KR20050014390A - 인공장기 제조를 위한 생분해성 콜라겐 필름 및 그의제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 인공장기 제조용 생분해성 콜라겐 필름 및 그의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 1.0% 미만의 콜라겐으로 콜라겐 스폰지를 제조하는 단계; 상기 콜라겐 스폰지를 글루코사미노글리칸 (glucosaminoglycan, GAG) 용액에 담가 콜라겐 필름을 형성하는 단계; 및 상기 콜라겐 필름을 가교결합시키는 단계에 의해 제조되는 생분해성 콜라겐 필름 및 그의 제조방법에 관한 것이다. 본 발명의 생분해성 콜라겐 필름은 저농도의 콜라겐 용액을 사용하여 물성을 향상시켰으며 천연 고분자만을 이용하여 이식수술시 우려되는 면역반응 (immune response)은 줄이고 생착률은 높여 다양한 인공장기의 제조를 위한 기질로 유용하게 사용될 수 있다.

Description

인공장기 제조를 위한 생분해성 콜라겐 필름 및 그의 제조방법{BIODEGRADABLE COLLAGEN FILM USED FOR ARTIFICIAL ORGANS AND METHOD FOR PREPARING SAME}

본 발명은 생분해성 고분자인 콜라겐과 글루코사미노글리칸을 가교결합시켜 필름 형태로 제조한 인공장기 제조용 생분해성 콜라겐 필름 및 그의 제조방법에 관한 것이다.

조직공학 (tissue engineering)이란 세포를 생체적합한 기질에 3차원적으로 배양하여 세포-기질 복합체를 제조하고 이를 이용하여 생체조직 및 장기를 재생하는 학문이다. 조직공학의 기본적인 원리는, 먼저 환자의 몸에서 필요한 조직을 약간 채취하고 그 조직편으로부터 세포를 분리한 다음 배양을 통하여 분리된 세포를 필요한 양만큼 증식시키고 여러 형태의 생분해성 고분자 기질에 심어 일정기간 체외 배양한 후 다시 상기 세포-기질 복합체를 인체 내에 이식하는 것이다. 이식 후 세포들은 신생 혈관이 형성될 때까지는 체액의 확산에 의해 산소와 영양분을 공급받다가 인체 내에서 혈관이 자라 들어와 혈액의 공급이 이루어지면 세포들이 증식 분화하여 새로운 조직 및 장기를 형성하고 고분자 기질은 분해되어 없어지게 된다.

조직공학은 인공피부, 인공뼈, 인공연골, 인공각막, 인공혈관, 인공근육, 인공건 등 인체의 모든 장기의 재생에 적용되고 있으며, 치료 효과를 높이기 위해서는 먼저 생체조직과 유사한 생분해성 고분자 기질을 제조하는 것이 매우 중요하다.

조직공학 기술을 이용하여 상품화된 최초의 제품은 인공피부로서, 예를 들면 INTEGRA^TM(Integra LifeScience사)는 콜라겐 스폰지에 실리콘 막이 붙어있는 형태로서 진피 재생용으로 개발되었고, Apligraf^TM(Organogenesis사)는 섬유아세포와 각질세포를 포함하는 제품으로서 궤양 치료용으로 미국식품의약안정청 (FDA)으로부터 허가를 받았다. 미국의 Ortec사의 CCS^?는 섬유아세포와 각질세포가 배양되어 있는 스폰지형 콜라겐 기질을 이용한 인공피부로 사용되고 있다.

화상과 같은 넓은 부위의 상처의 경우 진피 이식 후 생착이 되면 자가표피를 이식하는 것이 가장 바람직한 치료방법이다. 그러나, 자가표피 이식은 자가조직의 부족과 새로운 환부를 유발하기 때문에, 1980년대부터 배양된 자가상피층의 이용에 관한 연구가 활발히 진행되어 왔다. 이와 같이 배양된 상피세포를 이용하는 치료방법은 현재 피부 외에 비뇨기와 각막의 치료에도 이용되고 있다. 그러나, 배양된 상피세포층만을 이식할 경우 찢어지기 쉽기 때문에 환부에 옮겨 이식하는 시술이 어렵고 생착률이 낮은 단점이 있다. 따라서, 이러한 단점을 보완하기 위해 폴리우레탄 시트, 히알루론산 막, 콜라겐 필름 등을 이용하고자 하는 연구들이 최근에 활발히 진행중이다.

