(filter wash)로부터 여과 및 후속 용리 방법을 사용하고, 필요한 경우, 상기 용리액을 농축하면서, PrP^SC를 정확한 양이 되도록 충분한 농도로 얻을 수 있다. 본 발명의 방법을 사용하면서, 상기 처리로 PrP^SC를 면역글로불린 조제물로부터 이의 검출 한계까지 분리하기에 충분함으로 발견하였다. 상기 프리온을 검출에 사용된 평가법의 감도는 약 10³ 정도 증가하여, 부피 감소가 가능해 지며, 이로써 샘플의 프리온 농도가 증가될 수 있다.

본 발명의 PrP^SC 응집 태양에 있어서, 사용가능한 응집 보조제는 비정상 감염성 프리온 단백질 섬유를 침전시키지만, 처리될 생물학적 물질과는 혼화성이 있고, 사용할 필터와도 혼화성이 있는 것으로 밝혀진 임의의 보조제일 수 있다.

본 발명의 여과 태양은 처리될 생물학적 물질에 적합한 임의의 온도에서 수행될 수 있는데, 실은 여과 조건은 프리온 물질을 포획하는데 필요한 조건이 아니라 여과될 생물학적 생성물, 식품(food product) 또는 화장품에 의하여 조절된다. 분획 및 여과시 단백질의 손상을 억제하기 위하여, 사용된 분획 및 여과는 바람직하게는 저온에서 수행될 수 있다. 단백질 용해도는 온도에 의존하기 때문에, 분획의 각 단계별로 선택된 온도는 손상을 방지하기 위하여 필요한 분리 및/또는 여과에 대하여 허용가능한 가장 낮은 온도이어야 한다. pH 조건은 정제될 생물학적 생성물의 특성(liability)에 따라 결정되어야 한다.

본 발명의 실시에 사용될 수 있는 심층 필터는 충전되거나 비충전되는 심층 필터이다. 사용가능한 심층 필터의 예는 Celite(World Minerals, Lompoc, CA), Millipore filters 75DE 및 SA(Millipore Corporation, Bedford, MA), 및 Cuno 35P 및 Cuno Zeta Plus 90SP(Cuno Corporation, Meriden, CT)를 포함한다.

본 발명에 사용하기에 가장 바람직한 것은 소규모 여과 작업을 위한 적당한 스테인레스강 필터 하우징과 함께, 47mm 큐노 제타 플러스(Cuno Zeta Plus) 90SP 심층 필터, 및 제조 방법에 사용된 16 ft² 카트리지이다. 바람직하게는, 본 발명의 실시에 사용하기 위한 필터는 심층 필터이나, 상기 필터를 통한 여과가 상기 필터를 막지 않는 한, 비심층 필터가 응집된 PrP^sc 의 제거에 이용될 수 있다. 상기 대안적인 필터는 예를 들면, 충전되거나 비충전된 막 필터이다. 상기 필터에는 예를 들면, 일회용 주사기 필터 Swinex 또는 Millex 25mm PVDF 주사기 구동된 필터 단위체, 0.22 마이크론 Opticap 및 Optiseal 카트리지(Millipore 사, Bedford MA)가 포함된다.

본 발명의 PrP^sc (및 원하는 경우에는, PrP^c) 응집체의 제거 및 포획의 실시에 사용되는 필터의 공극 크기는 비교적 중요하지 않으나, 공극 크기는 여과된 생물학적 산물의 회수에 영향을 줄 수 있다. 필터 마트릭스의 공극 크기는 바람직하게는 0.2 내지 6 마이크론, 특히 0.6 내지 1.5 마이크론의 범위이다. 공극 크기는 그 위에 보유된 입자의 입자 크기의 면에서 정의된다. 전형적으로 정의된 크기의 입자, 예를 들면, 덱스트란 또는 미생물이 보정 목적으로 사용된다.

본 발명의 실질적으로 순수한, 비정상적인 감염성 프리온이 없는 면역글로불린 산물의 제조에 사용되는 여과 단위체의 공극 크기는 약 6㎛ 미만, 바람직하게는 약 0.6㎛ 미만이다. 그러나, 단백질성 용액으로부터 비정상적인 감염성 프리온을 줄이거나 또는 제거하기에 충분한 컷오프 등급을 갖는 임의의 필터가 본 발명의 가공 방법에 사용될 수 있다. 예를 들면, 심층 필터에 대해, 큐노 제타 플러스 90S 필터 패드(Cuno 사, Meriden, CT)가 사용될 수 있으며, 상기 단위체는 분자량 공극 크기 등급이 0.1 내지 5 마이크론이다.

유사하게, 필터 조성은 응집된 PrP^sc 를 포획하는 필터의 성능에 영향을 주어서는 안되나, 상기 필터로부터 프리온 물질의 회수는 용출 버퍼, 예를 들면, 고염 용액 또는 계면활성제를 요구할 수 있다.

상기 필터 물질은 고상 다공성 미립자 물질, 예를 들면, 키젤구어(Kieselguhr), 페라이트 또는 규조토와 함께, 일반적으로 셀룰로오스의 자가 결합 마트릭스를 포함하는 심층 필터를 포함할 수 있다.

상기 심층 필터는 일반적으로 두께가 1-10mm, 특히 2-5mm 의 범위이다. 심층 필터에 사용되는 물질은 관련된 바람직한 단백질에 거의 또는 전혀 영향을 주어서는 안된다. 허용가능한 심층 필터에는 공극 크기가 0.6 내지 1.5㎛인 Seitz KS80 필터, Seitz K200P, 효과적인 여과 영역이 27cm³ 인 Cuno Delipid Del 1 미니 카트리지, Millipore 필터, 특히 Millipore CP20 가 포함되며, 또한 통상적인 한외필터, 예를 들면, Millipore PTHK 폴리에테르술폰 막, AMICON ym-100 재생된 셀룰로오스 한외여과막, (Millipore 사, Bedford MA), PALL Filtron Omega VR, Pall Ultrapore VFDV50 (Pall 사, East Hills, NY)뿐만 아니라, 기타 카트리지 필터, 예를 들면, Asahi Planova 재생된 셀룰로오스 카트리지 필터(Asahi, Tokyo Japan)가 포함된다. 사용될 수 있는 기타 필터는 충전된 심층 필터, 예를 들면, [E.Begerow GmbH & Co., Langenlonshein, Germany]의 것이다. 그러나, 본원에 가장 바람직한 구현예는 큐노 제타 플러스 90S 필터 패드, 47mm 필터를 사용한다.

필터를 통한 생물학적 물질의 유속은 생물학적 물질의 적당한 여과를 보증하나, 필터의 완전성을 손상시키지 않기에 적합한 유속이며, 큰 구형 단백질을 포함하는 생물학적 물질의 경우에는, 제제가 의도하는 목적에 허용되지 않도록 단백질의 구조를 손상시키지 않는 속도이다. 예를 들면, 면역글로불린 산물의 심층 여과에서, 여과 속도는 약 0.01 내지 약 20ml/분, 더욱 바람직하게는 약 10ml/분, 더욱 바람직하게는 약 1ml/분이다.

상기 방법은 4-10, 바람직하게는 5-9, 더욱 바람직하게는 6-8의 pH 범위에서 수행될 수 있다. 그러나, pH 범위는 처리되는 생물학적 물질 및 사용되는 필터의 완전성을 보존하기 위해 요구되는 pH 에 의해 결정될 것이나, 응집 또는 여과 방법 자체에 대한 임의의 제한에 의해 영향을 받지는 않을 것이다.

열을 가하는 것은 불필요하며, 상기 방법은 생물학적 물질 및 여과 매체의 완전성을 유지하는데 적합한, 실질적으로 실온 이하, 특히 -5 내지 +20℃의 온도에서 수행될 수 있다.

전술한 바와 같이, 본 발명의 하나의 양태는 응집 보조제, 예를 들면, 그 안에 포함된 프리온을 응집시키기에 충분한 용매를 이용한 생물학적 액체의 처리인데, 상기 프리온은 여과에 의해 포획될 수 있으며, 예를 들면, 웨스턴 블롯과 같은 공지된 방법을 이용하여 검출하기에 충분한 농도로 용출될 수 있다. 일부 생물학적 액체는 이들의 제조의 함수로서 처리될 수 있는데, 예를 들면, Cohn 방법에서 알코올로 처리된 면역글로불린이다. 생물학적 액체가 이미 상기와 같이 처리되지 않은 경우에, 전술한 적당한 응집 보조제를 이용하여 처리되어 그 안에 포함된 프리온을 응집시킬 수 있다. 상기 생물학적 액체는 상기에 열거되며, 혈액 및 이의 성분, 소변 및 뇌척수액 뿐만 아니라 면역글로불린을 포함할 수 있다.

상기 응집 보조제를 이용한 생물학적 물질의 처리에 이어, 필터 패드는 이의 하우징으로부터 제거되고, 프리온이 그로부터 용출되며, 원한다면 원심분리와 같은 방법을 이용하여 농축되며, 유용한 분석법을 이용하여 정량화되며, 모두는 본 발명의 나머지 양태에 따르며, 모두는 본원에 기재된다.

프로테아제 저항성 프리온 단백질 이성질체가 프리온 질환에 걸린 동물 및 인간의 소변에 존재한다. Shaked 등 (2001, J. Biol. Chem. 276(34): 31479-31482)은 소변으로부터 프리온을 분리하는 단계를 논의한다. Shaked 등에 기재된 방법은 3000rpm 에서 5분 동안 침전된 후, 셀룰로오스 막 튜브에서 밤새 투석되는 2-15ml 의 소변 시료를 요한다. 이어서, 소변 시료를 4℃에서 1시간 동안 고속(100,000 xg)에서 원심분리하였다.

Shaked 등의 절차는 시간이 소요되고, 용이하게 농축될 수 있는 시료의 양에 의해 제한된다. 본원에 수 분내에 수행될 수 있고, 부피에 의해 제한되지 않는, 소변과 같은 생물학적 액체로부터 프리온을 정확하게 정량화하는 절차가 개시된다. 본 발명의 방법을 이용하여 소변으로부터 프리온 여과 및 용출 동안, 1 리터 이하의 소변 부피가 47mm 큐노 필터를 이용하여 여과될 수 있다. 상기 부피 차이는 당업계의 현재 상태와 비교하여 본 절차의 농축능의 양 증가를 허용한다. 본원의 실시예 9를 참고한다.

