KR20050024299A - 화학 요법 중의 내피 및 상피 세포의 보호 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 본 발명은 면역억제제에 의한 치료를 받는 환자의 치료 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 치료적 유효량의 면역억제제 및 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다.

Description

화학 요법 중의 내피 및 상피 세포의 보호 방법{METHOD FOR THE PROTECTION OF ENDOTHELIAL AND EPITHELIAL CELLS DURING CHEMOTHERAPY}

본 발명은 방사선 치료 및/또는 화학 요법(chemotherapy)을 사용하는 분야에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 그러한 치료와 관련된 부작용을 경감하는 방법에 관한 것이다.

동종 줄기 세포 이식(allogeneic SCT(Stem Cell Transplantation))은, 혈액 작용 신생물(hematological neoplasia) 및 증가하는 다양한 다른 악성 질환의 치료를 위한 잘 확립된 방법이다. SCT는 주로 두 개의 순차적인 단계로 이루어진다: 그 제1 단계는, 전통적으로 온몸 조사(TBI: Total Body Irradiation) 및 화학 요법으로 이루어지는 것으로서, 받는 이의 후유증 및 면역억제제를 최소화하도록 하는, 전 이식 조건화(pretransplant conditioning)이며, 그 제2 단계는, 치료 효과를 제공할 동종 줄기 세포의 이식이다. 그러나, 주 조직적합항원(MHC)과 부 조직적합항원(mHAg)의 불일치로 인해, 이식 후의 다른 단계에서 급성 이식대숙주병(GvHD: Graft-versus-Host Disease) 등의 심한 염증 반응이 발생할 수 있다. 본 발명의 발명자들(참조: 문헌 1)과 몇몇의 다른 연구자(참조: 문헌 2,3)들의 연구 결과에 기초하여, 조건화는 비특이적 염증을 통해 이들 이식 관련 합병증(TRC: Transplant-Related Complication)의 일 원인으로 널리 인식되고 있다. 게다가, 특히 TBI의 직접적 독성이 입증되었다(참조: 문헌 4,5). 이로부터 현재, 다양한 대안적인 조건화 요법에 대한 연구가 진행되게 되었다. 또한, 새로운 전 이식 요법은 치료 프로토콜 및 환자 선택을 확장할 수 있게 해준다. 이러한 새로운 조건화 개념의 화합물 중의 하나가, 원래 만성 림프모구 백혈병(lymphatic leukemia)의 치료에 사용되었던 비골수억제성 면역억제제인, 플루다라빈(fludarabine)이다(참조: 문헌 6). 플루다라빈은, 예를 들면 비스클로로에틸니트로스유레아(BCNU: bischloroethylnitrosurea) 및 멜팔란(melphalan), 시클로포스파미드(cyclophosphamide), 또는 다른 물질과 함께, TBI를 대체하여 사용하거나, 또는 투여량이 경감된 TBI 요법과 함께 사용되기도 한다(참조: 문헌 7,8). 현재까지 얻어진 임상 데이터에 의하면, 플루다라빈은, 비교적 부작용이 적고, 조혈 및 면역 세포 특이성을 갖는 것으로 주장된다(참조: 문헌 9). 그러나 이 화합물이 내피 및 상피 세포 등의 비 조혈 세포(non-hematopoetic cell)에 대하여 미치는 영향은 아직 연구의 대상으로 되지 않았다.

사실상 모든 TRC는 내피의 기능 장애 및 기능 손상과 관련되어 있다(참조: 문헌 10). 본 발명자들과 다른 이들은, 내피가 시험관내 및 생체내에 있어서 전 이식 조건화의 표적임을 밝혀내었다. 이온화 방사선(ionizing radiation)은, 내피 세포에서 세포 예정사(programmed cell death, 아포토시스(apoptosis))가 일어나게 한다(참조: 문헌 11-14). 이와 동시에, 염증 프로세스의 전제 조건인 백혈구-내피 상호 작용이 증가되게 하는 부착 분자 발현(adhesion molecule expression)을 통해 내피 세포가 활성화된다(참조: 문헌 15,16). 이들 효과는, 위장관으로부터, 손상된 점막 장벽을 통하여 이동할 지도 모르는, 박테리아 내독소(LPS: lipopolysaccharide, 지질다당질)에 의하여 유의하게 증진된다(참조: 문헌 17). 또한, LPS는 동종 CD8+ 세포 독성 T 림프구에 대한 내피 세포의 항원성을 증가시키는 것으로 알려져 있다(참조: 문헌 18).

경감된 강도의 조건화(RIC: reduced intensity conditioning) 요법을 포함하는, 플루다라빈을 사용한 지금까지의 임상 결과로부터, 면역 재구성에 영향을 미치는 일 없이, 조건화에 관련된 독성이 명백하게 하향 조절(downregulation)됨이 밝혀졌다. RIC를 받는 환자에서의 급성 GvHD의 이환율은, 전통적인 조건화 요법을 받는 환자들의 경우에 비하여 필적할 만하거나 또는 오히려 적다. 그러나, 뼈괴사, 폐 합병증, 및 더 많은 만성 GvHD의 사례와 같은 후유 효과가 동등한 정도로 심하거나 혹은 오히려 증가했다는 보고는, 플루다라빈 치료법에 관련된 심각한 부작용의 가능성을 분명하게 입증하고 있다.

발명의 요약

본 발명은 플루다라빈이 내피 및 상피 세포를 활성화시키고 손상시킨다는 발견에 기초한 것이다. 상기 세포의 활성화는, 예컨대 SCT에 의해 악성 종양을 치료하는 등의, 플루다라빈이 사용되는 치료 상황에 있어 손상을 입힌다. 데피브로티드를 사용한 치료에 의해, 이 활성화 및 손상으로부터 내피 및 상피 세포를 보호할 수 있다. 이 치료는 공동적(concomitant)일 수 있으며, 또는 데피브로티드는 플루다라빈을 사용하는 치료 전이나 또는 그 후에 투여할 수 있다.

축약 및 정의

SCT: 조혈 줄기 세포 이식

면역억제제: 투여 대상의 면역 반응을 하향 조절하는 물질. 면역억제제는 줄기 세포 요법을 받는 환자의 면역 체계를 억제하는데에 사용된다. 면역억제제의 예로는 플루다라빈, 시클로포스파미드, BCNU, 시클로스포린(cyclosporin), 시로리머스(sirolimus), 타크로리머스(tacrolimus), 및 멜팔란을 들 수 있다. 이 중 본 출원의 맥락 상 플루다라빈("2-플루오로-9-베타-D-아라비노퓨라노실아데닌"으로도 알려져 있음)이 바람직하다.

보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드: 본 출원의 맥락 상, 미국특허 제5,646,268호 공보에 명시된 올리고데옥시리보뉴클레오티드, 및 미국특허 제5,223,609호 공보에 명시된 폴리데옥시리보뉴클레오티드 모두를 의미하며, 상기 특허 문헌들은 그 전체로서 여기에 참조 문헌으로 포함된다.

미국특허 제5,646,268호 공보에는 다음의 물리화학적 및 화학적 특성을 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 제조 방법이 개시되어 있다.

분자량: 4000~10000

h: < 10

A+T/C+G^* 1.100~1.455

A+G/C+T^* 0.800~1.160

고유 회전(specific rotation) +30°~ +48°

-----------------------------------------------

*염기 몰비

h=흡광증가 파라미터(hyperchromicity parameter)

이러한 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 제조하는 방법은 다음 단계를 포함한다: 폴리데옥시리보뉴클레오티드 나트륨염의 0.8M 아세트산나트륨 수용액을, 그 수용액에 에틸, 프로필, 및 이소프로필 알코올로 이루어지는 군으로부터 선택되는 알킬 알코올을 첨가함으로써 20℃에서 침전시킨다.

미국특허 제5,223,609호 공보에는 소정의 약리학적 및 치료적 특성을 충족시키는 데피브로티드가 개시되어 있으며, 따라서 이 데피브로티드는, 그것을 형성하는 뉴클레오티드 분획이, 하기 랜덤 서열의 폴리데옥시리보튜클레오티드 식과 화학양론적 관계를 만족한다면, 특히 적합하다:

P_1-5, (dAp)_12-24, (dGp)_10-20, (dTp)_13-26, (dCp)_10-20

상기에서,

P=인산 라디칼

dAp=데옥시아데닌 모노머

dGp=데옥시구아닌 모노머

dTp=데옥시티미딘 모노머

dCp=데옥시시티딘 모노머

상기 식에 부합하는 데피브로티드는 아래의 물리화학적 특성을 보여 준다:

전기 영동 = 균일 음극 이동성(homogeneous anodic mobility)

흡광 계수(extinction coefficient), 260nm에서의 E_1cm ^1%=220±10

흡광비, E₂₃₀/E₂₆₀=0.45±0.04

몰 흡광 계수(인산에 의한), ε(P)=7.750±500

회전력(rotatory power) [α]_D ^20°=53°±6

가역적 흡광증가도(reversible hyperchromicity), 자연적인 DNA에서 %로 표시됨, h=15±5.

