KR20040089604A

KR20040089604A - 조류 유래 프로모터, 인트론 및 터미네이터

Info

Publication number: KR20040089604A
Application number: KR10-2004-7012230A
Authority: KR
Inventors: 후쿠다사토루; 사가나오츠네; 오바토시하루; 나가시마사와코; 다카하시슈이치; 아사다키요조; 가토이쿠노신
Original assignee: 다카라 바이오 가부시키가이샤
Priority date: 2002-02-28
Filing date: 2003-02-26
Publication date: 2004-10-21
Also published as: ATE392472T1; WO2003072775A1; CN1650008A; EP1477560B1; US7449568B2; AU2003211719A1; JPWO2003072775A1; EP1477560A1; EP1477560A4; DE60320382D1; CN100430475C; US20060234368A1

Abstract

조류에서 유용한 외래 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있고 따라서 유전공학 기술을 이용하여 조류의 육종에 유용한 프로모터, 인트론 및 터미네이터.

Description

조류 유래 프로모터, 인트론 및 터미네이터{Alga-origin promoter, intron and terminator}

전통적으로, 산업적으로 유용한 조류의 수득은 조류의 모집과 선별에 의존하여 왔다. 다르게는, 교배육종에 의해 조류를 보다 유용한 것으로 변형시키려는 시도가 있어 왔다. 그러나, 교배육종과 선별은 배양을 위해 장시간과 많은 노동력을 필요로 하며, 충분한 결과를 낳지 못하였다.

유전공학 기술을 이용한 육상 식물의 변형이 빈번하게 수행되어 왔으며 일부 성공적인 결과를 얻었다. 한편, 유전공학 기술을 이용한 변형이나 도입된 유전자의 발현조차에 대해서도 성공적인 사례가 해양 대형조류에 대해서는 알려진 바 없었다.

사용되는 숙주에 적합한 프로모터는 유전자의 생체 내 발현에 필수적이다. 따라서, 조류에서 유전자를 발현시키고자 하는 경우, 조류에서 작동하는 프로모터가 필수적이다. 그러나, 지금까지 조류로부터 유래된 알려진 프로모터는 없었다. 따라서, 조류에서 유전자를 발현시키는 것은 불가능하였다.

발명의 목적

상기한 바와 같은 선행기술에 비추어 본 발명이 만들어졌다. 본 발명의 주된 목적은 조류에서 유용한 외래의 유전자를 효율적으로 발현시키는데 사용할 수 있고 유전공학 기술을 이용한 조류의 육종에 유용한 프로모터, 인트론 및 터미네이터를 제공하기 위한 것이다.

발명의 요약

지속적인 연구 결과, 본 발명자들은 일반적으로 식품으로 섭취되어 온 김(Porphyra yezoensisUeda)의 유전자 분석 결과, 생활 주기의 모든 단계에서 높은 수준으로 발현되는 두 개의 연장 인자(elongation factor: EF)를 발견하였다. 그 후, 본 발명자들은 상기 유전자의 5' 상류 부위를 분리하고, 그들이 프로모터 활성을 가짐을 발견하였다. 더욱이, 본 발명자들은 이전에는 알려져 있지 않았던 EF 유전자들 중 하나의 게놈 서열을 밝혀내었다. 본 발명자들은 게놈 서열에서 인트론 서열과 터미네이터 서열을 밝혀내고, 이들 서열이 도입된 유전자의 발현효율을 증가시키는 활성을 가짐을 보여주었다. 따라서, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 아래와 같이 개괄될 수 있다. 본 발명의 제1 측면은

(a) 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(b) 엄격한 조건 하에서 (a)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(c) (a)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 프로모터 활성을 나타내는 분리된 DNA에 관한 것이다.

본 발명의 제2 측면은

(d) 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(e) 엄격한 조건 하에서 (d)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(f) (d)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 유전자의 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 분리된 DNA에 관한 것이다.

본 발명의 제3 측면은 제1 측면의 분리된 DNA와 제1 측면의 분리된 DNA의 하류에 그에 인접하거나 그로부터 1 내지 10,000 뉴클레오타이드의 DNA 단편에 의해 분리되도록 위치한 제2 측면의 DNA를 갖는, 조류에서 프로모터 활성을 나타내는 분리된 DNA에 관한 것이다. 제3 측면에 따르면, 분리된 DNA의 예는 서열번호 3의 87번 내지 1367번 위치의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 것이다.

본 발명의 제4 측면은

(g) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(h) 엄격한 조건 하에서 (g)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(i) (g)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 터미네이터 활성을 나타내는 분리된 DNA에 관한 것이다.

본 발명의 제5 측면은 목적 유전자가 제1 내지 제4 측면의 DNA들 중 어느 하나에 발현 가능하도록 연결된 재조합 DNA에 관한 것이다. 제5 측면에 따르면, 목적 유전자의 예는 단백질-코딩 핵산, 안티센스 핵산-코딩 핵산, 데코이-코딩 핵산 또는 리보자임-코딩 핵산이다.

본 발명의 제6 측면은 제1 내지 제5 측면의 DNA들 중 어느 하나를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 제6 측면에 따르면, 벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터이다.

본 발명의 제7 측면은 제5 측면의 DNA가 도입되거나, 제6 측면의 벡터로 형질전환된 조류에 관한 것이다.

본 발명의 제8 측면은

(j) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(k) 엄격한 조건 하에서 (j)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(l) (j)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 연장 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 DNA에 관한 것이다.

본 발명의 제9 측면은

(m) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(n) 엄격한 조건 하에서 (m)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(o) (m)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

본 발명의 프로모터 활성을 나타내는 DNA, 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 DNA 및/또는 터미네이터 활성을 나타내는 DNA를 사용하여, 조류를 유전자 변형시키기 위한 벡터가 제공된다. 조류의 유전자 변형은 조류의 육종 방법을 열고, 결과적으로 새로운 산업적으로 유용한 조류가 제공될 수 있다.

더욱이, 본 발명은 유전공학 기술을 이용하여 조류로부터 유래된 연장 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드의 제조를 가능하게 한다.

본 발명은 유전공학 기술을 이용한 조류(algae)의 육종 및 조류 세포를 이용한 산업적 생산에 사용되는 유전자 발현용 프로모터 및 벡터에 관한 것이다.

도 1은 A1 유전자의 아가로스 젤 전기영동 결과를 나타낸다.

도 2는 A2 유전자의 아가로스 젤 전기영동 결과를 나타낸다.

도 3은 클론번호 20과 클론번호 47에 대한 서던 혼성화의 오토래디오그램 결과를 나타낸다.

도 4는 벡터 p47GUS의 도입 1 주 후 세포에서 인디고틴 염료의 축적을 나타낸다. A: 탈색 전; B: 탈색 7 일 후.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 명세서에 사용된, "프로모터"는 유전자를 전사시키는 기능, 즉 DNA를 주형으로 사용하여 mRNA의 합성을 개시하는 작용을 갖는 DNA를 의미한다. 본 발명에 따른 프로모터는 상기한 기능만으로 제한되지 않는다. 그것은 전사 개시 위치(+1)의 20 내지 30 염기쌍 상류에 위치하고 RNA 폴리머라제가 정확한 위치로부터 전사를 개시하도록 하는 TATA 박스 또는 TATA 박스-양 부위, 또는 발현 조절을 위해 필요한 다른 부위를 포함할 수 있다.

본 명세서에 사용된, "프로모터 활성"은 발현될 수 있도록 프로모터의 하류에 연결된 목적 유전자를 숙주(조류)로 도입 시 숙주의 내부 또는 외부에서 목적 유전자의 산물을 생산하는 능력 및 기능을 가리킨다.

프로모터의 존재 또는 강도는 일반적으로 쉽게 정량 가능한 단백질을 코딩하는 유전자(리포터 유전자)를 발현될 수 있도록 프로모터의 하류에 연결하고, 그 제작물을 숙주로 도입하고 발현된 단백질의 양을 결정함으로써 결정될 수 있는 프로모터 활성에 의해 표현된다. 발현될 수 있도록 프로모터의 하류에 연결된 목적 유전자의 발현이 관찰된다면, 프로모터는 도입된 숙주에서 활성을 갖는다고 말할 수 있다.

본 명세서에 사용된, "인트론"은 유전자 또는 그의 전사체 내에 존재하고 유전자의 최종 RNA 산물에는 포함되지 않는 서열을 가리킨다.

인트론의 뉴클레오타이드 서열은 아미노산 서열에 관한 정보를 갖지 않는다. 인트론 서열을 함유하는 외래 유전자를 숙주로 도입하면, 일부 경우 전사 효율이 증가될 수 있고 도입된 유전자에 의해 코딩되는 목적 단백질이 높은 수준으로 생산될 수 있다. 예를 들어, 고등 식물의 사례가 알려져 있다(Tanaka, A. 등, Nucleic Acids Res., 18(23): 6767-6770(1990)).

전사 효율은 예를 들어 노던 혼성화 방법 또는 RT-PCR 방법과 같은 공지의 방법에 따라 전사된 RNA의 양을 측정함으로써 결정할 수 있다.

본 명세서에 사용된, "터미네이터"는 RNA의 전사를 종결시키는 활성을 갖는 것을 가리킨다. 예를 들어, 터미네이터의 존재는 노던 혼성화 방법과 같은 공지의 방법에 따라 전사된 RNA의 크기를 결정함으로써 조사할 수 있다.

본 발명에 따르면 "조류"에 관하여 특별한 제한은 없다. 그의 예들은 홍조류(예를 들어 김(Porphyra yezoensis Ueda)), 갈조류(예를 들어 다시마(Laminariaceae과의 조류), 미역(Undaria pinnatifida) 또는 톳(Hizikia fusiforme)) 및 녹조류(예를 들어 파래(Enteromorpha속의 조류))를 포함한다.

본 발명에 따르면 "목적 유전자"에 관하여 특별한 제한은 없다. 그의 예들은 조류에서 발현될 수 있는 단백질-코딩 핵산, 안티센스 RNA-코딩 핵산, 데코이-코딩 핵산 및 리보자임-코딩 핵산을 포함한다.

본 발명에 따른 프로모터 활성을 나타내는 DNA, 전사효율을 증가시키는 DNA 또는 터미네이터 활성을 나타내는 DNA에 원래 기능적으로 연결되어 있지 않는 "외인성 유전자"를 본 발명에 따라 사용할 수 있다.

