KR20050032390A - 베타-프럭토실-엘-아스코르브산을 함유하는 미백용 화장료조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 산화안정성이 개선된 신규 구조의 아스코르브산 유도체인 베타-프럭토실-L-아스코르브산을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 미생물 유래의 레반 프럭토트랜스퍼라제(levan fructotransferase) 또는 이눌린 프럭토트랜스퍼라제(Inulin fructotransferase)를 이용하여 아스코르브산에 프럭토실기를 결합시킴으로써 산화 안정성을 갖으며, 동시에 항산화, 티로시나제 저해활성으로 인한 미백 등의 생리활성을 나타내는 신규물질인 β-프럭토실-L-아스코르브산을 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

베타-프럭토실-엘-아스코르브산을 함유하는 미백용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising beta-fructosyl-L-ascorbic acid for skin whitening}

본 발명은 산화안정성이 개선된 아스코르브산 유도체를 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 미생물 유래의 레반 프럭토트랜스퍼라제 (levan fructotransferase) 또는 이눌린 프럭토트랜스퍼라제(Inulin fructotransferase) 효소를 이용하여 아스코르브산에 프럭토실기를 결합시켜 제조되고 산화 안정성을 갖으며, 동시에 항산화 및 티로시나제저해활성으로 인한 미백 등의 생리활성을 나타내는 신규물질인 β-프럭토실-L-아스코르브산을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

기능성 물질로 다양한 생리활성을 지닌 아스코르브산은 구조적으로 불안정하여 쉽게 산화된다. 아스코르브산의 화학적 성질은 분자 속에서 하나의 이중결합에 2개의 수산기가 붙은 구조(엔디올基)를 가지고 있으므로 환원성이 매우 강하다. 생체 내에서는 아스코르브산 산화효소의 작용으로 산화되어 탈수소아스코르브산이 된다. 이 반응은 가역반응으로 생체 내의 산화환원 상태를 일정하게 유지하는 역할을 한다. 또한, 티로신, 페닐알라닌 등의 대사작용에도 중요한 역할을 하고 있고, 티로신으로부터 생성되는 흑갈색 색소인 멜라닌 색소의 형성도 아스코르브산에 의해 억제된다. 이러한 아스코르브산은 γ-락톤(lactone)과 유사한 구조를 갖고있어 불안정하고 빛, 공기, 물, 열 등의 영향을 받아 쉽게 산화되어 탈수소아스코르브산이 된다. 아스코르브산의 산화 반응은 일반적으로 연속적인 두개의 전자 전이 과정인 수소이온의 해리로 인해 아스코르브산의 산화 중간체인 디히드로아스코르브산 라디칼(dehydroascorbate radical)이 만들어지며, 이는 반응성이 풍부하고 그 자체가 2 분자로 반응해서 1분자의 아스코르브산과 탈수소아스코르브산을 생성한다(Williams, N.H.& Yandell, J.K.; Aust. J. Chem., 35(6), pp1133-44, 1982). 항산화제는 이 때 생성된 디히드로아스코르브산 라디칼과 반응하여 유리기를 환원시키므로 산화 반응을 억제한다. 아스코르브산의 산화 반응은 가역적이며 산화형인 탈수소아스코르브산 역시 비타민으로서의 생리 활성을 지니고 있다. 하지만 탈수소아스코르브산은 쉽게 가수분해되어 2,3-데케토-L-굴론산(2,3-deketo-L-gulonic acid)이 만들어지는데 이는 카르복실기의 이웃에 2개의 C=O 기를 갖기 때문에 일반 카르본산보다 해리되기 쉬우며 C=O 기의 결합각(120') 때문에 원자간 위치의 자유도가 작은 락톤환을 생성하기 어려워진다. 따라서 비가역적으로 분해되어 L-리속신산(lyxosic acid)과 L-자일로신산(xylosic acid)이 생성되는데 이들은 아스코르브산으로서의 생리 활성이 소실된 상태이다(Staudinger, H., Krisch, K.; Ann. N.Y. Acad. Sci., 92, pp195, 1961).

아스코르브산은 비수용액에서는 극소량이 용해되는 반면, 수용액에서는 다량이 용해되는 특성을 갖고 있으나 산화작용으로 쉽게 안정화되지 못해 의약품, 식품, 화장품 등의 용도로는 사용하기가 어렵다.

종래에는 아스코르브산의 화학적 안정성을 높이기 위해서 아스코르브산 황산염, 아스코르브산 인산염, α-글리코실-L-아스코르브산 등과 같은 유도체들을 화학적 또는 효소법으로 합성하는 기술이 보고된 바 있다. 이시오(Ishio) 등(일본특허공보 5,920/83호)과 마사모토(Masamoto) 등(일본특허공보 198,498/83호)은 화학적합성법으로 α-글리코실-L-아스코르브산을 생산하는 기술을 개발하였으나, 그 반응이 복잡하고 수율이 낮을 뿐만 아니라 생성된 유도체에 대한 무독성과 안전성 확립이 어려운 등의 단점이 있어 최근에는 효소를 이용한 배당체의 생산방법이 주로 연구되고 있다. 지금까지 α-글리코실-L-아스코르브산를 생산하는 것으로 알려진 효소로는 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제와 α-글루코시다제가 있다. 이 중 α-글루코시다제는 덱스트린의 말단의 비 환원성 α-1, 4-결합의 α-글루코스 단위를 가수분해하는 효소로 반응조건에 따라 α-글리코실-L-아스코르브산의 합성과 가수분해 활성을 모두 갖고 있다. 이러한 효소에 의한 배당화 반응으로 개발된 아스코르브산의 포도당 유도체인 2-O-α-D-글루코피라노실-L-아스코르브산은 1990년 노리스(Noris) 등이 쥐 소장의 α-글루코시다제를 사용하여 처음으로 합성하였다(Noris M., et al., Agricultural and biological chemistry, 54, pp1697-1733, 1990). 이후 일본의 하야시바라사가 시클로덱스트린 글루카노트랜스퍼라제와 α-글루코시다제를 사용한 효소합성법에 의한 α-글리코실-L-아스코르브산의 제조기술을 개발하였다(일본특허 2926412호/2832848호, 한국특허등록 158102호/제162495호).

