KR20040106194A

KR20040106194A - 고분자형 만노스 결합형 렉틴의 대량 생산방법 및 상기방법으로 제조된 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질의제제화

Info

Publication number: KR20040106194A
Application number: KR1020030041051A
Authority: KR
Inventors: 문홍모; 염정선; 안병철; 이복률; 윤재승
Original assignee: (주)두비엘
Priority date: 2003-06-11
Filing date: 2003-06-24
Publication date: 2004-12-17
Also published as: KR100755931B1

Abstract

본 발명은 고분자형 만노스 결합형 렉틴의 대량 생산방법 및 상기 방법으로 제조된 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질의 사용에 관한 것이다. 특히 본 발명은 미생물 감염 시 보체계를 활성화시킴으로 미생물 감염을 예방 및 치료할 수 있는 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질을 제제화하는 방법을 제공한다.

Description

고분자형 만노스 결합형 렉틴의 대량 생산방법 및 상기 방법으로 제조된 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질의 제제화{METHODS FOR OVEREXPRESSION OF MANNOSE BINDING LECTIN AND FORMULATION}

[발명이 속하는 기술분야]

본 발명은 고분자형 만노스 결합형 렉틴의 대량 생산방법 및 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질의 제제화에 관한 것으로, 보다 상세하게는 만노스 결합형 렉틴 재조합 단백질을 이용하여 보체계를 활성화시키므로써 미생물 감염 시 체내 방어시스템을 활성화시켜 질병을 치료 할 수 있는 방법에 관한 것이다.

[종래기술]

만노스 결합형 렉틴(Mannose Binding Lectin: 이하 "MBL"이라 함)은 선천성 면역을 담당하고 있는 혈청단백질로, 32 kD의 분자량을 갖는다. MBL의 N' 말단부위에는 짧은 시스테인 다분포 부위(Cysteine Rich Region)가, 연이어 콜라겐 도메인이 있으며, C'말단부위에는 탄수화물 인식 도메인(CRD: C-type carbohydrate recognition domain)이 있다. 상기 콜라겐 도메인은 세 개의 분자가 삼중나선 구조를 형성하므로, 세 개의 MBL 분자가 하나의 복합체를 만들게 한다. 이러한 복합체는 다시 N'말단 부위의 시스테인에 의한 이황화결합(-s-s-)을 통하여 여섯 개가 결합되어 총 18개의 MBL로 이룬 거대 분자를 형성시킨다.

또한 MBL의 콜라겐 도메인은 여러 개의 다른 단백질을 부착시킬 수 있다. 대표적인 것으로는 MASP(MBL Associated Serine Protease)-1 및 -2가 있다.

MBL은 구조적인 면에서 보체계(Complement System)의 C1q 와 흡사하고, 기능적인 면에 있어서도 C1q와 유사하여 보체계를 활성화시킨다. 또한 C1q와 같이 고분자형의 MBL이 보체를 활성화 할 수 있는 것으로 알려져 있다. 즉, 외부에서 침입한 미생물은 표면에 존재하는 단백질의 독특한 당화형태 (Glycosylation Pattern)를 인식해서 결합하는 CRD를 통하여 MBL과 복합체를 형성한다. 상기 복합체는 세린 프로테아제의 전구체인 MASP-1과 MASP-2를 활성화시키고, 보체계의 C4와 C2를 분해하여 보체계를 활성화시키는 것이다. 이때 MBL은 숙주에서 나타나는 당쇄패턴이과 다른 당쇄패턴을 갖는 분자에만 결합할 수 있으며, 또한 칼슘이 필수적으로 존재하여야 한다. 또한 MBL은 C1q와 달리 IgM이나 IgG가 결합되지 않은 외부침입자를 식세포에 의하여 식균(Phagocytosis) 되도록 할 수 있어, MBL은 우리 몸의 제 1차 방어에 아주 중요한 역할을 하며 동시에 후천성 면역 반응을 유도하는데도 중요한 역할을 한다.

한편, 식균작용을 하는 세포로는 중성백혈구(Neutrophile)과 대식세포(Macrophage)가 있다. 이들 세포는 외부에서 침입한 미생물이나 이물질을 제거하는데 중요한 역할을 한다. 특히 대식세포는 APC(Antigen Presenting Cell)로 작용하여, 항원 또는 NK 세포나 T-세포에서 분비되는 인터페론 감마에 의해 활성화되어 TNF나 IL-12를 분비하므로써 후천성 면역반응을 유도한다. 또한 APC는 함유하고 있는 항원을 T-림포사이트에 통보하여 후천성 면역반응을 유도한다.

보체계의 활성화는 면역학적인 측면에서 동물의 몸을 방어한다는 의미에서 매우 중요하다. 먼저, 보체계를 이루는 단백질 중 일부는 옵소닌(Opsonin)으로 작용하여 직접 미생물 세포의 표면에 결합함으로써 대식세포나 중성백혈구에 의한 식균작용을 도와준다. 다음으로, 일부 활성화된 단백질들은 막 공격성 복합체(Membrane Attacking Complex: MAC)를 형성하여, 침입한 미생물을 직접 분해하기도 한다. 그 외에도, 활성화 과정에서 생성된 보체 단백질 절편은 강한 염증반응을 일으키는 사이토카인의 분비를 촉진시키므로써, 백혈구를 침입자가 존재하는 곳으로 모이게 한다.