전혈(whole blood)을 본 발명의 생물학적 액체로서 이용할 경우에, 이의 양, 예를 들면, 1 리터를 먼저 세포 성분을 분리하는데 적합한 조건하에 원심분리할 수 있다. 생성된 혈장을 응집 보조제, 예를 들면, 적당량의 메탄올(예를 들면, 약 1부의 메탄올에 대해 약 5부의 혈장의 비율)과 혼합하여 프리온 물질을 응집시킨다. 혼합물을 존재하는 프리온을 응집시키기에 충분한 시간, 예를 들면, 약 1분의 시간 동안 회전 교반기에서 부드럽게 혼합한다. 이어서, 상기 혼합물을 예를 들면, 47mm 큐노 제타 플러스 90S 필터를 통해 통과시킨다. 이어서, 물질을 본원에 기재된 용출 버퍼를 이용하여 필터로부터 용출시키고, 프리온을 임의의 적당한 분석법, 예를 들면, 웨스턴 블롯 분석법에 의해 정량화한다. 원한다면, 검출 한계는 추가로 PrP^sc 침강 단계를 포함함으로써 개선될 수 있다. 시료를 희석하고, 프로테이나제-K(PK)에 이어, AEBSF(4-(2-아미노에틸)벤젠술포닐 플루오라이드)로 처리하여 프로테이나제 활성을 저해한다. PK 처리에 이어, 시료를 4℃에서 1 시간 동안 20,000xg에서 원심분리한다. 이어서, SDS PAGE 를 위한 펠렛을 제조한다.

프리온 응집 보조제로 처리되는 생물학적 물질이 면역글로불린인 경우에, 상기 생물학적 물질은 혈장 분획 방법 동안 처리될 것이다. 본원의 도 1 및 실시예 1을 참고하여, 혈장 단위체를 모은 후, 지정된 조건하에 원심분리하고, 관련된 부분을 응집 보조제, 이 경우에 바람직하게는 메탄올을 이용한 추가의 가공을 위해 보유한다. 상층액 III 가 수득되는 분획화 지점에서, 상층액 III 분획을 막 또는 심층 필터를 통해 여과하는데, 상기 여과는 그 안에 포함될 수 있는 응집된 프리온을 제거한다. 이로 인해 포획된 응집된 프리온은 필터로부터 용출되고, 공지의 분석법을 이용하여 검출되고, 정량화될 수 있다.

본 발명의 포획 및 용출 절차는 분석법의 검출 한계를 100배 이상 증가시키는데, 이는 현재 감염성 분석법 검출한계에 접근한다. 당업계에 현재 유용한 방법을 이용하면, 감염성 분석법은 본 발명의 방법을 이용하여 결과를 생성하는데 수 시간과 비교하여 연구중인 종에 의존하여, 결과를 수득하는데 수 개월이 걸릴 수 있다.

용매에 의하든지 그렇지 않든 간에, 생물학적 액체에 존재하는 프리온의 응집에 이어, 다음 단계는 프리온 (예를 들면, PrP^sc) 용출 및 회수이다. 상기 단계에서, 필터 또는 필터 패드(들)은 제거되고, 용출 버퍼를 이용하여 세정된다. 한가지 방법은 상기 패드를 적절한 용기에, 예를 들어 페트리 접시, 비이커 또는 유사한 적절한 컨테이너와 같은 용기에 두고, 적절한 부피의, 예를 들어 약 15㎖ 내지 100㎖의, 용출 완충액을 거기에 첨가하여 상기 용기를 상온에서 약 25분간 회전 교반기에 두는 것이다. 이로써 상기 필터-부착된 PrP^SC 는 상기 용출 완충액을 부드럽게 씻어줌으로써 필터로부터 용출된다. 적절한 용출 완충액은 예를들어 1.0 - 2.0M NaCl 완충액, 1.0M 내지 약 2.0M 농도의 아세테이트 나트륨염-메탄올 완충용액과 같은 고장염(hypertonic salt)용액 등 어떠한 수용성 완충용액도 포함한다.

필요한 경우에는, 증가된 농도를 얻기 위해 상기 응축된 프리온을 원심 분리 또는 당해 기술 분야에서 알려진 어떠한 방법으로 더욱 농축될 수 있다.

혈액 생성물의 프리온 감염이 이론적으로 가능하다면, 심층 여과의 효과 및 면역 글로불린 생성물인 RhoGAM? Ultra-Filtered Rho(D) 면역 글로불린(인간) 으로부터의 중간체에서 프리온을 제거하는 메카니즘을 규명하는 것이 특히 중요하다. 상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자들은 스크래피에 감염된 햄스터로부터 얻은 스크래피 뇌 균질액(SBH)을 PrP^SC 의 소재로 사용하였다. 이러한 연구를 수행하기 위하여, "스파이크"는 우선 그것을 용해시키기 위하여 계면활성제로 처리되었고 초음파로 처리하여 원섬유를 분쇄하였다. 상기 스파이크는 상기 PrP^SC 를 가능한 한 작게 만들어 필터 시스템에 테스트해 볼 수 있도록 처리되었다. 초음파 처리된 SBH는 그런 다음 스파이킹 전에 PrP^SC 스파이크의 크기를 더욱 잘 정의하도록 하기 위해 순차적으로 0.45, 0.22 및 0.1 미크론 막으로 여과된다. 종래 연구(Van Holten R, et al., Transfusion(투고됨))는 이러한 처리가 상기 PrP^SC 에 부작용을 끼치지는 않으며 상기 심층 여과가 제거하는 입자들의 크기가 감염과 관련된 개개의 원섬유의 크기에 근접함을 추가적으로 보장하는 것을 증명하였다. 심층 여과 후에 PrP^SC 의 감소는 기계적인 여과에 의한 것이라기 보다는 원섬유가 양으로 대전된 필터 매질에 흡착되었기 때문이라는 것을 지적할 수 있다. 포스파이트 완충액/메탄올 혼합물에 희석된 IgG에 상기 스파이크를 첨가한 결과 상기 재료의 응집으로 탁한 모습을 보여준다.

Cuno Zeta Plus SP 대전된 심층 필터는 SBH로 스파이크된 RhoGAM? Rho(D) 면역 감마 그로불린(인간)을 여과하는데 사용되었다. Zeta Plus Sp 필터을 통해 여과하면서 상기 탁함은 제거되었다. 여과 후에 필터상에서 흰색 침전물 층이 관찰되었다. PrP^RES 를 탐지하기 위한 웨스턴 블랏 분석에서 상기 필터 재료는 면양떨림병이 없은 것이었다. 2.0M 소금 용액으로 처리하여 상기 프리온 재료를 필터에서 분리하였다. 상기 웨스턴 블랏의 결과는 하기의 표 1 에 도시되어 있다.

또한 두번의 조절된 실험이 수행되었다. 제 1 실험에서, PrP^SC 스파이크된 면역 글로불린 중간체는 먼저 상기 PrP^SC 가 기계적인 여과를 통해 심층 필터에서 제거될 수 있는 더욱 큰 입자들로 뭉쳐지지 않는 것을 보장하도록 0.22㎛ 필터로 여과되었다. 제 2 실험에서, 상기 초음파 처리되고 여과된 SBH는 면역 글로불린 중간체 대신에 트리스 버퍼 식염수(TBS)로 스파이크된 후 심층 여과로 처리되었다.

상기 심층 필터는 면역 글로불린을 여과액으로부터 PrP^SC 를 4 log 이상으로 제거하였다. 상기 PrP^SC의 상당 부분은 높은 몰농도의 염화 나트륨으로 용출 시킴으로써 면역 글로불린 여과로부터 얻어질 수 있다. 상기 스파이크된 상등액 III의 0.22㎛ 필터 사전 여과는 심층 여과전에 모든 탐지할 만한 PrP^SC를 제거하였다. PrP^SC의 1 log 미만이 심층 여과에 의한 완충 조절에 의해 제거되었다. 실시예 6 및 7 을 참조하라.

따라서, 심층 필터가 PrP^SC를 면역 글로불린으로부터 필터 매트릭스에의 흡착에 의해서보다 기계적인 여과에 의해서 제거함이 밝혀졌다. 상기 면역 글로불린의 준비는 PrP^SC가 크기가 0.22㎛ 보다 크고 0.1㎛ 보다 작은 입자들로 뭉치도록 하였다. 심층 필터는 상기 완충 조절 샘플로부터 PrP^SC를 제거하는데 실패했다.

실시예 3 에서, 초음파 처리된 SBH의 막 여과는 상기 심층 필터가 크기가 0.1미크론 보다 크지 않은 입자를 관찰하는 것을 보장하기 위해 SBH 스파이크된 상등액 III("SupIII")의 심층 여과 전에 수행되었다. 이것은 심층 필터에 대한 가장 큰 테스트를 제공할 것이며 PrP^SC 제거 메카니즘을 특정지우는 것을 가능하게 할 것이다. 상기 SBH는 먼저 PrP^SC 집합체를 분쇄하고 막 여과를 용이하게 만들기 위해 초음파 처리된다. 초음파 처리에도 불구하고, 점차 더 작은 필터(0.45 및 0.22 미크론)를 통해 순차적으로 여과하여 0.1 미크론 필터의 막힘을 최소화하는 것이 필요하다.

Cuno Zeta Plus 90SP 심층 필터는 입자 제거를 위해 두가지 메카니즘을 사용한다. 약 0.1 미크론의 명목적인 구멍 크기보다 큰 입자들은 기계적인 여과에 의해 대부분 걸러진다. 0.1 미크론 미만의 경우에는 음으로 대전된 입자들은 양으로 대전된 필터 매질에 동전기적 흡착에 의해 걸러진다(미국 특허 제 4,859,340). 0.1 미크론 보다 더 큰 입자들은 상등액 III 로의 첨가 및 이후의 심층 여과 전에 SBH로부터 제거되었기 때문에 심층 필터에 의한 PrP^SC 의 정체는 메탄올에의 노출에 의한 입자 크기의 증가에 기인한 것이다. 그렇지만, 제거의 전하 포획 메카니즘은 프리온이 포획되는 등전점에서 하나가 이탈할 때 유효할 것이다.