조류에서 발현될 수 있는 단백질-코딩 핵산의 예들은 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만 조류로부터 유래된 것들을 포함한다. 본 발명에 따른 목적 유전자는 조류에서 발현될 수 있는 한 미생물(예를 들어 세균, 효모, 방선균, 필라멘트상 진균, 자낭균류 및 담자균류), 식물 및 동물 및 바이러스로부터 유래된 핵산을 포함한다. 단백질-코딩 핵산은 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만 효소, 수용체, 사이토카인, 성장인자, 유전자의 발현이나 조절에 관여하는 인자 및 구조 단백질을 포함한다.

본 발명에 따른 프로모터 활성을 나타내는 DNA(이하 프로모터라 함)는 조류에서 프로모터 활성을 갖는다. 그 예는 서열번호 3의 87번에서 859번 위치의 뉴클레오타이드 서열(즉 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열)을 갖는 DNA와 같은 김으로부터의 EF1-알파 A2 유전자의 프로모터 또는 그의 일부를 포함하는 DNA이다. 본 발명의 프로모터는 조류에서 프로모터 활성을 갖는 한 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열 내의 어떠한 DNA일 수도 있다.

본 발명의 프로모터는 또한 엄격한 조건 하에서 그러한 DNA 또는 그의 상보 쇄에 혼성화할 수 있고 조류에서 프로모터 활성을 나타내는 DNA를 포함한다. 혼성화는 T. Maniatis 등(eds.), Molecular cloning: A Laboratory Manual, 2nd ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory에 기재된 바와 같은 방법과 같이 공지의 방법에 따라 수행할 수 있다. 엄격한 조건의 예는 6×SSC(1×SSC: 150 mM 염화나트륨, 15 mM 시트르산 삼나트륨 이수화물, pH 7.0), 0.5% SDS, 5×덴하르츠 용액 및 100 ㎎/㎖의 청어 정자 DNA를 함유하는 용액 중에 65 ℃에서 밤새 프로브와 함께인큐베이션하는 것이다. 더욱이, 본 발명의 프로모터는 그러한 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖고 조류에서 프로모터 활성을 나타내는 DNA를 포함한다. 목적 유전자가 본 발명의 프로모터 하류에 발현될 수 있도록 연결된 재조합 DNA를 조류로 도입함으로써 조류에서 목적 유전자를 발현시키는 것이 가능하다. 이것은 유전공학 기술을 이용한 조류의 육종, 숙주로서 조류를 이용한 유용한 물질의 생산 등을 가능하게 한다.

본 발명에 따른 조류에서 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 DNA의 예는 서열번호 3의 878번 내지 1331번 위치로부터의 뉴클레오타이드 서열(즉 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열)을 갖는 DNA와 같은 김으로부터의 EF1-알파 A2 유전자의 인트론 또는 그의 일부를 포함하는 DNA이다. 본 발명의 DNA는 조류에서 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 한 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열 내의 어떠한 DNA일 수 있다.

본 발명의 DNA는 또한 엄격한 조건 하에서 그러한 DNA 단편 또는 그의 상보 쇄에 혼성화할 수 있고 조류에서 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 DNA를 포함한다. 혼성화 조건의 예는 상기한 바와 같다.

더욱이, 본 발명의 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 DNA는 그러한 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖고 조류에서 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 DNA를 포함한다.

목적 유전자가 발현될 수 있도록 본 발명의 프로모터 활성을 나타내는 상기DNA에 연결된 재조합 DNA의 적당한 위치에 본 발명의 조류에서 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 DNA를 추가로 삽입함으로써 전사효율을 증가시키는 것이 가능하다. 예를 들면, 적당한 위치는 프로모터 활성을 나타내는 DNA의 하류에 그에 인접하거나 그로부터 1 내지 10,000 뉴클레오타이드의 DNA 단편에 의해 분리되어 위치하는 것이다.

본 발명에 따른 터미네이터 활성을 나타내는 DNA(이하 터미네이터라 함)는 조류에서 터미네이터 활성을 나타내는 것이다. 그 예는 서열번호 3의 2718번에서 3764번 위치의 뉴클레오타이드 서열(즉 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열)을 갖는 DNA와 같은 김으로부터의 EF1-알파 A2 유전자의 터미네이터 또는 그의 일부를 포함하는 DNA이다. 본 발명의 DNA는 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열 내의 어떠한 DNA일 수도 있다.

본 발명의 터미네이터는 또한 엄격한 조건 하에서 그러한 DNA 단편 또는 그의 상보 쇄에 혼성화할 수 있고 조류에서 터미네이터 활성을 나타내는 DNA를 포함한다. 혼성화 조건의 예는 상기한 바와 같다.

더욱이, 본 발명의 터미네이터는 그러한 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖고 조류에서 터미네이터 활성을 나타내는 DNA를 포함한다.

목적 유전자가 발현될 수 있도록 본 발명의 프로모터 하류에 연결된 재조합 DNA의 하류에 본 발명의 터미네이터 활성을 나타내는 단편을 추가로 연결시킴으로써 목적 유전자의 발현효율을 증가시키는 것이 가능하다. 임의로, 목적 유전자의발현효율을 본 발명의 조류에서의 유전자의 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 DNA를 추가로 도입함으로서 더욱 증가시킬 수 있다.

본 발명에 따른 연장 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA(이하 EF 유전자라 함)의 예는 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부, 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부, 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA 또는 그의 일부이다. 본 발명에 따른 EF 유전자의 바람직한 예는 서열번호 1의 79번 내지 1425번 위치의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA, 서열번호 2의 65번 내지 1401번 위치의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 및 서열번호 3의 1368번 내지 2714번 위치의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA를 포함한다. 또한, 서열번호 8의 아미노산 서열 내의 어느 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA일 수 있다.

본 발명의 DNA는 또한 엄격한 조건 하에서 그러한 DNA 단편 또는 그의 상보 쇄에 혼성화할 수 있고 EF 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 포함한다. 혼성화 조건의 예는 상기한 바와 같다.

더욱이, 본 발명의 터미네이터는 그러한 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖고 EF 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA를 포함한다.

엄격한 조건 하에서 상기 DNA 또는 그의 상보 쇄에 혼성화할 수 있는 DNA, 또는 상기 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA의 예는 상기 DNA와 예를 들어 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 더욱 바람직하게는 97% 초과의 상동성을 갖는 DNA이다.

예를 들어, EF 활성은 Shalak, V. F. 등, Ukr. Biokhim. Zh., 69: 104-109(1997)에 기재된 바와 같은 방법에 따라 측정할 수 있다.

목적 유전자가 발현될 수 있도록 본 발명의 프로모터, 조류에서 전사효울을 증가시키는 활성을 나타내는 DNA, 또는 터미네이터 활성을 나타내는 DNA에 연결된 재조합 DNA를 벡터 중재 하에 또는 없이 조류로 도입할 수 있다. 바람직하게는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터를 벡터로 사용할 수 있다.

DNA가 도입되는 조류의 형태에 관하여 특별한 제한은 없다. 필라멘트상 엽상체, 포자, 엽상 엽상체, 배양 세포 또는 원형질체와 같은 어떠한 형태의 조류도 사용할 수 있다.

DNA를 조류로 도입하는 방법에 관하여 특별한 제한은 없다. 입자 총-매개 도입방법과 같은 공지의 방법을 사용할 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 프로모터는 아래와 같이 김으로부터 분리될 수 있다.

김은 로도파이타(Rhodophyta) 문, 로도파이세아(Rhodophyceae) 강, 프로토플로리데오파이시대(Protoflorideophycidae) 아강, 반기알레스(Bangiales) 목, 반기아세아(Bangiaceae) 과에 속하는 조류이다. 이것은 일본 홋카이도의 서부와 남부, 혼슈의 북부 부근과 한반도 부근에서 자연적으로 자란다.

김은 일반적으로 식품으로 섭취되고, 무성하게 양식되며 널리 시판되는 조류이다. 바다로부터 수획된 자생 조류, 양식 조류 또는 시판 조류를 본 발명을 위해사용할 수 있다. 공지의 방법(Kuwano, K. 등, Plant Sci., 116(1): 117-124(1996))에 따라 확립된 주를 또한 본 발명을 위해 사용할 수 있다.

<프로모터를 분리하기 위한 후보 유전자의 선별>

외래 유전자를 높은 수준으로 발현하기 위한 프로모터를 찾기 위하여, 숙주로서 조류에서 높은 수준으로 발현된 유전자를 찾고, 그의 게놈 서열을 분리하고 그 구조를 분석하는 것이 필요하다.

김으로부터의 발현 서열 태그(ESTs)의 서열은 카주사 DNA 리서치 인스티튜트(http://www.kazusa.or.jp/en/plant/porphyra/EST/)로부터 공중에 이용가능하다.

EST 클러스터링 분석을 서열 정보에 대해, 예를 들어 PARACEL CLUSTERING PACKAGE 소프트웨어(파라셀)를 이용하여 수행한다. 클러스터링 분석 결과 다수의 EST 서열이 동일한 클러스터에 속하는 것으로 결정된 유전자가 아마 높은 수준으로 발현되는 것으로 여겨진다. 따라서, 그러한 유전자의 프로모터를 분리하고자 하는 후보 서열로 사용할 수 있다.

예를 들면, 두 개의 그러한 유전자, 포르피라 예조엔시스 우에다 연장 인자 EF1-알파 A1 유전자 및 포르피라 예조엔시스 우에다 연장 인자 EF1-알파 A2 유전자(이하 A1 유전자 및 A2 유전자라 함)를 선별하고 본 발명의 프로모터를 분리하기 위한 재료로 사용할 수 있다.

후보 유전자에 대한 cDNA를 클러스터링 분석 결과 선별된 후보 유전자에 대한 클러스터에 함유된 EST 서열, 어셈블링에 의해 수득한 컨센서스 서열, 또는 그의 일부를 프로브로 사용하여 클로닝할 수 있다. 예를 들면, 프라이머를 A1 유전자에 속하는 EST 서열을 어셈블링하여 얻은 컨센서스 서열에 기초하여 설계할 수 있고, A1 유전자의 단편을 이 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭할 수 있으며, 이 단편을 프로브로 사용할 수 있다.

서열번호 1에 의해 나타내어지는 A1 유전자의 cDNA는 상기한 바와 같이 본 발명에 따라 분리된 신규한 후보 유전자의 cDNA의 예이다.