이와 같이 MBL은 선천성 면역 반응과 후천성 면역 반응에 매우 중요한 역할을하기에, 혈액 속에 존재하는 MBL은 그 양에 따라 개체의 저항력에 큰 영향을 미친다. MBL은 유전적 변이로 결핍되거나 소량만 발현될 수 있다. 일예로, MBL 유전자에 잘 알려진 3가지 점 돌연변이 중 하나가 발생된 경우, MBL 분자간의 복합체 형성이 이루어지지 않아 MBL 기능을 수행할 수 없다. 또한 MBL 유전자의 프로모터 부위에 돌연변이가 있는 경우, 발현되는 MBL 양이 달라질 수 있다.

특히, 갓난아기나 또는 면역 억제제를 처방받은 사람들 중 MBL 수준이 낮은 군에서는 병원성 미생물에 감염될 확률이 높다. 또한 MBL은 B형 및 C형 간염바이러스 감염에도 적지 않은 영향을 주는 것으로 알려져 있다. B형 간염바이러스 감염 환자를 대상으로 한 연구보고 논문(Hakozaki Y. et al, Liver 2002, 22, 29-34)에 의하면, B형 간염바이러스의 감염상태가 전격형 감염(Fulminant Infection) 상태로 되어 위기상태로 진전되는 환자들의 경우 혈장에 MBL의 양이 3 ug/㎖ 이상이면 사망률이 0 %이고, 1.5 ug/㎖ 이면 사망률이 54 %이며, 0.5 ug/㎖ 이하이면 사망률이 거의 80 % 이상에 달하는 것으로 알려져 있다. 이 연구 결과는 B형 간염바이러스 보균자의 혈액내 MBL의 양이 질환의 진전에 중요한 영향을 미침을 나타내는 것이다. 또한 중국 사람을 대상으로 실시한 연구에서, MBL 양이 낮은 사람은 혈액속에 감염성 B형 바이러스 숫자가 MBL 양이 많은 사람에 비해 훨씬 많다는 것이 보고된 바 있다.

MBL과 관련성이 보고된 질환은 감염성 질환에 한정되지 않고, 매우 다양하게 보고되고 있다(표 1).

감염성 질환
Viral disease	HIV
	HBV
	HCV
	Influenza A virus
Bacterial disease	meningococcal disease
	ischaemic heart disease
	bacterial pneumonia
Fungal and protozoal disease	crytosporidium parvum diarrhoea
	malaria
	chronic necrotizing plumonary aspergillosis
비감염성 질환
systemic lupus erythematosus (SLE)
rheumatoid arthritis
recurrent miscarriage
neoplastic disease

종래기술의 문제점은 고분자형 MBL의 대량생산 체계가 되어있지 않다는 것이다. 이를 해결하기 위하여, 본 발명은 고분자형 MBL을 대량 생산할 수 있는 형질전환체를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 MBL 결합성을 가지는 pre S를 이용하여 MBL 생산균주 배양액으로부터 MBL을 정제하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 pre S를 이용하여 MBL의 기능을 활성화하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 MBL 재조합 단백질을 보체계를 활성화시키는 용도로 제제화하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명은 MBL 재조합 단백질을 보체계 활성화를 통하여 해당 질환의 예방 및 치료하는 용도로 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한 본 발명의 MBL 재조합 단백질을 사스 코로노바이러스 감염을 억제할 수 있는 용도로 제공하는 것을 목적으로 한다.

도 1a 및 1b는 형질전환체 CHO MBL/D1-3에서 생산된 재조합 MBL단백질을 정제하여 SDS-PAGE와 웨스턴 블롯으로 확인한 것이고,

도 2a 및 2b는 MBL단백질이 당쇄화된 단백질인 preS 또는 만난(mannan)에 특이적으로 결합함을 나타내는 그래프이고,

도 3은 재조합 MBL단백질에 의한 C4 활성화를 나타내는 그래프이고,

도 4는 PLGA-preS 나노파티클의 형태를 도식화한 그림이고,

도 5은 PLGA-preS 파티클에 재조합 MBL단백질이 결합함을 확인한 그래프이고,

도 6은 재조합 MBL단백질이 PLGA-preS 파티클에 결합하여 C4를 활성화함을 확인한 그래프이고,

도 7은 사스 코로나바이러스 감염에서의 MBL 재조합 단백질의 효과를 확인한 그래프이고,

도 8은 사스 코로나바이러스를 감염시킨 FRhk-4세포를 위상차 현미경 (phase contrast microscope)으로 관찰한 사진이다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 pMSG 벡터의NheI 및BglII 제한효소 인식부위에 MBL(Mannose Binding Lectin) 유전자가 발현가능하도록 삽입된 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환체로부터 생산된 MBL 재조합 단백질을 제공한다.

또한 본 발명은 MBL 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 보체계 활성화 조성물을 제공한다.

본 발명은 (a) B형 간염 바이러스 preS가 부착된 기질을 충진하여 MBL정제용 컬럼을 제조하고, (b) 상기 컬럼을 평형화시킨 다음 MBL이 포함된 시료를 칼슘 이온존재하에 컬럼에 투입하여 MBL을 상기 B형 간염 바이러스 preS에 특이적으로 결합시키고 및 (c) 상기 MBL이 결합된 컬럼에 EDTA 또는 EGTA가 포함된 완충액을 흘려주어 MBL을 용출시키는 것을 포함하는 MBL 정제방법을 제공한다.

본 발명은 MBL 재조합 단백질을 사람 또는 동물에 투여하여 보체계를 활성화시키는 방법을 제공한다.