본 발명자들은 그동안 프럭토트랜스퍼라제의 일종인 레반슈크라제를 이용한 알킬 프럭토시드의 생산기술을 개발하여 국내특허로서 등록한 바 있고 (한국특허 0257118, 2000. 2. 28), 미생물 유래 신규 프럭토트랜스퍼라제 유전자를 분리하고 이 효소의 트랜스프럭토실레이션 활성을 이용한 디-D-프럭토퓨라노스 2,6':6,2' 디언하이드리드 생산기술을 개발하여 국내외 특허로서 출원[한국특허출원 99-45302 (1999. 10. 19); 미국특허출원 제 09/868,328 (2001. 6. 18), 유럽특허출원 제 00 976 414.3호 (2001. 6. 20)] 하는 등의 연구실적을 보고한 바 있으며, 프럭토실 배당체 생산기술을 개발하는 과정에서 프럭토트랜스퍼라제가 이눌린과 레반과 같은 프락탄으로부터 과당 전이반응에 의해 프럭토시드를 생성한다는 사실을 확인하였다.

이에 본 발명자는 프럭토실기 수용체로서 아스코르브산을 사용하여 화학적으로 안정한 신규물질인 β-프럭토실-L-아스코르브산을 제조하여 이의 티로시나제저해활성을 확인하고, 이를 화장료에 첨가함으로서 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 종래에 화학적으로나 생물학적 방법으로 생산된 바가 없는 안정하고 새로운 아스코르브산 유도체인 β-프럭토실-L-아스코르브산을 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 안정하고 신규한 하기 일반식 I의 β-프럭토실-L-아스코르브산을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물을 제공한다.

(I)

상기 식에서, n은 0부터 10 사이의 정수이다.

상기 일반식 (I) 화합물 정의에서 바람직하기로는 n이 0 내지 5의 정수인 화합물이다.

또한 본 발명의 β-프럭토실 -L-아스코르빈산은 1) 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 미생물을 β-프럭토실 당화합물을 주성분으로 함유하는 배지에 접종하여 배양하고, 배양물을 원심분리하여 균체를 제거한 다음, 유안침전법(Ammonium sulfate precipitation method)으로 프럭토트랜스퍼라제 조효소 용액을 제조하고 부가적으로 정제하는 제 1단계;

2) β-프럭토실 당화합물을 함유한 완충액에 아스코르브산을 용해시킨 후, pH를 4.5 내지 7.0으로 조정하고, 빛이 차단된 조건하에서 상기 제 1 단계에서 수득된 프럭토트랜스퍼라제를 가하고 반응시켜 β-프럭토실-L-아스코르브산을 수득하는 제 2단계;

3) 상기 제 2단계에서 수득된 β-프럭토실-L-아스코르브산에 부가적인 정제과정을 수행하여 정제된 β-프럭토실-L-아스코르브산을 제조하는 제 3단계;로 이루어진 공정을 포함하는 제조방법에 의해 수득될 수 있다.

또한 레반 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 균주로서 바람직하게는 아스로박터 옥시단스(Arthrobacter oxydans), 아스로박터 유레아파시엔스(A. ureafacience), 아스로박터 니코티노보란스(A. nicotinovorans) 균주들을 포함하며, 더욱 바람직하게는 장 등의 문헌(K.H. Jang, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, pp2632-2636, 2003)에 기재된 아스로박터 옥시단스, 송 등의 문헌에 기재된 아스로박터 유레아파시엔스 K2032(K. B. Song et. al., Enzyme and Microbial Technology, 27, pp212-218, 2000) 또는 아스로박터 니코티노보란스 ATCC 49919 균주를 사용할 수 있다.

이 외에도 아스로박터 유레아파시엔스에서 분리한 레반 프럭토트랜스퍼라제 유전자로 형질전환된 재조합 대장균, 바람직하게는 레반 프럭토트랜스퍼라제 pUDFA84로 형질전환된 재조합 대장균(KCTC 8961P)을 포함한다.

또한, 이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 균주는 바람직하게는 아스로박터 유레아파시엔스(A. ureafacience), 아스로박터 그로비포미스(A. globiformis), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence)를 포함하고, 더욱 바람직하게는 장 등의 문헌(K.H. Jang, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, pp2632-2636, 2003)에 기재된 아스로박터 옥시단스, 기탁번호 KCTC 9101인 아스로박터 그로비포미스 또는 기탁번호 KCTC 1645인 슈도모나스 플루오레센스 균주를 사용할 수 있다.