SBH를 스파이크된 SupIII의 여과 후 및 1.0M 및 2.0M NaCl 용액으로 용출하기 전에 심층 필터를 검사한 결과 상기 심층 필터의 표면에 작은 양의 물질이 발견되었다. 이것은 SBH가 SupIII에 첨가되었을 때 SupII에 존재하는 메탄올에 의해 형성된 침전물로 여겨진다. 이 침전물이 PrP^SC 를 포함하는지 여부를 결정하기 위해 제 2 실험이 수행되었다. 여기서 SBH가 스파이크된 SupIII는 심층 여과 전에 0.22미크론 필터로 가장 먼저 사전-여과되었다. 상기 사전-여과는 PrP^SC 를 탐지 불가능한 수준까지 제거함으로써, 이전 실험에서 PrP^SC 가 심층 필터에의 정전 흡착에 의해서보다는 침전 및 기계적 여과에 의해 제거됨을 보여준다. Prusiner등이(Biochemistry 1980; 19: 483-91)에탄올이 PrP^SC 를 쉽게 침전시키는 것을 증명하였기 때문에 본 분류 과정에 사용된 메탄올이 동일한 효과를 가지는 것은 놀라운 것이 아니다.

심층 여과가 알코올의 침전 없이 PrP^sc를 제거할 것인지 여부를 결정하기 위하여, 버퍼 수용액에 PrP^sc를 스파이크(spike)하여 심층 여과하는 대조군 전개가 수행되었다(실시예 4 참조). 버퍼 대조군으로부터 PrP^sc의 제거가 없음은 심층 필터가 기계적인 수단을 통해서도(왜냐하면 상기 PrP^sc는 전에 0.1 마이크론 필터도 통과하였었다.), 정전기적 부착력을 통해서도 단백질을 유지하지 않았음을 가리켰다.

이러한 연구들은 PrP^sc를 제거하기 위한 심층 여과의 유효성에 관한 이전의 보고들이 오도하는 것일 수 있음을 가리킨다. 심층 여과는 정말로 심층 여과에 흔히 수반되는 흡수 메카니즘에 의하지 않고, 침전된 단백질의 기계적인 여과에 의해 PrP^sc를 제거한다. 이 연구의 결과들은 심층 여과 단독으로는 PrP^sc를 여과하는 데 효과적이지 않음을 가리킨다. 그러나, 먼저 침전 단계와 함께 사용되면, 심층 여과 또는 막 여과는 비정상적인 프리온 단백질을 혈장 분획으로부터 제거하는 효과적인 메카니즘이 될 수 있다.

프리온을 감지할 수 있는 허용되는 어떤 분석도 본 발명의 정량 측면에 사용될 수 있다. 이러한 분석으로는 엘리사(ELISA), SDS-페이지(SDS-Page), 웨스턴 블럿(Western Blot), EG & G 월럭(Wallac), 델피아(DELFIA), 프리오닉스 분석(Prionics assay), 엔퍼(Enfer) ELC 엘리사(ELISA), CEA 엘리사(ELISA), 컨포메이션-의존성 분석, 델피아(DELFIA), 및 모세관 전기영동 등 몇 개를 들 수 있는데, 이들은 모두 당업계의 지식을 가진 자에게 익숙한 것들이다.

본 발명의 발명자들은 여과된 프리온을 검출하기 위해 웨스턴 블럿을 사용하였고, 생물학적 액체 샘플을 용출하였다. 웨스턴 블러팅은 PrP^sc를 식별하고 특성화하는 데 쓰이는 방법이다. 상기 PrP^sc는 추출에 의해 분리되고 프로티나제 K 소화에 부분적으로 저항하는 PrP^sc에 의해 분화된다. 상기 PrP^RES는(프로티나제 소화에 저항하는 PrP^sc) 글리코실레이션 형태 및 단편의 이동 위치에 의해 식별된다. 이 분석의 민감도는 감염성 분석보다 3 로그단위 정도 덜 민감하다. 이러한 민감도 논쟁은 상기에서 준비한 물질을 원심분리하고, 더 작은 부피에서 상청액(supernatant)을 제거하고 프리온 물질을 재부유하여, 프리온 물질의 농도를 얻는 것에 의해 부분적으로 극복된다. 그러나, 큰 부피의, 예를 들면, 체액과 같은 생물학적 액체를 스핀다운는 대신, 본 발명자들은 프리온을 포함하는 생물학적 액체에 응집 보조제를 처리하고, 필터를 통해 여과함으로써 농도를 높이고, 용출에 의해 작은 부피에 수집함으로써 프리온을 잡아낼 수 있음을 보였다. 이 기술은 생성물 흐름으로부터 프리온을 대규모로 분리하는 데 사용될 수 있다.

이 절차는 생물학적 마트릭스에 PrP^sc가 존재하는지 여부를 결정하는 웨스턴 블럿의 사용에 큰 영향을 미칠 것이다. 이 발명은 TSE 물질이 신속히 정량적으로 농축되어 잘 검출될 수 있도록 한다. PrP^sc의 생물학적 또는 식품 용액을 정화하고자 할 때, 본 발명은 생물학적 또는 식품 용액 및 물질을 명목 기공이 큰 필터를 통해 여과하는 편리한 장점이 있다.

프리온의 특정한 포획을 확인하기 위한 표준 웨스턴 블럿 분석은, 모든 정상적인 프리온(PrPc)은 소화하지만 비정상적인 프리온(PrP^sc 또는PrP^RES)은 두드러지게 소화하지 않는 프로티나제 K로 처음 처리된 포획 물질에 의존한다. 상기 소화는 Lee 등[J Virol Methods 2000, 84:77-89]의 상기 방법에 따라서 SDS 겔 상에서 일어나고, 니트로셀룰로오스 또는 PVDF(폴리비닐리덴 플로라이드) 멤브레인의 시트로 빨려들게 된다. 이어서 분리된 PrP^res 밴드는 3F4 또는 6H4를 사용하여 가시화된다. PBS Tween 20 - 5% 탈지유 버퍼 중에 총부피 10ml로 3F4(stock 1mg/ml)에 대하여 1:2000 또는 6H4(stock 2.5mg/ml)에 대하여 1:5000으로 희석하였다. 염소 항-생쥐 IgG-HRP 콘쥬게이트를 이용하여 항체를 검출하였다(동일한 버퍼 중에서 1:5000). 화학발광을 하는 HRP 기질을 사용하여 밴드들을 검출하고, X레이 필름에 노출된 이후에 가시화된다. Lee 등을 참조.

16A18과 같은 특정 PrP^sc 모노클로널 항체들은 자기 비드(활성화된 Dynal Tosyl, Dynal Biotech, Oslo, Norway) 상에서 특수하게 결합될 수 있고, 그러한 항체들은 서구의 Blot법보다는 PrP^sc의 존재를 찾는데 사용될 수 있다. 이러한 패밀리에서 대부분의 항체들은 PrP^sc를 포획할 수 있으나, 검출은 상기와 같은 웨스턴 Blot 포맷으로 3F4 또는 6H4에 의존한다.

PrP^sc를 검출하는 다른 방법들은 ELISA 및 SDS-Page를 포함하고, 본 명세서에서 개시한 바와 같은 일반적으로 받아들여지는 검출법을 포함한다.

이러한 경우에 PrP^sc 물질은 예를 들어 살균필터와 같은 필터상에 포획되고, 상기 필터는 프리온-특정 항체와 같은 프리온을 함께 결합하고, 웨스턴 Blot 법은 PrP^sc 를 검출하는 데 사용될 필요가 없다. 오히려 모토클로널과 같은 프리온-특정 항체는 프리온을 검출하고 정량화하는 데 사용될 수 있다. 그러한 항체는 포괄적인 프리온 항체들 6H4 또는 3F4을 포함하고, 이는 정상(PrP^c ) 및 이상 (PrP^c )또는 (PrP^res) 프리온 모두에 인지된다. 만일 멤브레인이 프리온의 모든 형태를 결합하게 된다면 PrP^sc의 관계량은 매우 낮을 것이다(예를 들어 프리온이 약 1% 미만으로 존재). 예를 들어, 16A18 또는 12A5와 같은 이상 프리온용 특정 모노클로널은 프리온의 임의의 형태(정상 및 이상)를 결합하는 경우에 PrP^sc를 검출하는 데 사용될 수 있다. 이러한 모노클로널을 사용하는 것은 신호가 증폭된다면, 필요하다면 화학발광 기질 또는 폴리 HRP 콘쥬게이트를 사용하여, PrP^sc를 검출하는 것이 가능하여야 한다.

본 명세서에 기술되어 있는 창의적인 방법은 100배 이상의 시험의 검출 한계에서의 증가에 기인하였고, 전염성 시험 검출 제한에 근접하게 되었다. 당업계에서 활용가능한 통상의 방법을 사용하여, 상기 전염성 시험은 연구하에 상기 종들에 의존하여 수개월을 경과하여 결과를 얻었다. 또한 이들 발명자들은, 상기 시험군들이 추출하지 않고 멤브레인 표면상에서 이상 프리온의 존재를 검출하는 것에 의하여 간단하게 될 수 있다는 것을 보여주었다.

면역글로불린과 함께 PrP^sc 집합화 및 제거의 창의적인 방법의 용도에 있어서, 특히, 안티-D 면역글로불린, 구체적으로 RhoGAM Rho(D) 면역 글로불린(인간), 및 도 1의 플로챠트 및 Cohn 등[J. Am. Chem. Soc., Vol. 68, pages 459-475]와 관련하여, 분별법(fraction)은 전체의 휴면 혈장에서 기인한다. 상기 혈장는 약 1℃로 냉각하고 이어서 상청액(supernatant)으로부터 원심분리하여 찬 불용성 침전체를 분리하였다.