<유전자가 조류 생활주기에 걸쳐 높은 수준으로 발현되는지 여부를 조사>

후보 유전자의 DNA 서열을 프로브로 사용하는 노던 혼성화에 의해 조류 생활주기의 다양한 단계에서 발현된 mRNA의 양을 측정함으로써 후보 유전자가 조류 생활주기에 걸쳐 높은 수준으로 발현되는지 여부를 조사할 수 있다.

공지의 방법(예를 들면 구아니딘 티오시아네이트 방법 또는 페놀/클로로포름 방법)을 조류 조직으로부터 총 RNA를 추출하기 위해 사용할 수 있다. 추출된 총 RNA를 관심 있는 발현 mRNA의 양을 측정하기 위해 사용할 수 있다.

예를 들면, 총 RNA를 조류 김으로부터 변형된 페놀/클로로포름 방법을 이용하여 아래 단계의 생활주기에서 추출하고 아가로스 젤 전기영동 후 후보 유전자 DNA를 프로브로 사용하여 노던 혼성화시킨다:

(1) 모노스포어가 형성되지 않은 배우체 단계;

(2) 모노스포어가 형성된 배우체 단계;

(3) 모노스포어 형성 후 무성적으로 성장하는 배우체 단계:

(4) 팔라멘트상 포자체 단계.

다르게는, RT-PCR을 이용하여 발현 양상을 분석하는 것이 가능하다. 이 경우, 과 유전자를 더욱 엄격하게 구별하는 분석이 특이적인 프라머를 설계함으로써 가능하게 된다.

예를 들어, 유전자에 대한 cDNA의 번역 부위와 비번역 부위에 대한 프라이머, 주형으로 구아니딘 티오시아네이트 방법과 TaKaRa RNA PCR kit Ver. 2.1(다카라 슈조)을 이용하여 각 단계에서 추출된 총 RNA 등을 이용하여 RT-PCRs를 수행함으로써 상기 단계에서 후보 유전자의 발현 수준을 결정할 수 있다.

따라서, 조류에서 각 단계에서 높은 수준으로 발현되는 유전자를 찾을 수 있다.

<프로모터-포함 부위의 클로닝>

상기한 바와 같이 선별된 각 단계에서 높은 수준으로 발현되는 유전자의 프로모터-포함 부위를 예를 들어 유전자의 게놈 DNA에 대한 게놈 라이브러리를 스크리닝함으로써 분리할 수 있다.

본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니지만, 게놈 라이브러리를 사용하는 플라크 혼성화 방법, 미지의 서열을 공지의 서열에 기초하여 게놈 DNA를 사용하여 증폭하는 PCR 방법 등을 조류에서 높은 수준으로 발현되는 유전자의 프로모터를 클로닝하는데 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 분리된 서열번호 3에 의해 나타내어지는 신규한 연장 인자 EF1-알파 A2 유전자를 포함하는 게놈 DNA 단편이 각 단계에서 높은 수준으로 발현되는 유전자의 예이다. 이 서열은 A2 유전자(서열번호 3)와 cDNA 서열(서열번호 1) 및 클러스터링 분석 결과 얻어진 EST 서열의 비교, 및 전사 인자 서치, 코딩 부위 서치 및 인트론-엑손 서치에 의해 프로모터 서열, 인트론 서열과 터미네이터 서열을 포함하는 것으로 나타났다.

상세하게는, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열은 연장 인자 EF1-알파 A2 유전자의 전체 게놈 서열을 포함한다. 이 서열에서, 1368번부터 2717번 위치의 뉴클레오타이드 서열이 A2 폴리펩타이드-코딩 서열(종결 코돈 포함)이고, 878번부터 1331번 위치의 뉴클레오타이드 서열이 제1 인트론 서열이며, 1번부터 859번 위치의 뉴클레오타이드 서열이 프로모터 서열이고, 2718번부터 3764번 위치의 뉴클레오타이드 서열이 터미네이터 서열이다.

서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열과 cDNA 서열(서열번호 1) 및 클러스터링 분석 결과 얻어진 EST 서열을 비교하여 A2 유전자에 대한 cDNA의 서열을 밝혔다. 이 서열을 서열번호 2에 나타내었다. 이 서열에서, 서열번호 3의 뉴클레오타이드 서열에 포함된 부위는 EF1-알파 A2 유전자의 엑손 부위이다.

본 발명에 따라 분리된 프로모터는 조류에서 프로모터 활성을 나타내고 조류에서 목적 유전자를 발현하는데 사용될 수 있는 DNA이다. 또한, 프로모터 활성을 나타내고 엄격한 조건 하에서 이 서열과 혼성화할 수 있는 DNA, 또는 프로모터 활성이 제거되지 않도록 이 서열에서 뉴클레오타이드(들)가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 DNA를 상기 목적을 위해 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 분리된 터미네이터는 조류에서 터미네이터 활성을 나타내고 조류에서 목적 유전자의 발현효율을 증가시키는데 사용될 수 있는 DNA이다. 또한, 터미네이터 활성을 나타내고 엄격한 조건 하에서 이 서열과 혼성화할 수 있는 DNA,또는 터미네이터 활성이 제거되지 않도록 이 서열에서 뉴클레오타이드(들)가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 DNA를 상기 목적을 위해 사용할 수 있다.

고등식물에서, 일부 경우 도입을 위해 인트론 서열을 함유하는 유전자를 사용하고, 목적 단백질을 도입된 유전자로부터 높은 수준으로 생산함으로써 전사효율이 증가되는 것이 알려져 있다. 본 발명에 따라 분리된 제1 인트론을 조류에서 발현시키고자 하는 목적 유전자의 전사효율을 증가시키기 위하여 사용할 수 있다. 엄격한 조건 하에서 이 서열과 혼성화할 수 있는 DNA, 또는 이 서열에서 뉴클레오타이드(들)가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 DNA를 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 한 상기 목적을 위해 사용할 수 있다.

본 발명에 따라 분리된 엑손 부위는 조류의 새로운 연장 인자(EF), EF1-알파 A2 폴리펩타이드를 코딩하는 서열이다. 이 서열은 유전공학 기술을 이용하여 EF1-알파 A2 폴리펩타이드를 생산하는데 사용할 수 있다. 또한, 이 서열을 추가의 새로운 EF 유전자, 특히 조류로부터의 새로운 EF 유전자를 스크리닝하기 위한 프로브나 프라이머를 위해 사용할 수 있다.

여기에 개시된 본 발명의 DNA는 상기한 바와 같이 분리될 수 있다. 다르게는, 여기에 개시된 서열정보에 기초하여 화학적으로 합성될 수 있다.

조류에서 프로모터 활성을 나타내는 DNA는 본 발명에 따라 최초로 분리되었다. 그 후, 지금까지 불가능하였던 조류에서의 목적 유전자의 인공적 발현이 가능하게 되었다. 더욱이, 터미네이터 활성을 나타내는 DNA와 인트론이 조류로부터 최초로 분리되었다. 그 후, 이제 조류에서 목적 유전자의 발현효율을 증가시키는 것이 가능해졌다. 상기한 것은 유전공학 기술을 이용하여 조류에서 유용한 물질의 생산을 가능하게 한다. 또한, 전통적으로 매우 비효율적인 교배육종에 의존할 수밖에 없었던 조류의 육종을 유전공학 기술을 사용하여 효율적으로 수행하는 것이 가능해졌다.

새로운 연장 인자가 본 발명에 따라 최초로 조류로부터 분리되었다. 그 후, 이제 수획되거나 배양된 조류로부터 얻을 수밖에 없었던 조류의 연장 인자를 유전공학 기술을 이용하여 생산하는 것이 가능하다.

하기 실시예들이 본 발명을 상세하게 설명하지만 그 범위를 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.

실시예 1: 김의 각 단계로부터의 mRNA의 제조

1. 재료

Kuwano, K. 등, Plant Sci., 116(1): 117-124(1996)에 의해 확립된 포르피라 예조엔시스 우에다의 순수한 주, 포르피라 예조엔시스 우에다 TU-1으로부터의 엽상 배우체와 필라멘트상 포자체를 사용하였다.

2. 배양 조건

엽상 배우체를 15 ℃, 10 시간 명기(광량 80 μE/(㎡·s); 백색형광등) 및 14 시간 암기로 ESL 배지(3.5%(w/v) SEALIFE 파워(Marine Tech), 1%(v/v) ESS₂)를 함유하는 1-1 사이드암 평저 유리 플라스크(파이렉스)에서 통기(여과에 의해 멸균된 공기, 0.12 ℓ/분) 하에 환류부유 상태에서 배양하였다.

필라멘트상 포자체를 ESL 배지를 함유하는 500-㎖ 유리 엘렌마이어 플라스크에서 25 ℃, 명소(광량 17 μE/(㎡·s); 백색형광등)에서 24 시간 정치배양하였다.

3. 총 RNA의 분리

총 RNA를 아래 단계에서 김 TU-1으로부터 추출하였다: 모노스포어 형성 전 1- 내지 2-㎜ 길이 엽상 배우체, 30 분간 모노스포어 방출 유도시킨 2-㎜-길이 엽상 배우체, 1- 내지 2-㎝-길이 엽상 배우체, 및 필라멘트상 포자체.

총 RNAs를 Apt, K. E. 등, Mol. Gen. Genet., 246(4): 455-464(1995)에 기재된 페놀/클로로포름 방법을 일부 변형하여 추출하였다.

조류로부터 총 RNA를 추출하는데 사용된 과정을 아래 기재한다.

종이 타월을 사용하여 물을 제거한 후, 배양된 조류를 칭량하였다. 1.2 g의 조류를 액체 질소에서 막자사발과 막자를 이용하여 분쇄하였다. 분쇄된 조류를 액체 질소에서 예냉시킨 숟가락을 사용하여 16.8 ㎖의 추출 완충액(100 mM Tris-HCl(pH 8.0), 1.5 M NaCl, 20 mM EDTA, 20 mM DTT(디티오트레이톨) 및 2% CTAB(세틸트리메틸암모늄 브로마이드))을 함유하는 50-㎖ 원심분리 튜브에 옮겼다. 혼합물을 실온에서 15 분간 쉐이커 NR-1(타이텍)을 이용하여 110 rpm/분에서 혼합하였다. 그 후, 동일한 부피의 클로로포름을 가하고, 혼합물을 교반하였다.

혼합물을 원심분리하여 상층을 모았다. 1/3 부피의 에탄올을 천천히 적가하고 혼합하였다. 혼합물을 원심분리하여 주로 다당류로 구성된 침전물을 제거하였다. 동일한 부피의 클로로포름을 상등액에 가하고 교반하였다. 혼합물을 원심분리하여 상등액을 모았다. 이 과정을 상등액이 탈색될 때까지 반복하였다.