또한 상기 β-프럭토실 당화합물는 레반, 이눌린 또는 이들의 혼합물로부터 선택되어 사용될 수 있다.

상기 1단계에서 균주 접종시 레반 또는 이눌린의 농도는 0.01 내지 5%를 사용할 수 있으며, 0.5%의 농도로 사용하는 것이 바람직하고, 사용시 50 내지 70℃의 온수에 용해하여 0.45㎛ 필터를 통과시킨 후 타 배지성분과 혼합한다. 배양시 배양온도는 4 내지 80℃, 배양시간은 3시간 내지 5일간이 바람직하며 가장 적절한 배양pH, 온도와 배양시간은 pH 7.0에서, 30℃에서 24시간 배양하는 것이다.

특히, 레반 프럭토트랜스퍼라제 유전자로 형질전환된 재조합 대장균의 경우, 재조합 대장균을 항생제가 첨가된 LB 배지에 접종하여 37℃에서 100 내지 200 rpm의 조건으로 8시간 내지 12시간동안 배양한 후 유가식 발효(semi-batch process)에 종균으로 사용하여 당업계의 통상적인 방법으로 단백질발현을 유도시킨 후, 분리 정제하여 본 발명의 프럭토트랜스퍼라제를 생산할 수 있다. 상기 수득된 조효소 용액에 부가적으로 투석, 이온교환크로마토그래피, 겔여과크로마토그래피를 수행하여 정제된 형태의 프럭토트랜스퍼라제를 제조할 수 있다.

상기 제 2단계에서, 레반 또는 이눌린은 완충액, 바람직하게는 50mM 인산완충액에 1 내지 20중량%으로 함유하며, 이에 아스코르브산을 0.5 내지 15 중량%로 용해시킨 후, pH를 4.5 내지 7.0, 바람직하게는 5.0 내지 6.0으로 조정한다. 효소와 반응시 빛이 차단된 조건하에서 수행하며, 상기 제 1 단계에서 수득된 프럭토트랜스퍼라제를 레반 또는 이눌린 1g 당 5 내지 100 단위(unit)씩 가하고, 배양온도는 25 내지 50℃이고, 37℃이 바람직하며, 반응시간은 3시간 내지 5일이내가 바람직하다.

상기 제 3단계에서, 정제된 β-프럭토실-L-아스코르브산 제품을 필요로 하는 경우 그의 분리정제는 분자량과 전자 친화성의 차이로 분리 정제할 수 있는데, 이러한 성질을 이용하여 용매 추출법, 멤브레인 분리법, 겔 여과 크로마토그래피법, 칼럼 크로마토그래피법, 고속 액체 크로마토그래피법 및 이온교환 수지법 중 한 가지 또는 그 이상의 방법을 통하여 분리 정제가 가능하며, 이를 이용하여 β-프럭토실-L-아스코르브산을 아스코르브산과 프럭토스 및 반응 부산물 등의 미반응물과의 분리가 가능하다. 그 예로써는 반응혼합물에 일정량의 유기용매를 가하여 불용성 물질을 막 분리법으로 여과하여 분리하며, 또는 활성탄을 처리하여 단백성물질과 착색물질을 제거할 수 있다. 또한 양이온 교환수지로 탈염하고 음이온 교환수지로 착염시켜 분리 정제하는 방법이 있다. 이러한 방법으로 분리 정제된 물질을 실리카겔 충진제나, 리크로프렙(LiChroprep) RP-18 충진제를 이용하여 좀 더 순도 높은 물질로 분리 정제가 가능하다.

상기에서 수득된 β-프럭토실-L-아스코르브산의 티로시나제 저해활성을 조사한 결과, 기존에 미백제로 사용하고 있는 L-아스코르브산의 티로시나제 저해활성과 유사한 정도의 뛰어난 효과를 보였다.

본 발명은 β-프럭토실-L-아스코르브산의 양이 전체 화장료 조성물의 0.001 내지 20 중량 %, 바람직하게는 0.01 내지 10.0 중량 %로 함유하고 화장품학적으로 적용가능한 기제가 혼합된 미백용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 β-프럭토실-L-아스코르브산을 유효성분으로 함유하는 조성물은 미백용 화장품, 세안제 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를 들어, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 각종 크림, 에센스, 팩, 파운데이션 등과 같은 화장품류와 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료의 구체예로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 바디로션, 에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 보디샴푸, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등을 들 수 있다.