포넥 등 (Ponec, M. et al.,Wound Repair and Regeneration7: 214-225, 1999)은 각질형성세포를 다공성 폴리카보네이트 또는 폴리에스터 막 위에 배양하여각질층을 재구성하고 배양된 표피층의 회수시 효소 처리시간을 단축시켜 생착률을 높였고, 웬트워쓰 등(Wentworth, B. M. et al.,Burns24: 7-17, 1998)은 HydroDerm^TM이라는 폴리우레탄 막 위에 각질형성세포를 배양하여 표피층을 재구성하였으며, 발렌시안 등 (Valentian, Z. et al.,J. Biomed Mater Res. 40: 187-194, 1998; Giampaolo, G. et al.,Biomaterials21: 2183-2191, 2000)은 laserskin^TM이라는 다공성 히알루론산 막 위에 각질형성세포를 배양하여 표피층을 재구성하였다. 그리고, 호르쉬 등 (Horch et al.,Tissue Engineering6(1): 53-67, 2000)은 TissuFascie^TM이라는 콜라겐 필름 위에 각질형성세포를 단층으로 배양하였다. 또한, 대한민국 특허공개번호 제1992-336호에는 천공되어 있는 인공합성막에 각질세포를 배양하는 방법이 개시되어 있다.

상기와 같이 생분해성 고분자 기질에 세포를 배양하고 이로부터 얻은 세포-기질 복합체를 그대로 이식하는 경우에는 생체적합성이 매우 중요하다. 따라서, 상기 여러 재료들 중 생체적합성이 가장 우수한 콜라겐을 이용하여 필름 형태로 제조하고자 하는 연구들이 활발히 진행되고 있다.

틸러 등 (Tiller, J. C. et al.,Biotechnol Bioeng. 73: 246-252, 2001)은 콜라겐을 아세틸화 (acetylation) 또는 석씨닐화 (succinylation)시킨 뒤 0.25% 콜라겐 용액을 건조시켜 제조한 콜라겐 필름에 폴리에틸렌글리콜 (polyethyleneglycol, PEG)을 처리하여 유연성 (flexibility)과 항균성을 높였고, 야마구치 등 (Yamauchi, K. et al.,Biomaterials22: 855-863, 2001)은 콜라겐 분자사이에 SH기를 부착시킨 뒤, 0.3 내지 0.5%의 콜라겐 용액을 건조시켜 필름을 제조하여 효소 (콜라게나아제)에 대한 분해도를 향상시켰다. 스콧 (Scott, R.,Urological Research12: 295-299, 1984)은 0.3% 콜라겐 용액에 0.25% 글리세롤을 첨가한 뒤 건조하여 콜라겐 필름을 제조하였다. 대한민국 특허공개번호 제2003-10636호에는 0.7 내지 2% 콜라겐을 겔화시킨 뒤 건조하거나 스폰지 제조 후 고압으로 압축하여 콜라겐 필름을 제조한 뒤 다공성 기질에 부착시켰다.

상기와 같이 많은 연구들에서 콜라겐을 이용하여 필름 형태의 기질을 제조하는 방법이 개시되어 있으나, 이들은 모두 콜라겐의 낮은 물성으로 인해 콜라겐 분자에 폴리머를 첨가하거나 높은 농도 (2%)의 콜라겐을 이용하고 있다.

이에 본 발명자들은 이식수술시 우려되는 면역반응을 줄이고 생체조직과 좀더 유사하면서 조직친화성이 우수한 인공장기 제조용 생분해성 고분자 기질을 개발하기 위하여 예의 연구한 결과, 기존의 기질을 제조하기 위한 농도 (1 내지 2%)보다 낮은 저농도의 콜라겐 용액과 글루코사미노글리칸만을 가교결합시켜 필름 형태의 생분해성 콜라겐 기질을 제조함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 단독으로 또는 세포를 배양하여 체내에 이식될 수 있고 이식 후 면역거부 반응이 일어나지 않으며 생착율이 높은 인공장기 제조용 생분해성 콜라겐 기질을 제공하는 것이다.