상등액을 모았다. 1/2 부피의 9 M LiCl과 1/100 부피의 β-머캅토에탄올을 상등액에 가하였다. 혼합물을 -20 ℃에서 밤새 방치하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 모으고, 50 ㎕의 DEPC(디에틸 피로카보네이트)-처리된 물에 녹이고 동일 부피의 페놀/클로로포름(1:1)으로 추출하였다. 이 추출 과정을 중간층이 사라질 때까지 반복하였다.

상층을 모았다. 1/10 부피의 3 M 아세트산나트륨과 2 부피의 에탄올을 상층에 가하고 혼합하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 모으고, 75% 에탄올로 헹궈 공기-건조시켰다.

침전물을 90 ℓ의 DEPC-처리된 물에 녹였다. 1 ㎖의 ISOGEN(와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈)을 가하였다. 혼합물을 실온에서 5 분간 방치하였다. 0.2 ㎖의 클로로포름을 가하였다. 교반 후, 혼합물을 실온에서 2 내지 3 분간 방치하였다.

혼합물을 원심분리하여 상등액을 얻었다. 0.5 ㎖의 이소프로판올을 가하였다. 생성된 침전물을 원심분리에 의해 모으고, 75% 에탄올로 헹궈 공기-건조하고, 400 ㎕의 DEPC-처리된 물에 녹였다.

더욱이, 남아있는 다당류를 제거하기 위하여, 200 ㎕의 고염 침전 용액(1.2 M NaCl, 0.8 M 시트르산 삼나트륨 이수화물, pH 미조정)과 200 ㎕의 이소프로판올을 가하고, 혼합물을 원심분리하였다. 생성된 침전물을 75% 에탄올로 헹구고, 공기-건조하여, 100 ㎕의 DEPC-처리된 물에 녹였다.

상기한 바와 같이 추출된 총 RNA의 농도와 순도를 분광광도계 UV-2002(시마쥬)를 사용하여 결정하였다. 또한, 총 RNA를 1.0% 아가로스 젤 전기영동하여 분해되지 않았음을 확인하였다.

mRNA를 상기한 바와 같이 추출된 총 RNA로부터 Oligotex™-dT30 super(로슈)를 이용하여 첨부된 설명서에 따라 분리하였다.

실시예 2: 김 EST 서열의 클러스터링 분석

분석을 위해 사용한 김 EST 서열을 카주사 DNA 리서치 인스티튜트(http://www.kazusa.or.jp/en/plant/porphyra/EST/)의 홈페이지로부터 다운로드받았다. 다운로드받은 총 10154개의 김 EST 서열을 PARACEL CLUSTERING PACKAGE(파라셀)를 이용하여 서열 클러스터링하였다.

그 결과, 8243개의 서열이 1140개의 클러스터로 분류되고 1911개 서열은 어느 클러스터에도 속하지 않았다.

가장 많은 서열이 속한 50개의 클러스터에 대한 클러스터 IDs의 리스트를 아래 표 1 내지 4에 나타내었다. 유전자가 높은 수준으로 발현되면, 클러스터에 속하는 서열의 수(서열 카운트)가 더 클 것으로 생각된다.

더욱이, 각각의 클러스터에 속하는 서열을 어셈블링함으로써 생성된 컨티그(contigs)의 컨센서스 서열에 대해 BLAST 프로그램(Altschul, S. F. 등, Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402(1997))을 이용하여 NCBI(National Center for Biotechnology Information)(http://www.ncbi.nih.go/)의 뉴클레오타이드 데이타베이스(비-중복 핵산의 데이타베이스) 상동성 서치를 수행하였다.

상동성 서치 결과 중, 가장 높은 히트 스코어가 관찰된 클러스터의 컨티그에대해 컨티그 IDs, 서열 수(서열 카운트)와 GenBank 등록번호를 번호(No.)와 함께 표 1 내지 4에 나타내었다. 또한, 스코어와 E 값을 표 1 내지 4에 나타내었다.

김 EST 서열의 클러스터링

No.	클러스터 ID	서열 카운트	컨티그 ID	GenBank 등록번호	스코어	E 값
1	145	687	3	X60733.1	220	8.00E-55
2	13	500	5	L26199.1	3495	0
3	0	394	3	X57263.1	163	8.00E-38
4	40	131	1	U65510.1	42	0.041
5	17	113	B1	D10167.1	42	0.21
6	72	90	1	AC003030.1	42	0.47
7	16	80	1	NM_003654.1	48	0.006
8	107	76	1	M72894.1	48	0.005
9	261	75	1	AC006214.1	44	0.075
10	25	60	1	Y00545.1	42	0.11
11	284	58	2	Z79601.1	40	0.94
12	459	57	1	U77477.1	46	0.019
13	38	49	1	AL009198.1	42	0.28
14	4	47	1	AJ012146.1	38	4.3

김 EST 서열의 클러스터링(계속 1)

No.	클러스터 ID	서열 카운트	컨티그 ID	GenBank 등록번호	스코어	E 값
15	189	47	1	X62072.1	46	0.027
16	74	46	1	AC004476.1	48	0.002
17	334	41	1	AB025619.1	44	0.052
18	120	40	1	AL008728.1	44	0.037
19	291	38	1	AF080121.1	488	E-135
20	350	38	2	D86993.1	40	0.94
21	508	38	1	AC006213.1	42	0.18
22	5	37	1	M11779.1	42	0.28
23	114	37	1	AF034863.1	40	0.96
24	401	35	1	AB025615.1	42	0.33
25	97	32	1	M88684.1	551	E-155
26	515	32	1	AL021707.2	42	0.32
27	56	31	1	X97257.1	44	0.047
28	676	31	1	Z98747.1	42	0.2
29	320	30	1	Z79702.1	40	0.98
30	369	30	1	D86051.1	58	2.00E-06

김 EST 서열의 클러스터링(계속 2)

No.	클러스터 ID	서열 카운트	컨티그 ID	GenBank 등록번호	스코어	E 값
31	700	30	1	AB005232.1	44	0.043
32	9	29	1	U08844.1	1889	0
33	348	29	1	U58679.1	74	5.00E-11
34	812	29	1	AF071752.1	50	8.00E-04
35	14	28	1	AC005615.1	42	0.62
36	251	28	1	AF064842.1	46	0.024
37	383	28	1	AJ012478.1	220	4.00E-55
38	806	28	1	AF117660.1	40	0.75
39	122	27	1	NM_003330.1	40	1
40	321	26	1	X61361.1	42	0.19
41	564	26	1	AB022100.1	40	0.83
42	132	25	1	AF055296.1	64	9.00E-08
43	279	25	1	U13168.1	86	2.00E-14
44	382	25	1	M74056.1	42	0.32
45	140	24	1	D38516.1	188	2.00E-45
46	451	24	1	X80345.1	593	E-167

김 EST 서열의 클러스터링(계속 3)

No.	클러스터 ID	서열 카운트	컨티그 ID	GenBank 등록번호	스코어	E 값
47	672	24	1	Z97055.1	44	0.056
48	662	23	1	AP000133.1	40	0.67
49	34	22	1	D12631.1	74	6.00E-11
50	399	22	1	AC005288.1	42	0.29

히트의 GenBank 등록번호 표제를 표 5 내지 8에서 히트 명칭 하의 칼럼에 나타내었다.

히트의 등록 번호에 대한 표제

No.*	히트 명칭
1	감마-비근육 액틴의 O. cuniculus mRNA
2	Porphyra leucosticta DNA 단편
3	히스톤 H2B-Ⅳ의 닭 유전자
4	Rhodospirillum rubrum CO-유도 하이드로게나제 오페론(cooM, cooK, cooL, cooX, cooU, cooH) 유전자, 철 황 단백질(cooF) 유전자, 일산화탄소 데하이드로게나제(cooS) 유전자, 일산화탄소 데하이드로게나제 액세서리 단백질(cooC, cooT, cooJ) 유전자, 추정 전사 활성화제(cooA) 유전자, 니코티네이트-뉴클레오타이드 피로포스포릴라제(nadC) 유전자, 완전 cds, L-아스파테이트 옥시게나제(nadB) 유전자, 및 알킬 하이드로퍼옥시다제 리덕타제(ahpC) 유전자, 일부 cds
5	리보솜 단백질 S15의 닭 rig 유전자
6	인간 염색체 19, 오버랩핑 코스미드 R29828 및 F25496, 완전 서열
7	인간 탄수화물(콘드로이틴 6/케라탄) 설포트랜스퍼라제 1(CHST1), mRNA
8	대두 페리틴(SOF-H2) mRNA, 일부 cds
9	초파리 염색체 2L, 부위 36A7-36A13, P1 클론 DS04680 및 DS00592, 완전 서열
10	칼모듈린-민감성 아데닐레이트 사이클라제의 Bordetella pertussis cya 유전자
11	Caenorhabditis elegans 코스미드 K09A9, 완전 서열
12	Oryctolagus cuniculus 응고 인자 Ⅶ mRNA, 완전 cds
13	Mycobacterium tuberclosis H37Rv 완전 게놈: 세그먼트 144/162
14	Ovis aries cyp19 유전자, 엑손 4

*: 표 5의 No.는 표 1의 No.에 상응한다.

히트의 등록 번호에 대한 표제(계속 1)

No.*	히트 명칭
15	KdgR 억제제에 대한 KdgR 유전자의 Erwinia chrysanthemi kdgR 유전자
16	인간 염색체 19, 코스미드 R29388, 완전 서열
17	Arabidopsis thaliana 게놈 DNA, 염색체 5, P1 클론: MBA10
18	염색체 6q26-27 상의 클론 125N5로부터의 인간 DNA 서열, 추정 신규 유전자, ESTs, STSs 및 GSSs 포함, 완전 서열
19	Arabidopsis thaliana BAC T25C13
20	인간 면역글로불린 람다 유전자 위치 DNA, 클론: 23C6
21	인간, 클론 hRPK.15_A_1, 완전 서열
22	돼지 칼파인 Ⅰ 경 서브유닛 mRNA, 완전 cds.
23	Rattus norvegicus 시냅스 스캐폴딩 분자(S-SCAM) mRNA, 완전 cds.
24	Arabidopsis thaliana 게놈 DNA, 염색체 3, TAC 클론: K5K13
25	Aglaothamnion neglectum 유비퀴틴 mRNA, 완전 cds
26	염색체 22q12-13 상의 클론 RP3-508115로부터의 인간 DNA 서열, GTPBP1(GTP 결합 단백질 1) 유전자 , 2개의 새로운 유전자 KIAA0063 및 KIAA0668, ESTs 및 cDNA에 기초한 신규 유전자, AOP1(항산화제 단백질 1)과 유사한 슈도유전자, ESTs, STSs, GSSs, 게놈 마커 D22S272, CA 리피트 및 CpG 아일랜드, 완전 서열
27	슈도래비스 바이러스 UL[5, 6, 7, 8, 8.5, 9, 10, 11, 12, 13] 유전자
28	염색체 1p36.2-36.3 상의 클론 37J18로부터의 인간 DNA 서열, 추정 신규 유전자, ESTs 및 GSSs 포함, 완전 서열
29	Mycobacterium tuberclosis H37J18 완전 게놈; 세그먼트 102/062
30	카보닉 언하이드라제의 Porphyridium purpureum mRNA, 완전 cds

*: 표 6의 No.는 표 2의 No.에 대응하는 것이다.