바람직한 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 데피브로티드(CAS 등록 번호: 83712-60-1)이며, 이는 당업자에게 주지된 폴리뉴클레오티드로서, 동물 및/또는 식물 조직으로부터의 추출(참조: 미국특허 제3,770,720호 공보 및 미국특허 제3,899,481호 공보)에 의해 얻어지는 폴리데옥시리보뉴클레오티드로 알려져 있다; 이 폴리데옥시리보뉴클레오티드는 대개 알칼리 금속염, 일반적으로는 나트륨염의 형태로 사용되며, 보통 약 45~50kDa의 분자량을 갖는다. 데피브로티드는, 예컨대 급성 신부전증의 치료(참조: 미국특허 제4,694,134호 공보) 및 급성 심근 허혈증(참조: 미국특허 4,693,995호 공보) 등의 다른 적용에도 사용할 수 있지만, 주로 그 항혈전성 때문에 사용된다(참조: 미국특허 제3,829,567호 공보). 미합중국 특허 제4,985,552호 공보 및 제5,223,609호 공보에는, 일정하고 뚜렷한 물리화학적 성질을 가지며, 또한 원하지 않은 부작용도 없는 데피브로티드를 얻을 수 있게 하는 제조 방법이 개시되어 있다.

도 1: 플루다라빈은 인간 미세혈관 내피 세포(HMEC)에서 세포예정사를 유도한다.

HMEC를 처리하지 않고 그대로 두거나 또는 낮추어가는 농도의 2-플루오로-9-β-D-아라비노퓨라노실아데닌(이하 "F-Ara"라 함, 플루다라빈의 대사된 형태)과 함께 48시간 동안 배양하고, 흐름 세포 측정 분석(flow cytometric analysis)(A) 또는 현미경 DAPI 염색 분석(microscopic DAPI stain analysis)을 행하였다.

A: 세포 크기에 대한 세포 입도(cellular granularity)를 파라미터로 하여, 전방 산란 영상(foward scatter immage, y-축)에 대하여 플롯한, 프로피듐 아이오다이드(PI: Propidium Iodide)-음성 세포의 측면 산란 영상(x-축)의 등고선도(SSC: Contour plots of the Side Scatter).

B: DAPI로 염색된 내피 세포의 정량적 형광 현미경 분석(Quantitative fluorescence microscopy analysis). 결과는 "% 자멸 HMEC(% 자멸 세포)±표준 편차(평균이 필드(field) 당 70세포일 때 n=10 마이크로스코픽 필드로부터)"로 나타낸다. 적어도 5개의 독립적인 실험들의 대표적인 것들을 나타낸다. ^*: F-Ara(10㎍/ml)로 처리된 세포에 대한 처리하지 않은 대조군의 p〈 0.001.

도 2: 데피브로티드(D)는 HMEC에서, F-Ara에 의해 유도되는 세포자멸사를 억제한다; 세포내 길항작용의 증거.

F-Ara: 10㎍/ml. D: 100㎍/ml.

PI-음성 세포의 SSC-영상의 흐름 세포 측정 분석.

A: F-Ara에 의한 세포자멸사의 재현적 유도.

B: D에 의한, F-Ara에 의해 유도되는 세포자멸사의 투여량 의존적 억제.

C: 좌측도: F-Ara와 함께 HMEC를 1시간 동안 배양하고, 세정한 후, D와 함께 48시간 동안 후속 배양한 경우.

우측도: D와 함께 HMEC를 1시간 동안 배양하고, 세정한 후, F-Ara와 함께 48시간 동안 후속 배양한 경우.

실험의 세부적 내용에 대해서는 도 1의 설명문과, "재료 및 방법" 란을 참조하면 된다. 3개의 독립된 실험으로부터의 1개의 대표적인 것을 나타낸다.

도 3: F-Ara는 각질 형성 세포(keratinocyte) 및 폐포 상피 세포 내에서 세포자멸사를 유도하나, 내장 또는 기관지 상피 세포에서는 그렇지 않다; 데피브로티드의 보호 효과.

F-Ara: 10㎍/ml. D: 100㎍/ml.

PI-음성 세포의 SSC-영상의 흐름 세포 분석(도 3A)과 자멸 세포의 DAPI-염색 분석(도 3B). 결과를 3개의 다른 실험으로부터의 "평균 % 자멸 세포±표준 편차"로 나타낸다. HaCaT: 인간 각질 형성 세포주(Human Keratinocyte Cell Line). SW 480: 내장 상피 세포주. A 549: 폐포 상피로부터의 폐 암종 세포주. BEAS-2B: 기관지 상피 세포주. 1차 기관지 상피 세포를 기관지경 솔 과정(bronchoscopic brush procedure)으로 얻었다.

도 3A: ^*: F-Ara+D로 처리된 HaCaT 세포에 대한 F-Ara 처리의 p=0.005. ^**: F-Ara+D로 처리된 A 549 세포에 대한 F-Ara 처리의 p=0.116. "-": 세포자멸사 유도 없음.

도 3B: +: F-Ara+D로 처리된 HaCaT 세포에 대한 F-Ara 처리의 p=0.026. ⁺⁺: F-Ara+D로 처리된 A 549 세포에 대한 F-Ara 처리의 p=0.001.

실험의 세부적 내용에 대해서는 도 1에 대한 설명문과, "재료 및 방법" 란을 참조하면 된다. 3개의 대표적 실험들을 각 세포주에 대하여 요약한다.

도 4: 데피브로티드(D)는 F-Ara의 항 백혈병 효과 및 항-PBMC 효과를 간섭하지 않는다.

F-Ara: 10㎍/ml. D: 100㎍/ml.

A: 모세포 위기(blast crisis, 총 PBMC 수의 70%가 모세포) 환자에게서 얻은, 일차 급성 골수성 백혈병(AML: Acute Myeloid Leukemia) 세포의, 프로피듐 아이오다이드 염색. 결과는 3개의 독립적 실험의 평균 % 생명력(vitality)으로 나타낸다. ^*: F-Ara로 처리된 AML 세포에 대한 음성 대조군의 p=0.008.

B: PI-음성 세포의 SSC-영상의 흐름 세포 측정 분석. 공혈자(blood donor)를 달리하는 5개의 독립적 실험으로부터의 1개의 대표적인 것을 나타낸다.

도 5: F-Ara는 HMEC에서 ICAM-1 발현을 유도한다; 데피브로티드(D)의 보호 효과.

ICAM-1 양성 세포의 흐름 세포 측정 분석. HMEC를, 처리하지 않고 그대로 두거나, 또는 F-Ara(10㎍/mL, 또는 B에서는 농도를 낮추어 감)와 함께, 낮추어가는 농도의 D의 존재 또는 부재 하에 배양하였다.

A: 대표 실험으로부터 얻은 ICAM-1 발현의 도수분포도. 점선: 배경 염색(background staining, 닐(nil: 영(零)) 대조군); 가는선: 미처리 대조군 세포의 ICAM-1 발현; 굵은 선: F-Ara로 처리된 세포의 ICAM-1 발현.

B: F-Ara에 의한 ICAM-1 발현의 투여량 의존적 유도.

3개의 독립된 실험을 요약하여 나타내었다. 결과를 "평균 % ICAM-1 양성 세포±표준 편차"로 나타낸다. ^*: 처리되지 않은 대조군 세포에 대한 F-Ara 처리의 p=0.075.

C: 데피브로티드(D)에 의한, F-Ara에 의해 유도되는 ICAM-1 발현의, 투여량 의존적 유도. 결과를 "평균 % ICAM-1 양성 세포±표준 편차"로 나타낸다. ^**: F-Ara+D-처리 HMEC에 대한 F-Ara 처리의 p=0.004.

도 6: F-Ara는 CD8-양성 세포 독성 T-림프구(CTL: Cytotoxic T-Lymphocyte)에 대한 HMEC의 동종성을 증가시킨다; 데피브로티드의 보호 효과.