본 발명의 미백용 화장료 조성물을 제조하는 경우에 용매로서 에탄올, 글리세린, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세레스-26, 메틸글루세스-20, 이소세틸미리스테이트, 이소세틸옥타노에이트, 옥틸도데실미리스테이트, 옥틸도데칸올, 이소스테아릴이소스테아레이트, 세틸옥타노에이트 및 네오펜틸글리콜디카프레이트 중에서 선택된 1 종 이상을 이용한다. 이러한 용매를 사용하여 본 발명의 조성물을 제조하는 경우 화합물의 종류에 따라, 용매의 혼합비에 따라 용매에 대한 화합물의 용해도가 조금씩 다르나, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자라면 제품의 특성에 따라 용매의 종류 및 사용량을 알맞게 선택하여 적용할 수 있다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴·카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, α-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산·메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산·메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜 (중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈·에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈·헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE(폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POE·POP (폴리옥시에틸렌·폴리옥시프로필렌) 공중합체, POE·POP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, α-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인삼염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민, 카본블랙 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠·스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-β-알라닌칼슘, N-라우로일-β-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; Nε-라우로일-L-리진, Nε-팔미토일리진, Nα-파리토일올니틴, Nα-라우로일아르기닌, Nα-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; α-아미노카프릴산, α-아미노라우린산 등의 α-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠·스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리친산페닐, 살리친산옥틸, 살리친산벤질, 살리친산부틸페닐, 살리친산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필·디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다. 알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01 ∼ 50 중량%, 보다 바람직하게는 0.01 ∼ 30 중량 % 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료는 필수성분인 이외에 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택되는 성분(필요에 따라 상기에 예시되는 것 이외에 첨가해도 되는 배합 성분 등)을 공지의 방법, 예를 들어 「경피 적용 제제 개발 메뉴얼」 마츠모토미치오 감수 제 1판 (세이시 서원 1985년 발행) 등에 기재된 방법에 준하여 조제함으로써 얻을 수 있다.

본 발명의 β-프럭토실-L-아스코르브산은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 대표적인 β-프럭토실-L-아스코르브산을 다음의 실험에서 구체적으로 설명한다.

참고예 1. 레반 프럭토트랜스퍼라제의 활성측정

레반 프럭토트랜스퍼라제의 활성은 다음과 같이 측정하였다.

50mM 인산완충용액(pH 6.5)을 사용하여 제조한 1% 레반 용액 180㎕에 효소액 20㎕를 혼합하고, 이를 45℃에서 30분간 반응시킨 후 생성된 프럭토오스의 양을 넬슨-소모기(Nelson-Somogyi) 법(Somogyi, M., J. Biol. Chem., 195, pp19-23, 1952)으로 정량하였다.

효소 활성 1 단위는 1분 동안에 1μ㏖의 프럭토오스를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

참고예 2. 이눌린 프럭토트랜스퍼라제의 활성측정

이눌린 프럭토트랜스퍼라제의 활성은 다음과 같이 측정하였다.

50mM 인산완충용액(pH 5.5)을 사용하여 제조한 1% 이눌린 용액 180㎕에 효소액 20㎕를 혼합하고, 이를 45℃에서 30분간 반응시킨 후 생성된 프럭토오스의 양을 넬슨-소모기(Nelson-Somogyi) 법으로 정량하였다.

효소 활성 1 단위는 1분 동안에 1μ㏖의 프럭토오스를 생성하는 효소의 양으로 정의하였다.

실시예 1: 프럭토트랜스퍼라제의 제조

1-1. 레반 프럭토트랜스퍼라제의 제조

레반 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 것으로 알려진 아스로박터(Arthrobacter) 속 미생물 중에서 본 발명자가 분리한 아스로박터 옥시단스(A. oxydans)(K.H. Jang, et al., Journal of Agricultural and Food Chemistry, 51, pp2632-2636, 2003)와 아스로박터 유레아파시엔스(A. ureafacience K2032, K.B. Song et al., Enzyme and Microbial Technology, 27, pp212-218, 2000) 및 아스로박터 니코티노보란스(A. nicotinovorans, ATCC 49919)를 각각 0.5% 레반(w/v), 0.3% NaNO₃, 0.05% MgSO₄, 0.02% MnCl₂, 0.1% K₂HPO ₄, 효모 추출물 0.3%로 조성된 배지에 접종하여 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 이 때 레반은 고압살균하는 다른 영양성분과는 별도로 물에 용해하여 0.45 ㎛ 필터를 통과시킨 후 다른 성분과 혼합되었다. 배양 후 원심분리하여 균체를 제거하고 유안 침전법으로 배양 상등액에 존재하는 단백질을 침전시켜 레반 프럭토트랜스퍼라제 조효소액을 조제하였다.

이 레반 프럭토트랜스퍼라제 조효소액을 20 mM 인산완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.5)에 투석한 후 동일 완충용액(pH 6.5)으로 안정화된 Q-세파로스(Sepharose) FF 음이온 교환 크로마토그라피 컬럼(2.5 X 500 mm, Pharmacia사, Piscataway, NJ)에 흡착시키고, 동일 완충액을 사용하여 제조한 0.5M NaCl 용액을 사용하여 염 농도를 일정하게 증가시키며 분당 0.45㎖의 속도로 가하여 효소를 용출시켰다. 용출된 레반 프럭토트랜스퍼라제 용액은 센트리플러스(Centriplus, Amicon사, Beverly, USA)로 농축한 후 위와 동일한 인산완충용액을 사용하여 투석하였다. 이어서 투석으로 염이 제거된 효소액을 인산완충용액으로 안정화된 모노-Q HR 5/5 (Pharmacia사) 크로마토그라피에 흡착시키고, 인산 완충액을 사용하여 제조한 0.5M NaCl 용액을 사용하여 염 농도를 일정하게 증가시키며 분당 0.5㎖의 속도로 가하여 효소를 용출시켰다. 용출된 효소 용액은 센트리플러스(Amicon사, Beverly, USA)으로 농축한 후 인산완충용액에 대하여 투석하여 정제 레반 프럭토트랜스퍼라제를 얻었다.

이러한 정제방법에 의하여 약 70배의 정제도와 20 - 30 %의 수율로 레반 프럭토트랜스퍼라제를 얻었다.