도 1a는 본 발명에 따라 콜라겐 기질을 제조한 후 글루코사미노글리칸 (GAG)을 가교시켜 제조한 콜라겐 필름 (A; 0.5% Coll)과 기질 제조 전에 GAG를 혼합하여 제조한 콜라겐 필름 (B; 0.5% Coll-GAG), 및 2.0% 농도의 콜라겐 용액으로 일반적인 건조방법에 따라 제조한 콜라겐 필름 (C; 2% Coll)의 외형을 찍은 사진이고,

도 1b는 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll)의 H/E 염색 결과이고,

도 1c는 대조군으로 GAG가 함유된 스폰지를 이용하여 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll-GAG)의 H/E 염색 결과이고,

도 2는 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 위에 각질형성세포를 배양하여 현미경으로 관찰한 사진 (×200)이고,

도 3은 다양한 콜라겐 필름 위에 각질형성세포를 배양한 후 중층화를 확인하기 위하여 H/E 염색을 수행한 결과이고,

A: 0.5% Coll, B: 0.5% Coll-GAG, C: 2% Coll

도 4는 다양한 콜라겐 필름 위에 각질형성세포를 배양한 후 라미닌 분비를 확인하기 위하여 라미닌 면역화학적 염색을 수행한 결과이고,

A: 0.5% Coll, B: 0.5% Coll-GAG, C: 2% Coll

도 5는 다양한 콜라겐 필름 위에 각질형성세포를 배양한 후 타입 Ⅳ 콜라겐 분비를 확인하기 위하여 타입 Ⅳ 면역화학적 염색을 수행한 결과이고,

A: 0.5% Coll, B: 0.5% Coll-GAG, C: 2% Coll

도 6은 다양한 콜라겐 필름 위에 각질형성세포를 배양한 후 세포의 분화를 확인하기 위하여 사이토케라틴 10 (CK-10) 면역화학적 염색을 수행한 결과이고,

A: 0.5% Coll, B: 0.5% Coll-GAG, C: 2% Coll

도 7은 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll) 위에 각질형성세포를 배양한 후 줄기세포의 유무를 확인하기 위하여 Ki-67 면역화학적 염색을 수행한 결과이고,

도 8은 다양한 콜라겐 필름 위에 각질형성세포를 배양한 후 이를 동물에 이식한 결과를 나타낸 것이고,

A: 이식 1주일 후 환부의 수축을 관찰한 사진

B: 본 발명의 콜라겐 필름 (0.5% Coll) 위에 각질형성세포를 배양한 인공표피 이식 후 2주째의 조직 검사사진

C: 각질형성세포만을 배양한 배양표피만 이식 후 2주째의 조직 검사사진

도 9는 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름의 인장강도를 측정한 그래프이고,

도 10은 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름의 함수율 (swelling ratio)을 측정한 그래프이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 생분해성 고분자 기질인 콜라겐과 글루코사미노글리칸을 가교결합시켜 필름 형태로 제조한 인공장기 제조용 생분해성 콜라겐 필름 및 그의 제조방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 생분해성 콜라겐 기질은 기존에 기질로 사용되고 있는 인공합성기질 및 천연-인공기질에 비해 생분해성 천연 고분자만을 이용하여 제조되었기 때문에 이식수술시 우려되는 면역반응은 줄이고 생착율은 높였으며, 저농도의 콜라겐 용액을 사용하였음에도 기존의 콜라겐 필름에 비해 물성을 향상시킨 데에 그 특징이 있다.

본 발명의 인공장기 제조용 생분해성 콜라겐 필름은

1) 1.0 % 미만의 콜라겐 용액을 동결 건조하여 스폰지 형태의 기질을 제조하는 단계;

2) 상기 콜라겐 기질을 글루코사미노글리칸 용액에 담근 뒤 4 내지 20℃에서 24 내지 48시간 동안 건조시켜 콜라겐 필름을 형성하는 단계; 및

3) 상기 콜라겐 필름을 가교결합시키는 단계에 의해 제조될 수 있다.

단계 1)에서 사용한 콜라겐은 조직세포의 유착과 증식이 잘되며 분화된 세포의 기능이 잘 보전되고, 또한 체내에 이식된 후에도 주위 조직과 융화가 잘되며 염증반응이 없고 일정 기간이 지난 후에는 스스로 분해되어 이물질로 남지 않는다.

스폰지 형태의 콜라겐 층은 콜라겐을 1% 미만, 바람직하게는 0.5 내지 0.7% 농도로 산성용액에 용해시켜 크림형태의 용액으로 제조한 후 웰 플레이트에 도포하고 초저온 냉동고에서 완전히 냉동시킨 다음 동결건조시켜 제조한다. 상기에서 사용될 수 있는 산성용액으로는 초산 또는 염산의 수용액이 있으며, 산성용액의 농도는 0.01 내지 0.1 M이 바람직하다.