A: PBMC를, 조사된(irradiated) HMEC로, 인터루킨 2(50U/mL)의 존재 하에 7일간 자극하고, 처리하지 않은 것을 대조군, F-Ar(10㎍/mL)로 처리된 HMEC(24시간 배양)를 표적 세포로 하는, ⁵¹Cr 방출 분석(release assay)을 행하였다. 자가 B-LCL: 자가(효과자) 엡스타인 바르 바이러스(EBV)로 형질전환된 B-림프모구 세포(B-lymphoblastoid cell). K 562: 자연세포독성세포(NK cell: Natural Killer cell)의 표적 세포.

결과를 "재료 및 방법" 란에 기재된 바와 같이 "% 특이적 용해"로 나타낸다. * : 항 MHC 클래스 I 항체 w6/32의 존재 하에 F-Ara로 처리된 HMEC의 % 특이적 용해. E/T비: 효과자/표적 비.

B: 데피브로티드(D)에 의한, CD8-양성 CTL에 대한 HMEC의 F-Ara에 의해 유도되는 동종성의 하향 조절. CD8-양성 PBMC를, 자력 비드 분리(magnetic bead seperation)에 의해 음성적으로 선택하였다(비 CD8+ 세포를 제거함). 실험적인 세부 내용은 도 6A의 설명문을 참조하면 된다.

도 7: F-Ara는 NK 세포에 대한 HMEC의 동종성을 감소시킨다; MHC 클래스 I의 차단에 의한 용해의 증진.

NK 세포를, 자력 비드 분리에 의해 음성적으로 선택하고, 조사된 HMEC로, IL-2(50U/mL)의 존재 하에 4일간 자극하고, 도 6에 대한 설명에 나타낸 바와 같이 ⁵¹Cr 방출 분석(release assay)을 행하였다.

도면 아래의 표: HMEC에 의한 자극 전후에 있어서의 효과자 세포 집단의 흐름 세포 측정 분석. NK 세포는 CD3-/CD16+CD56+로 특징지워졌다. * : E/T 비가 20:1일때 K 562 세포의 % 특이적 용해.

표 1: T_c1 유사 형질을 이끌어내는 항-내피 CTL.

효과자	IFN-γ	IL-4
PBMC	319[±176]	0
CD8+	524[±174]	0

자극된 효과자 세포(7일, 조사된 HMEC, 50U/mL IL-2)의 상청액(supernatant) 중에서 인터페론 감마(IFN-γ)와 인터루킨 4(IL-4)의 생산을 위한 ELISA.

PBMC를, 도 6의 실험에서와 마찬가지로, 분리하지 않거나 또는 CD8+을 음성적으로 선택하였다. 결과를 3개의 독립적인 실험으로부터의 "평균 pg/mL 사이토킨±표준 편차"로 나타낸다.

본 발명은 면역억제제에 의한 치료를 받는 환자의 치료 방법에 관한 것으로서, 상기 환자에게 유효량의 보호 올리고데옥시뉴클레오티드를 투여하는 단계를 포함하는 것이다. 면역억제제에 의한 치료는 바람직하게는 SCT 동안에 발생한다. 상기 면역억제제는 바람직하게는 항대사물질{예를 들면, 5-플루오로우라실(5-FU), 메토트렉세이트(methotrexate), 플루다라빈}; 항미세관제(anti-microtubule){예를 들어 빈크리스틴(vincristine), 빈블라스틴(vinblastine), 탁산류(파크리탁셀 및 도세탁셀(docetaxel) 등의)}; 알킬화제(예를 들면, 시클로포스파미드, 멜팔란, 비스클로로에틸니트로스유레아(BCNU)); 백금제{예를 들면 시스플라틴("cDDP"라 하기도 함), 카르보플라틴, 옥살리플라틴, JM-216, CI-973}; 안트라시클린류(예를 들면, 독소루비신, 다우노루비신); 미토마이신-C을 포함하는 항생제; 국소이성화효소 저해제(예를 들면 에토포시드, 캄프토테신); 시클로스포린, 타크로리머스, 사이로리머스 및 면역 체계를 억제하는 다른 세포독성제;이다. 악성 종양의 치료에 종종 사용되는 상기 약제들에 대한 고찰은, 본 명세서에 참고 문헌으로 게재한 Gonzales et al., Alergol. Immunol. Clin. 15, 161-181, 2000에서 찾아볼 수 있다. 바람직한 면역억제제는 뉴클레오시드(즉, 뉴클레오티드로부터 포스페이트 기를 제거하여 얻어지는 글리코시드)로서, 예를 들면 플루다라빈은 본 발명의 목적을 실현함에 있어 바람직한 면역억제제이다.

상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 면역억제제와 병행적으로(concurrently), 동시적으로(simultaneously), 또는 함께(together) 투여할 수 있다. 바람직한 조합은 데피브로티드와 플루다라빈의 동시 투여이다.

상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 투여 단계는, 바람직하게는 환자에 대한 상기 면역억제제의 투여의 전이나 후에, 병행적으로(concurrently), 공동적으로(concomitantly), 동시에(simultaneously) 행할 수 있다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서는, 상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 투여하는 단계는, 환자에 대한 면역억제제의 투여 후에 행한다. 더 바람직한 실시태양에서는, 환자에게 보호제를 투여하는 단계와 면역억제제의 투여 사이의 시간 지연이 약 1시간∼약 2주이다. 가장 바람직하게는, 환자에게 보호제를 투여하는 단계와 면역억제제의 투여 사이의 시간 지연이 약 2일∼약 7일이다.

본 발명의 또다른 바람직한 태양에서는, 상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 투여하는 단계는, 환자에 대한 면역억제제의 투여 전에 행한다. 바람직하게는, 환자에게 보호제를 투여하는 단계와 면역억제제의 투여 사이의 시간차가 약 1시간~약 2주이다. 더 바람직하게는, 환자에게 보호제를 투여하는 단계와 면역억제제의 투여 사이의 시간차가 약 2시간~약 2일이다.

바람직한 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 데피브로티드이지만, 보호 올리고뉴클레오티드로서 앞서 언급한 다른 물질을 사용해도 좋다. 아래의 실시례는 데피브로티드의 바람직한 투여량을 규정하나, 데피브로티드가 아닌 다른 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 사용하는 때는 상기 투여량에 유사한 투여량을 사용할 수 있다. 어느 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드이든, 주치의에 의하여 그 적절한 투여량이 결정될 수 있다. 하기의 실험은 데피브로티드의 보호 효과를 나타낸다. 이러한 실험으로부터 결정되는 유효 투여량을, 치료를 위한 유효 투여량을 결정하는 지침으로 사용할 수 있다.

데피브로티드는 바람직하게는 경구 투여되거나 혹은 정맥내로 주사된다.

바람직한 데피브로티드의 투여량은 혈중 레벨이 약 0.1㎍/mL∼100㎍/mL에 이르도록 선택된다. 더 바람직하게는 데피브로티드의 투여량은 혈중 레벨이 약 10㎍/mL∼약 100㎍/mL에 이르도록 선택된다. 가장 바람직하게는, 데피브로티드의 투여량은 혈중 레벨이 약 100㎍/mL에 이르도록 선택된다.

본 발명의 바람직한 실시태양에서, 투여되는 데피브로티드의 용량은, 환자 체중 1kg 당 약 0.01mg∼약 100mg이다. 바람직하게는, 투여되는 데피브로티드의 용량은, 환자 체중 1kg 당 약 0.1mg∼약 20mg이다. 더 바람직하게는, 투여되는 데피브로티드의 용량은, 환자 체중 1kg 당 약 1mg∼약 15mg이다. 더 바람직하게는, 환자 체중 1kg 당 약 12mg∼약 14mg의 1일 용량이 투여된다. 가장 바람직하게는, 투여되는 데피브로티드의 용량은, 환자 체중 1kg 당 약 12mg이다.

바람직하게는, 본 발명에 따른 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 투여는 면역억제제의 효과로부터 내피 및 상피 세포를 보호할 수 있다. 상기 면역억제제는 내피 및 상피 세포를 우선적으로 활성화시키고 그 세포자멸사를 유도한다. 따라서, 바람직한 실시태양에서, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 내피 및/또는 상피 세포를, 면역억제제에 의한 세포자멸사 및/또는 활성화로부터 보호한다. 상기 면역억제제는 바람직하게는 플루다라빈이다. 상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 바람직하게는 데피브로티드이다.