1-2. 재조합 레반 프럭토트랜스퍼라제의 제조

아스로박터 유레아파시엔스에서 분리한 레반 프럭토트랜스퍼라제 유전자로 형질전환된 재조합 대장균을 개발하여(한국특허등록 제 380970호) 레반 프럭토트랜스퍼라제의 대량생산에 이용하였다. 재조합 대장균을 리터당 100 mg의 엠피실린이 첨가된 LB 배지 100 ㎖에 접종하여 37℃에서 115 rpm의 조건으로 10시간동안 배양한 후 유가식 발효에 종균으로 사용하였다. 유가식 발효는 높은 세포농도를 얻기 위하여 세포 성장 단계와 효소 단백질 생산 단계로 나누어 실시하였다. 초기 회분식 배양배지는 13.3g/L KH₂PO_4, 4.0g/L 효모추출물, 6.0g/L 글루코스, 1.7g/L 시트르산, 1.2g/L MgSO_4·7H₂O, 0.1g/L 티아민(Thiamine)-HCl, 0.14g/L 암피실린을 함유한 것을 사용하였고, 성장단계에서는 부피증가를 최소화하면서 세포농도를 높이고자 상기 조성에서 포도당의 농도를 700g/L로 증가시킨 배지를 사용하였고, pH의 유지와 동시에 질소원으로는 NH₄OH를 사용하였다. 효소 발현단계에서는 600nm에서 배양액의 흡광도가 약 100에 도달하였을 때 IPTG를 0.02 mmol/L/g cell의 농도로 투입하였다. 이렇게 유가식 배양에서 IPTG 유도에 의하여 발현된 레반 프럭토 트랜스퍼라제의 생산량은 약 3 g/L 였다.

1-3. 이눌린 프럭토트랜스퍼라제의 제조

이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 생산하는 것으로 알려진 미생물 중에서 아스로박터 유레아파시엔스(A. ureafacience, KCTC 8961P)와 아스로박터 그로비포미스(A. globiformis, KCTC 9101), 슈도모나스 플루오레센스(Pseudomonas fluorescence, KCTC 1645) 를 각각 0.5% 이눌린(w/v), 0.3% NaNO₃, 0.05% MgSO₄, 0.02% MnCl₂, 0.1% K₂HPO₄, 효모 추출물 0.3%로 조성된 배지에 접종하여 30℃에서 24시간동안 배양하였다. 이 때 이눌린은 고압살균하는 다른 영양성분과는 별도로 60℃ 온수에 용해하여 0.45 ㎛ 필터를 통과시킨 후 다른 성분과 혼합되었다. 배양 후 원심분리하여 균체를 제거하고 유안 침전법으로 배양 상등액에 존재하는 단백질을 침전시켜 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 조효소액을 조제하였다. 이 조효소액을 20 mM 인산완충액(sodium phosphate buffer, pH 6.5)에 투석한 후 동일 완충용액(pH 6.5)으로 안정화된 Q-세파로스 FF 음이온 교환 크로마토그라피 컬럼(2.5 X 500 mm, Pharmacia사, Piscataway, NJ)에 흡착시키고, 동일 완충액을 사용하여 제조한 0.5M NaCl 용액을 사용하여 염 농도를 일정하게 증가시키며 분당 0.45㎖의 속도로 가하여 효소를 용출시켰다. 용출된 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 용액은 센트리플러스(Centriplus, Amicon, Beverly, USA)로 농축한 후 위와 동일한 인산완충용액을 사용하여 투석하였다. 이어서 투석으로 염이 제거된 효소액을 인산완충용액으로 안정화된 모노-Q HR 5/5 (Pharmacia사) 크로마토그라피에 흡착시키고, 인산 완충액을 사용하여 제조한 0.5M NaCl 용액을 사용하여 염 농도를 일정하게 증가시키며 분당 0.5㎖의 속도로 가하여 효소를 용출시켰다. 용출된 효소 용액은 센트리플러스(Amicon사, Beverly, USA)으로 농축한 후 인산완충용액에 대하여 투석하여 정제 이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 얻었다.

이러한 정제방법에 의하여 약 80배의 정제도와 20 - 30%의 수율로 이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 얻었다.

1-4. 유안 침전법

상기 실시예 1-1, 1-2 및 1-3에 명시된 프럭토트랜스퍼라제 생산 미생물을 대량 배양한 후 4℃에서 원심분리(6000rpm, 30분)하여 균체를 제거한 상등액에 (NH₄)₂SO₄를 4℃에서 서서히 첨가하여 80%까지 포화시킨 후 하룻밤 방치하였다. 생성된 침전물을 원심분리(6000rpm, 20분)하여 회수한 후 적정량의 20mM 인산완충액(pH 6.5)에 녹인 후, 동일 완충액에서 충분히 투석하였다. 투석 후 생성된 침전물, 즉 불활성화된 단백질은 원심분리하여 제거한 후, 그 상등액을 이온교환 크로마토그라피 시료로 사용하였다.