본 발명은 B형 간염바이러스 pre S, 당쇄화된 단백질, 당쇄화된 펩타이드, 당쇄물(glycosyl moiety) 및 만난으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 물질이 부착된 나노 파티클 및 상기 물질에 결합된 MBL 단백질을 포함하는 보체계 활성화용 나노 파티클을 제공한다.

이하 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명자들은 동물의 보체계를 활성화시킬 수 있는 방법을 연구하던 중, MBL 과정(pathway)에 의하여 보체계 활성화를 유도하기 위하여 고분자형 MBL을 동물세포에서 대량생산할 수 있는 시스템을 확립하였다.

본 발명의 MBL 형질전환체는 숙주세포에 pMSG-MBL 벡터가 형질도입된 것이다. 상기 pMSG-MBL 벡터는 베타 글로빈 유전자의 MAR 인자(Nuclear matrix attachment region element) 역방향체 및 SV40 바이러스의 poly-A와 가스트린(gastrin) 유전자의 전사종결인자 조합체를 포함하는 pMGS(KCCM 10202) 벡터에 MBL cDNA(Gene Bank NM_000242)가 삽입된 것이다. 본 발명의 숙주세포는 통상적인 동물세포이며, 바람직하게는 CHO(Chinese hamster ovary), 간세포(human hepatocyte), 및 HEK(human embryonic kidney) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 세포이다.

본 발명에서는 일실시예로, CHO 세포에 pMSG-MBL 벡터를 도입하여 형질전환체를 제조하였고, 상기 형질전환체는 MTX 존재하에 적응시켜, 다량의 MBL 재조합 단백질을 발현하는 형질전환체를 선별하였다. 선별한 형질전환체는 CHO MBL/D1-3로 명명하고, 2003년 5월 16일자로 대한민국 대전에 소재한 유전자은행 (Korean Collection for Type Culture)에 기탁하여, 기탁번호 KCTC 10472BP를 부여받았다.

본 발명의 MBL 형질전환체에서 생산되는 MBL 재조합 단백질은 인간유래의 천연 MBL과 유사하게 다중중합체(multimerization) 형태를 가진 고분자형이다. MBL은 모노머로는 선천성 면역체계를 활성화하는 성질을 갖지 못하므로 고분자(oligomer)형태로 만들어지는 것이 매우 중요하다. 본 발명에서 제공하는 재조합 MBL 단백질은 기존의 시도와는 차별되게 천연 MBL단백질과 유사한 다중중합체 형태를 갖는다. 또한 본 발명에서 제공하는 재조합 MBL단백질은 형질전환체로부터 발현율이 매우 높으며, 형질전환체는 생산클론으로 활용이 가능하다.

본 발명의 MBL 재조합 단백질은 B형 간염 바이러스 preS의 결합성을 이용하여 MBL 형질 전환체의 배양액으로부터 정제할 수 있다. MBL 정제방법은 (a) B형 간염 바이러스 preS가 부착된 기질을 충진하여 컬럼을 제조하고, (b) 상기 컬럼을 평형화시킨 다음 재조합 MBL단백질이 포함된 시료를 칼슘 이온존재 하에 컬럼에 투입하여 재조합 MBL단백질을 상기 B형 간염 바이러스 preS에 특이적으로 결합시키고 및 (c) 상기 MBL 재조합 단백질이 결합된 컬럼에 EDTA 또는 EGTA가 포함된 완충액을 흘려주어 재조합 MBL단백질을 용출시키는 것을 포함한다.

상기 (a) 단계에서, 상기 기질은 통상의 친화성 크로마토그래피에 사용되는 기질일 수 있으며, 그 예로 세파로즈가 있다.

상기 (b) 단계에서, 컬럼의 평형화는 MBL 재조합 단백질을 B형 간염 바이러스 preS와 결합시킬 때 사용하는 동일 용액 또는 완충액을 컬럼에 흘려주어 실시할수 있다. MBL 재조합 단백질을 B형 간염 바이러스 preS와 결합시킬 때 칼슘이온 존재하에 실시하는 것이 좋으며, 이때 칼슘의 농도는 2 내지 20 mM인 것이 바람직하다. MBL 재조합 단백질이 포함된 시료는 MBL 형질전환의 배양배지 또는 MBL 형질전환체 용혈물로부터 수득한 상청액일 수 있다.

상기 (c) 단계에서, MBL 재조합 단백질의 용출은 칼슘이온이 비포함된 EDTA 또는 EGTA 완충액을 사용하여 실시된다. 상기 완충액은 EDTA 또는 EGTA가 2 내지 10 mM로 포함된 완충액, 예를 들면 증류수 또는 Tris-Cl일 수 있다.

상기 (c) 단계 이후에 용출물은 동결건조하거나, 투석후 동결건조하여 정제된 MBL 재조합 단백질을 수득할 수 있다.

본 발명의 상기 MBL 재조합 단백질 정제방법은, 형질전환체로부터 생산된 MBL 재조합 단백질이외에도 천연의 생체시료로부터 MBL을 정제하는데 사용할 수 있다. 상기 생체시료로는 혈액, 플라즈마 또는 혈청(serum)이 사용될 수 있다.

본 발명의 MBL 재조합 단백질은 의학적인 용도로 사용하여 선천성 또는 후천성 MBL 결핍 환자에게 처방할 수 있으며, 그 외 방어시스템 증강을 위한 용도로 사용할 수 있다. 또한 표 1에서 열거된 질환을 포함하는 MBL단백질과 관련이 있는 질환의 예후를 개선하는데 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 MBL 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 보체계 활성화 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약리학적으로 허용가능한 담체나 단백질 안정화제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 담체로는 증류수, 식염수 또는 글리세린을 사용할 수 있으며, 단백질 안정화제로는 소르비톨, 글루코스, 슈크로즈, 트레할로스,말토스, 알부민, 아미노산(일예로, 라이신, 글리신)이 있다. 상기 담체 또는 단백질 안정화제는 각각 상기 조성물에 3 내지 30 중량%로 포함될 수 있다.