상기 활성화는 ICAM-1 및 MHC 클래스 I 분자의 증가된 발현을 포함한다. 발현의 증가는 바람직하게는 실질적인 레벨이다. 더 바람직하게는, 상기 면역억제제는 환자에게 있어서 내피 세포 및/또는 상피 세포의 친염증적 활성화(pro-inflammatory activation)를 유도한다. 상기 세포는 바람직하게는 인간 미세혈관 내피 세포(HMEC: Human Microvascular Endothelial Cell) 및/또는 피부 및/또는 폐포 상피 세포이다. 상기 손상은 바람직하게는 환자의 내피 및/또는 상피 세포가 면역억제제에 약 1시간~약 1주 또는 그 이상 노출되었을때 일어난다. 더 바람직하게는, 상기 손상은 상기 세포가 면역억제제에 약 5시간~약 72시간 노출되었을때 일어난다. 보다 더 바람직하게는, 그러한 노출의 지속은 20시간~72시간이다. 가장 바람직하게는, 그러한 노출의 지속은 48시간 이상이다.

상기 면역억제제에 의한 치료는 바람직하게는 조혈 줄기 세포 이식 중에 행하여진다. 조혈 줄기 세포 이식은 바람직하게는 동종 조혈 줄기 세포 이식이다.

본 발명은 또한 보호 올리고데옥시뉴클레오티드를 필요로 하는, 면역억제제에 의한 치료를 받는 환자의 치료를 위한, 적어도 1종의 보호 올리고데옥시뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 상기 제약 조성물의 투여는, 면역억제제 또는 면역억제제와 이식에 의해 유발되는 부작용을 완화하거나, 또는 그로부터 보호한다. 상기 이식은 바람직하게는 골수 또는 조혈 줄기 세포 이식이다.

상기 부작용은 바람직하게는 환자의 내피 및/또는 상피 세포 및/또는 조직에 관한 것이다. 바람직하게는, 상기 부작용은 상기 세포의 세포자멸사, 및/또는 상기 세포의 활성화를 포함한다. 상기 활성화는 바람직하게는 MHC 클래스 I 분자 및/또는 세포간 부착 분자 1(ICAM-1: Intercellular adhesion molecule 1)의 증가된 발현을 포함한다. 상기 부작용은, 약리학적으로 적절한 농도(1㎍/mL~10㎍/mL)로 사용하였을 때, 48시간 배양 후, 바람직하게는 피부 또는 폐포 상피 세포주, 뿐만 아니라, 인간의 미세혈관 내피 세포(HMEC)도 손상시킨다.

상기 부작용은 일반적으로 이식 관련 합병증의 표적 조직에 대한 손상, 및 동종 면역 반응의 자극을 포함한다.

상기 부작용은 환자의 내피 세포 및/또는 상피 세포, 바람직하게는 폐포 내피 세포에서 세포간 부착 분자 1(ICAM-1) 및 MHC 클래스 I 분자의 유의한 상향 조절을 포함한다. 또한 상기 부작용은 미세혈관 내피 세포의 친염증적 활성화를 포함한다. 상기 부작용은, 더 바람직하게는, 이식 조직으로부터 얻어지는, 동종 MHC 클래스 I로 제한된 세포 독성 T 림프구에 의한 상기 세포의 증가된 용해(lysis)를 포함한다.

상기 보호 올리고데옥시뉴클레오티드의 투여는, 바람직하게는, 세포자멸사 및 동종 활성화(alloactivation)를 포함하는, 면역억제제에 의해 유도된 부작용으로부터 보호한다.

본 발명의 면역 억제제를 포함하는 제약 조성물은 통상의 기술, 부형제 및 운반체를 사용하여, 경구 투여용 및 주사 투여용, 바람직하게는 정맥내 경로를 통한 투여용 등의 잘 알려진 타입으로 제조할 수 있다. 본 발명에 의한 조성물 중 활성 성분의 투여량은 1회 투여량 당 50~1500mg이나, 바람직한 결과를 위해서는 10~40mg/kg의 1일 투여량을 제안한다. 데피브로티드의 제조 방법은 미국특허 제4,985, 552호 공보 및 미국특허 제5,223,609호 공보에 개시되어 있으며, 상기 특허 문헌을 그 전체로서 여기에 참조 문헌으로 포함시킨다.

본 발명은 또한 면역억제제와 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 치료적 유효량을 포함하는 제약 조성물에 관한 것이다. 상기 면역억제제는 바람직하게는 플루다라빈이다. 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드는 바람직하게는 데피브로티드이다.

방법

(세포 배양 및 시약)

인간의 피부 미세혈관 내피 세포주 CDC/EU.-HMEC-1(이하 "HMEC"라 함)을, 미국 질병 관리 및 예방 센터(The Center for Disease Control and Prevention, 죠지아주 애틀랜타 소재)로부터 제공받아, 전술한 바와 같이 확립하였다(참조: 문헌 19). HMEC를 MCDB131 배지에서 배양하고, 여기에 15% 소 태아 혈청, 1㎍/mL 하이드로코르티손(시그마(Sigma)사제, 독일 디젠호펜 소재), 10ng/mL 표피 성장 인자 (콜래보러티브 바이오케미털 프로덕트(Collaborative Biochemical Products)사제, 미국 매사추세츠주 베드포드 소재) 및 항생제를 보충하였다. 모든 세포 배양 시약은 달리 언급하지 않는 한 깁코 비이알엘(Gibco BRL)사(독일 칼스루헤 소재)로부터 구입하였다. 2-플루오로아데닌 9-베타-D-아라비노퓨라노시드(F-Ara)는 독일 디젠호펜 소재 시그마사로부터 구하였고, 데피브로티드 바이알은 이탈리아 코모 크리노스 소재의 프로시클라이드(Prociclide^TM)사로부터 구하였다.

(세포자멸사 분석)

인간 내피 세포에서 세포자멸사를 검출하는 확립된 방법을, 전술한 바와 같이(참조: 문헌 20) 흐름 세포 측정(FACScan^TM 및 CellQuest^TM 소프트웨어, 벡튼 디킨슨(Becton Dickinson)사제, 독일 하이델베르크 소재)을 사용하여 실시하였다. 내피 및 상피 세포를, 처리하지 않고 그대로 두거나 또는 낮추어가는 농도의(범위: 10㎍/mL∼0.1㎍/mL) F-Ara와 함께, 데피브로티드의 존재 또는 부재 하에서, 48시간 동안 배양하였다. 그 후, 세포를 PBS/10% FCS로 세정하고 괴사 검출 염료(necrosis detecting dye)인 프로피듐 아이오다이드(PI, 0.2㎍/mL, 시그마사제, 독일 디젠호펜 소재)로 염색하였다. PI-음성 염색, 및 비 자멸 세포의 그것과 구분되는 특징적 측면 산란 영상에 의해, 자멸 세포를 확인하였다. 세포 타입 당 적어도 3개의 실험을 행하였다.

세포자멸사 검출의 또다른 방법으로, DNA가 형광 표지된 세포의 현미경 분석을 사용하였다. 35mm 페트리 디쉬(눈크(Nunc)사제, 독일 비스바덴 소재)에 플레이트 당 1×10⁵ 개의 내피 세포를 시딩(seeding)하였다. 이들 세포를 상술한 바와 같이 처리하고, 이어서 메탄올/아세톤(1:1)으로 2분간 고정하고, PBS 중에서 1회 세정하고 4,6-디아미디노-2-페닐인돌(DAPI)(0.5㎍/mL, 시그마사제, 독일 디젠호펜 소재)로 염색하여, 20% 글리세린/PBS에 용해시켰다. 시료를 탑재하여 현미경 분석을 행하였다. 트리판 블루(trypan blue)의 부재 하에 DAPI 염색에 의해 드러나는 핵 응축은, 괴사(necrosis)와 반대되는 세포자멸사(apoptosis)의 특징이다(참조: 문헌 21). 정량 분석은 필드 당 평균 70개의 세포로, 적어도 10개의 현미경 필드로부터 확인 가능한 모든 세포에 상대적인 자멸 수를 카운트하는 단계를 포함하였다.

명확성을 위해 DAPI 염색 결과는 A549 세포 뿐 아니라 내피 세포 및 HaCaT에 대한 실험에 대해서도 도시한다.