1-5. 이온교환 크로마토그라피

활성화시킨 Q-세파로스(Q-Sepharose) 칼럼(50x2.5cm)을 먼저 20 mM 인산완충액(pH 6.5)으로 평형화시킨 후, 유안 침전법으로 얻은 효소액을 흡착시킨 후, 동일한 완충액으로 비흡착 단백질 및 다른 불순물을 충분히 용출시켜 제거하는 세척과정을 수행하였다. 단백질 용출은 0.5 M NaCl을 함유한 동일한 완충용액을 이용하여 NaCl용액(0 내지 0.5 M)으로 직선농도구배를 형성시켜 0.45 ㎖/분의 유속으로 용출하면서 시험관 당 6.5 ㎖씩 분획하여 각 분획의 단백질 양 및 효소 활성을 측정하였다. 이온교환 크로마토그라피로 얻은 효소분획을 모아 20 mM 인산완충액(pH 6.5)에 투석하고 센트리플러스(Centriplus, Amicon사, USA)로 농축하여 정제된 효소를 얻었다.

실시예 2 : 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조

50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 4%와 아스코르브산 1%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 레반 1g당 아스로박터 옥시단스 유래 레반 프럭토트랜스퍼라제 50 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 HPLC로 분석한 결과 약 30%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 90%의 수율로 얻었다.

실시예 3 : 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조

50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 6%와 아스코르브산 2%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 레반 1g당 50 단위에 해당하는 양의 아스로박터 니코티노보란스 유래 레반 프럭토트랜스퍼라제를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 결과 약 27%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환되었다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 85%의 수율로 얻었다.

실시예 4: 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조

50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 4%와 아스코르브산 2%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 레반 1g당 아스로박터 유레아파시엔스 유래 레반 프럭토트랜스퍼라제 100 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 분석한 결과 약 33%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 72%의 수율로 얻었다.

실시예 5: 이눌린 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조

50 mM 인산완충액(pH 5.5)에 이눌린 10%와 아스코르브산 2%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 레반 1g당 아스로박터 유레아파시엔스 유래 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 50 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 과당전이 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 HPLC로 분석한 결과 약 27%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 91%의 수율로 얻었다.

실시예 6: 이눌린 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조

50 mM 인산완충액(pH 5.5)에 이눌린 15%와 아스코르브산 3%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 레반 1g당 슈도모나스 플루오레센스 유래 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 50 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 HPLC로 분석한 결과 약 25%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 83%의 수율로 얻었다.

실시예 7: 이눌린 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조

50 mM 인산완충액(pH 5.5)에 이눌린 10%와 아스코르브산 3%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 이 용액 100㎖을 취하여 갈색 시약병에 넣고 레반 1g당 아스로박터 그로비포미스 유래 이눌린 프럭토트랜스퍼라제 100 단위를 가하여 밀봉한 후 37℃에서 72시간동안 진탕해 주면서 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 HPLC로 분석한 결과 약 30%의 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 나타났다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 94%의 수율로 얻었다.

실시예 8: 재조합 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 β-프럭토실-L-아스코르브산 제조

50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 6%와 아스코르브산 3%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 3리터를 취하여 온도 및 pH 제어장치와 혼합장치가 부착된 5리터 효소반응기에 넣고 빛이 차단되도록 알루미늄 호일을 사용하여 반응조를 둘러쌌다. 이 용액에 레반 1g당 아스로박터 유레아파시엔스 유래 재조합 레반 프럭토트랜스퍼라제 200 단위를 가하여 밀봉한 후 온도 37℃, pH 6.5를 유지하고, 100 rpm으로 혼합해 주면서 72시간동안 과당전이 효소반응을 수행하였다. 반응 생성물을 분석한 결과 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 수율은 약 35% 였다. 반응 혼합물을 가열하여 미반응의 효소를 실활하고 여과한 후 여액을 활성탄으로 탈색하여 정제한 다음 농축하여 출발물질 중량에 대하여 건조고형분 기준으로 약 88%의 수율로 얻었다.

실시예 9: 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 정제

실시예 2 내지 8에서 제조된 반응혼합물 중 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산을 분리 정제하기 위하여, 반응혼합물 100㎖를 알콜에 침전시켜 침전물을 제거한 후 여액을 감압 건조하였다. 건조된 고체를 증류수에 용해시킨 후 묽은 염산으로 용액의 pH를 3으로 조절한 다음, 리크로프렙 RP-18(LiChroprep RP-18, 제조회사) 충진제로 충진된 칼럼을 통과시켰다(용리액; 증류수). 용리액을 증발시켜 순수하게 분리된 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산을 얻었다. 수율은 반응혼합물 중의 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산에 대해 약 80% 이었다. D₂O에서 측정된 수소 및 탄소핵자기공명 스펙트럼을 도 1과 도 2에 각각 나타내었다.

¹H-NMR in D₂O(ppm) ; 3.50-4.20(m, 5H), 3.73(dd, 2H, J=14Hz, 4Hz), 3.93(dd, 1H, 12Hz, 2Hz), 4.81(m, 3H)

¹³C-NMR in D₂O(ppm) ; 51.2, 57.7, 60.2, 60.4, 61.6, 67.3, 70.7, 74.6, 75.7, 116.2, 153.7, 171.8

또한 정제된 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산을 하기의 HPLC 조건에서 머무름 시간을 L-아스코르브산과 비교하여 측정하였으며 크로마토그람을 도 3에 나타내었다

분리칼럼; Capcell Pak C₁₈ 4.6 x 250mm(Shiseido사)

이 동 상; 0.05M KH₂PO₄(인산으로 pH 2.2 로 조절)

유 속; 1.0㎖/분

검 출 기; UV 254nm(Photodiode detector;996, Waters)