상기 조성물은 동물에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 바람직하기로는 비경구 처방하는 것이다. 더욱 바람직하기로는 상기 조성물을 피내, 피하, 근육내, 동맥내 또는 정맥내 주사하는 것이다. 상기 조성물의 제형은 유제, 액제, 산제, 정제 또는 과립제일 수 있으며, 고체인 경우 사용직전 담체에 용해시켜 사용할 수 있다.

본 발명의 MBL 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 보체계 활성화 조성물은 또한 MASP-1 또는 MASP-2를 더욱 포함할 수 있다. 상기 MASP-1 또는 MASP-2는 천연에서 분리한 단백질이거나 이들을 포함한 단백질조성물일 수 있으며, 또는 재조합 단백질일 수 있다. MSAP-1 또는 MASP-2는 단독 또는 모두 상기 조성물에 포함될 수 있다. 상기 MASP-1 및 MASP-2는 MBL에 의한 보체계 활성을 더욱 촉진시킬 수 있다.

또한 본 발명은 B형 간염바이러스 pre S가 부착된 나노 파티클 및 상기 pre S에 결합된 MBL 단백질을 포함하는 나노 파티클을 제공한다. 상기 나노 파티클은 리포솜 또는 PLGA이며, 10 ㎚ 내지 10 ㎛ 직경을 갖는 것이다. 상기 리포솜 또는 PLGA에는 preS 외에도 MBL이 붙을 수 있는 당쇄화된 단백질, 펩타이드 또는 만난(mannan)이 부착될 수 있다.

본 발명의 MBL 단백질이 부착된 나노 파티클은 MBL을 안정성 있는 형태로 사용할 수 있고, MBL 단백질을 활성화된 상태로 제공할 수 있으므로, 바이러스, 박테리아, 곰팡이 등의 미생물에 의한 감염성질환을 치료할 수 있는 용도로 광범위하게 제공될 수 있다. 특히 MBL 단백질은 사스(SARS: Severe Acute Respiratory Syndrome) 코로나바이러스(Coronavirus)의 감염을 현저히 억제시키므로, 본 발명의 MBL 단백질이 부착된 나노 파티클은 사스를 예방 및 치료하기 위한 용도로 사용할 수 있다.

또한 본 발명은 MBL을 유효성분으로 포함하는 사스 예방 및 치료 조성물을 제공한다. 상기 MBL은 야생형 MBL이거나 MBL 재조합 단백질이다. 상기 조성물은 약리학적으로 허용가능한 담체나 단백질 안정화제를 더욱 포함할 수 있으며, 상기 담체 또는 단백질 안정화제는 각각 상기 조성물에 3 내지 30 중량%로 포함될 수 있다. 상기 조성물은 동물에 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 바람직하기로는 비경구 처방하는 것이다. 더욱 바람직하기로는 상기 조성물을 피내, 피하, 근육내, 동맥내 또는 정맥내 주사하는 것이다. 상기 조성물의 제형은 유제, 액제, 산제, 정제 또는 과립제일 수 있으며, 고체인 경우 사용직전 담체에 용해시켜 사용할 수 있다.

이하 본 발명의 실시예를 기재한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: MBL 형질전환체 및 MBL 재조합 단백질 제조

1-1. 발현벡터 제작

사람의 간세포 cDNA 라이브러리로부터 PCR법으로 수득한 MBL cDNA를 pEZ 벡터에 클로닝하여 pEZ-MBL 2-5를 제조하였고, MBL cDNA 염기서열을 보고된 MBL 염기서열과 비교, 확인하였다(Gene Bank NM_000242). 이를 주형으로 서열번호 1 및 2의 프라이머 세트로 PCR을 실시하여 약 750 bp의 MBL cDNA를 증폭하였다. 프라이머 각각은 제한효소 인식서열과 코작 서열(Kozak sequence)을 포함하고 있어 암호화부위 전체를 증폭시킨다. MBL cDNA는 pMSG 벡터(대한민국 특허 출원 10-2000-0043996)에 클로닝하여 pMSG-MBL을 제조하였고, 삽입된 MBL 염기서열을 확인하였다.

1-2. 형질 도입 (Transfection)

1-2-1. 발현 플라스미드 DNA 준비

pMSG-MBL을 대장균에 형질도입한 다음, 형질전환주를 100 ug/㎖의암피실린이 첨가된 100 ㎖의 LB 배지에서 배양하고, QIAPREP 플라스미드 미디 키트 (Quiagen, 미국)를 이용하여 pMSG-MBL DNA를 분리하였다. 분리된 DNA를ScaI 제한효소로 절단하여 선형화시키고, QIAQuick PCR 정제키트 (Quiagen, 미국)로 분리하여 사용하였다.

1-2-2. 숙주세포 준비

CHO DG44(dhfr^-/dhfr^-)숙주세포를 10 % cFBS가 첨가된 α-MEM배지에서 배양한 다음 헤마사이토미터를 사용하여 세포 수를 측정하였다. 2 x 10⁵의 세포를 10 % cFBS가 첨가된 α-MEM배지에 분주하고, CO₂배양기에서 하루 동안 배양하였다.