히트의 등록 번호에 대한 표제(계속 2)

No.*	히트 명칭
31	Arabidopsis thaliana 게놈 DNA, 염색체 5, P1 클론: MBG8
32	Porphyra purpurea 연장 인자 EF1-알파(tef-c) mRNA
33	Porphyridium cruentum 광-수획 복합체 Ⅰ 폴리펩타이드(Lhca1) mRNA, 완전 cds
34	Neurospora crassa 단백질 포스파타제-Z-결합 세린/트레오닌 단백질 포스파타제(pzl-1) mRNA, 완전 cds
35	인간 염색체 19, 코스미드 19, 코스미드 R28058, 완전 서열
36	인간 map 2q30-p32; 상부 반복 부위로부터의 202.6 cR, 완전 서열
37	Ran 단백질에 대한 Salmo salar mRNA
38	Triticum aestivum S-아데노실메티오닌 디카복실라제 전구체, mRNA, 완전 cds.
39	인간 티오레독신 리덕타제 1(TXNRD1) mRNA
40	포토시스템 Ⅱ의 광 수획 클로로필 a/b의 E. gracilis 유전자
41	T-카데린의 Mus musculus mRNA, 완전 cds.
42	Zantedeschia aethiopica 제라닐제라닐 리덕타제 mRNA, 일부 cds.
43	Chlamydomonas reinhardtii YptC1(yptC1) 유전자, 완전 cds.
44	Myxococcus xanthus 단백질 U 유전자, 완전 cds.
45	인간 Rab11B mRNA
46	28S 리보솜 RNA의 H. catenoides 유전자

*: 표 7의 No.는 표 3의 No.에 상응한다.

히트의 등록 번호에 대한 표제(계속 3)

No.*	히트 명칭
47	염색체 22 상의 클론 RP3-388M5로부터의 인간 DNA 서열, RPL4(60S 리보솜 단백질 4) 슈도유전자, 고-운동성 그룹의 HMG17L1 유전자(비-히스톤 염색체) 단백질 17-양 1, 신규 설포트랜스퍼라제(설포키나제, EC 2.8.2.1)-양 단백질 유전자, GS2-양 단백질 유전자, ESTs, STSs, GSSs 및 4개의 추정 CpG 아일랜드 포함, 완전 서열
48	21q22.1, GART 및 AML, f43D11-119B8 부위의 인간 게놈 DNA, 세그먼트 8/10, 완전 서열
49	리보솜 L7A의 벼 mRNA, 완전 cds.
50	인간 염색체 17, 클론 hCIT.131_K_11, 완전 서열

*: 표 8의 No.는 표 4의 No.에 대응하는 것이다.

히트 유전자 표제를 mRNA 또는 cDNA(게놈 서열의 클론이나 그의 단편이 아닌), 또는 용어 Porphyra를 포함하는 히트에 대해 스크리닝하였다. 그 결과, 포르피라 예조엔시스 우에다와 밀접하게 관련된 유기체로부터의 유전자를 발견하였다.

더욱이, 포르피라 예조엔시스 우에다와 밀접하게 관련된 유기체로부터의 2개의 mRNA 또는 cDNA 서열들, 클러스터 번호 13(표 1과 5의 번호 2) 및 클러스터 번호 9(표 3과 7의 번호 32)를 높은 수준으로 발현된 유전자 서열의 스크리닝에 의해 50개의 클러스터 중에서 찾았다.

2 개의 mRNA 또는 cDNA 서열 중 하나인, 클러스터 번호 13은 18S rRNA와 매우 상동적이다. 클러스터 번호 9의 컨티그 1의 컨센서스 서열을 이용한 상동성 서치 결과, 하나의 히트가 포르피라 푸르푸레아 연장 인자 EF1-알파(tef-c) mRNA(GenBank 등록번호 U08844)에 대해 발견되었다. 이것은 본 발명의 목적을 위해 가장 적합한 후보 중 하나인 것으로 여겨졌다.

또한, 클러스터 번호 9의 컨티그 1의 어셈블링 결과에서 미스매치가 존재하고, 서열들이 두 그룹으로 나뉘어지고, 특히 5' 말단의 비번역 부위의 서열이 명확히 구별되는 것으로 밝혀졌다.

상기 결과에 기초하여, 두 그룹의 유전자를 포르피라 예조엔시스 연장 인자 EF1-알파 A1 및 연장 인자 EF1-알파 A2 유전자라 명명하였다(이하 A1 및 A2 유전자라 함).

실시예 3: A1 유전자의 전장 cDNA의 클로닝, 서열결정 및 서열분석

1. 재료

포르피라 예조엔시스 우에다 TU-1(Kuwano, K. 등, Plant Aci., 116(1): 117-124(1996)에 의해 확립)의 배양된 단일 조류 엽상 배우체를 cDNA 클로닝의 재료로 사용하였다.

2. 배양조건

포르피라 예조엔시스 우에다 TU-1을 15 ℃, 10 시간 명기(광량 80 μE/(㎡·s); 백색형광등) 및 14 시간 암기를 갖는 단일 조건 하에서 ESL 배지를 함유하는 1-1 사이드-암 평저 플라스크(파이렉스)에서 통기 하에(0.2-㎛ 필터(어드밴텍)으로의 여과에 의해 멸균된 공기, 0.25 ℓ/분) 환류부유 상태에서 배양하였다. 배지를 매 7 일마다 교환하였다.

3. RNA 추출

총 RNA를 실시예 1에 기재된 바와 같은 방법에 따라 포르피라 예조엔시스 TU-1의 배양된 단일 조류 엽상 배우체로부터 추출하였다.

4. cDNA 라이브러리 스크리닝을 위한 프로브의 제조

Kitade 등, J. Phycol., 32: 396-498(1996)에 기재된 방법에 따라 포르피라 예조엔시스 우에다 TU-1으로부터 DNA를 추출하였다.

이 DNA를 주형으로 하여, AmpliTaq Gold(어플라이드 바이오시스템즈), 및 두 프라이머, PYEF1(서열번호 7) 및 PYEFR1(서열번호 5)을 사용하여 PCR을 수행하였다. 이들 프라이머를 EF1-알파 유전자의 모티프를 함유하는 고도로 보존된 서열을 증폭하기 위하여 실시예 2에 기재된 바와 같은 EST 클러스터링 결과에 기초하여 설계하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 2 분간 예열; 94 ℃에서 1 분간, 53 ℃에서 1 분간, 72 ℃에서 2 분간 30 사이클; 72 ℃에서 10 분간 최종 반응.

생성된 약 170-bp PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤 전기영동시켰다. 관심있는 밴드를 Geneclean Ⅱ kit(바이오101)를 이용하여 젤로부터 회수하고, DNA ligation kit Ver. 2(다카라 슈조)를 이용하여 TA 클로닝용 벡터에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 통상의 방법(Maniatis et al.(eds.), Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1989)에 따라 대장균 JM109 컴피턴트 세포로 도입하였다. 대장균 형질전환체의 콜로니들을 앰피실린 함유 LB 아가 배지 상에서 배양하여 얻었다.

형질전환체 콜로니들을 무작위로 픽업하였다. 콜로니에 하버링된 플라스미드의 삽입체 길이를 벡터 pT7Blue 및 프라이머 M4(다카라 슈조) 서열을 갖는 T7 프로모터 프라이머(노바젠)를 사용하여 PCR 증폭산물의 전기영동에 의해 결정하였다. 예상된 길이의 DNA 단편을 갖는 대장균 콜로니를 선별하였다.

대장균 형질전환체의 선별된 콜로니를 액체 배양하였다. 그 후 플라스미드를 QIAGEN Plasmid Mini Kit(퀴아젠)를 이용하여 추출하였다.

뉴클레오타이드 서열을 주형으로 이 플라스미드와 dRhodamine Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(어플라이드 바이오시스템즈)를 이용하여 사이클 서열결정 방법에 따라 결정하였다. 사이클 시퀀싱 반응을 아래와 같이 수행하였다: 96 ℃에서 2 분간 예열; 96 ℃에서 10 분간, 50 ℃에서 5 초간, 60 ℃에서 4 분간 25 사이클.

생성된 반응산물을 에탄올 침전을 이용하는 단순화된 방법에 따라 정제하였다. 그 후 뉴클레오타이드 서열을 ABI PRISM 310 Genetic Analyzer(어플라이드 바이오시스템즈)를 사용하여 결정하였다. 플라스미드 추출과 뉴클레오타이드 서열 결정을 첨부된 설명서에 따라 수행하였다.

뉴클레오타이드 서열 결정 후, 결정된 서열이 관심있는 서열인지 여부를 확인하기 위하여 핵산 서열 데이타베이스의 상동성 서치를 NCBI로부터 공중에 이용가능한 BLAST 프로그램(Altschul, S. F. 등, Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402(1997))을 이용하여 수행하였다. 서치 결과 결정된 서열이 클러스터링과 어셈블링에 기초하여 예측된 A1 유전자의 서열에 가장 잘 매치하는 것으로 밝혀졌다.

주형으로 상기 조건 하에서 서열이 결정된 플라스미드와 프라이머 PYEF1(서열번호 7) 및 PYEFR1(서열번호 5)를 사용하여 PCR을 다시 수행하였다. PCR 산물을 PCR DIG Labeling Mix(로슈)를 사용하여 디곡시제닌으로 표지하였다. 표지 반응 후, 스크리닝을 위한 프로브를 Quick Spin Columns™ G-50(로슈)를 이용하여 표지산물을 정제하여 미반응 기질을 제거함으로써 얻었다. 표지화 및 정제를 첨부된 설명서에 따라 수행하였다.