주사부피; 20㎕

머무름시간; 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산 ; 5.37분

L-아스코르브산 ; 4.64분

실험예 1 : 레반 프럭토트랜스퍼라제에 의한 과당전이 효소반응

50 mM 인산완충액(pH 6.0)에 레반 4%와 아스코르브산 1%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 6.0으로 조정하였다. 이 용액 100㎖ 씩을 취하여 빛이 차단되도록 제조된 갈색 용기 3개에 넣고 각각에 실시예 1의 방법으로 제조한 미생물 유래 레반 프럭토트랜스퍼라제를 레반 1g당 10 단위(unit)씩 가하여 밀봉한 후 37℃에서 48시간동안 반응시켰다. 반응 후 반응 생성물은 -20℃에 보관되었으며 HPLC로 분석한 결과 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 확인되었으며 전환수율은 각각 아스로박터 옥시단스 효소의 경우 28%, 아스로박터 니코티노보란스 효소의 경우 25%, 아스로박터 유레아파시엔스 효소의 경우 35% 이었다.

실험예 2 : 이눌린 프럭토트랜스퍼라제에 의한 과당전이 효소반응

50 mM 인산완충액(pH 5.5) 에 이눌린 4%와 아스코르브산 3%를 용해시킨 후 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 5.5로 조정하였다. 이 용액 100㎖ 씩을 취하여 빛이 차단되도록 제조된 갈색 용기 3개에 넣고 각각에 실시예 2의 방법으로 제조한 3종의 미생물 유래 이눌린 프럭토트랜스퍼라제를 이눌린 1g당 10 단위(unit)씩 가하여 밀봉한 후 37℃에서 48시간동안 반응시켰다. 반응 후 반응 생성물은 -20℃에 보관되었으며 HPLC로 분석한 결과 아스코르브산이 아스코르브산 프럭토사이드로 전환된 것으로 확인되었다. 전환수율은 아스로박터 유레아파시엔스 효소의 경우 23%, 아스로박터 그로비포미스 효소의 경우 26%, 슈도모나스 플루오레센스 효소의 경우 20% 이었다.

실험예 3 : 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 티로시나제 활성억제효과

실시예 9에서 얻어진 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산을 사용하여 피부의 멜라닌 생성을 억제하는 데 관여하는 효소 중의 하나인 티로시나제 활성 억제 시험을 실시하였다.

L-티로신(0.3㎎/㎖, sigma사) 1.0㎖에 포타슘 완충용액 (pH 6.8, 0.1M) 1.0㎖와 여러 농도(1, 5, 50, 100, 250, 500㎍/㎖)의 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산 0.9㎖을 상온조건에서 넣고 37℃에서 10∼20분간 유지시켰다. 그 후 티로시나제(1250 units /㎖, sigma사) 0.1㎖를 넣고 10분간 유지하였다. 10분±5초 이내로 꺼내서 얼음물로 구성된 냉동조건에서 반응을 종결 시켰다.

또한, 상기와 같은 반응조건으로 L-아스코르브산(sigma사)의 티로시나제 활성 억제정도를 시험하여 비교하였다. 이 때 대조군은 포타슘 완충용액을 사용하였다. 마지막으로 475㎚에서 흡광도를 UV 스펙트로포토미터(HEWLETT-PACKARD 사, G1103A)로 측정하였고, 티로시나제 저해 효과는 하기 수학식으로 계산하였다. 시험 결과는 표 1과 같다.

티로시나제 저해율(%)=[1-(시험 시료의 효소 활성도/대조군의 효소 활성도)] X 100

시 료	IC50(㎍/㎖)
2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산 (Mw = 319)	120.1
L-아스코르브산 (Mw = 176)	63.21

위의 결과를 보면 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 티로시나제 활성 억제효과가 분자량을 감안하면 L-아스코르브산의 활성저해 효과와 거의 유사함을 알 수 있다.

본 발명의 화합물은 아래와 같은 제형으로 제조할 수 있으며, 아래의 제제 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 내용이 제한되는 것은 아니다.

제제예 1. 목욕액

DL-락트산나트륨 21 중량부, 피루브산 나트륨 8 중량부, 실시예 3의 방법으로 제조한 β-프락토실-L-아스코르브산 분말 5중량부 및 에탄올 40 중량부와 정제수 26 중량부 및 적당량의 색소와 향료를 혼합하여 목욕액을 제조하였다.

이 제품은 사용할 때에 목욕물중에 100-10,000 배로 희석하여 피부 미용제 및 피부 색백제로 사용하기 적합하다. 이 경우에 있어서 목욕물 대신에 클렌징액, 수렴액 및 보습액을 사용할 수 있다.

제제예 2. 스킨 로션

정제수에 글리세린 3 중량부, 부틸렌글리콜 2중량부, 프로필렌 글리콜 2 중량부, 방부제를 투입하여 교반하여 용해시킨 후 폴리옥시에칠렌(60)경화 피마자유 1 중량부를 60℃정도 가열하여 용해시킨 후 향료를 투입 교반하여 정제수 80.9 중량부에 투입한다. 마지막으로 실시예 3의 방법으로 제조한 β-프락토실-L-아스코르브산 분말 1 중량부, 에탄올 10 중량부, 트리에탄올 아민 0.1 중량부, 색소를 투입하여 충분히 교반하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 고품질의 일광 차단제, 피부 미용제 및 피부 미백제로 사용된다.