1-2-3. 형질전환

pMSG-MBL 벡터 2 ㎍을 Dosper^TM5.3 ㎕, pDCH1P 벡터(DHFR 유전자를 가지고 있는 플라스미드, Venolia, L. et al., 1987,Somat. Cell Mol. Genet. 13, 491-501) DNA 16 ng과 혼합하여 상온에서 45분 반응시키고, 이를 숙주 세포에 첨가하였다. 37 ℃에서 6시간 배양한 후 배지를 제거하고, 새로운 10 % cFBS를 포함하는 α-MEM배지를 3 ㎖/웰 첨가하여 다시 배양하였다. 2~3일 후, 형질전환된 세포들이 충분히 자랐을 때 트립신을 처리한 다음 세포(4 x 100⁵/well)에 10 % dFBS를 포함하는 α-MEM (w/o)를 2 ㎖ 첨가하여 배양하였다. 2~3일 간격으로 배지를 교환하면서 현미경으로 세포의 상태와 단일 콜로니 생성여부를 관찰하였고, 10일 후에 초기 적응된 세포들을 얻을 수 있었다.

1-3. MBL 발현 세포주의 선별 및 발현량 증폭

초기 적응된 세포들을 얻은 후, 배지내 MTX(methotrexate) 농도를 단계적으로 증가시켜 도입 유전자의 증폭을 유도하였다.

세포를 4 x 10⁵세포/웰로 분주하고, 10 nM MTX가 첨가된 배지(α-MEM + 10 % dFBS)에서 배양하였다. 2-3일 간격으로 배지를 교환하면서 배양하고, 이를 분주하여 동일한 방법에 따라 100 nM MTX가 첨가된 배지에서 적응시킨 다음 다시 1 uM MTX 조건에서 적응시켰다. 발현 증폭 과정을 거치면서 각 단계마다 웨스턴 블롯을 수행하여 MBL 발현량의 변화를 관찰하였다. MBL은 배지에 함유된 MTX 농도가 높아짐에 따라 발현량이 증가하였다. 이에 1 uM MTX 조건에서 적응된 세포군으로부터 단일 세포주를 분리하고자 하였다.

1-4. 단일 세포주 분리

MBL 발현 효율이 높은 단일 세포주 선별을 위하여, 1 uM MTX 배양조건에서 적응된 세포들을 0.5 세포/웰로 96-웰 평판에 분주하고 배지(α-MEM + 10 % dFBS + 1 uM MTX)에서 배양하였다. 약 2주 후 단일 콜로니가 형성되면 24-웰 평판으로 옮기고 계속적으로 배양하여 충분한 수의 세포로 증식시킨 다음 일부는 동결보관하고, 일부는 웨스턴 블롯으로 세포간의 발현을 비교하였다. 다량의 MBL을 발현시키는 것으로 확인된 단일세포 D1-3 형질전환체를 세포주로 선별하였다.

도 1은 정제된 재조합 MBL 단백질의 SDS-PAGE(A) 및 웨스턴블롯(B)이다. 레인 1은 비변성조건에서 정제된 재조합 MBL 단백질이고, 레인 2는 변성조건에서 정제된 재조합 MBL 단백질이고, 레인 3은 비변성조건에서 인간 혈장으로부터 일부 정제한 천연 MBL 이고, 레인 4는 변성조건에서 인간 혈장으로부터 일부 정제한 천연 MBL이며, M은 분자크기마커이다. 형질전환체에서 발현된 MBL 재조합 단백질은 비변성조건에서 전기영동한 결과 인체 유래의 천연 MBL과 유사한 다중합체(multimerization) 양상을 나타내었다(도 1).

1-5. 형질전환체에서의 MBL 재조합 단백질 발현율 확인

형질전환체 CHO MBL/D1-3의 MBL 재조합 단백질 발현효율을 분석하였다. 세포 각각을 5 X 10⁵로 T25 플라스크에 분주하여 배지(α-MEM(w/o) + 10 % dFBS)에서 배양하였다. 세포가 약 90 %의 컨플루언시(confluency)에 이르렀을 때, 용액(α-MEM(w/o) + 5 % dFBS) 3 ㎖을 첨가하고 4일 배양 후 회수하였다. 배양액을 10배 희석하여 웨스턴 블롯을 수행하여 천연 MBL과 비교한 결과 평판배양시 MBL 재조합 단백질 발현율은 약 50 ㎍/10⁶cells/day이었다.

실시예 2: MBL 재조합 단백질 정제

2-1. preS-세파로즈 컬럼 제조

CNBr로 활성화된 세파로즈4B 파우더 1 g을 1 mM HCl에 녹인 후 여러 번 세척하였다. preS를 리간드로 사용하기 위하여 6.4 mg pre S단백질을 커플링 완충액(0.2 M NaHCO₃, 0.5 M NaCl, pH8.3)에 0.5 내지 10 mg/ml이 되도록 녹였다. 세파로즈4B 수지를 pre S용액에 섞어 상온에서 2시간동안 반응시킨 후, 블롯킹 완충액(0.1 M TrisCl, pH 8.0)로 옮겨서 다시 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 후 세파로즈 결합된 preS를 웨스턴블롯으로 확인한 결과, 반응한 양이 모두 결합되었음을 알 수 있었다. 이를 컬럼에 충진하여 재조합 MBL단백질 정제에 사용하였다.