5. cDNA 라이브러리의 제작

cDNA 라이브러리 제작에 사용된 cDNA를 Timesaver cDNA Synthesis Kit(아머샴 파마시아 바이오텍)를 사용하여 실시예 3-4에서 제조한 폴리(A)⁺mRNA로부터 합성하였다. EFLCpure™ 클로닝된 쥐 역전사효소(아머샴 파마시아 바이오텍)를 cDNA 합성을 위한 역전사효소로 사용하였다. 반응온도는 44 ℃였다.

합성된 cDNA를 벡터 λZAPⅡ(스트라타진)에 결찰시켰다. 결찰 반응산물을 Gigapack Ⅲ Gold Packaging Extract(스트라타진)를 이용하여 팩키징하였다. 상기한 바와 같은 팩키징에 의해 얻은 파지 현탁액을 cDNA 라이브러리로 사용하였다.

6. 일차 스크리닝

팩키징에 의해 얻은 파지 현탁액을 ZAP-cDNA Synthesis Kit(스트라타진)에 첨부된 설명서에 따라 바닥 플레이트가 준비되고 미리 인큐베이션된 24×24-㎝ 사각형 페트리 디쉬 MS-12450(스미토모 바케라이트) 상으로 약 1×10⁵플라크의 농도로 도포하였다. 플레이트 상에 형성된 파지 플라크를 니트로셀룰로스 막 NITROPLUS 2000(후나코시)으로 통상의 방법에 따라 옮겼다.

막을 알칼리 변성 용액(0.9 M naOH, 1.5 M NaCl)에 2 내지 5 분간, 중화 용액(1.5 M Tris-HCl(pH 7.5), 1.5 M NaCl)에 2 내지 5 분간 담갔다. 그 후 막을 6×SSC로 세척하고, 건조하여 건열 멸균기 SP-650(어드밴텍)에서 80 ℃로 2 시간 가열하였다.

막을 변성 연어 정자 DNA를 최종 농도 100 ㎍/㎖로 함유하는 혼성화 용액(5×덴하르츠, 4.1 mM EDTA, 0.5% SDS, 6×SSC) 중에 65 ℃에서 2 시간동안 인큐베이션하여 예비혼성화를 수행하였다.

그 후, 막을 최종 농도 100 ㎍/㎖의 변성 연어 정자 DNA와 최종 농도 10 ng/㎖의 단일 쇄로 열변성된 실시예 3-4에서 제조된 프로브를 함유하는 혼성화 용액 중에 60 ℃에서 밤새(12 시간 이상) 인큐베이션하여 혼성화를 수행하였다.

혼성화 후, 막을 세척 용액(2×SSC, 0.1% SDS) 중에 실온에서 5 분간 인큐베이션하여 미결합 프로브, 혼성화 용액 등을 씻어내었다. 세척 과정을 2회 반복하였다.

그 후, 막을 미리 60 ℃에서 인큐베이션한 세척 용액(0.5×SSC, 0.1% SDS) 중에 60 ℃에서 20 분간 인큐베이션하여 비특이적으로 결합된 프로브를 해리시켰다. 세척과정을 2회 반복하였다.

그 후, 막을 미리 60 ℃에서 인큐베이션한 세척용액(0.1×SSC, 0.1% SDS) 중에서 60 ℃에서 20 분간 인큐베이션하여 비특이적으로 결합된 프로브를 해리시켰다. 세척과정을 2회 반복하였다.

DIG DNA Labelling and Detection Kit(로슈)에 첨부된 설명서에 따라 발색 반응을 이용하여 디곡시제닌 검출을 수행하였다. 검출 결과를 사진용 라이트 박스(LIGHT BOX NEW 5000 INVERTER(후지 칼라))를 이용하여 관찰하였다. 일차 스크리닝을 상기 과정에 따라 수행하였다.

7. 이차 스크리닝

일차 스크리닝에사 양성 파지를 모으고, Manabe, K., Bio Jikken Illustrated(4): Kurous Nashi No Cloning, Shujunsha(1997)의 방법에 따라 라이브러리 증폭시켰다.

증폭된 파지 현탁액을 바닥 플레이트가 준비되고 미리 인큐베이션된 9-㎝ 페트리 디쉬(높이: 1.5 ㎝, 직경: 9 ㎝)에 50 내지 100 플라크/플레이트의 농도로 도말함으로써 얻은 플라크에 대해 이차 스크리닝을 수행하였다. 일차 스크리닝에 관하여 상기한 것과 유사한 방식으로 이차 스크리닝을 수행하였다.

상기 방법에 따라, 엽상 배우체의 cDNA 라이브러리를 제작하고, 일차 스크리닝을 수행하고, 양성 클론을 증폭하였다. 5개의 양성 클론을 증폭 파지 현탁액으로부터 얻은 1×10⁵플라크를 스크리닝하여 분리하였다. 이차 스크리닝에서 양성으로 결정된 플라크에 대해 PCRs를 두 벡터 서열-특이적 프라이머(T3 프로모터 프라이머(노바젠)) 및 T7 프로모터 프라이머(노바젠))를 사용하여 수행하였다. 증폭 산물을 1.0% 아가로스 젤 전기영동시켜 삽입 단편의 길이를 결정하였다.

파지 벡터에 삽입된 단편을 ZAP-cDNA Synthesis Kit(스트라타진)에 첨부된 설명서에 따라 생체 내 절개에 의해 플라스미드 벡터로 서브클로닝하였다.

생체 내 절개 결과 생성된 콜로니들을 무작위로 픽업하고, 상기한 프라이머 쌍(T3 프로모터 프라이머 및 T7 프로모터 프라이머)을 이용하여 PCR시켰다. 증폭 산물을 1.0% 아가로스 젤 전기영동시켜 삽입 단편의 길이를 결정하였다.

8. 뉴클레오타이드 서열 분석

가장 긴 cDNA 삽입체를 갖는 플라스미드를 대장균으로 도입시켰다. 생성된 형질전환체를 액체 배양하였다. 플라스미드를 QIAGEN 플라스미드 미니 키트(퀴아젠)를 이용하여 추출하였다. 삽입된 cDNA 부위의 뉴클레오타이드 서열을 프라이머 워킹 방법에 따라 플라스미드를 이용하여 결정하였다.

결정된 cDNA 서열을 서열번호 1에 나타내었다. 1350-bp 오픈 리딩 프레임(ORF, 79번부터 1428번 위치, 정지 코돈 포함)이 1644-bp cDNA 서열에서 발견되었다. 이 ORF는 449 아미노산으로 구성된 단백질을 코딩한다. 이 ORF에 의해 코딩되는 단백질의 아미노산 서열은 서열번호 8에 나타내었다. 이 ORF에 의해 코딩되는 단백질의 예상 분자량과 등전점은 각각 49.4 KDa 및 9.18이다.

코작 규칙(Kozak, M., Cell, 44: 283-292(1986))에 따른 서열과 유사한 서열(ATCATGG)이 개시 코돈을 포함한 76번부터 82번 위치의 부위에서 발견되었다.

폴리(A) 부가 신호(AATAAA)나 폴리(A) 테일이 cDNA 서열에 발견되지는 않았지만, 출아하는 효모 사카로마이세스 세레비시에의 CYC1 유전자에 대해 보고된 폴리(A) 부가 서열(TACATA; Proudfoot, N., Cell, 64(4): 671-674(1991))과 유사한 서열(TACTATT)이 1579번 내지 1585번 위치의 부위에서 발견되었다.

얻어진 서열이 EF-1α를 코딩하는 유전자인지를 확인하기 위하여 상동성 서치와 모티프 서치를 수행하였다.

NCBI로부터 공중에게 이용가능한 BLAST 2.0 ADVANCED BLAST SEARCH(Altschul, S. F. 등, Nucleic Acids Res., 25(17): 3389-3402(1997))의BLASTX 2.0.10 프로그램을 이용하여 상동성 서치를 수행하였다.

Interpro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)로부터 공중에게 이용가능한 프로그램 InterPro Release 4.0(Apweiler, R. 등, J. Biosci., 26(2): 277-284(2001)을 이용하여 PROSITE 모티프 데이타베이스(http://www.expasy.ch/prosite/)의 모티프 서치를 수행하였다.

BLASTX 프로그램(뉴클레오타이드 서열을 이용하여 아미노산 서열을 서치하기 위한)을 이용한 상동성 서치에서 제1 히트는 포르피라 푸르푸레아 EF-1α tef-c에 대해 상동성 스코어 887로 관찰되었다. 매우 낮은 E 값(목적 데이타베이스와 동일한 크기를 갖는 임의의 서열 라이브러리의 무작위 서치 시 유사성 스코어 위의 스코어를 갖는 히트 수의 예상값)은 이 히트가 우연이 아님을 보여준다. 따라서, 이 실시예에서 결정된 상기 서열이 포르피라 푸르푸레아 EF-1α tef-c에 상동적임이 분명하다.

InterPro를 이용한 아미노산 모티프 서치의 결과는 아래와 같다.

PROSITE 데이타베이스 서치 결과, ATP/GTP-결합 위치 모티프 A(P-루프)(PROSITE 등록번호 PS00017)가 서열번호 8의 아미노산 서열의 14번 내지 21번 위치 부위(GHVDSGKS)에서 발견되었고, GTP-결합 연장 인자 신호(PROSITE 등록번호 PS00301)가 서열번호 8의 아미노산 서열의 61번 내지 76번 위치 부위(DKLKAERERGITIDIA)에서 발견되었다.

이들 결과에 기초하여, 이 실시예에서 얻어진 DNA 단편은 연장 인자로 기능하는 아미노산을 코딩하는 신규한 DNA 단편인 것으로 여겨진다.

실시예 4: RT-PCR을 이용한 포르피라 예조엔시스 우에다의 생활주기의 각 단계에서 A1 및 A2 유전자의 발현양상 분석

1. A1 유전자

(1) 프라이머 합성

A1 유전자, PYEFRT1(서열번호 4) 및 PYEFR1(서열번호 5)의 발현양상을 조사하기 위하여, RT-PCR을 위한 프라이머를 합성하였다.