상청액을 추가로 분별하여 침전체 I 및 상청액 I을 얻었다. 주로 피브리노겐을 구성하는 침전체 I을 버렸다. 상청액 I을 추가적으로 분별하여 침전체 II + III 및 상청액 II + III을 얻었다. 상청액 II + III을 버리고 알파, 베타 글로불린, 지질을 함유한다. 침전체 II + III은 주로 베타 및 감마 글로불린 및 동종 혈구 응집반응(isoagglutinins)을 구성하나, 또한 프로트롬빈, 플라즈미노겐, 콜레스테롤 및 기타 지질을 함유한다. 추가적으로 더 분별을 하게 되면 침전체 II + III은 상청액 II + III W 및 침전체 II + III W를 얻는다. 베타 글루불린, 콜레스테롤 및 기타 지질은 버려지는 상청액 II + III W 중에서 크게 제거될 수 있다. 침전체 II + III W은 주로 감마 글로불린, 동종 혈구 응집반응(isoagglutinins), 및 프로트롬빈, 일부 베타 글로불린, 콜레스테롤 및 기타 지질을 함유한다. 추가적으로 분별하면, 침전체 II + III W은 상청액 II + III W를 얻는다. 침전체 III를 버리고, 동종 혈구 응집반응, 플라즈미노겐 및 프로트롬빈을 함유한다. 상청액 III은 주로 감마 글로불린으로 피브리노겐 및 지질 소량으로 이루어진다. 분별의 최종단계에서 본질적으로 순수 감마 G 글로불린인 침전체 II를 얻는다. 본 발명의 방법에 의해 제조된 침전체 II은 안티-Rh 감마 글로불린이다.

본 발명의 바람직한 방법에 있어서, 재현탁용 면역글로불린 출발물질은 개질된 Cohn 방법으로부터의 침전체 II 페이스트이다. 만일 프로테인이 미국 특허 제6,096,872호에서 예기된 바와 같은 부형제의 존재하에 냉동건조된다면 냉동 건조된 침전체 II 페이스트가 사용될 수 있다. 이러한 경우에 프리온 포획에 대한 본 발명의 여과 공정은 이미 침전체 II의 분별에서 바람직하게 수행될 수 있고; 상기 내용과 도 1과 관련하여 프리온을 포획하게 하는 면역글로불린의 여과는 도시하는 바와 같이 침전체 II가 수득되기 전, 상청액 III을 얻은 후, 가장 바람직하게는 상청액 III 및 여과된 상청액 III의 사이에 수행된다. 약 4 내지 약 1의 비율로 MeOH 집합화 보조 메탄올을 사용한 물질의 처리는 상청액 III은 상청액 III 중에서 프리온을 집합화하고, 집합화된 부분은 본 발명의 추가적인 방법을 사용하여 제거될 수 있다. 또한 본 발명의 프리온 포획을 하게 하는 여과단계는 완결된 면역글로불린 결과물 상에서 행해질 수 도 있다. 그러나, 그 단계에서의 처리 및 여과가 생물활성을 방해하지 않거나 또는 다른 것이 최종 결과물을 포함하는 한, 집합화 보조를 수반하는 처리 및 여과는 결과물이 프로세싱되는 마지막 단계와 같이 행해질 수도 있다.

본 발명의 조제의 투여 방식은 상기 화합물이 전달되는 조직에서의 위치 및/또는 셀을 결정할 수 있다. 본 발명의 방법에 의하여 정제된 상기 화합물은 단독으로 투여될 수 있으나, 일반적으로 투여의 의도된 경로 및 표준 약제학적 실제와 관련하여 선택된 약학적 담체 또는 희석제와 함께 혼화재로 투여될 것이다. 상기 조제는 예를 들어 내부-동맥혈적 또는 정맥혈과 같은 비경구적으로 주입될 수 있다. 또한 조제는 경구, 피하의 또는 근육상의 경로를 통하여 전달될 수 있다. 비경구적인 투여의 경우에는 예를 들어, 무균의 형태와 같이 사용될 수 있고, 예를 들어 염 또는 글루코스가 등장성 용액을 만들게 하는 기타 용질을 포함할 수 있는 수용액의 형태로도 사용될 수 있다.

경구를 통한 투여의 경우에는, 본 발명의 정제 조성물은 정제, 갭술, 로젠지, 분말, 시럽, 일렉서, 수용액 및 현탁액 등의 형태로 사용될 수 있다. 정제의 경우에, 사용될 수 있는 담체는 락토오스, 시트르산 나트륨, 및 포스폰산염을 포함한다. 전분과 같은 정제분해 물질 및 마그네슘 스테아르산과 같은 윤활제는 통상적으로 정제로 사용될 수 있다. 갭슐의 형태로 투여하는 경우에는 유용한 희석제는 락토스 및 분자량이 큰 폴리에틸렌 글리콜이다. 경구용으로 수용액이 필요한 경우에는 특정 감미료 및/또는 조미료 제제가 부가될 수 있다.

본 발명의 실질적으로 순수한 조제는 인간을 포함한 포유동물과 같은 대상에 투여될 수 있다. 통증의 치료용으로 사용되는 경우에는 처방 의사 또는 수의사는 인간 또는 동물 대상에 대한 적합한 복용량을 최종적으로 결정할 것이고, 이는 개별 증상의 성질 및 경중 뿐만 아니라 개별 중량, 연령, 및 부작용에 따라서 변경될 수 있다.

본 발명의 실질적으로 순수한 안티-D 면역글로불린의 경우에 있어서, 복용당 투여량은 RhoGAM? 용으로 약 300ug 및 MICRhoGAM? 약 50ug의 범위이고, 이들 각각은 가이드라인과 상기 및 각 결과물 문헌에서 기술된 목적에 따라서 투여된다.

상술한 각 생성물들은 또한, 치료하는 의사에 의해 결정되는 전체 전달량에 대하여 복수회-투여 될 수 있다.

본 발명의 프리온-프리 제제는 생물학적 약제, 일반 약제, 식료품, 및 사료를 포함할 수 있으며, 본 발명의 제조방법은 이들의 제조방법에서 사용될 수 있다.

본 출원에서는 다양한 특허 및 문서를 참조로 한다. 이들에 개시된 내용은 본 출원에 참조에 의해 전체적으로 통합되어 있으며, 이들은 본 명세서에서 기술되고 청구된 본 발명의 날자를 기준으로 당업자에게 알려져 있는 종래기술의 상태를 보다 상세히 설명한다.

하기 실시예를 들어 본 발명을 보다 상세히 설명하지만 이들이 본 발명의 범위를 한정하기 위한 것은 아니다.

실시예 1: 응집 촉진법을 사용하는 Rho(D) 면역 글로불린 침전물 II의 제조

본 실시예는 Rho(D) 면역 글로불린의 제조시 사용되는 침전물 II를 얻기 위하여 인간 혈장의 분획 공정을 기술한다.

혈장 유닛(항-D) (대략 943L의 총량)을 4일 동안 2℃ 내지 8℃에서 저장하여 해동하였다. 상기 유닛을 5 내지 10℃의 물이 순환하는 스테인레스 강 물-쟈켓 탱크에서 울혈시켰다. 울혈된 상기 혈장를 1 내지 3℃에서 삼십(30)분간 교반하였다. 이어서 상기 혈장를 1000mL/분의 속도로 공급되는 연속 흐름 원심분리기에서 원심분리하였다. 차가운 불용성 상등액(원심분리된 혈장)을 스테인레스강 쟈켓 탱크에서 수집하고 교반하여 균질화된 혼합물을 얻었다. 이 시점에서 상기 뱃치 부피는 905L의 상청액(정화된 혈장)이었다.

상청액 전체 뱃치의 pH를 5.0N NaOH 2.172L를 사용하여 pH 9.45로 조정하였다. 메탄올(71%) 160.185L를 pH 조절한 뱃치에 가한 후, 온도는 -5.3℃이었다. 상기 뱃치를 -5.2℃에서 13.5시간 동안 방치하였다. 최종 부피는 1067.357L이었다. 상기 뱃치를 -5.8℃에서 1000ml/분의 속도로 공급하는 연속 흐름 원심분리기에서 원심분리하였다. 상청액 I를 스테인레스 강 쟈켓 탱크에서 수집한 후 잘 혼합하였다. 침전물 I을 의료용 폐기물로서 폐기하였다. 상청액 I를 3.132L의 진한 아세트산 나트륨 버퍼용액 (pH 4.0) 및 71% 메탄올 627.444L를 첨가하여 pH를 조절하였다. 상기 뱃치 온도는 -5.5℃이었고, pH는 6.75였다. 상기 뱃치를 14시간 동안 방치하였다.

상기 뱃치를 -5.5℃에서 1000ml/분의 속도로 공급하는 연속 흐름 원심분리기에서 원심분리하였다. 침전물 II + III을 스테인레스 강 소재의 병으로 옮기고; 순 중량 40.220 Kg을 수집한 후; 이 순 중량의 침전물 II + III를 미국약전(U.S.P.)에 따라 주입하기 위하여 1.1℃의 물 2 부피(80.440L)에 재현탁시킨 후 45분간 교반하여 균질한 현탁액을 얻었다. 3 부피(120.660L)의 0.0187 디소듐 포스페이트를 가하고, 30분간 2.1℃에서 교반하였다.

스테인레스강 쟈켓 탱크에서, 미국약전에 따른 주입을 위하여 19 부피(764.180L)를 1.0℃로 냉각하였다. 고용량 전송 펌프를 사용하여, 상기 뱃치를 미국약전에 따른 주입용 물 19 부피와 결합하고 30분간 교반하였다.

71% 메탄올 1 부피를 상기 침전물 II + III의 15배 중량이 되도록 조절하였다. 이 메탄올(603.300L)을 -14℃로 냉각하고, 온도를 -5.5℃로 서서히 낮추면서 스테인레스강 분무 장치(Sparger device) 및 계량 펌프를 사용하여 상기 뱃치에 가하였다. 상기 메탄올 첨가를 종료한 후, 상기 뱃치를 1시간 동안 교반하였다. pH는 7.23이었다. 상기 뱃치를 10시간 20분 동안 방치하였다.