본 발명에 사용될 수 있는 콜라겐은 불용성 콜라겐과 가용성 콜라겐을 모두 포함한다. 또한, 본 발명의 콜라겐은 소와 같은 포유동물로부터 유래하거나 경골어류의 피부와 같은 해양생물로부터 유래한 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 무색소 피부를 갖는 어류, 가장 바람직하게는 가자미류, 예를 들어 서대, 문치가자미, 터봇, 브릴과 같은 어류가 이용될 수 있다.

단계 2)에서는 상기와 같이 제조된 콜라겐 스폰지를 1 내지 10 ㎎/㎖, 바람직하게는 5 내지 15 ㎎/㎖의 글루코사미노글리칸 용액에 담근 뒤 페트리 디쉬에 깔고 4 내지 20℃, 바람직하게는 4℃에서 24 내지 48시간, 바람직하게는 48시간 동안 건조시켜 콜라겐 필름을 제조한다. 건조속도가 빠르면 필름이 우그러지므로 저온에서 서서히 건조시킨다.

GAG는 콜라겐과 함께 실제 피부의 기질을 구성하는 주요 성분으로 세포가 분비하는 세포외기질 중의 하나로서 세포의 활성을 측정하는 지표가 될 수 있으며 콜라겐과 결합하여 강도 및 물성을 증가시킨다. 본 발명에 사용될 수 있는 GAG로는 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 헤파란, 헤파란 설페이트 등이 있다.

단계 3)은 단계 2)에서 제조된 콜라겐 필름을 가교결합시키는 단계이다. 가교결합은 물리적 가교결합 또는 화학적 가교결합에 의해 이루어질 수 있는데, 물리적 가교결합에는 진공 하에서의 열 건조 (105℃, 72시간) 또는 UV 조사 (4℃에서 10 W, 254 ㎚의 세기로4시간) 등에 의해 수행될 수 있고, 화학적 가교결합은 디페닐포스포릴아자이드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드 또는 카보디이마이드와의 가교결합에 의해 수행될 수 있다.

본 발명에 따라 제조된 인공장기 제조용 생분해성 콜라겐 필름은 각질형성세포 배양의 최적 환경을 제공하여 라미닌과 타입 Ⅳ 콜라겐을 분비하였으며 줄기세포가 많이 유지되어 있고 배양표피처럼 배양 후 디쉬에서 탈착시키기 위한 효소처리의 단계를 생략할 수 있는 장점을 제공한다. 또한, 본 발명의 인공장기 제조용 생분해성 콜라겐 필름은 저농도의 콜라겐 용액으로 필름을 제조하여 물성을 향상시켰으며, 생분해성 천연 재료만을 이용하였기 때문에 생체적합성이 우수하여 이식시 염증반응을 줄일 수 있다. 따라서, 본 발명의 인공장기 제조용 콜라겐 필름은 인공피부, 인공각막, 인공점막 등의 다양한 인공장기 제조를 위한 기질로 유용하게 사용될 수 있다. 또한, 상기 콜라겐 필름은 체외 독성 및 생리활성 물질의 스크리닝을 위한 검사용 킷트의 세포배양 기질로도 사용될 수 있다.

이러한 적용범위의 일례로 본 발명의 제조방법에 따라 생분해성 콜라겐 필름에 각질세포를 배양하여 인공표피층을 형성한 후 이를 누드마우스에 이식한 결과, 세포만을 배양한 표피층을 이식한 것보다 치료효과가 더 우수함을 확인하였다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 콜라겐 필름의 제조

타입 Ⅰ 콜라겐을 0.05 M 초산에 녹여 최종 농도 5 ㎎/㎖ 용액으로 제조한 후 1,500 ㎕를 12웰 플레이트에 도포하고 -85℃의 초저온 냉동고에서 12시간 이상 냉동시킨 후 -80℃의 진공 동결건조기 (SFDSM 06, 삼원)에서 36시간 동안 동결 건조시켜 콜라겐 스폰지를 제조하였다. 동결 건조된 다공성 형태의 콜라겐 스폰지를 5 내지 15 ㎎/㎖ 농도의 글루코사미노글리칸 용액에 담근 뒤 꺼내어 디쉬에 올려놓고 4℃에서 48시간 동안 건조시켜 콜라겐 필름을 제조하였다. 이와 같이 제조된 콜라겐 필름을 0.25% 글루타르알데히드 용액에 24시간 동안 담가 가교결합시킨 후 7일간 3차 증류수로 세척하였다 (0.5% Coll; 실험군).