실시예 3에서 결정된 서열번호 1에 의해 나타내어지는 A1 유전자의 5' 비번역 부위의 서열과 서열 AV435982 간의 비교에 기초하여 확연하게 구별되는 서열을 갖는 부위를 선별함으로써 프라이머 PYEFRT1의 서열을 설계하였다. 서열 AV435982는 실시예 2에서 클러스터링한 EST 서열 중 하나이고, A2 유전자 그룹에 속하며, 가장 긴 5' 비번역 부위 서열을 갖는다.

따라서, 프라이머 PYEFRT1의 서열은 서열번호 1에 의해 나타내어진 A1 유전자의 5' 비번역 부위 서열에 포함되고 A2 유전자의 5' 비번역 부위 서열에는 상동적이지 않다.

프라이머 PYEFRT1의 서열은 실시예 2에서 클러스터링 시 A2 유전자 그룹에 속하는 것으로 결정된 EST 서열에 매우 상동적이기도 한 포르피라 푸르푸레아 연장 인자 EF1-알파(tef-c)의 서열이다.

(2) RT-PCR

총 RNA를 실시예 1에 기재된 방법에 따라 아래 단계에서 포르피라 예조엔시스 우에다 TU-1으로부터 추출하였다: 모노스포어 형성 전 1- 내지 2-㎜-길이 엽상배우체, 30 분간 모노스포어 방출 유도된 2-㎜-길이 엽상 배우체, 1- 내지 2-㎝-길이 엽상 배우체, 및 필라멘트상 포자체.

각각 200 ng의 폴리(A)⁺RNAs와 RNA PCR Kit(AMV) Ver. 2.1(다카라 슈조)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 첨부된 설명서에 따라 프라이머로 올리고 dT-Adaptor Primer(다카라 슈조)를 이용하여 53 ℃에서 역전사반응을 수행하였다.

주형으로 5 ng의 생성된 cDNA, Gene Taq NT(와코 퓨어 케미컬 인터스트리즈) 및 두 합성 프라이머 PYEFRT4(서열번호 6) 및 PYEFR1(서열번호 5)을 이용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 94 ℃에서 2 분간 예열; 94 ℃에서 30 초간, 53 ℃에서 30 초간, 72 ℃에서 1 분 30 초간 30 사이클; 및 72 ℃에서 7 분간 최종 반응.

음성 대조로서, 주형으로 역전사반응시키지 않은 각 단계의 폴리(A)⁺RNAs를 사용하여 동일한 조건 하에서 PCR을 수행하였다. PCR 산물을 1.5% 아가로스 젤 전기영동시켰다.

아가로스 젤 전기영동 결과를 도 1에 나타내었다.

도 1에서, 역전사반응시킨 샘플에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과는 도 1(A)에 나타내고, 역전사반응시키지 않은 샘플(음성 대조)에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과는 도 1(B)에 나타내었다.

도 1(A) 및 (B)에서, 레인들은 하기를 나타낸다:

M: 100 bp 래더 마커(다카라 슈조);

레인 1: 주형으로 모노스포어 형성 전 1- 내지 2-㎜-길이 엽상 배우체로부터 제조된 mRNA를 사용하여 얻은 결과;

레인 2: 주형으로 모노스포어 형성된 2-㎜-길이 엽상 배우체로부터 제조된 mRNA를 사용하여 얻은 결과; 및

레인 3: 주형으로 1- 내지 2-㎝-길이 엽상 배우체로부터 제조된 mRNA를 사용하여 얻은 결과;

레인 4: 주형으로 필라멘트상 포자체로부터 제조된 mRNA를 사용하여 얻은 결과.

391-bp 증폭 산물을 각 단계에서 관찰하였다. 따라서, A1 유전자는 포르피라 예조엔시스 우에다의 생활주기의 각 단계에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 여겨진다.

2. A2 유전자

(1) 프라이머 합성

A2 유전자의 발현양상을 조사하기 위한 RT-PCR을 위한 프라이머, PYEFRT4(서열번호 6)를 아래와 같이 합성하였다.

실시예 3에서 결정된 서열번호 1에 의해 나타내어진 A1 유전자의 5' 비번역 부위 서열과 A2 유전자 그룹에 속하는 서열 AV435982 간의 비교에 기초하여 확연하게 구별되는 서열을 갖는 부위를 선별함으로써 프라이머 PYEFRT4의 서열을 설계하였다.

따라서, 프라이머 PYEFRT4의 서열은 A2 유전자의 5' 비번역 부위 서열에 포함되고 A1 유전자의 5' 비번역 부위 서열에는 상동적이지 않다.

프라이머 PYEFRT4 및 상기 프라이머 PYEFR1(서열번호 5)을 RT-PCR을 위해 사용하였다.

(2) RT-PCR

총 RNA를 실시예 1에 기재된 방법에 따라 아래 단계에서 포르피라 예조엔시스 우에다 TU-1으로부터 추출하였다: 모노스포어 형성 전 1- 내지 2-㎜-길이 엽상 배우체, 30 분간 모노스포어 방출 유도된 2-㎜-길이 엽상 배우체, 1- 내지 2-㎝-길이 엽상 배우체, 및 필라멘트상 포자체.

각각 200 ng의 폴리(A)⁺RNAs와 RNA PCR 키트(AMV) Ver. 2.1(다카라 슈조)을 이용하여 cDNA를 합성하였다. 첨부된 설명서에 따라 프라이머로 올리고 dT-어댑터 프라이머(다카라 슈조)를 이용하여 53 ℃에서 역전사반응을 수행하였다.

아가로스 젤 전기영동 결과를 도 2에 나타내었다.

도 2에서, 역전사반응시킨 샘플에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과는 도 2(A)에 나타내고, 역전사반응시키지 않은 샘플(음성 대조)에 대한 아가로스 젤 전기영동 결과는 도 2(B)에 나타내었다.

도 2(A) 및 (B)에서, 레인들은 하기를 나타낸다:

M: 100 bp 래더 마커(다카라 슈조);

369-bp 증폭 산물을 각 단계에서 관찰하였다. 따라서, A1 유전자는 포르피라 예조엔시스 우에다의 생활주기의 각 단계에서 높은 수준으로 발현되는 것으로 여겨진다.

실시예 5: 게놈 라이브러리로부터의 A2 유전자의 분리, 서열결정 및 프로모터 서열의 분리

1. 게놈 DNA의 제조

뉴클레온 파이토퓨어, 식물 및 진균 DNA 추출 키트(아머샴 파마시아 바이오텍)를 이용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 일부 변형하여 게놈 DNA를 포르피라 예조엔시스 우에다 TU-1으로부터 추출하였다.

조류로부터 게놈 DNA를 추출하는데 사용된 과정은 아래와 같다.

종이 타월을 이용하여 물을 제거한 후, 엽상체 단계에서 배양된 조류를 칭량하였다. 2.5 g의 조류를 막자와 막자사발을 이용하여 액체 질소에서 분쇄하였다. 분쇄된 조류를 액체 질소에서 예냉시킨 숟가락을 이용하여 키트에 첨부된 시약 1 완충액 11.5 ㎖를 함유하는 50-㎖ 원심분리 튜브로 옮겼다. RNase A를 최종농도 20 ㎍/㎖로 가하였다. 혼합물을 37 ℃에서 30 분간 인큐베이션하였다. 그 후 키트에 첨부된 3.75 ㎖의 시약 2를 가하였다. 균질해질 때까지 교반한 후, 혼합물을 튜브를 잡아당기면서 65 ℃에서 10 분간 인큐베이션하고 혼합물을 3회 적당하게 혼합하였다. 그 후 튜브를 20 분간 얼음 상에서 인큐베이션하였다. 2 ㎖의 클로로포름을 가하고, 생성된 혼합물을 -20 ℃에서 20 분간 인큐베이션하였다. 500 ㎕의 뉴클레온 파이토퓨어 DNA 추출 수지(아머샴 파마시아 바이오텍)를 가하고, 혼합물을 실온에서 10 분간 혼합하였다.

혼합물을 원심분리하여 상층을 모았다. 염화세슘을 3.2 g/3 ㎖의 최종농도로 가하고 용해시켰다. 1/10 부피의 에티디움 브로마이드 용액(최종농도 10 mg/㎖)을 추가로 가하였다. 혼합물을 초원심분리 튜브(12PA 밀봉 튜브, 히타치)에 나누고, 히타치 초원심분리기 65P(히타치)를 이용하여 15 ℃에서 20 시간동안 50,000 rpm으로 원심분리하였다.

원심분리 후, 초원심분리 튜브를 자외선에 노출시키면서 주사 바늘(22G×1, 테루모)이 장착된 주사기(테루모 주사기 2.5 ㎖, 테루모)를 이용하여 DNA 층을 채취하였다. 동일한 부피의 에소부탄올을 채취한 DNA 층에 가하고, 혼합물을 교반 원심분리한 후, 하층을 모았다(이소부탄올 처리). 에티티움 브로마이드의 색깔이 관찰되지 않을 때까지 이소부탄올 처리를 반복하였다(2 내지 3회).

모은 하층을 투석 막 Spectra/Por 7 Membrane(스펙트럼)에 위치시키고, 1 ℓ의 TE 완충액(10 mM 트리스-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5)에 대해 실온에서 밤새 투석시켰다. 투석 후, 1/10 부피의 3 M 아세트산나트륨과 2 부피의 에탄올을 가하고 혼합하였다. 형성된 침전물을 원심분리로 모으고, 75% 에탄올로 헹구고 공기-건조하였다.

그렇게 얻은 침전물을 100 ㎕의 TE 완충액에 녹였다. 추출된 게놈 DNA의 농도와 순도를 분광광도계 Gene Quant(아머샴 파마시아 바이오텍)를 이용하여 결정하였다. 또한, 게놈 DNA를 1.0% 아가로스 젤 전기영동하여 분해되지 않았음을 확인하였다.

2. 프로브의 제조

프로모터를 분리하기 위한 후보로서의 A1 및 A2 유전자가 포르피라 푸르푸레아 연장 인자 EF1-알파(tef-c) mRNA(GenBank 등록번호 U08844)에 매우 상동적임이 실시예 2의 분석에 기초하여 알려져 있다.

상기에 기초하여, 연장 인자 EF1-알파 유전자를 A1 및 A2 유전자 모두의 게놈 서열을 분리하기 위하여 고도로 보존적인 모티프-함유 서열에 대해 서치하였다.그 후, 순방향 프라이머 PYEF1(서열번호 7) 및 역방향 프라이머 PYEFR1(서열번호 5)을 그러한 모티프가 프라이머들 사이에 위치하도록 설계하였다.