-5.8℃에서 500mL/분의 속도로 공급하는 연속 흐름 원심분리기에서 상기 뱃치의 원심분리를 통해 침전물 III를 형성하였다. 상기 침전물 II + III w를 상기 오목접시에서 스테인레스 소재의 병으로 옮긴 후; 상기 순 중량은 22.760kg이었다.

침전물 II + III w를 +1.3℃에서 미국약전에 따른 주입을 위하여 물 2 부피(L) (45.520L)에 재현탁하고, 45분간 교반하여 균질한 현탁액을 얻었다. 0.175M 아세트산 나트륨 2 부피를 가하고 30분간 1.4℃에서 교반하였다. 상기 뱃치에 미국 약전에 따른 주입용 물 22.760L에 용해한 아세트산 나트륨 버퍼(pH 4.0) 0.489L를 첨가하여 (전체 부피 137.049L) 전체 뱃치의 pH를 조절한 후, 1.5℃에서 1시간 동안 교반하였다. pH는 5.38이었다. 스테인레스강 쟈켓 탱크에서, 미국 약전에 따른 주입용 물 13.5 부피(307.260L)를 교반하면서 +2.5℃로 냉각하였다. 고용량 전송 펌프를 사용하여, 상기 뱃치를 주입용 물과 결합하였으며, 전체 계산된 부피는 444.309L이었다. NaCl (6.186L, 1.33M)을 22.760Kg의 침전물 II + III에 가한 후, 30분간 교반하였다.

71% 메탄올 1 부피를 상기 침전물 II + III w의 중량에 8.78배가 되도록 조절하였다. 상기 메탄올 (199.833L)을 -10.5℃로 냉각한 후, 스테인레스강 살포 장치 및 계량 펌프를 사용하여, 온도를 -6.6℃로 서서히 낮추면서 상기 뱃치에 메탄올을 가하였다. 메탄올의 첨가 종료 후, 상기 뱃치를 1시간 동안 교반하였다. pH는 5.38이었다. 상기 뱃치를 -6.3℃에서 8시간 30분간 방치하였다.

침전물 III은 다음과 같은 공정에 따라 제조하였다: 상기 뱃치를 -6.3℃에서 500mL/분의 공급속도로 공급하는 연속 흐름 원심분리기에서 원심분리하였다. 상기 상청액 III를 스테인레스 강 탱크에서 수집하였다. 상기 침전물 III를 혈액 폐기물로서 폐기하였다.

상기 상청액 III의 여과 공정을 다음과 같이 진행하였다:

(4) 16 평방피트 카트리지를 포함하는 CUNO 필터 90SP 하우징을 제조업자의 설명서대로 조립하였다. 아세트산 나트륨-메탄올 버퍼 (320L)을 -6.5℃로 냉각한 후, 55분에 걸쳐 상기 필터 카트리지를 통해 여과하였다. 공정을 진행하기 전에, 상기 아세트산 나트륨-메탄올 버퍼 세척액을 상기 필터로부터 불어서 완전히 제거하였다. 양호한 제조 방법에 따라서 얻어진 Cuno 필터 90SP를 사용하고 제조업자의 설명서대로 수행하여 상기 뱃치를 여과하였다. 상청액 III의 전체 부피를 여과한 경우, 상기 필터 하우징 내의 압력이 해제되었다. 여과된 상청액 III의 부피는 622L이었으며, 적절한 속도로 교반하였다. NaCl (1.33M, 23.387mL)을 상청액 III에 서서히 가한 후, 6.5℃에서 30분간 교반하였다. pH는 5.38이었으며, 1.0M 중탄산나트륨 4.840L를 사용하여 7.10으로 조절하였다. 상기 상청액 III의 부피의 0.166배에 해당하는 메탄올(100%)를 살포장치 및 계량 펌프를 사용하여 상기 상청액 III에 가한 후, 상기 뱃치를 격렬하게 교반하였다. pH는 7.3이었다.

침전물 II의 분획공정을 다음과 같이 수행하였다: 상기 뱃치를 -6.3℃에서 500mL/분의 속도로 공급하는 연속 흐름 원심분리기에서 원심분리한 후, 상청액을 제거하였다. 무수 질소를 사용하여 공급 라인을 불어 내고, 15분간 건조 회전시켰다. 상기 침전물 II (7.420g)을 상기 원심분리기 오목 접시로부터 포장 무게를 밴 스테인레스 강 소재의 병으로 옮긴 후, -22.1℃에서 방치하였다. 반 홀텐(Van Holten) 등에게 함께 양수된 미국 특허(미국특허 6,096,872호, 2000년 8월 1일 등록)에 기재된 방법에 따라서 바이러스 제거 공정에서 이 물질을 사용하였다.

실시예 2-실시예 1의 프리온의 용출 및 검출

전술한 실시예 1의 방법에 의해 얻어진 상등액 (Supernatant) Ⅲ을 여과하기 위해 사용된 쿠노 심층 필터 상에 수집된 프리온을 하기 실시예 3의 방법을 사용하여 추출, 정량 및 검출하였다.

특히, 실시예 1에서 사용된 쿠노 심층 필터 패드를 상기 필터 하우징에서 제거되어 45 ml의 1.0 M NaCl (용출 버퍼)을 포함하는 페트리 디쉬에 놓았다. 상기 페트리 디쉬를 로터리 쉐이커 상에 놓고 약 20-30 분 동안 완만하게 회전시켰다. 상기 필터를 제거하고 20-30 분 동안 45 ml의 2.0 M NaCl (용출 버퍼)로 다시 유사하게 세척하였다.

상기 용출물 상의 PrP^sc의 웨스턴 블롯 분석을 1.0M NaCl 용출 버퍼의 용출물 상에서 실행하고 제2 웨스턴 블롯을 2.0M NaCl 용출 버퍼의 용출물 상에서 별개로 실행하였는데, 이들 모두 실시예 3의 웨스턴 블롯 방법에 따랐다.

실시예 3-면역 글로불린 제조에서의 PrP ^sc 의 제거 및 정량 평가

안티-D를 포함하는 상등액 Ⅲ (SupⅢ) (190 mL)를 풀 스케일 (약. 450 리터) 변형된 콘-온클레이 분획화 (Cohn-Oncley fractionation) (Ortho-Clinical Diagnostics, Raritan NJ)에서 얻었다 (실시예 1 참조). 상기 SupⅢ을 약 -70℃에서 보관하고 스크래피 뇌 균질물 (scrapie brain hogenate) (SBH)를 첨가하기 바로 전에 약 25℃에서 녹이고, 이후 -5.5 내지 -7.5℃의 온도에서 평형화하였다.

뇌 균질물

스크래피 뇌 균질물 (10%)을 263K 햄스터-적응된 약제 (hamster-adapted agent)로 감염된 햄스터의 뇌를 사용하여 제조하였다. 동결 뇌들 (뇌 당 ~0.5 그램으로써 약 3-20 개)을 얼음 위에서 녹이고, 이후 9 볼륨의 트리스 완충 식염수 (pH 8.0)에서 균질화하였다. 상기 균질물을 20 분 동안 2 - 8 ℃에서 1200 r.c.f.로 원심분리에 의해 정제하였다. 1%의 라이소레시틴 (lysolecithin)을 0.1% (w/v)의 최종 농도까지 상기 상청액에 첨가하였다. 상기 물질을 사용할 때까지 -70℃에서 보관하였다. 사용하기 전에 SBH를 실온 수조에서 녹이고, 이후 용액이 탁한 상태에서 투명해질 때 까지 밀리리터당 약 2 분 동안 컵 호른-초음파처리 하였다 (Cup horm-sonicated) (컵 호른이 구비된 Misonix Sonicator XL2020, Heat Systems, Farmingdale, NY). 이후 상기 처리된 균질물을 Millex? 25 mm PVDF 시린지 구동 필터 유닛 (Millipore Corporation) 0.45/0.22/0.1 미크론 필터를 통하여 연속적으로 여과하였고, 이는 상기 물질을 추가적으로 정제하였다. 콘 분획 프로세스에 의한 수퍼너턴트 Ⅲ (SupⅢ) (200 mL)을 여과된 SBH (1:51 희석)로 스파이킹하였다. 두 번째 실시는 상기 심층 여과의 시작 바로 전에 0.22 미크로 필터를 통하여 여과하여 혼합물에서 형성하는 일체의 응집체를 제거하였다 (실시예 5 참조). SHB의 샘플을 처리 전 및 초음파 처리 및 여과후에 웨스턴 블롯 평가를 위해 샘플링하였다.

여과

47 mm CUNO 제타 플러스 90SP 필러 패드 (Cuno Corporation, Meridan CT)를 스테인레스 강 필터 하우징에 놓았다. 계량펌프 (Peristaltic Pump)를 사용하여 약 1ml/min 까지 여과의 유속을 조절하였다. 전체 필터 하우징을 단열 염화나트륨 아이스 배스에 놓고 약 -5.5 내지 -7.5 ℃까지 상기 필터를 냉각시켰다. 소디움 아세테이트-메탄올 버퍼 (80 ml의 0.01N 소디움 아세테이트 메탄올 버퍼, 22.7% MeOH -5.5 내지 -7.5 ℃)를 사용하여 상기 필터를 세척하였다. -5.5 내지 -7.5 ℃의 SBH-스파이킹된 SupⅢ (180 ml)를 1.9 mL/분의 유속에서 CUNO 필터를 통하여 여과하였다. 여과물의 분액을 상기 여과의 시작 (75 ml), 중간 (75 ml) 및 종료 (30 ml)시에 수집하였다. 상기 시스템의 압력을 전 여과 동안 모니터링하였고 약 2 psi였다.

필터에서의 PrP^sc의 용출

여과 후, 상기 필터 패드를 필터 하우징으로부터 제거하고, 거친 면을 위로하여 비이커 안에 놓고, 로터리 쉐이커 상에서 완만하게 회전시키면서 20-30 분 동안 45 mL의 1.0M NaCl 용출 버퍼로 세척하였다. 상기 필터를 제거하고 로터리 쉐이커 상에서 완만하게 회전시키면서 20-30 분 동안 45 mL의 2.0M NaCl 용출 버퍼로 다시 세척하였다. 4 ℃에서 약 1 시간 동안 100,000 xg에서 원심분리로 상기 PrP^sc를 더 농축할 수 있었으나, 표 1에 기재된 바대로 웨스턴 블롯 분석 동안 충분히 농축되었기 때문에 필요하지 않았다.