비교군으로 0.5% 콜라겐 용액에 GAG를 미리 첨가한 혼합용액을 디쉬 위에 약 5 ㎖ 도포한 후 실온에서 3일간 건조하여 콜라겐 필름 (0.5% Coll-GAG)을 제조하였고, 대조군으로 2% 콜라겐 용액을 이용하여 일반적인 건조방법에 따라 제조된 콜라겐 필름 (KOKEN, Japan)을 사용하였다.

도 1a는 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll; A), GAG가 함유된 콜라겐 용액으로 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll-GAG; B) 및 2% 콜라겐 용액으로 제조된 콜라겐 필름 (2% Coll; C)의 외형을 찍은 사진이다. 이들의 구조적 차이점을 확인하기 위하여 필름을 각각 H/E 염색한 결과, 본 발명의 콜라겐 필름 (도 1b)은 연속적이고 규칙적인 구조를 보인 반면, 대조군 콜라겐 필름 (도 1c)은 기공이 존재하는 불연속적인 구조를 갖는 것을 확인할 수 있는데, 이 부분이도 1a의 B에서 불투명한 부위를 형성하게 된다. 0.5% 콜라겐 용액을 이용하여 일반적인 건조방법으로 필름을 제조하면 필름이 제대로 형성되지 않았다.

<실시예 2> 콜라겐 필름 위에 각질형성세포의 배양

각질형성세포의 일차배양은 효소분해법 (enzymatic degradation)에 따라 수행하였다 (E. K. Yang,Artificial Organs24: 7-17, 2000). 먼저 표피와 진피를 분리하기 위하여, 포피조직 (foreskin)을 칼슘 아세테이트 완충용액 (130 mM NaCl, 10 mM Ca acetate, 20 mM HEPES, pH 7.2)에 용해시킨 3 ㎎/㎖ (1,000 U)의 콜라게나아제 (collagenase) 용액과 PBS에 용해시킨 1 ㎎/㎖ (1.5 U)의 디스파아제 (dispase) 용액을 1:1로 혼합한 효소용액에 담가 4℃에서 16시간 동안 처리하여 표피와 진피를 분리하였다. 분리된 표피를 0.05% 트립신 (trypsin) 효소용액에 넣어 37℃에서 15분간 처리한 후 10% 우태아 혈청 (fetal bovine serum, FBS)이 첨가된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, GIBCO 12100-038) 배지로 희석한 후 원심분리하여 각질형성세포를 얻었다. 이와 같이 얻은 각질형성세포를 37℃, 5% CO₂조건의 배양기에서 무혈청배지 또는 10% 혈청이 포함된 DMEM과 F12가 3:1로 혼합된 배지로 10일간 배양하였다.

상기 실시예 1에서 제조한 콜라겐 필름 (0.5% Coll)과 대조군 필름 (0.5% Coll-GAG 및 2% Coll)을 디쉬 바닥에 놓은 뒤 각질형성세포를 5×10⁵세포/㎠의 농도로 각각의 필름 위에 접종한 후 3시간 동안 배양기에 넣어두었다. 그리고, 약 5일간 액침배양 (submerge culture)을 수행한 후 스테인레스망 위에 올려 기-액 배양 (air-liquid interface culture)을 실시하였다. 이때, 배지 내의 표피성장호르몬(epidermal growth factor; EGF)를 제거하고 약 1주일간 배양하여 중층화된 표피층을 얻었다.

도 2는 본 발명의 콜라겐 필름이 세포적합성을 가지고 있는지 확인하기 위하여 각질형성세포를 접종하여 4일간 배양한 결과이다.도 2에 나타난 바와 같이, 콜라겐 필름 위에 접종된 세포가 잘 자라있어 본 발명의 콜라겐 필름이 우수한 세포적합성을 가지고 있음을 확인하였다. 주변의 하얗고 탁한 부위는 세포가 중층화되고 있음을 나타내는 것이다.

<실시예 3> 염색

상기와 같이 제조된 본 발명의 콜라겐 필름이 세포적합성을 가지고 있는지를 확인하기 위하여 실시예 2와 같이 세포를 배양한 후 H/E (hematoxylin eosin) 염색과 면역화학적 염색 (라미닌, 타입 Ⅳ 콜라겐, 사이토케라틴-10 및 Ki-67 염색)을 수행하였다. 조직학 검사는 조직검사학 (전국임상병리교수협의회,고려의학1992)과 병리조직특수염색도감 (김주호,신광출판사1993)을 참고하여 실시하였다.