(세포 표면 분석)

ICAM-1(벡튼 디킨슨/파밍겐(Becton Dickinson/Pharmingen)사제, 독일 하이델베르크 소재) 및 HMEC에 대한 MHC 클래스 I(w6/32, 하이브리도마 상청액, ATCC사제, 미국 버지니아주 마나사스 소재) 분자를, 간접적 면역형광술, 및 이어서 FACScan^TM 흐름 세포 측정기 및 Cell-Quest^TM 분석 프로그램(벡튼 디킨슨(Becton Dickinson)사제, 독일 하이텔베르크 소재)을 사용한 흐름 세포 측정에 의하여 평가하였다. 내피 세포를 소정의 방법으로 처리하고, 배양물을 트립신/EDTA(깁코(Ginco)사제)로 수확한 후 차가운 PBS/10% FCS로 1회 세정하고, 5㎍/mL의 항 부착 분자 MoAbs와 함께 1시간 동안 얼음 상에서 배양하였다. 세포를 다시 세정하고 염소 항 마우스 IgG-FITC 접합 항체 F(ab)₂ 단편(다코(Daco)사제, 독일 함부르크 소재)과 함께 45분간 얼음 상에서 배양하였다. 그리고 나서 세포를 PBS/10% FCS로 세정하여 분석을 행하였다. 동시에 프로피듐 아이오다이드(0.2㎍/mL, 시그마사제, 독일 디젤호펜 소재) 염색을 함으로써 세포의 생명력(viability)을 결정하였다. 첫번째 항체의 누락은 비특이적 형광을 검출하기 위한 음성 대조군으로서 기능하였다. 동위원소 컨트롤 항체의 사용을 대신하는 이러한 접근 방법은, 내피 세포에는 Fc 수용체가 없다는 이전의 관찰 결과(참조: 문헌 22)에 의해 정당화된다. 따라서, 항체의 그 Fc 부분을 통한 비특이적 결합을 배제할 수 있다.

(말초 혈액 세포에 대한 HMEC에 의한 동종 자극(allostimulation))

말초 혈액 단핵 세포(PBMC: Peripheral Blood Mononuclear Cell)를, 건강한 사람 자원자의 혈액에 헤파린(독일 마인쯔 소재 노보노르디스크(Novo Nordisk)사제)을 첨가한 것 또는 바바리안 레드 크로스(Barvarian Red Cross)로부터의 백혈구연층(buffy coat)의 각각으로부터, Ficoll hypaque(파마시아(Pharmacia)사제, 독일 프라이부르크 소재) 밀도 구배 원심 분리기를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 마련하였다. 그리고나서, 세포를, 1:1~2:1의 비로, 조사된(20Gy) HMEC에 의해, 인터루킨 2(50U/mL) 및 10% 인간 AB 혈청(시그마사제, 독일 디젠호펜 소재)의 존재 하에 7일간 자극하였다. 다른 방법으로서, PBMC로부터 CD8+ T 세포 및 자연세포독성세포(NK 세포)를, 세포 분리 키트를 사용하여 제조자의 지시 사항(MACS^TM, 밀테니 비오테크(Miltenyi Biotech)사제, 독일 베르기스크-글라드바흐 소재)에 따라, 각각 비 CD8+ 세포 및 비 NK 세포를 제거함으로써 선택하였다. 이 선택된 세포에 대한 자극은, NK 세포에 대해서는 3일간만 자극한 점을 제외하면, 전체 PBMC 배양물에 대한 자극과 마찬가지로 하였다.

(세포독성 분석)

T-세포 또는 NK-세포가 매개하는 세포 독성을, 잘 확립된 프로토콜(참조: 문헌 23)에 따라, 4h ⁵¹Cr 방사성 동위원소 분석법을 사용하여 측정하였다. 처리하지 않고 그대로 두거나 또는 F-Ara(10㎍/mL)과 함께 밤새 배양한 HMEC를 표적 세포로서 사용하여, 0.4mCi Na₂ ⁵¹CrO₄로 2시간 동안 표지하였다. 3회 세정 후, 표적 세포를 10⁴cells/mL로 조정하여 PBMC, CD8+ 또는 NK 효과자 세포와 함께, 효과자를 목표 비율에 이르기까지 줄여 가면서, 추가로 4시간 동안 더 공배양(coincubation)하였다. 상청액을 건조 신틸레이션 플레이트(scintillation plate)로 옮겨 γ-계수기(모두 칸베라 팩커드(Canberra Packard)사제, 독일 담스타트 소재)로 계수하였다. 자가(효과자) B-림프모구 세포주(B-LCL) 및 NK 민감 세포인 K562를 부가적인 대조 표적으로 하였다. 특이적 용해의 백분율을 다음 식으로 계산하였다: [(실험적 방출-자발적 방출)/(최대 방출-자발적 방출)]×100. 모든 실험에서 자발적 방출은 항상 20% 미만이었다.

(효소면역측정법(ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent assay))

동종 효과자 T 세포(후술)의 상청액 중의, 인터루킨 4(IL-4, T_c2 반응) 및 인터페론γ(IFN-γ, T_c1 반응), IL-1, 및 IL-10을 검출하기 위한 ELISA를, 제조자의 키트의 지시 사항(R&D 시스템사제, 미국 미네소타주 미니애폴리스 소재)에 정확하게 따라 수행하였다.

(통계적 분석)

실험값 간의 차이의 유의성은 Student's t-test 방법에 의해 산정하였다.

실시예 1: F-Ara는 인간 미세혈관 내피 세포(HMEC)에서 세포자멸사(세포예정사)를 유도한다.

배양된 인간 내피 세포(HMEC)의 생명력을 측정하기 위하여, HMEC를, 약리학적으로 적절한, 낮추어가는 농도의(10㎍/mL∼0.1㎍/mL), 플루다라빈의 대사된 형태인 2-플루오로아데닌-9-베타-D-아라비노퓨라노시드와 함께 배양하였다. 표적 세포에서의 활성(세포독성) 플루다라빈 트리포스페이트의 세포내 레벨의 중간값은 20μM으로서, 농도 5.8㎍/mL에 해당된다(메닥 쉐링(medac SCHERING)사, 제조자의 지시 사항). 48시간 배양 후, HMEC에 대하여, 흐름 세포 측정에서 프로피듐 아이오다이드(PI: Propidium Iodide)-음성 세포의 측면 산란 영상의 세포 입도(cellular granularity)를 검출하는 방법 및 DAPI로 염색된 세포를 현미경 분석하는 방법의 각각을 사용하여 세포자멸사 분석을 행하였다. 어느 분석 시스템을 사용했든지, 도 1A 및 B에 나타나는 바와 같이, F-Ara가 10㎍/mL∼5㎍/mL의 농도에서 HMEC의 세포자멸사를 유도함이 명백한 반면, 1㎍/mL에서는 더 이상 유효하지 않았다. F-Ara의 세포 독성의 임계치는 2㎍/mL~3㎍/mL에 있었다. F-Ara에 의한 세포자멸사는 24시간 배양 후에 이미 그 정도는 약하지만 검출할 수 있었다(데이터는 생략함).

실시예 2: 데피브로티드는 F-Ara에 의해 유도되는 세포자멸사로부터 HMEC를 보호한다.

여러 농도(100㎍/mL~0.1㎍/mL)의 데피브로티드의 존재 또는 부재 하에, HMEC를 F-Ara로 처리하거나 또는 처리하지 않고, 48시간 후 도 1A에 나타내는 바와 같이 SSC 영상의 흐름 세포 측정 분석법으로 세포예정사를 측정하였다.

도 2A(중앙의 등고선도)로부터 두번째 대조군인 데피브로티드 단독의 경우는 내피 세포의 생명력에 영향을 미치지 못함을 알 수 있다.

도 2A(우측 등고선도)는 F-Ara의 세포자멸사 효과를 나타내나, 이에 반해 도 2b는 데피브로티드에 의한, F-Ara에 의해 유도되는 세포사의 투여량 의존적 보호를 나타낸다. 시험관내에서, F-Ara와 데피브로티드가 비특이적인 인공적 세포외 작용을 하는 것을 배제하기 위하여, HMEC를 미리 데피브로티드로 1시간 동안 처리하고 이어서 3회 세정 후 F-Ara와 함께 48시간 동안 더 배양하였으며 그 역 또한 같다. 도 2C(우측 등고선도)는 HMEC의 1시간 동안의 전처리가 세포를 F-Ara에 의해 유도되는 세포자멸사로부터 보호하기에 충분했음을 나타낸다. 마찬가지로 HMEC를 F-Ara로 1시간 동안 전처리하고(도 2C, 좌측 등고선도) 이어서 데피브로티드와 함께 배양하는 것으로는 내피 세포예정사가 일어나지 않았다.