제2 실험은 SBH로 스파이크된 SupⅢ가 먼저 밀렉스 (Millex) 0.22 미크론 필터를 통하여 전여과되었다는 점을 제외하고는 제1 실험과 동일하였다.

대조 실험을, 0℃까지 상기 필터 장치를 냉각시키고 80 mL의 TBS로 심층 필터 패드를 세척하면서 실시하였다. 여과된 SBH (1:51 희석)로 스파이크된 TBS (180 mL)을 상기와 동일한 유속 하에서 여과하였고, 이후 상기 필터를 세척하였다 (실시예 4 참조).

상기 용출물 상의 PrP^sc의 웨스턴 블롯 분석을 1.0M NaCl 용출 버퍼에서의 용출물 상에서 실시하고 제2 웨스턴 블롯 분석을 2.0M NaCl 용출의 용출물 상에서 실시하였고, 양자 모두 하기 웨스턴 블롯 분석법에 따랐다.

표 1을 참조하면, 두 번의 용출 후 필터로부터 용출되었을 때 PrP^sc가 존재한다는 정보를 알 수 있다.

웨스턴 블롯

샘플 제조

샘플 제조 및 분석 방법을 Lee 등, J Virol Methods 2000; 84:77-89에 따라서 실시하였다. 샘플을 PrP^c와 PrP^sc를 구별하는데 사용되는 프로티나제 K 소화 단계에서 처리하였다. 상기 프로티나제 K 처리를 한 후 상기 샘플을 4℃에서 1 시간 동안 20,000 r.c.f.로 원심분리하였다. 상기 펠렛을 2x 소디움 도데실 설페이트 (SDS) 샘플 버퍼 각각 10㎕로 재현탁하고 5 분 동안 100℃에서 가열하였다. 하프-로그 연속 희석액을 웨스턴 블롯에 의한 PrP^sc의 검출용 겔 상으로 로딩하기 전에 제조하였고, 이들 모두는 Lee 등(상동)에 따랐다.

분석

샘플을 Lee 등(상동)의 방법에 따라서 분석하였다. 각 샘플을 125 볼트로 일정하게 유지하면서 60분 동안 12% SDS-트리스-글리신 폴리아크릴아미드 겔 상에서 전기 영동하였다. 겔은 일정하게 125 mA에서 60분 동안 니트로셀룰로오스 막에 이동된 후, TBS에 적셔지고, 5% 무지방유에 60분동안 블록되었다. 이동과 블로킹에 이어 상기 막은 3F4 단일 클로날 항체에 배양되었다. 세척한 후, 상기 막은 알칼리 포스파타제-접합 항생쥐 IgG 이차 항체에 노출되었다. 상기 블럿은 CDP-Star plus NitroBlock II에서 적셔지고, 코닥 XAR-2 필름에 노출되었다. 유효한 테스트는 33 kDa 마크에서 밴드를 보이는 양성 대조군에 의해 결정되었다. 33 kDa 밴드보다 작고 약한 두 밴드가 또한 전형적으로 관찰되었다. 이 3중 밴드는 PrP^RES의 전형적인 웨스턴 블럿 이미지이다.(상술한 리(Lee) 등).

결과

초음파 처리와 직렬 막 여과는 SBH로부터 모든 혼탁(turbidity)을 제거하였다. 이뮤노글로뷸린의 제조에 스파이크된 SBH의 후속적인 심층 여과는 여과물에서의 PrP^sc 농도를 웨스턴 블럿 분석(표 1)의 검출 한계 아래로 낮추었다. 상당한 양의 PrP^sc가 용출에 의해 고염 용액과 함끼 필터 패드로부터 회수되었다. 심층 여과 전에 0.22 마이크론 필터를 통한 SBH 스파이크된 SupIII의 여과는 PrP^sc를 검출불가능한 수준으로 제거하였다. 버퍼 대조군에 스파이크 되는 SBH의 심층 여과는 PrP^sc를 거의 제거하지 못하거나 전혀 제거하지 못하였다.

실시예 3에서, 초음파 처리된 SBH의 막 여과는, 심층 필터가 0.1마이크론 크기보다 작은 입자와 만나는 것을 보장하기 위하여 SBH 스파이크된 SupIII의 심층 여과에 앞서 수행되었다. 이것은 심층 필터에게 커다란 도전을 제공할 것이고 PrP^sc제거 메카니즘의 특성화를 허용할 것이다. 상기 SBH는 처음에 PrP^sc 응집물을 깨고 막 여과를 쉽게 하기 위해 초음파 처리된다. 초음파 처리에도 불구하고 0.1 마이크론 필터의 클로깅(clogging)을 최소화하기 위해 SBH를 점점 작아지는 필터들을 통해 직렬적으로 여과할 필요가 있었다.

SBH 스파이크된 SupIII의 여과 후에 및 1.0M과 2.0M NaCl 용액의 용출 이전에 심층 필터의 점검은 심층 필터 표면상에 소량의 물질을 나타나게 하였다. 이것은 SBH가 SupIII에 가해질 때 SupIII에 존재하는 메탄올에 기인하여 형성된 침전물로 믿어졌다. 이 침전물이 PrP^sc를 포함하는지를 결정하기 위해 SBH 스파이크된 SupIII가 심층 여과 전에 먼저 0.22 마이크론 필터를 통해 예비-여과되는 경우에 대해 이차 전개(run)가 수행되었다. 실시예 6을 보라. 상기 예비-여과는 PrP^sc를 검출해 낼 수 없는 수준으로 제거하였는데, 이는 앞선 전개(run)에서 PrP^sc가 심층 필터에의 흡수보다는 침전 및 기계적 여과에 의해 제거되었음을 가리킨다.

[표 1]

스크래피 뇌 균질액 (scrapie brain homogenate, SBH)이 스파이크된 (spiked) 면역 글로불린 제제 중에서의 웨스턴 블랏 분석 (Weatern blot assay)에 의한 PrP^SC의 측정

* Log₁₀ 감소 인자 (Log₁₀ Reduction Factor)는 여과물 (filtrate)과 비교한 스파이크량 Ⅱ 중의 PrP^RES 사이의 차이이다.

+ 스파이크량 Ⅱ는, IgG에 SBH가 부가되어 형성된 임의의 가능한 응집물들을 제거하기 위해서 0.22 미크론 여과된, SBH 스파이크된 면역 글로불린 (즉, 스파이크량 Ⅰ)이다.

"<"는, 최대 수치를 나타내며; 어떠한 PrP^RES도 여과 샘플들 중 어느 것에서도 검출되지 않았다.

실시예 4 - 대조군

침전 알코올의 부존재 하에서 심층 여과가 PrP^SC를 제거하는지를 결정하기 위해서, 대조군 실험을 수행하였으며, 이는 PrP^SC가 수성 완충용액 내로 스파이크된 후, 심층 여과되었다.

실시예 3의 재료들 및 공정들이 반복되었으며, 동일한 농도 및 부피 (3.6 ml)의 SBH가 0.1 M 트리스 완충 식염수 (Tris Buffered Saline, TBS) 180 ml 내로 스파이크되었다. 완충용액 대조군으로부터 PrP^SC가 제거되지 않는다는 사실은, 심층 여과가, 기계적인 수단 (이는 PrP^SC가 이전에 0.1 미크론 필터를 통과하였기 때문임) 또는 전기역학적 흡착에 의해서 단백질을 보유하지 않았다는 것을 나타낸다. 표 1 참조.

이러한 데이터들은 PrP^SC를 제거하기 위한 심층 여과의 효율성에 대한 이전 보고 문헌들이 잘못된 것일 수도 있다는 것을 나타낸다. 실제로, 심층 여과는 통상적으로 심층 여과와 연관된 흡착 메카니즘에 의해서가 아니라, 침전된 단백질의 기계적 잡아당김 (mechanical straining)에 의해서 PrP^SC를 제거한다. 이러한 연구의 결과들은 심층 여과 단독으로는 PrP^SC를 제거하는데 효율적이지 않다는 사실을 나타낸다. 그러나, 이전의 침전 단계와 결합되어 사용되는 경우에는, 심층 여과 또는 막 여과는 혈장 분획들로부터 비정상적인 프리온 단백질을 제거하기 위한 효과적인 메카니즘이 될 수 있다.

실시예 5 - 필터로부터의 PrP ^SC 의 용출

실시예 3에서 사용된 필터 패드를 필터 하우징으로부터 제거하여 1.0M NaCl 45ml (용출 완충용액)를 포함하는 페트리 접시 중에 놓았다. 페트리 접시를 회전 쉐이커 상에 올려 놓고, 약 20 내지 30분 동안 부드럽게 회전시켰다. 필터를 제거하고, 앞서와 유사하게, 2.0M NaCl 45ml (용출 완충용액)로 20 내지 30분 동안 2차 세척하였다.

용출물에 대한 PrP^SC의 웨스턴 블랏 분석을 1.0M NaCl 용출 완충용액으로부터의 용출물 (eluate)에 대해서 수행하였고, 2.0M NaCl 용출로부터의 용출물에 대해서도 개별적으로 제2의 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 양자 모두는 실시예 3의 웨스턴 블랏 방법들에 따라서 수행하였다. 표 1을 참조하면, 데이터는 양 용출들 이후의 필터로부터 용출된 것처럼 PrP^SC가 존재한다는 것을 보여준다.

실시예 6 - 0.22 미크론 필터 중의 SBH의 사전 여과

실시예 3의 심층 여과 단계 이전에 필터 상에서 관찰되는 침전물이 PrP^SC를 함유하는지를 측정하기 위해서, 제2 실험을 수행하였으며, 여기에서는 SBH가 스파이크된 Sup Ⅲ가 심층 여과 이전에 0.22 미크론 필터를 통하여 먼저 사전 여과되었다. 실시예 3의 재료 및 공정들이 반복되었으며, SBH가 스파이크된 Sup Ⅲ는 심층 여과 이전에 0.22 미크론 필터를 통하여 사전 여과되었다. 표 1을 참조하면, 사전-여과는 PrP^SC를 검출불가능한 수준으로 제거하며, 이는 이전 실험에서 PrP^SC가 심층 필터와의 정전기적 상호작용에 의해서라기 보다는 침전 및 기계적 잡아당김에 의해서 제거되었다는 것을 나타낸다.