(1-1) H/E 염색

세포가 배양된 필름들을 4% 포름알데히드 (formaldehyde) 용액으로 고정한 후 알코올을 이용하여 탈수하고 자일렌으로 청명한 다음 파라핀 (paraffin)에 포매한 것을 절단하여 얻은 절편을 헤마톡실린/에오신 (hematoxlyn/eosin, H/E)으로 염색한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

그 결과,도 3에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (A) 위에 세포의 중층화가 가장 잘 이루어져 있으며, 기저층 세포의 극성도 잘 유지되고 있음을 확인할 수 있다. 이는 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름에서 배지 또는 영양성분과 같은 물질의 이동 (mass transfer)이 고농도의 콜라겐으로 제조된 것 (C)보다 잘 이루어지고 있음을 나타내는 것이다. 또한, 필름의 표면구조가 불연속적이고 불규칙적이면 (B) 기저 세포층의 형성이 제대로 이루어지지 않음을 알 수 있다.

(1-2) 라미닌 (laminin) 염색

포르말린으로 고정된 파라핀 포매조직을 4 ㎛ 두께의 조직절편으로 만든 다음 폴리-L-라이신 (poly-L-Lysin; Sigma, St Louis)이 코팅된 슬라이드에 부착한 후 건조시켰다. 조직절편을 자일렌으로 탈파라핀 (deparaffinization)한 후 100, 95, 90, 85 및 70% 알코올로 각각 5분간 처리하여 증류수로 함수시키고(rehydration) 세척하였다. 내인성 과산화효소의 활성을 억제하기 위해 3% H₂O₂에 10분간 처리한 후 0.05 M TBS (triphosphate buffered saline) 완충용액으로 세척하였다. 조직의 항원발현을 증가시키기 위해 단백질 분해효소 K (Proteinase K)를 실온에서 30분간 처리하였고, 비특이적 반응을 억제하기 위해 5% 전지분유 (skim milk, nonfat milk)로 5분간 예비-차단 (pre-blocking)시키고 증류수로 깨끗이 세척하였다. 일차 항체로는 마우스에서 얻은 단클론성 항체 (anti-laminin monoclonal antibody, DAKO)를 사용하였는데, 이를 1: 50으로 희석하여 시료와 1시간 동안 반응시킨 후 0.05 M TBS로 5분간 3 내지 4회 세척하였다. 그 후에 바이오틴 (biotin)이 부착된 이차 항체 (DAKO사, Denmark, LSAB2 kit)를 20분간 처리한 후 0.05 M TBS로 세척하고 스트렙타비딘 (streptavidin)-HRP 과산화수소 (peroxidase)로 20분간 처리하였다. 이를 0.05 M TBS로 세척한 후 표지 시약으로 디아미노벤지딘 (diaminobenzidine, DAB)을 사용하여 10분간 발색하였고, 발색반응 후 해리스 헤마톡실린 (Harris hematoxylin) 용액으로 3분간 대조염색을 시행하였다. 시료를 탈수 및 봉입한 후 광학현미경으로 관찰하였다. 상기 염색을 통하여 새로이 형성된 라미닌을 확인할 수 있다.

그 결과,도 4에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll, A)에서만 라미닌 (갈색)을 분비하였고, 0.5% Coll-GAG (B) 및 2% Coll (C)에서는 라미닌이 분비되지 않는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 본 발명의 콜라겐 필름이 세포에게 가장 적합한 배양 환경을 제공함을 나타내는 것이다. 라미닌과 타입 Ⅳ 콜라겐은 기저막의 주성분으로 각질형성세포 배양시 미리 코팅하여야 기저층이 잘 형성되나 본 발명에 의한 콜라겐 필름은 이러한 세포외기질 (extracellular matrix)의 코팅 없이도 세포가 잘 부착하여 라미닌을 분비하는 것으로 확인되었다.

(1-3) 타입 Ⅳ 콜라겐 염색

타입 Ⅳ 콜라겐에 대한 면역화학적 염색은 일차 항체로 마우스에서 얻은 단클론성 항체 (anti-Type 4 monoclonal antibody, NeoMarkers)를 사용하는 것을 제외하고는 라미닌 염색과 동일한 방법으로 시행하였다. 상기 염색을 통하여 새로이 형성된 타입 Ⅳ 콜라겐을 관찰할 수 있다.

그 결과,도 5에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (A)에서 타입 Ⅳ 콜라겐 (갈색)이 연속적으로 분비되었고 대조군 콜라겐 필름 (C)에서는 미량만이 분비되었다. 그러나 0.5% Coll-GAG (B)에서는 타입 Ⅳ 콜라겐을 관찰할 수가 없었다. 이로부터 본 발명에 의한 콜라겐 필름이 세포에게 가장 적합한 배양 환경을 제공함을 알 수 있다.