2-2. MBL 재조합 단백질 정제

MBL 재조합 단백질은 B형 간염바이러스의 pre S와 강한 결합력을 나타내므로, 이러한 성질을 이용하여 정제하였다.

preS-세파로즈로 충진된 컬럼을 결합 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.05 % Tween 20)로 평형화시켰다. 재조합 MBL 단백질 배양배지를 컬럼에 로딩하여 MBL을 흡착시켰다. 결합 완충액으로 컬럼을 수차례 세척한 다음, Ca 이온이 무첨가된 용출 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA)을 컬럼에 통과시켜 MBL을 용출시켰다. 용출물을 SDS-PAGE에서 확인한 결과 99.9 %의 순도를 갖는 MBL 재조합 단백질이 정제되었다(도 1).

실시예 3: MBL 재조합 단백질의 생물학적 활성 검증

MBL 재조합 단백질의 생물학적 기능은 칼슘 이온 존재하에서 만노실레이티드 단백질에 결합하는지 여부 및 보체계(Complement) 활성화 여부를 측정하여 확인하였다.

3-1. 만노실레이티드 단백질에 결합실험

3-1-1 만난 결합 실험

50 mM 카르보네이트-바이카르보네이드 완충액에 용해시킨 만난을 웰 당 1 ug이 되도록 Nunc Maxisorp Immunoplate에 넣고, 4 ℃에서 하룻밤동안 방치하여 코팅하였다. 세척 완충액(20 mM Tris, 150 mM NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.05 % Tween-20, pH 7.6)으로 4회 세척한 후, 0.2 % BSA로 상온에서 1 시간 동안 블롯킹하였다. 세척 완충액으로 3회 세척하고, 결합 완충액(20 mM Tris, 1 M NaCl, 10 mM CaCl₂, 0.1 % BSA, 0.05 % Tween-20, pH7.6)에 용해시킨 MBL단백질 1 ug을 넣고 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 세척 완충액으로 6회 세척한 다음 마우스 단일클론 항-인간 MBL8F6를 1:100으로 상온에서 2시간 반응시켰다. 항-마우스 IgG-HRP를 1:1500으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 150 ul OPD 용액을 넣고 20분간 발색시켰다. 이후 50 ul의 3 M HCl을 가한 다음 492 nm에서 ELISA 플레이트 리더를 이용하여 OD값을 측정하였다 (도2).

3-1-2 HBV PreS을 이용한 결합 실험

Nunc Maxisorp Immunoplate에 만난 대신 B형 간염바이러스의 재조합 preS 단백질을 웰 당 1 ug이 되도록 넣고, 3-1-1과 같은 조건에서 재조합 MBL단백질의 결합 실험을 수행하였다. 사용한 재조합 pre S 단백질은 사카로마이세스 세레비지아에서 발현하여, 고당쇄화된 형태로 정제되었다(PCT 출원 PCT/KR02/00820).

도 2a는 만난 및 pre S 에 대한 인간 혈장 MBL의 결합성을 나타낸 것이고, 2b는 재조합 MBL 단백질의 결합성을 나타낸 것이다. MBL는 당쇄된 preS 및 만난에는 결합하는데 반해, BSA에는 결합하지 않았다. 또한 재조합 MBL은 인간 혈장 MBL과 같이 만난 및 preS에 결합하였으므로 개발된 재조합 MBL단백질은 천연 MBL과 같은 활성을 보인다.

3-2. 보체계 활성화 실험

3-2-1 천연MBL단백질과 재조합 MBL단백질을 이용한 C4 활성화

Nunc Maxisorp Immunoplate에 웰당 1 ug의 만난으로 코팅하고, 각각 1 ug의 천연 MBL 단백질 또는 재조합 MBL 단백질과 MASP 단백질 공급원으로 MBL이 없는 MBL-결핍 혈청을 1/100이 되도록 넣고, 상온에서 2시간 동안 결합시켰다. 세척 완충액으로 6회 세척한 다음 500 ng C4를 넣고, 상온에서 2시간 반응시켰다. C4b 침전(deposit)을 측정하기 위하여 항-C4 항체-HRP를 1:1500으로 희석하여 상온에서 1시간 동안 반응시킨 후, 150 ul OPD 용액을 넣고 20분간 발색시켰다. 50 ul의 3 M HCl를 가한 다음 492 nm에서 ELISA 플레이트 리더로 OD값을 측정하였다(표 2).

	천연 MBL	재조합 MBL단백질
C4+	0.892	0.723
C4-	0	0

표 2에서와 같이, 본 발명에서 제공하는 재조합 MBL 단백질은 만난 결합후 천연 MBL 단백질과 유사한 수준으로 C4를 활성화시킴을 확인할 수 있다.

3-2-2. pre S를 이용한 C4 활성화 실험

Nunc Maxisorp Immunoplate에 재조합 pre S 단백질을 웰 당 1 ug이 되도록 코팅한 후, 3-2-1과 같은 조건에서 재조합 MBL 단백질을 결합시켜 C4 활성화 실험을 수행하였다.

	만난	pre S
C4 +	0.765	1.113
C4 -	0.042	0.048

표 3에서와 같이 재조합 MBL단백질은 만난에 결합한 상태에서 뿐 아니라 preS단백질에 결합한 상태에서도 C4를 활성화시킬 수 있다. 또한 재조합 MBL단백질은 만난에 비해 pre S 단백질에 결합되었을 때 보다 높은 C4 활성화를 유도함을 알 수 있었다.

도 3은 재조합 MBL 단백질에 의한 C4 활성화를 나타낸 것이다. 재조합 MBL단백질은 농도에 의존적으로 C4 활성화를 유도하였다.