실시예 7 - 필터로부터의 PrP ^SC 의 용출

실시예 6에서 사용된 필터 패드를 필터 하우징으로부터 제거하여 1.0M NaCl 45ml (용출 완충용액)를 포함하는 페트리 접시 중에 놓았다. 페트리 접시를 회전 쉐이커 상에 올려 놓고, 약 20 내지 30분 동안 천천히 회전시켰다. 필터를 제거하고, 앞서와 유사하게, 2.0M NaCl 45ml (용출 완충용액)로 20 내지 30분 동안 2차 세척하였다.

용출물에 대한 PrP^SC의 웨스턴 블랏 분석을 1.0M NaCl 용출 완충용액으로부터의 용출물에 대해서 수행하였고, 2.0M NaCl 용출로부터의 용출물에 대해서도 개별적으로 제2의 웨스턴 블랏을 수행하였으며, 양자 모두는 실시예 3의 웨스턴 블랏 방법들에 따라서 수행하였다.

표 1을 참조하면, 데이터는 양 용출들 이후의 필터로부터 용출된 것처럼 PrP^SC가 존재한다는 것을 보여준다.

실시예 8 - 혈액 샘플로부터의 프리온의 제거

소 전혈(250 ml)을 100 ×g에서 원심분리하여 적혈구 세포들을 제거하였다. 결과물인 혈장을 22.7%의 메탄올 75 ml와 혼합하여 프리온 물질을 응집시켰다. 혼합물을 회전 혼합기 상에서 5분 동안 천천히 회전시켰다. 혼합물을 상기 실시예 3와 같이 제조된 47mm Cuno Zeta Plus 90S 필터를 통하여 통과시켰다. 웨스턴 블랏 분석을 위해서, 필터 패드를 1.0 M NaCl - 15 mg/mL 글리신 용액 5 ml 중에서 세척함으로써 물질을 용출시켰다. Lee 등의 문헌에 기재된 바에 따라서 추출 및 농축 과정을 거친 후, 이 물질 0.5 ml를 실시예 3의 방법들에 따라서 웨스턴 블랏으로 분석하였다.

상기 과정은 분석의 검출 한계를 100 배 이상으로 증가시키며, 이는 감염 분석 검출 한계에 접근하는 것이다. 당업계에 이용가능한 현재의 방법들을 사용하면, 감염 분석은, 연구 대상이 되는 종에 따라서, 결과를 얻기까지 수 개월이 소요될 수 있다. 본 발명자들은 또한, 본 분석은 G17 용출을 필요로 하지 않으면서 막 표면 상에서 비정상적인 프리온의 존재를 검출함으로써 단순화될 수 있다는 사실도 입증하였다.

실시예 9 - 소변 샘플로부터의 프리온의 제거

인간 소변 샘플 (200 ml)을 3000 rpm에서 5분 동안 침전시켜서 발생가능한 세포 잔류물들을 폐기하였다. 상기 소변 샘플을 22.7%의 메탄올 75 ml와 혼합하여 프리온 물질을 응집시켰다. 혼합물을 회전 혼합기 상에서 5분 동안 천천히 회전시켰다. 혼합물을 상기 실시예 3와 같이 제조된 47mm Cuno Zeta Plus 90S 필터를 통하여 통과시켰다. 웨스턴 블랏 분석을 위해서, 필터 패드를 1.0 M NaCl - 15 mg/mL 글리신 용액 5 ml 중에서 세척함으로써 물질을 용출시켰다. Lee 등의 문헌에 기재된 바에 따라서 추출 및 농축 과정을 거친 후, 이 물질 0.5 ml를 실시예 3의 방법들에 따라서 웨스턴 블랏으로 분석하였다.

당업자라면, 상기 서술 및 예들이 본 발명의 실시에 대한 예시적인 것들이며, 결코 본 발명을 제한하는 것이 아님을 이해할 것이다. 본 발명의 범위 및 정신을 벗어 남이 없이, 여기에 제공된 세부사항들에 대한 변화가 가능하다.

Claims (75)

1. (a) 수용액을 하나 이상의 응집 보조제와 혼합하는 단계; 및

   (b) (a) 단계의 혼합물을 필터를 통하여 여과하여 프리온 단백질을 제거하는 단계를 포함하는, 생물학적 물질 또는 음식물을 포함하는 수용액으로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법.
2. 제1항에 있어서, 상기 프리온 단백질은 정상 프리온 단백질, 비정상 감염성 프리온 단백질, 또는 정상 및 비정상 감염성 프리온 단백질의 혼합물인 방법.
3. 제2항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 전혈, 혈액 성분, 뇨, CSF, 알부민 함유 액체, 면역글로불린 및 그 단편, 인자 IX, 트롬빈, 피브로넥틴, 피브리노겐, 인자 VIII, II, VII, IX, X, XI, XIII과 같은 혈액 응고인자, 헤모글로빈, 알파-2-마크로글로불린, 햅토고빈, 트란스페린, 아포리포프로틴, 단백질 C, 단백질 S, C-1-에스테라제 저해제, 효소, 인터-알파-트립신 저해제, 성장 호르몬 및 폰 빌리브란트 인자를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
4. 제1항에 있어서, 상기 음식물은 식품 및 음료를 포함하는 것인 방법.
5. 제3항에 있어서, 상기 혈액 성분은 혈청 및 혈장을 포함하는 것인 방법.
6. 제3항에 있어서, 상기 면역글로불린은 다클론 또는 단일클론 면역글로불린인 방법.
7. 제6항에 있어서, 상기 면역글로불린은 IgG인 방법.
8. 제7항에 있어서, 상기 IgG 면역글로불린은 IgG 항-D 면역글로불린인 방법.
9. 제8항에 있어서, 제8항의 상기 IgG 면역글로불린은 약 4.0 내지 6.0 중량%의 면역글로불린 및 약 80 내지 200 ppm의 폴리소르베이트 80을 포함하는 약제학적 조성물 중에 있는 것인 방법.
10. 제3항에 있어서, 상기 하나 이상의 응집 보조제는 함께 혼합되거나 연속하여 사용되는 것인 방법.
11. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 응집 보조제는 저유전상수의 유기 용매를 포함하는 것인 방법.
12. 제11항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세톤 및 수혼합성 알콜로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
13. 제11항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올, 메탄올, 이소프필, 이소프로판올, n-프로판올, 이소프로필 에테르, 케톤 및 알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
14. 제13항에 있어서, 상기 알콜은 약 2 % 내지 약 100 % 농도의 에탄올 또는 메탄올인 방법.
15. 제10항에 있어서, 상기 하나 이상의 응집 보조제 암모늄 설페이트, 카프릴릭산, 트리클로로아세트산(TCA), 디알데히드, 헤테로폴리산, 락테이트 모노하이드레이트 (C18H21N304H20), 및 금속 이온 Cu²⁺, Ni, Zn 및 Ag를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
16. 제10항에 있어서, 상기 프리온 단백질이 비정상 프리온 단백질을 포함하는 경우, 상기 하나 이상의 응집 보조제는 착화제 (complexing agents)인 방법.
17. 제16항에 있어서, 상기 착화제는 헤테로폴리몰리브데이트, 헤테로폴리텅스데이트, 소듐 포스포텅스데이트 (NaPTA), 항체, 효소 및 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
18. 제10항에 있어서, 상기 필터는 막 또는 심층 필터 (depth filter)인 방법.
19. 제18항에 있어서, 상기 필터는 심층 필터인 방법.
20. 제18항에 있어서, 상기 필터는 약 6 ㎛ 미만의 보류 (retention)를 제공하는 포어 크기를 갖는 것인 방법.
21. 제20항에 있어서, 상기 필터는 약 0.6 내지 약 1.5 미크론의 보류를 제공하는 포어 크기를 갖는 것인 방법.
22. 제19항에 있어서, 상기 심층 필터는 약 0.6 미크론 미만의 보류를 제공하는 포어 크기를 가진 것인 방법.
23. 제22항에 있어서, 상기 원래 생물학적 상태의 상기 생물학적 단백질의 회수물은 적어도 약 50 %를 초과하는 정도로 실질적으로 유지되는 것인 방법.
24. 제22항에 있어서, 상기 비정상 감염성 프리온 단백질은 약 10^2.5 이상의 정도로 달성될 수 있는 것인 방법.
25. 제24항의 방법에 따른 비정상 감염성 프리온이 제거된 주사용 면역글로불린을 포함하는 실질적으로 순수한 약제학적 조성물.
26. 면역글로불린이 IgG 항-D 면역글로불린인 제25항의 실질적으로 순수한 면역글로불린.
27. IgG 항-D 면역글로불린은 약 4.0 내지 6.0 중량%의 면역글로불린 및 약 80 내지 200 ppm의 폴리소르베이트 80를 포함하는 약제학적 조성물 중에 있는 것인, 제26항의 실질적으로 순수한 IgG 항-D 면역글로불린.
28. (a) 혈액을 임상적으로 원심분리하여 그로부터 적혈구와 혈소판을 분리하는 단계;

    (b) 상기 적혈구와 혈소판으로부터 (a) 단계의 상기 원심분리 상등액을 따라 내는 단계;

    (c) 상기 상등액을 하나 이상의 응집 보조제와 혼합하는 단계;