실시예 3: 서로 다른 세포주에 대한 F-Ara의 효과, 데피브로티드의 보호 효과

피부, 위장관(GIT: Gastrointestinal Tract) 및 가장 바람직하게 폐는 GvHD의 1차 표적에 속한다. 따라서, 이들 기관으로부터 얻은 세포주에 대한 F-Ara의 영향을 시험할 타당성이 있었다. 각질 형성 세포(HaCaT), GIT(SW 480), 폐포(A549)로부터의 세포, 일차 기관지 상피 세포, 및 기관지 상피(BEAS-2B) 세포주를, 도 1 및 2에 나타난 바와 같이, F-Ara(10㎍/mL)와 함께 배양하고, 처리 48시간 후에, 흐름 세포 측정 세포자멸사 분석법으로 분석하였다. 도 3A에 나타난 결과를 요약하면, 내장 및 기관지 상피 세포는 F-Ara의 세포자멸성 자극에 대해 저항성을 갖는 것으로 나타난 반면, 각질 형성 세포(HaCaT) 및 폐포 상피 세포(A549)는, SSC 영상의 흐름 세포 측정법으로 결정된 바와 같이(HaCaT: 34.0[±1.0] % 자멸 세포, A549: 42.9[±26.7]%), 세포자멸사의 징후를 보였다. 다시, 데피브로티드(100㎍/mL)의 보호 능력을 측정하였다. F-Ara 및 데피브로티드로 함께 처리한 후, HaCaT(4.3[±3.0] %) 및 A549(5.4[±2.9] %) 세포는 세포예정사로부터 완전히 보호되었다(도 3A에 삽입된 막대 그래프). 이러한 결과를 확인하기 위하여, HaCaT(도 3B, 좌측 열) 및 A549 세포(도 3B, 우측 열)에 대하여 DAPI-염색 세포자멸사 분석을 행하였다. 내피 세포에서 나타난 바와 같이, 데피브로티드 단독으로는 세포주에서도 자멸 세포의 수에 영향을 미치지 않았다(데이터 생략).

실시예 4: 데피브로티드는 F-Ara의 항백혈병 효과 및 항-PBMC 효과를 간섭하지 않는다.

내피 및 상피 세포를 F-Ara에 의해 유도되는 세포자멸사로부터 보호하는 바람직한 보호 능력 다음으로는, 데피브로티드가 F-Ara의 항 백혈병적 특성에 영향을 미치는지 여부를 연구하는 것이 중요하다. 이 의문을 해결하기 위하여, 모세포 양이 70%인 일차 말초 혈액 유래 급성 골수성 백혈병(AML) 세포로부터 얻은 1차 말초 혈액을 해동하여 24시간 동안 배양하고, 이어서 데피브로티드의 존재 또는 부재 하에 F-Ara로 추가로 48시간 동안 처리하였다. 도 4A는 이미 거의 50%의 세포가 괴사로 저절로 사멸했음을 나타내고 있다. 그러나, F-Ara에 의해 유도된 세포사는 세포의 80%에 이른다. 데피브로티드는, 그 내피 및 상피 세포에 대한 효과에 반해, F-Ara가 매개하는 독성으로부터 AML 세포를 보호할 수 없었다. 도 4A는 세포의 % 자멸 세포가 아닌 % 생명력을 나타내고 있는데, 이는 F-Ara가 AML 세포에서 세포자멸사 보다는 직접적으로 괴사를 유도하였기 때문이다. 이는 이미 24시간 배양 후와 같이 조기에 관찰할 수 있었다. 또한 도 4A는 데피브로티드가 F-Ara의 백혈병 세포에 대한 바람직한 독성을 간섭하지 않는다는 것을 나타낸다. 다음으로 본 발명자들은 데피브로티드가 F-Ara의 정상 조혈 세포에 대한 효과를 조절할 수 있는지에 대한 의문을 가지고, 정상 인간 공혈자로부터의 PBMC로 세포자멸사 분석(SSC-영상)을 행하였다. 도 4B에 나타난 대표 실험으로부터 알 수 있듯이, F-Ara는, 처리하지 않은 대조군에서의 5.1%의 자멸 세포에 비해, 40.1%의 세포의 자멸사를 유도하였다. 즉, 데피브로티드는 PBMC에 대한 F-Ara의 세포자멸 활성(43.1% 자멸 세포)을 간섭하지 않았는데, 이러한 사실은 F-Ara의 면역억제 특성이 데피브로티드와 함께 처리함으로써 훼손되지 않음을 시사하는 것이다.

실시예 5: F-Ara는 데피브로티드의 길항 효과에 의해 HMEC 상의 세포간 부착 분자 1(ICAM-1)을 상향 조절한다.

전 이식 조건화가 부착 분자 유도를 통하여 내피 세포를 손상시킬 뿐만 아니라 친염증적 활성화를 일어나게 하기도 한다는 전술한 관찰 결과(참조: 문헌 15)를 기초로 하여, 본 발명자들은 F-Ara의 영향 하에서의 ICAM-1의 발현을 연구하였다. 도 5A 및 B에 나타난 바와 같이, 흐름 세포 측정 분석으로부터, F-Ara는 24시간 배양 후에 HMEC 상의 발현을 세포자멸사 유도에서 관찰된 것과 유사한 투여량 의존적 방식으로 유의하게 증가시킴이 입증되었다. F-Ara의 농도를 1㎍/mL까지 낮추어도 ICAM-1를 유도하는 효과가 있었다. 본 발명자들은 다음으로 데피브로티드가 이러한 실험 환경 하에서 F-Ara의 길항제로도 작용하는지에 대한 의문을 가졌다. HMEC를 F-Ara로 소정의 처리를 하고, 낮추어가는 농도의 데피브로티드의 존재 하 또는 부재 하에 배양하였다. 도 5C는, 데피브로티드가 F-Ara가 유도한 ICAM-1 발현을, 100㎍/mL 및 10㎍/mL의 농도에서 실제로 길항함을 보여주는 3개의 독립적 실험을 요약하여 나타내고 있다. 데피브로티드 단독으로는 내피 세포를 활성화시키지 않고, ICAM-1 발현이 모든 실험 농도에서 변하지 않은 채로 있었다(데이터 생략)는 사실에 주목해야 한다.

표적 세포의 친염증적 활성화는 종종 주 조직적합항원(MHC) 클래스 I 및 II의 발현 증가와 연관이 있으므로, 본 발명자들은 24시간 동안 여러 농도의 F-Ara와 함께 배양한 후 이들 항원에 대한 흐름 세포 측정 분석을 더 행하였다. 잘 알려진 면역 억제 특성에도 불구하고, F-Ara는 놀랍게도 HMEC 상에서 MHC 클래스 I 분자를 투여량 의존적으로 유도하였으나(10㎍/mL의 농도에서, 평균 형광 강도의 1.5배 유도, 5㎍/mL의 농도에서 1.3배 유도), MHC 클래스 II는 변하지 않은 채로 있었다(데이터 생략).