실시예 4: MBL 재조합 단백질을 유효성분으로 하는 보체계 활성화 조성물

4-1. preS 단백질이 부착된 PLGA 나노파티클의 제조

분자량이 1,000 내지 100,000인 PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))를메탄올이나 메틸클로라이드와 같은 유기용매에 녹이고, SDS 또는 Tween 용액에 분산시켰다. 이를 하룻밤동안 강하게 혼합하여 나노 파티클을 제조하였다 (HS Yoo et al, J. Pharm Sci 2001, 90, 194-201; HS Yoo et al, Pharm Res, 1999, 16, 1114-1118). X-PEG-Y의 형태로 이종기능의 반응기(heterofunctional reaction group)를 갖는 폴리 에틸렌 글리콜(PEG)를 사용하여 나노 파티클의 반응기(-OH 또는 -COOH)에 접합시켰다(도 4).

상기 X 및 Y는 각각 서로 다르게 하기 화학식 1 내지 4로 표현되는 반응기이며, X는 나노 파티클에 접합시키고, Y에는 pre S를 접합시킨다.

(화학식 1)

(화학식 2)

(화학식 3)

(화학식 4)

Y 링커는 preS의 라이신, 알지닌의 ε-아민이나 N-말단 아민과 결합하거나, C-말단 또는 ε-카르복실산과 결합한다.

도 4는 preS가 부착된 형태의 나노 파티클을 나타낸 것이다. A는 preS가 부착된 형태의 나노파티클이고, B는 용액상태에서 여러 개의 preS가 나노파티클의 바깥쪽에 부착된 형태를 나타내고 있다. 이때 N-말단 쪽을 부착한 것을 PLGA-preS(N)우로, C-말단을 부착한 것을 PLGA-preS(C)라 명명하였다.

4-2. PLGA-preS를 이용한 결합 실험

재조합 MBL단백질과 PLGA-preS가 결합하는지를 부착상태에서 확인하였다.

Nunc Maxisorp Immunoplate에 PLGA-preS 또는 재조합 MBL단백질을 코팅하였으며, 이후 실험은 실시예 3에서와 같은 방법으로 수행하였다.

도 5는 MBL 단백질의 PLGA-preS와의 결합성을 나타낸 것으로, 5a는 MBL 단백질이 코팅된 플레이트에 PLGA-preS를 반응시킨 것이고, 5b는 PLGA-preS가 코팅된 플레이트에 MBL을 반응시킨 것이다. 재조합 MBL 단백질은 PLGA-preS의 나노파티클 형태에서도 preS에 결합함을 확인할 수 있었다.

4-3. PLGA-preS를 이용한 C4 활성화 실험

재조합 MBL단백질이 PLGA-preS에 부착된 상태에서 C4 활성화를 유도하는지 여부를 확인하였다.

Nunc Maxisorp Immunoplate에 PLGA-preS(N)과 PLGA-preS(C)를 웰당 각각 0, 1.56, 3.125, 6.25, 12.5, 25 및 50 ul씩 넣어 코팅하였다. 여기에 500 ng 재조합 MBL 단백질과 MBL 결핍성 혈청을 넣어 반응시켰다.

도 6은 PLGA-preS에 결합된 MBL단백질에 의한 C4 활성화를 나타낸 것이다. 도 6에서, 나노 파티클 상태의 preS는 C4 활성화를 유도함을 확인할 수 있다.

4-4. 용액상태에서 PLGA-preS 결합에 의한 C4 활성화 실험

PLGA-preS와 MBL을 10 mM CaCl₂이 있는 조건에서 용액상태에서 3시간 동안 반응시켰다. PLGA-preS-MBL 복합체를 측정하기 위하여, 반응물은 항-preS2 항체 500 ng/웰로 코팅된 Nunc Maxisorp Immunoplate에 넣고, 상온에서 2시간 반응시켰다. 각 웰을 세척한 다음 항-MBL-바이오틴 항체를 1:5,000으로 희석하여 가하고, 상온에서 90분간 반응시켰다. 익스트라비딘-HRP(Sigma, USA)를 1:2,500으로 가한 다음 상온에서 50분간 반응시켰다. 150 ul OPD 용액을 넣어 20분간 발색시키고, 50 ul 3 M HCl로 반응을 중지시켰다. 492 nm에서 ELISA 플레이트 리더로 OD값을 측정하였다(표 4). 이때 음성 대조군으로 PLGA-preS와 재조합 MBL을 5 mM EDTA 조건으로 용액상에서 반응시켰다.

시료	OD₄₉₂
PLG-preS + MBL/ 10 mM CaCl₂	0.535
PLG-preS + MBL/ 5 mM EDTA	0.076
PLG-preS	0.039
MBL	0.037
-	0.038

표 4에서, PLGA-preS-MBL 복합체는 10 mM CaCl₂조건에서 형성됨을 확인할 수 있었다.

실시예 5: MBL 재조합 단백질에 의한 사스 코로나 바이러스 (SARS-CoV)의 중화검정

MEM배지에 원숭이 콩팥세포 FRhk-4를 접종하여 배양한 다음 여기에 MBL 재조합 단백질을 처리한 다음 사스 코로나바이러스(SARS-CoV)를 감염시켰다. MBL 재조합 단백질은 2.5 ㎍/㎖에서부터 4-fold로 희석하여 사용하였다.

사스 코로나바이러스는 사스 환자로부터 직접 분리한 것을 사용하였다(Ksiazek TG et. al., "A novel coronavirus associated with severe acute respiratory syndrome" N Engl J Med 2003; 348(20): 1953-1966; Peiris JS et. al., "Coronavirus as a possible cause of severe acute respiratory syndrome" Lancet 2003; 361(9366): 1319-1325)

사스 코로나바이러스의 감염 여부는 PCR방법으로 확인하였다. 프라이머는 SARS-CoV에 특이적인 프라이머를 이용하였고, 정량적 Real-time PCR법을 실시하였다. 대조군으로는 MBL 재조합 단백질을 처리하지 않은 상태에서 SARS-CoV를 감염시킨 FRhk-4 세포를 사용하였다.