    (d) 막 또는 심층 필터를 통하여 상기 (c) 단계의 상기 혼합물을 여과하여, 여과물로부터 프리온 단백질을 제거하는 단계; 및

    (e) (a) 단계에서 분리된 상기 적혈구와 혈소판을 상기 여과물에 다시 첨가하는 단계를 포함하는, 전혈로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법.
29. 제28항에 있어서, 상기 응집 보조제는 함께 혼합되거나 연속하여 사용되는 것인 방법.
30. 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 응집 보조제는 저유전상수의 유기 용매를 포함하는 것인 방법.
31. 제30항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세톤 및 수혼합성 알콜로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
32. 제30항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올, 메탄올, 이소프필, 이소프로판올, n-프로판올, 이소프로필 에테르, 케톤 및 알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
33. 제32항에 있어서, 상기 알콜은 약 2 % 내지 약 100 % 농도의 에탄올 또는 메탄올인 방법.
34. 제29항에 있어서, 상기 하나 이상의 응집 보조제 암모늄 설페이트, 카프릴릭산, 트리클로로아세트산(TCA), 디알데히드, 헤테로폴리산, 락테이트 모노하이드레이트 (C18H21N304H20), 및 금속 이온 Cu²⁺, Ni, Zn 및 Ag를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
35. 제28항에 있어서, 상기 프리온 단백질이 비정상 프리온 단백질을 포함하는 경우, 상기 하나 이상의 응집 보조제는 착화제 (complexing agents)인 방법.
36. 제35항에 있어서, 상기 착화제는 헤테로폴리몰리브데이트, 헤테로폴리텅스데이트, 소듐 포스포텅스데이트 (NaPTA), 항체, 효소 및 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
37. 제28항에 있어서, 상기 필터는 막 또는 심층 필터 (depth filter)인 방법.
38. 제37항에 있어서, 상기 필터는 심층 필터인 방법.
39. 제38항에 있어서, 상기 필터는 약 6 ㎛ 미만의 보류 (retention)를 제공하는 포어 크기를 갖는 것인 방법.
40. 제39항에 있어서, 상기 필터는 약 0.6 내지 약 1.5 미크론의 보류를 제공하는 포어 크기를 갖는 것인 방법.
41. 제38항에 있어서, 상기 심층 여과는 약 0.6 미크론 미만의 보류를 제공하는 포어 크기를 갖는 심층 필터를 사용하여 수행되는 것인 방법.
42. (a) 수용액을 하나 이상의 응집 보조제와 혼합하는 단계;

    (b) (a) 단계의 상기 혼합물을 필터를 통하여 여과하여 프리온 단백질을 제거하는 단계;

    (c) 상기 필터로부터 상기 프리온을 용출하는 단계; 및

    (d) 분석법을 이용하여 비정상 감염성 프리온 단백질을 정량화하는 단계를 포함하는, 생물학적 물질 또는 음식물의 수용액 중의 TSE와 연관된 비정상 감염성 프리온 단백질을 포획, 용출, 농축 및 정량화하는 방법.
43. 제42항에 있어서, 상기 생물학적 물질은 전혈, 혈액 성분, 뇨, CSF, 알부민 함유 액체, 면역글로불린 및 그 단편, 인자 IX, 트롬빈, 피브로넥틴, 피브리노겐, 인자 VIII, II, VII, IX, X, XI, XIII과 같은 혈액 응고인자, 헤모글로빈, 알파-2-마크로글로불린, 햅토고빈, 트란스페린, 아포리포프로틴, 단백질 C, 단백질 S, C-1-에스테라제 저해제, 효소, 인터-알파-트립신 저해제, 성장 호르몬 및 폰 빌리브란트 인자를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
44. 제42항에 있어서, 상기 음식물은 식품 및 음료를 포함하는 것인 방법.
45. 제43항에 있어서, 상기 혈액 성분은 혈청 및 혈장을 포함하는 것인 방법.
46. 제43항에 있어서, 상기 면역글로불린은 다클론 또는 단일클론 면역글로불린인 방법.
47. 제46항에 있어서, 상기 면역글로불린은 IgG인 방법.
48. 제47항에 있어서, 상기 IgG 면역글로불린은 IgG 항-D 면역글로불린인 방법.
49. 제48항에 있어서, 제48항의 상기 IgG 항-D 면역글로불린은 약 4.0 내지 6.0 중량%의 면역글로불린 및 약 80 내지 200 ppm의 폴리소르베이트 80을 포함하는 약제학적 조성물 중에 있는 것인 방법.
50. 제42항에 있어서, 상기 하나 이상의 응집 보조제는 함께 혼합되거나 연속하여 사용되는 것인 방법.
51. 제50항에 있어서, 상기 하나 이상의 응집 보조제는 저유전상수의 유기 용매를 포함하는 것인 방법.
52. 제51항에 있어서, 상기 유기 용매는 아세톤 및 수혼합성 알콜로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
53. 제51항에 있어서, 상기 유기 용매는 에탄올, 메탄올, 이소프필, 이소프로판올, n-프로판올, 이소프로필 에테르, 케톤 및 알데히드로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
54. 제53항에 있어서, 상기 알콜은 약 2 % 내지 약 100 % 농도의 에탄올 또는 메탄올인 방법.
55. 제50항에 있어서, 상기 하나 이상의 응집 보조제 암모늄 설페이트, 카프릴릭산, 트리클로로아세트산(TCA), 디알데히드, 헤테로폴리산, 락테이트 모노하이드레이트 (C18H21N304H20), 및 금속 이온 Cu²⁺, Ni, Zn 및 Ag를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
56. 제50항에 있어서, 상기 프리온 단백질이 비정상 프리온 단백질을 포함하는 경우, 상기 하나 이상의 응집 보조제는 착화제 (complexing agents)인 방법.
57. 제56항에 있어서, 상기 착화제는 헤테로폴리몰리브데이트, 헤테로폴리텅스데이트, 소듐 포스포텅스데이트 (NaPTA), 항체, 효소 및 펩티드를 포함하는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
58. 제50항에 있어서, 상기 필터는 막 또는 심층 필터인 방법.
59. 제58항에 있어서, 상기 필터는 심층 필터인 방법.
60. 제58항에 있어서, 상기 필터는 약 6 ㎛ 미만의 보류 (retention)를 제공하는 포어 크기를 갖는 것인 방법.
61. 제60항에 있어서, 상기 필터는 약 0.6 내지 약 1.5 미크론의 보류를 제공하는 포어 크기를 갖는 것인 방법.
62. 제59항에 있어서, 상기 심층 필터는 약 0.6 미크론 미만의 보류를 제공하는 포어 크기를 가진 것인 방법.
63. 제62항에 있어서, 상기 원래 생물학적 상태의 상기 생물학적 단백질의 회수물은 적어도 약 50 %를 초과하는 정도로 실질적으로 유지되는 것인 방법.
64. 제62항에 있어서, 상기 비정상 감염성 프리온 단백질은 약 10^2.5 이상의 정도로 달성될 수 있는 것인 방법.
65. 제42항에 있어서, 상기 용출하는 단계는 용출 버퍼로 상기 필터를 온화하게 세척하는 단계를 포함하는 방법.
66. 제65항에 있어서, 상기 용출 버퍼는 고장액을 포함하는 것인 방법.
67. 제66항에 있어서, 상기 고장액은 고장 염 용액을 포함하는 것인 방법.
68. 제67항에 있어서, 상기 고장 염 용액은 1.0-2.O M NaCl 버퍼, 및 약 1.O M 내지 약 2.O M 농도의 소듐 아세테이트-메탄올 버퍼로 구성되는 군으로부터 선택되는 것인 방법.
69. 제42항에 있어서, (c) 단계와 (d) 단계 사이에 현재 이용가능한 분석법을 이용하여 정량화하기에 적합한 양의 상기 용출 버퍼 중에 상기 프리온을 농축하는 단계를 포함하는, 추가의 단계를 더 포함하는 방법.
70. 제69항에 있어서,(c) 단계와 (d) 단계 사이의 상기 농축하는 단계는 상기 용출 버퍼 중의 상기 프리온을 원심분리하는 단계를 포함하는 것인 방법.
71. 제42항에 있어서, 상기 정량화 단계 (d)는 ELISA, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, EG & G Wallac, DELFIA, 프리온닉스 분석법, Enfer ELC ELISA, CEA ELISA, 컨포메이션-의존성 분석법, DELFIA, 및 모세관 전기영도으로 구성되는 군으로부터 선택되는 이용가능한 분석법을 포함하는 것인 방법.
72. 제42항에 있어서, 상기 정량화 단계 (d)는 프리온 항체 6H4,3F4,16A18 또는 12A5를 사용하는 항체 분석법을 사용하는 단계를 포함하는 것인 방법.
73. 약 4.0 내지 6.0 중량%의 면역글로불린 및 약 80 내지 200 ppm의 폴리소르베이트 80를 포함하는 IgG 항-D 면역글로불린을 포함하는 수성 약제학적 조성물로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법으로서,

    (a) 상기 수성 조성물과 약 2% 내지 약 10% 메탄올을 혼합하는 단계; 및

    (b) (a) 단계의 상기 혼합물을 약 0.6 미크론 미만의 보류를 제공하는 포어 크기를 갖는 심층 필터를 통하여 여과하여 상기 프리온 단백질을 제거하는 단계를 포함하고, 원래 생물학적 상태의 상기 생물학적 단백질의 회수물은 적어도 약 50 %를 초과하는 정도로 실질적으로 유지되고, 상기 비정상 감염성 프리온 단백질은 약 10^2.5 이상의 정도까지 달성될 수 있는 것인 방법.
74. 제73항의 방법에 따른 비정상 감염성 프리온이 제거된 주사용 면역글로불린을 포함하는 실질적으로 순수한 약제학적 조성물.
75. (a) 혈액을 임상적으로 원심분리하여 그로부터 적혈구와 혈소판을 분리하는 단계;

    (b) 상기 적혈구와 혈소판으로부터 (a) 단계의 상기 원심분리 상등액을 따라 내는 단계;

    (c) 상기 상등액을 메탄올과 혼합하는 단계;

    (d) 약 0.6 내지 약 1.5 미크론의 보류를 제공하는 포어 크기를 갖는 심층 필터를 통하여 상기 (c) 단계의 상기 혼합물을 여과하여, 여과물로부터 프리온 단백질을 제거하는 단계; 및

    (e) (a) 단계에서 분리된 상기 적혈구와 혈소판을 상기 여과물에 다시 첨가하는 단계를 포함하는, 전혈로부터 프리온 단백질을 제거하는 방법.