(1-4) 사이토케라틴-10 (CK-10) 염색

사이토케라틴-10에 대한 면역화학적 염색은 일차 항체로 마우스에서 얻은 단클론성 항체 (anti-CK-10 monoclonal antibody, Biogenex)를 1:40으로 희석하여 사용하는 것을 제외하고는 라미닌 염색과 동일한 방법으로 시행하였다. 상기 염색을통하여 세포의 분화정도를 관찰할 수 있다.

그 결과,도 6에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (A)과 비교군 콜라겐 필름 (B)에서는 사이토케라틴-10 (갈색)이 발현되었으나 대조군 콜라겐 필름 (C)에서는 사이토케라틴-10이 발현되지 않았다. 이는 본 발명에 따른 콜라겐 필름의 물질이동이 고농도의 콜라겐으로 제조된 것보다 잘 이루어지고 있으며 연속적이며 평탄한 표면이 기저 세포층의 형성을 안정화시켜 상부구조 (각질층)의 분화를 안정적으로 지지해주기 때문인 것으로 판단된다.

(1-5) Ki-67 염색

상피줄기세포에 대한 Ki-67 면역화학적 염색은 단백질 분해효소 K 대신 ACE (3-amino-9-ethylcarbazole)를 처리하고 일차 항체로 토끼에서 얻은 다중클론성 항체 (anti-Ki-67 polyclonal rabbit anti-human, DAKO)를 사용하는 것을 제외하고는 라미닌 염색과 동일한 방법으로 시행하였다. 상기 염색을 통하여 분화중이거나 증식중인 상피줄기세포를 관찰할 수 있다.

그 결과,도 7에 나타난 바와 같이, 다른 기질에 세포를 배양하면 줄기세포는 노화되어 염색이 되지 않지만 본 발명에 의해 제조된 콜라겐 필름 위에 배양된 세포는 줄기세포 (화살표)가 잘 남아있어 세포에게 좋은 배양조건을 제공하고 있음을 알 수 있다.

<실시예 4> 동물이식 검사

본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 위에 각질형성세포를 2주간 배양한 인공표피와 대조군으로 각질형성세포만을 디쉬에 배양한 배양표피 (CEA)를 누드마우스에 이식하였다. 먼저 누드마우스의 등 부위를 지름 1.5 ㎝로 전층으로 절개한 후 배양표피 (CEA)와 인공표피를 이식한 뒤 8군데를 봉합하고 드레싱을 실시하였다. 이식 후 4일, 2주, 4주 및 8주 후에 각각 생검한 후 조직학적 염색을 실시하여 주위 조직으로부터 세포의 이동과 진피와 표피의 재생정도를 확인하였다.

도 8의 A는 누드마우스에 인공피부를 이식한 후 1주일째 등의 이식부위를 촬영한 사진으로 인공표피 (좌)가 배양표피 (우)에 비해 수축이 덜 되었음을 확인할 수 있다. 인공피부의 이식 후 환부의 수축이 적을수록 반흔 (scar)이나 섬유화 (fibrosis)가 적게 일어나 치료효과가 향상되었다. 배양표피는 현재 표피 재생을 위한 환자에게 많이 쓰이고 있으나 본 발명에 의한 인공표피가 수축을 억제시켜 좀더 좋은 치료효과를 나타낼 것을 기대할 수 있다.도 8의 B와 C는 각각 인공표피와 배양표피의 2주째 조직검사 사진으로 인공표피 (B)는 전반적인 진피의 재생이 이루어져 있으나, 배양표피 (C)는 아직까지 진피에 공백이 있어 진피 재생이 느리게 진행됨을 관찰할 수 있다. 이상의 결과로부터, 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름이 세포의 증식과 분화에 좋은 환경을 제공하고 이식 후에 환부의 재생에 효과적임을 확인하였다.

<실시예 5> 콜라겐 필름의 물성 분석

<5-1> 인장강도 검사

본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll)과 대조군 필름 (0.5% Coll-GAG 및 2% Coll)을 각각 5×10 ㎜의 크기로 자른 뒤 인장강도 측정기 (Universal testing machine, HOUSFIELD, 영국)로 1 ㎜/분의 속도로 잡아당겨서 파손 부하 (breaking load)를 측정하였다.