실시예 6: F-Ara는 동종 말초 혈액 세포에 대한 내피 세포의 항원성을 증가시킴; 데피브로티드에 의한 보호

F-Ara에 의한 HMEC 상에서의 MHC 클래스 I 분자의 유도로부터 고무되어, 본 발명자들은 F-Ara가 동종 세포 독성 반응을 자극하는 HMEC의 능력도 증진시키는지를 연구하였다. 효과자인 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)를, 건강한 인간 자원자의 헤파린 첨가 혈액 또는 백혈구연층 조직 표본의 각각으로부터 얻어, 조사된(20Gy) HMEC로, 50U/mL 인터루킨 2(IL-2) 존재 하에 7일간 자극하고, 이어서, 표준 ⁵¹Cr 방출 분석(상세 내용은 "재료 및 방법" 란을 참조)을 행하였다. 1일차에 표적인 프레시 HMEC를, 자극하지 않은 상태로 두거나, 또는 항 MHC 클래스 I 중화 항체(w6/32)의 존재 또는 부재 하에 F-Ara(10㎍/mL)와 함께 배양하였다. 자가 효과자 엡스타인 바르(Epstein-Barr) 바이러스로, B-림프모구 세포주(B-LCL) 및 K562 세포를, 전형적인 자연세포독성세포(NK 세포) 표적으로 형질전환시켜 이를 대조군으로 하였다. 도 6A는 F-Ara가 실험한 모든 E/T 비에서 동종 PBMC에 대한 HMEC의 항원성을 실제로 증가시킨 것을 나타낸다. K562 및 자가 효과자 B-LCL의 특이적 용해가 일어나지 않은 것은, MHC로 제한된 세포독성 T 림프구(CTL)가 개입한 것을 입증한다. 또한, 처리하지 않은 HMEC 또는 F-Ara로 처리한 HMEC의 용해는, 이들 세포를 항 MHC 클래스 I 항체 (w6/32)와 함께 공배양한 후 거의 완전히 차단될 수 있었다(도 6A, * ). CD8+ CTL이 항 내피 세포 독성 활성의 원인임을 더 확인하기 위해, PBMC로부터 CD8+ 및 CD4+ T 세포를, MACS^TM 비드 키트를 사용하여 자력 비드 분리함으로써 선택하였다(각각 비 CD8 및 비 CD4 제거 PBML). 제조물의 순도는 모든 경우에 있어 93% 이상이었으며, 다른 세포 집단이 전혀 존재하지 않았다(보이지 않음). 분리된 T 세포를, HMEC 및 IL-2로, 선택되지 않은 PBMC에 대한 상술한 방법과 똑같이 자극하였다. 도 6B에 나타내는 바와 같이, F-Ara로 처리된 HMEC의 CD8+ CTL에 의한 용해 정도도 역시 대조군 HMEC의 경우보다 유의하게 높았다. 나아가, 표적 HMEC를 F-Ara 및 데피브로티드(F-Ara+D)로 전처리함으로써 특이적 용해가 심지어 대조군 레벨 이하로 하향 조절된 바, 이는 데피브로티드 또한 동종 효과자 림프구의 용해로부터 내피 세포를 보호한다는 것을 시사해 준다. HMEC로 자극된 CD4+ T 세포는 이 실험 환경 하에서 어떠한 세포 독성 활성의 징후도 나타내지 않았다(데이터 생략). F-Ara+D로 처리된 HMEC에 대한 F-Ara의 흐름 세포 측정 분석으로부터, 데피브로티드에 의해 MHC 클래스 I이 유의하게 하향 조절됨이 밝혀진 바, 이는 MHC 클래스 I 발현이 F-Ara에 의해 유도된 세포 독성 반응을 조절함에 있어 결정적 요소로 됨을 시사하는 것이다(데이터 생략).

실시예 7: 항 내피 CTL은 T_c1-유사 형질을 보인다.

항 내피 CTL의 성질에 대한 정보를 얻기 위하여, PBMC 및 CD8+ T 세포를 상술한 바와 같이 자극하고, 상청액을 수집하여 ELISA 분석법으로 인터페론 감마(IFN-γ) 및 인터루킨 4(IL-4)의 측정을 행하였다. 표 1에 나타난 바와 같이, IL-4의 생성없이 IFN-γ만이 발현된 것이 말해주듯이, HMEC 및 IL-2를 사용한 자극에 의해 Tc1 유사 T 세포의 과성장이 일어났다.

실시예 8: F-Ara는 동종 NK 세포에 의한 HMEC의 용해를 하향 조정한다.

또다른 흥미있는 질문은, F-Ara에 의해 유도되는, MHC 클래스 I의 발현에 대한 조정이, 내피 세포에 대한 자연세포독성세포(NK 세포)의 세포 용해 반응에 어떻게 영향을 미치는가라는 것이었다. 건강한 개인으로부터의 PBMC로부터 NK 세포를 음성 선택하고(비 NK 세포를 제거함), 도 6B의 실험에서 기술한 바와 같이, 조사된 HMEC로 IL-2 존재하에 4일간 자극하였다. 4일차에, 표적 세포인 HMEC 세포를 처리하지 않거나 또는 F-Ara(10㎍/mL)와 함께 24시간 배양하여, 효과자인 자극된 NK 세포로 표준 ⁵¹Cr 방출 분석을 행하였다. 도 7은 F-Ara가 NK 세포에 대한 HMEC의 동종성을 하향 조절하였음을 입증한다. NK 세포 활성의 양성 대조군인 MHC 클래스 I 음성 K 562 세포의 용해를 관찰할 수 있었다(도 7, * ). F-Ara로 자극된 HMEC에 대한, 항 MHC 클래스 I 항체 w6/32를 사용한 전처리는, F-Ara의 효과를 완전히 없앴으며 거의 100%의 HMEC가 특이적 용해되게 한 바(도 7), 이는 HMEC 표면 상의 MHC 클래스 I 역시 NK 세포의 세포 독성 반응의 조절에 결정적인 스위치라는 것을 시사하는 것이다. MHC 클래스 I 분자의 높은 레벨의 발현에 의해 음성적으로 조절되는 것으로 알려져 있는 세포독성세포 억제 수용체(killer cell inhibitory receptor)의 역할(참조: 문헌 24)이 NK 세포의 세포 용해 반응을 감소시키는 원인일 수 있다.

토의(Discussion)

지금까지 얻어진 경감된 강도의 조건화(RIC) 요법을 포함하는 플루다라빈을 사용한 임상 결과는, 면역 재구성에 영향을 미치는 일 없이 조건화 관련 독성의 명백한 하향 조절을 보여 주었다(참조: 문헌 25). RIC를 받는 환자에서의 급성 GvHD의 발생은 전통적 조건화 요법을 받는 환자에서의 그것에 비해 필적할 만하거나 심지어는 더 낮았다(참조: 문헌 26). 그러나, 똑같이 가혹하거나 오히려 증가된, 예를 들면 뼈 괴사(참조: 문헌 27), 폐 합병증(참조: 문헌 28), 및 더 많은 경우의 만성 GvHD(참조: 문헌 29)와 같은 후유 효과에 대한 보고가 발생하였다. 문헌 상에 잘 입증된 면역억제 특성에도 불구하고, 플루다라빈은, 본 연구로부터, 내피 및 상피 세포를 활성화 및 손상시키는 것으로 드러났다. 뼈 괴사는 내피 기능 부전을 말해 주는 것이며 플루다라빈이 폐포 상피 세포에 대해 독성인 것으로 나타나므로, 이러한 결과는, 부분적으로라도, 상술한 원하지 않은 임상적 부작용을 설명해 준다고 할 수 있다. 기관지 상피 세포는 이 면역억제제에 대한 반응에서 세포자멸사를 일으키지 않았으므로, 플루다라빈이 페 세포에 미치는 해로운 효과가 구획 특이적으로 나타나는 점은 주목할 만 하다. 각질 형성 세포주(HaCaT) 또한 플루다라빈에 대해 민감하였다는 사실은 그 세포도 또한 SCT 후의 피부 질환에 연관되어 있을 것이라는 점을 시사한다. 후기 합병증의 발병 기전이 다양한 인자로 되어 있고, 또한 SCT 환자의 연령 증가 및 말초 줄기 세포의 사용에 의해서 영향을 받을 수도 있으므로, 폐 및 피부 합병증의 임상 분석에 있어서 추가적인 평가가 필요하다.

플루다라빈은 많은 전 이식 프로토콜에서 이온화 방사와 결합하여 사용되므로, 이들 두 화합물이 내피 세포에 영향을 미침에 있어 서로 협력하는지를 테스트하는 것이 중요했다. 흥미롭게도, 본 발명자들은 방사에 의해 유도된 세포사가 플루다라빈에 의해 증가되는 것을 관찰할 수 없었고, 그 역도 마찬가지였다(데이터 생략). 이는 자멸사 신호가 내피 세포로 어떻게 전달되는가에 대하여 특이적인(specific) 메커니즘을 시사한다.

플루다라빈이 어떻게 내피 및 상피 세포에서 세포자멸사를 유도하는가에 관한 정확한 메커니즘은 여전히 밝혀지지 않은 채로 남아 있다. 퓨린 유사체인 플루다라빈은, DNA로 통합되어, 전에 보고된 바와 같이 유전자 결손이 일어나게 하는 돌연 변이를 유발한다(참조: 문헌 30). 플루다라빈은 세포자멸사 카스파제 경로(apoptosis caspase pathway)에 대한 방아쇠작용을 함에 있어, 시토크롬 c 및 세포자멸사 단백질 활성화 인자-1(APAF-1: Apoptosis Protein-Activating Factor-1)과 협동할 수 있다(참조: 문헌 31).