제제예 3. 밀크 로션(영양로션)

시토 스테롤 1.7 중량부, 폴리글리세릴 2-올레이트 1.5 중량부, 세라마이드 0.7 중량부, 세테아레스-4 1.2 중량부, 콜레스테롤 1.5중량부를 일정한 온도에서 균질화하고 여기에 실시예 9의 방법으로 제조한 2-O-β-프락토실-L-아스코르브산 분말 1 중량부 및 디세틸포스페이트 0.4 중량부, 농글리세린 5.0, 선플라우어 오일 10 중량부, 카르복시비닐폴리머 0.2중량부, 산탄검 0.3중량부, 방부제를 통상의 방법으로 가열 용해시키고 이 용액에다 정제수 76.5 중량부를 가한 후 균질화기에서 유화시키고 나서 적당량의 향료를 가하고 다시 교반 혼합하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 고품질의 일광 차단제, 피부 미용제 및 피부 미백제로 사용된다.

제제예 4. 영양 크림

시토 스테롤 4 중량부, 폴리글리세릴 2-올레이트 3 중량부, 세라마이드 0.7 중량부, 세테아레스-4 2 중량부, 콜레스테롤 3 중량부를 일정한 온도에서 균질화하고 여기에 실시예 9의 방법으로 제조한 2-O-β-프락토실-L-아스코르브산 분말 3 중량부 및 디세틸포스페이트 0.4 중량부, 농글리세린 5.0, 선플라우어 오일 22 중량부, 카르복시비닐폴리머 0.5 중량부, 방부제를 통상의 방법으로 가열 용해시키고 이 용액에다 정제수 56.4 중량부를 가한 후 균질화기에서 유화시키고 나서 적당량의 향료를 가하고 다시 교반 혼합하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 고품질의 일광 차단제, 피부 미용제 및 피부 미백제로 사용된다.

제제예 5. 맛사지 크림

카르복시 비닐폴리머 0.2 중량부, 글리세린 5 중량부, 부틸렌글리콜 3 중량부, 프로필렌글리콜 3 중량부, 정제수 22.3 중량부, 미량의 방부제를 혼합교반하면서 80-85℃ 사이로 가열하여 제조부에 투입한 후 유화기를 작용시키고 밀납10 중량부, 폴리솔베이트 60 1.5 중량부, 솔비탄세스퀴올레이트 0.8 중량부, 유동파라핀 40 중량부, 스쿠알란 5.0 중량부, 카프릴릭/카프릭트리글리세라이드 4 중량부, 트리에탄올아민 0.2 중량부를 80-85℃ 사이로 가열하여 투입한 뒤 유화한다. 유화가 끝나면 교반기를 이용하여 교반하면서 50℃ 까지 냉각한 뒤 색소를 투입하고 45℃ 까지 냉각한 뒤 향료를 투입하고 35℃ 까지 냉각되면 실시예 3의 방법으로 제조한 β-프락토실-L-아스코르브산 분말 5 중량부를 투입 후 다시 교반 혼합하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 고품질의 일광 차단제, 피부 미용제 및 피부 미백제로 사용된다.

제제예 6. 영양 에센스

시토 스테롤 1.7 중량부, 폴리글리세릴 2-올레이트 1.5 중량부, 세라마이드 0.7 중량부, 세테아레스-4 1.2 중량부, 콜레스테롤 1.5 중량부를 일정한 온도에서 균질화하고 여기에 실시예 9의 방법으로 제조한 2-O-β-프락토실-L-아스코르브산 분말 5 중량부 및 디세틸포스페이트 0.4 중량부, 농글리세린 5.0, 선플라우어 오일 15 중량부, 카르복시비닐폴리머 0.2 중량부, 산탄검 0.2 중량부, 방부제를 통상의 방법으로 가열 용해시키고 이 용액에다 정제수 67.6 중량부를 가한 후 균질화기에서 유화시키고 나서 적당량의 향료를 가하고 다시 교반 혼합하여 표제의 제품을 얻었다. 이 제품은 고품질의 일광 차단제, 피부 미용제 및 피부 미백제로 사용된다.

상기와 같이 본 발명은 L-아스코르브산에 레반 또는 이눌린을 이용하여 프럭토트랜스퍼라제의 과당전이반응을 시킴으로써 제조된 안정화된 β-프럭토실-L-아스코르브산은 티로시나제저해활성이 뛰어나므로 이를 화장품에 첨가하여 항산화, 피부미백 등의 생리활성효과를 얻을 수 있다.

도 1은 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 수소핵자기공명스펙트럼이고,

도 2는 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 탄소핵자기공명스펙트럼이고,

도 3은 L-아스코르브산과 머무름시간을 비교한 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산의 HPLC 스펙트럼이다.

Claims (4)

1. 하기 일반식 I로 표기되는 β-프럭토실-L-아스코르브산을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물:

   (I)

   상기 식에서, n은 0 내지 5 사이의 정수이다.
2. 제 1항에 있어서, β-프럭토실-L-아스코르브산은 2-O-β-프럭토실-L-아스코르브산인 화장료 조성물.
3. 제 1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 크림, 에센스, 팩, 파운데이션, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 미용액의 제형을 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제 1 항에 있어서, β-프럭토실-L-아스코르브산은 조성물 총 중량에 대하여 0.001 - 20중량%의 양으로 배합됨을 특징으로 하는 화장료 조성물.