도 7은 사스 코로나바이러스 감염에서의 MBL 재조합 단백질의 효과를 확인한 그래프이다. 도 7의 그래프에서, 대조군에서 증식된 바이러스의 PCR 정량값을 100으로 둔 것이다. MBL 재조합 단백질을 처리한 경우 처리농도에 의존적으로 사스 코로나바이러스 감염이 억제되는 것으로 관찰되었으며, 특히 MBL 재조합 단백질을 2.5 ㎍/㎖로 처리하였을 때 바이러스의 증식이 약 15 % 이하로 억제되었다.

도 8은 사스 코로나바이러스를 감염시킨 FRhk-4세포를 위상차 현미경 (phase contrast microscope)으로 관찰한 사진이다. 도 8에서, MBL 재조합 단백질을 처리하지 않은 대조군에서는 건강한 세포가 관찰되지 않으나, 재조합 MBL이 처리된 실험군에서는 건강한 세포를 관찰할 수 있었다.

따라서, 본 발명의 MBL은 사스 코로나바이러스의 숙주 감염성을 억제하는 효과가 있으며, 이에 사스 치료제로 개발가능하다.

상기에 언급한 바와 같이, 본 발명은 보체계를 활성화시켜 체내 방어시스템을 강화시킬 수 있는 조성물 및 방법을 제공한다. 따라서, 본 발명의 만노스 결합형 렉틴은 만노스 결합형 렉틴의 결핍 또는 기능상실, 보체계 약화를 유도하는 질환 및 병원성 미생물 감염시 체내 방어기작을 활성화시키는 용도로 적용할 수 있다.

<110> DOBEEL CORP <120> OVEREXPRESSION METHOD OF MANNOSE BINDING LECTIN AND RECOMBINAT PROTEIN OF MANNOSE BINDING LECTIN <130> dpp20030817kr <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 1 ctagctagcc accatgtccc tgtttccatc actc 34 <210> 2 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 2 gaagatctca gatagggaac tcacagacg 29

Claims

pMSG 벡터의NheI 및BglII 제한효소 인식부위에 MBL(Mannose Binding Lectin) 유전자가 발현가능하도록 삽입된 벡터로 형질전환된 형질전환체.
제 1항에 있어서, 상기 형질전환체는 CHO, 간세포(hepatocyte) 및 HEK(human embryonic kidney) 세포로 이루어진 군으로부터 선택된 동물세포를 숙주세포로 사용하여 제조된 것인 형질전환체.
제 1항에 있어서, 상기 형질전환체는 MBL D1-3 (CHO cell line) KCTC 10472BP인 형질전환체.
제 1항 내지 3항중 어느 한 항에 따른 형질전환체로부터 생산된 MBL 재조합 단백질.
제 4항의 MBL 재조합 단백질을 유효성분으로 포함하는 보체계 활성화 조성물.
제 5항에 있어서, 상기 조성물은 MASP-1(MBL Associated Serine Protease), MASP-2, B형 간염바이러스 pre S, 리포솜 및 PLGA으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 것을 더욱 포함하는 것인 조성물.
(a) B형 간염 바이러스 preS가 부착된 기질을 충진하여 MBL 정제용 컬럼을 제조하고;

(b) 상기 컬럼을 평형화시킨 다음 MBL이 포함된 시료를 칼슘 이온존재하에 컬럼에 투입하여 MBL을 상기 B형 간염 바이러스 preS에 특이적으로 결합시키고; 및

(c) 상기 MBL이 결합된 컬럼에 EDTA 또는 EGTA가 포함된 완충액을 흘려주어 MBL을 용출시키는 것;

을 포함하는 MBL 정제방법.
제 4항의 MBL 재조합 단백질을 사람 또는 동물에 투여하여 보체계를 활성화시키는 방법.
제 8항에 있어서, 상기 방법은 MASP-1, MASP-2 및 B형 간염바이러스 pre S로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 것을 더욱 투여하는 것을 포함하는 것인 방법.
B형 간염바이러스 pre S, 당쇄화된 단백질, 당쇄화된 펩타이드, 당쇄물(glycosyl moiety) 및 만난으로 이루어진 군으로부터 1종이상 선택된 물질이 부착된 나노 파티클; 및

상기 물질에 결합된 MBL 단백질

을 포함하는 보체계 활성화용 나노 파티클.
제 10항에 있어서, 상기 나노 파티클은 리포솜 또는 PLGA(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid))인 것인 나노 파티클.
제 10항에 있어서, 상기 나노 파티클은 X-폴리에틸렌 글리콜-Y로 표현되는 링커를 이용하여 상기 물질을 부착하며,

상기 X 및 Y는 각각 서로 다르게 하기 화학식 1 내지 4로 표현되는 반응기인 것인 나노 파티클.

(화학식 1)

(화학식 2)

(화학식 3)

(화학식 4)
제 10항에 있어서, 상기 나노 파티클은 미생물에 의한 감염을 보체계 활성화를 통하여 치료하는 용도로 사용하는 것인 나노 파티클.
제 4항의 MBL 재조합 단백질 또는 MBL 야생형 단백질을 유효성분으로 포함하는 사스 예방 및 치료용 조성물.