그 결과,도 9에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll)은 대조군 콜라겐 필름 (0.5% Coll-GAG 및 2% Coll)보다 강한 인장강도를 나타내었다. 이는 제조공정 순서에 따라 콜라겐 분자의 구조에 결합되는 글루코사미노글리칸의 위치가 달라져 구조의 안정성이 변하기 때문인 것으로 확인되었다. 또한, 본 발명의 콜라겐 필름이 2% 농도의 콜라겐보다 다소 높은 인장강도를 나타낸 것은 콜라겐만으로 제조될 때보다 글루코사미노글리칸이 안정되게 가교되어 물성을 향상시킨 결과이다.

<5-2> 함수율 검사 (swelling ratio test)

본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll)과 대조군 필름 (0.5% Coll-GAG 및 2% Coll)을 각각 5×10 ㎜의 크기로 자른 뒤 실온에서 인산염 완충용액 (PBS)에 넣어 48시간 동안 처리한 후 꺼내어 표면의 수분을 제거한 후 바로 무게를 측정하였다. 함수율은 완충용액에 젖은 필름의 질량을 건조된 필름의 질량으로 나누어 계산하였다.

그 결과,도 10에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 콜라겐 필름 (0.5% Coll)과 대조군 필름 (0.5% Coll-GAG 및 2% Coll) 사이에는 제조 공정과 콜라겐 용액의 농도에 따른 함수율 차이는 없는 것으로 확인되었다. 글루코사미노글리칸이 콜라겐 분자와 결합하면 소수성의 경향을 띄게 되지만, 상기와 같이 함수율이 유사하게 측정됨으로써 저농도 (0.5%)의 콜라겐이 고농도 (2%)의 콜라겐과 유사한 친수성을 나타냄을 확인할 수 있다.

상기에서 살펴본 바와 같이, 본 발명에 따라 제조된 인공장기 제조용 생분해성 콜라겐 필름은 물성과 생체적합성이 뛰어난 반면 이식수술시 우려되는 면역반응의 위험성은 적어 인공피부, 인공각막, 인공요관 등의 다양한 인공장기 제조를 위한 기질로 유용하게 사용될 수 있다.

Claims (11)

1. 콜라겐과 글루코사미노글리칸 (glucosaminoglycan, GAG)을 가교결합시켜 필름 형태로 제조한 인공장기 제조용 생분해성 콜라겐 필름.
2. 제 1항에 있어서,

   콜라겐이 불용성 콜라겐 또는 가용성 콜라겐인 것을 특징으로 하는 콜라겐 필름.
3. 제 1항에 있어서,

   콜라겐이 포유동물 또는 해양생물로부터 유래한 것을 특징으로 하는 콜라겐 필름.
4. 제 3항에 있어서,

   콜라겐이 소 또는 경골어류로부터 유래한 것을 특징으로 하는 콜라겐 필름.
5. 제 1항에 있어서,

   글루코사미노글리칸이 콘드로이틴, 콘드로이틴 설페이트, 히알루론산, 헤파란 및 헤파란 설페이트로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 콜라겐 필름.
6. 1) 1% 미만의 콜라겐 용액을 동결 건조하여 스폰지 형태의 기질을 제조하는 단계;

   2) 상기 콜라겐 기질을 글루코사미노글리칸 용액에 담근 뒤 4 내지 20℃에서 24 내지 48시간 동안 건조시켜 콜라겐 필름을 형성하는 단계; 및

   3) 상기 콜라겐 필름을 가교결합시키는 단계를 포함하는, 제 1항의 콜라겐 필름의 제조방법.
7. 제 6항에 있어서,

   단계 1)에서 콜라겐 용액의 농도가 0.5 내지 0.7%인 것을 특징으로 하는 제조방법.
8. 제 6항에 있어서,

   단계 2)에서 글루코사미노글리칸 용액의 농도가 5 내지 15 ㎎/㎖인 것을 특징으로 하는 제조방법.
9. 제 6항에 있어서,

   단계 3)에서 가교결합이 물리적 가교결합 또는 화학적 가교결합에 의한 것임을 특징으로 하는 제조방법.
10. 제 9항에 있어서,

    물리적 가교결합이 진공 하에서의 열 건조 또는 UV 조사에 의해 이루어지는 것을 특징으로 하는 제조방법.
11. 제 9항에 있어서,

    화학적 가교결합이 디페닐포스포릴아자이드, 글루타르알데히드, 헥사메틸렌이소시아네이트, 석신이미드 및 카보디이마이드로 구성된 군으로부터 선택되는 화합물과의 가교결합인 것을 특징으로 하는 제조방법.