플루다라빈은 CD8+ T 세포의 내피 세포 표적의 동종성을 증가시킨다. 이와 대조적으로, 플루다라빈은 동종 NK 세포에 의한 내피 용해를 유의한 레벨으로 하향 조절한다. 클래스 I의 차단으로 CTL 용해를 완전히 없앴고, NK 세포에 의한 용해는 대폭 상향 조절되었으므로, MHC 클래스 I 발현은 이들 면역 반응 중 어느 것의 조절에도 결정적인 것으로 보인다. 플루다라빈의 이러한 상반되는 효과는, 플루다라빈이 전통적 조건화 요법보다 더 적은 급성 및 동등 또는 그 이상의 만성 독성을 나타낸다는 임상 결과와 함께 고려할 때, NK 세포 및 CTL은 GvHD 병태생리학의 서로 다른 단계에서 유효할지도 모른다는, 즉, NK 세포는 초기에 1차적으로 작용하고(플루다라빈에 의해 억제되는), 이식 후의 후기 단계(플루다라빈에 의해 증진되는)에서는 CTL이 작용할 것이라는 추측을 일으킨다.

항 내피 CTL의 성질에 관하여, 이들 CTL이 내피 특이적인가 또는 단순히 동종 특이적인가는 흥미로운 의문이다. 내피 특이적 효과자 림프구의 존재에 대해서는 전술하였다(참조: 문헌 32). 본 발명자들에 의해 T_c1 유사 형질을 보이는 것으로 특징지워진 CTL과는 대조적으로, 보고되어 있는 CTL 클론의 다수에 있어서는 IFN-γ가 거의 나타나지 않으며, 세포 용해 활성을 증진시킬지도 모르는 휴지기에 CD40 리간드가 비정상적으로 발현된다(참조: 문헌 33). 그러나 이러한 데이터에 의해 비조혈성 표적에 대한 특이성을 지닌 다른 동종 CTL의 존재가 배제되는 것은 아니다.

데피브로티드는 SCT 후의 주요한 간 합병증의 하나인 정맥폐쇄성 질환의 치료에 성공적으로 사용되는 내성이 우수한 의약이다(참조: 문헌 34). 또한, 재발 혈전저혈소판혈증자색반병 뿐만 아니라 허혈증/재관류 손상 및 죽경화증의 치료에 효과를 나타낸다는 전임상 및 임상 보고의 숫자가 증가하고 있다(참조: 문헌 35-37). 데피브로티드는 추가적인 대사를 요하지 않고 내피 세포에 직접 작용하는 것으로 알려져 있으며(참조: 문헌 38) 따라서 본 발명자들의 시험관내 연구에 사용될 수 있었다. 데피브로티드는 플루다라빈이 매개하는 세포자멸사로부터, 내피 및 상피 세포를 완벽하게 보호하였다. 데피브로티드가 플루다라빈을 길항하는 정확한 보호 메커니즘을 밝히기 위해서는 추가적인 실험이 필요하나, 데피브로티드가 플루다라빈의 DNA로의 통합(integration)의 저해 또는 전술한 카스파아제 활성화에 있어서 어떤 역할을 하리라고 상상해 볼 수 있다. 그 항 세포자멸 효과 이외에도, 데피브로티드는 MHC 클래스 I 발현을 조절함으로써, 항 내피 CTL 반응을 하향 조절할 수 있었다. 이와 대조적으로, AML 세포의 보호를 나타내지 않은 것으로부터 알 수 있듯이, 데피브로티드는 플루다라빈의 바람직한 항 백혈병적 효과에 대해서는 영향을 미치지 않았다. 다른 중요한 결과는, 데피브로티드는 PBMC의 플루다라빈에 의해 매개되는 세포자멸사를 차단하지 못했다는 것이다. 이는 조건화에 필수인 플루다라빈의 면역 억제 효과가 데피브로티드를 함께 처리함에 의해서 영향받지 않는다는 것을 시사한다.

데피브로티드가 방사 유도 내피 세포 손상에 대해 보호적이지 못했다는 것은 주목할 만 하며, 이는 데피브로티드의 효과가 플루다라빈 매개 세포 변화에 특이적이라는 것을 시사하는 것이다(데이터 생략).

이러한 연구 결과에 기초하여, 부작용이 거의 없는 점(참조: 문헌 39)을 고려할 때, 데피브로티드는 SCT에 앞서 조건화를 행할때, 특히 VOD의 리스크를 갖는 환자들에 있어서 플루다라빈과 병용되는 좋은 후보 물질이라는 결론을 내릴 수 있다. 추가적인 조건화 물질에 대한 내피 보호를 분석하는 연구는, 데피브로티드가 광범위한 보호제로 사용될 수 있는지의 여부를 밝히는 데 도움이 될 것이다.

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Claims (28)

1. 면역억제제에 의한 치료를 받는 환자의 치료용 약제의 제조를 위한, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
2. 면역억제제의 영향으로부터 내피 및/또는 상피 세포를 보호하는 약제의 제조를 위한, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
3. 면역억제제의 투여에 의해 유도되는 세포자멸사 및/또는 활성화로부터 내피 및/또는 상피 세포를 보호하는 약제의 제조를 위한, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
4. 제1항 내지 제3항에 있어서,

   상기 면역억제제가 뉴클레오시드인, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 면역억제제가 플루다라빈(fludarabine), 시클로포스파미드(cyclophosphomide), 비스클로로에틸니트로스유레아(BCNU:bischloroethylnitrosurea), 및 멜팔란(melphalan)을 포함하는 군으로부터 선택되는 것인, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 면역억제제가 플루다라빈인, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드가 데피브로티드(defibrotide)인, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,

   상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 투여하는 단계는, 환자에 대한 상기 면역억제제의 투여의 전 또는 후에, 공동적으로(concomitantly), 동시적으로(simultaneously) 행하는, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
9. 제8항에 있어서,

   상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 투여하는 단계는, 환자에 대한 상기 면역억제제의 투여 후에 행하는, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
10. 제9항에 있어서,

    상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 투여하는 단계와 환자에게 상기 면역억제제를 투여하는 단계 사이의 시간 지연이 약 1시간~약 2주, 바람직하게는 약 2일~약 7일인, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
11. 제8항에 있어서,

    상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 투여하는 단계는, 환자에 대한 상기 면역억제제의 투여 단계 전에 행하는, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
12. 제11항에 있어서,

    상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 투여하는 단계와 환자에게 상기 면역억제제를 투여하는 단계 사이의 시간차가 약 1시간~약 2주, 바람직하게는 약 2시간~약 2일인, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

    투여되는 데피브로티드의 용량이, 약 0.1㎍/mL∼약 100㎍/mL의 혈중 레벨, 바람직하게는 약 10㎍/mL∼약 100㎍/mL의 혈중 레벨에 이르도록 선택되는, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
14. 제13항에 있어서,

    투여되는 데피브로티드의 용량이, 약 10㎍/mL의 혈중 레벨에 이르도록 선택되는, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,

    투여되는 데피브로티드의 용량이, 환자 체중 1kg 당 약 0.01mg∼약 100mg, 바람직하게는 환자 체중 1kg 당 약 0.1mg∼약 20mg인, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
16. 제15항에 있어서,

    투여되는 데피브로티드의 용량이, 환자 체중 1kg 당 약 1mg∼약 15mg, 바람직하게는 환자 체중 1kg 당 약 12mg인, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
17. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 활성화가 ICAM-1의 증가된 발현을 포함하는, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
18. 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 면역억제제에 의한 치료는 줄기 세포(stem cell) 이식 중에 행하는, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
19. 제18항에 있어서,

    상기 줄기 세포 이식이 동종 줄기 세포 이식인, 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드의 용도.
20. 치료적 유효량의 면역억제제 및 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는 제약 조성물.
21. 제20항에 있어서,

    하나는 상기 면역억제제를 포함하고, 다른 하나는 상기 보호 올리고데옥시리보뉴클레오티드를 포함하는, 두 개의 서로 다른 개별적으로 투여가능한 제형(formulation)으로 구성되는, 제약 조성물.
22. 제20항에 있어서,

    동시의, 개별적 또는 순차적으로 사용하게 조합된 제제인, 제약 조성물.
23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 면역억제제가 뉴클레오시드인, 제약 조성물.
24. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 면역억제제가 플루다라빈, 시클로포스파미드, 비스클로로에틸니트로스유레아(BCNU), 및 멜팔란을 포함하는 군으로부터 선택되는, 제약 조성물.
25. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 면역억제제가 플루다라빈인, 제약 조성물.
26. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,

    상기 보호 올리고테옥시리보뉴클레오티드가 데피브로티드인, 제약 조성물.
27. 제20항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,

    통상의 부형제 및/또는 보조제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 제약 조성물.
28. 제20항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서,

    제약 조성물이 정맥내 주사 가능한 것을 특징으로 하는, 제약 조성물.