이 프라이머들, Ampli Taq Gold(퍼킨엘머) 및 주형으로 포르피라 예조엔시스 유에다 TU-1을 사용하여 PCR을 수행하였다. PCR을 아래와 같이 수행하였다: 95 ℃에서 10 분간 예열; 94 ℃에서 1 분간, 52 ℃에서 1 분간, 72 ℃에서 2 분 30 초간 30 사이클; 및 72 ℃에서 10 분간 최종 반응. PCR 산물을 2.0% SeaKem GTG 아가로스 젤(다카라 슈조) 전기영동시켰다. 관심있는 약 170-bp DNA 단편을 절개하고 젤로부터 회수하였다. DNA를 Gene Clean Ⅱ(바이오101)를 이용하여 정제하고, TA 클로닝을 위한 벡터, pT7Blue(노바젠)에 Ligation Kit Ver. 1(다카라 슈조)을 사용하여 결찰하였다. 약 16 시간의 결찰 후, 결찰 산물을 사용하여 대장균 JM109 컴피턴트 세포(다카라 슈조)를 형질전환하였다. 형질전환된 JM109 세포를 앰피실린을 함유하는 LB 아가 배지에서 배양하여 콜로니를 형성시켰다.

콜로니에 하버링된 플라스미드 내의 삽입체를 벡터 pT7Blue 및 프라이머 M4(다카라 슈조) 서열을 갖는 T7 프로모터 프라이머(노바젠)를 이용하여 콜로니 PCR에 의해 조사하였다. 관심있는 DNA 단편을 갖는 플라스미드를 하버링한 대장균 콜로니를 선별하였다.

플라스미드를 추출하고 Quiagen Plasmid Mini Kit(퀴아젠)를 이용하여 선별된 대장균 콜로니로부터 정제하였다. 뉴클레오타이드 서열을 디데옥시 방법을 사용하는 사이클 시퀀싱 방법에 따라, 주형으로 이 플라스미드, Dye Termination Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(퍼킨엘머) 및 ABI Prism 10 GeneticAnalyzer(퍼킨엘머)를 이용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 결정하였다.

상기한 바와 같이 뉴클레오타이드 서열 결정된 플라스미드를 PCR DIG 표지화 키트(로쉐)를 이용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 표지하여 게놈 라이브러리를 스크리닝하기 위한 프로브를 제조하였다. 표지 반응 후, Quick Spin Columns™ G-50(로쉐)을 이용하여 과량의 기질을 제거하여 정제된 표지 산물을 얻었다. 정제된 표지 산물을 스크리닝을 위한 프로브로 사용하였다.

3. 게놈 라이브러리의 제작

실시예 5-1에 기재된 바와 같이 추출된 게놈 DNA를 λDASHⅡ/BamHⅠ Vector Kit(스트라타진)를 이용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 벡터 λDASHⅡ에 결찰시켜 게놈 라이브러리를 제작하였다. 결찰 반응 산물을 Gigapack ⅢGold Packaging Extract(스트라타진)를 이용하여 팩키징시켰다. 파지 현탁액을 팩키징 엑스트랙트에 첨부된 설명서에 따라 플레이트 당 약 1×10⁴플라크의 농도로 바닥 플레이트가 준비되고 미리 인큐베이션된 90×20-㎜ 멸균 페트리 디쉬(SH-20, 이와키) 상으로 도말하였다

4. 일차 스크리닝

플레이트 상에 형성된 파지 플라크를 니트로셀룰로스 막 NITROPLUS 2000(후나코시)으로 통상의 방법에 따라 옮겼다.

막을 알칼리 변성 용액(0.5 M NaOH, 1.5 M NaCl)에 5 분간, 중화 용액(1.5 M Tris-HCl(pH 7.5), 1.5 M NaCl)에 5 분간 담갔다. 그 후 막을 6×SSC로 세척하고,건조하여 건열 멸균기 SP-650(어드밴텍)에서 80 ℃로 2 시간 가열하였다.

막을 연어 정자 DNA를 최종 농도 100 ㎍/㎖로 함유하는 혼성화 용액(5×SSC, 50% 포름아미드, 50 mM 처치 포스페이트 완충액(pH 7.0), 10% 블록킹 시약(로쉐), 7% SDS 및 0.1% 소듐 N-도데카노일 사르코시네이트) 중에 65 ℃에서 2 시간동안 인큐베이션하여 예비혼성화를 수행하였다.

그 후, 막을 최종 농도 100 ㎍/㎖의 연어 정자 DNA와 단일 쇄로 열변성된 프로브를 함유하는 혼성화 용액 중에 50 ℃에서 밤새 인큐베이션하여 혼성화를 수행하였다.

혼성화 후, 막을 세척 용액 1(2×SSC, 0.1% SDS) 중에 실온에서 5 분간 인큐베이션하여 미결합 프로브, 혼성화 용액 등을 씻어내었다. 세척 과정을 2회 반복하였다.

그 후, 막을 미리 가온한 세척 용액 2(0.1×SSC, 0.1% SDS) 중에 68 ℃에서 15 분간 인큐베이션하여 비특이적으로 결합된 프로브를 해리시켰다. 세척과정을 2회 반복하였다.

DIG DNA Labeling and Protection Kit(로슈)에 첨부된 설명서에 따라 발색 반응을 이용하여 디곡시제닌 검출을 수행하였다.

5. 이차 스크리닝

일차 스크리닝에서 양성 파지를 모았다. 파지 현탁액을 통상의 방법에 따라 제조하고, 이차 스크리닝하였다.

파지 현탁액을 바닥 플레이트가 준비되고 미리 인큐베이션된 90×20-㎜ 멸균페트리 디쉬 상으로 플레이트 당 50 내지 100 플라크의 밀도로 도말하는 것을 제외하고는 일차 스크리닝에 관하여 상기한 것과 유사한 방식으로 이차 스크리닝을 수행하였다.

그 결과, 두 개의 양성 클론번호 20 및 47을 얻었다. 양성인 것으로 결정된 플라크를 수기우라(Sugiura, M., Cloning To Sequence, Nouson Bunka Sha, Tokyo, pp. 152-156(1989))의 방법에 따라 λ 파지 증폭 및 λ 파지 DNA 추출하였다.

6. λ 파지 DNA의 서던 혼성화

이차 스크리닝 결과 얻어진 양성 클론 20 및 47을 게놈 라이브러리를 스크리닝하는데 사용한 프로브를 사용하여 서던 혼성화시켰다. 서던 혼성화를 Maniatis 등(eds.), Molecular Cloning, a Laboratory Manual, Chapter 9, pp. 31-58, Cold Spring Harbor, 1989에 기재된 방법에 따라 수행하였다.

구체적으로는, 양성 클론번호 20 및 47로부터 추출된 DNA를 다양한 제한효소로 분해시키고 1% 아가로스 젤 전기영동시켰다. 전기영동 후, 젤을 알칼리 변성시킨 후 중화시켰다. DNA를 통상의 방법에 따라 나일론 막 Hybond-N(아머샴 파마시아 바이오텍)에 밤새 블랏팅하였다. 블랏팅 후, 막을 자외선(254 ㎚)에 자외선 트랜스일루미네이터를 사용하여 5 분간 노출시켜 DNA를 막에 고정시켰다.

막을 20 ㎖의 DIG-Easy-Hyb. Granules(로슈) 중에 42 ℃에서 2 시간동안 인큐베이션하여 예비혼성화를 수행하였다.

그 후, 막을 4 ㎖의 혼성화 용액에서 단일 쇄로 열변성된 프로브와 함께 42 ℃에서 밤새 인큐베이션하여 혼성화를 수행하였다.

그 후, 막을 미리 68 ℃로 가온한 세척 용액 2(0.1×SSC, 0.1% SDS) 중에 68 ℃에서 15 분간 인큐베이션하여 비특이적으로 결합된 프로브를 해리시켰다. 세척과정을 2회 반복하였다.

DIG DNA Labeling and Detection Kit(로슈)를 이용한 처리에 의해 막을 화학발광시켰다. 건조 후 X-레이 필름(코닥)을 포함하는 카세트에서 30 초간 노출시켜 오토래디오그래피시켰다.

그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에서, 각각의 레인은 하기를 나타낸다. 레인 1 내지 7에 관하여, 클론번호 20 또는 47을 처리하는데 사용한 제한효소(들)가 표시되어 있다:

M: pHY 마커(다카라 슈조);

레인 1: HindⅢ;

레인 2: HindⅢ 및 XbaⅠ;

레인 3: XbaⅠ;

레인 4: XbaⅠ 및 SalⅠ;

레인 5: SalⅠ;

레인 6: SalⅠ 및 EcoRⅠ; 및

레인 7: EcoRⅠ.

"a"로 표시된 레인은 클론번호 20에 대한 결과를, "b"로 표시된 레인은 클론번호 47에 대한 결과를 나타낸다.

그 결과, 유전자와 상류 부분이 제한효소 HindⅢ 및 XbaⅠ으로의 이중분해에 의해 생성된 클론번호 20의 4-kbp 단편과 제한효소 HindⅢ로의 분해에 의해 생성된 클론번호 47의 5.5-kbp 단편에 함유되어 있을 가능성이 높은 것으로 여겨졌다.

그 후, 클론번호 20의 DNA를 제한효소 HindⅢ 및 XbaⅠ으로 완전 분해하고 1% 아가로스 젤 전기영동시키고, 약 4-kbp 밴드를 절개하고 아가로스 젤로부터 회수하였다.

더욱이, 클론번호 47의 DNA를 제한효소 HindⅢ로 완전 분해시키고 1% 아가로스 젤에서 전기영동하고, 약 5.5-kbp 밴드를 절개하고 아가로스 젤로부터 회수하였다.

회수된 DNA 단편을 TaKaRa Ligation Kit ver. 1(다카라 슈조)을 이용하여 벡터 플라스미드 pBluescriptⅡ(토요보)에 결찰시켰다. 30 분간 결찰 후, 결찰 산물을 사용하여 대장균 JM109 컴피턴트 세포(다카라 슈조)를 형질전환시켰다. 형질전환된 JM109 세포를 앰피실린을 함유하는 LB 아가 배지에 배양하여 콜로니를 형성시켰다.

콜로니에 하버링된 플라스미드의 삽입체를 벡터 pBluescript Ⅱ 서열 및 프라이머 M4(다가라 슈조)를 갖는 프라이머 RV(다카라 슈조)를 사용하여 콜로니 PCR에 의해 조사하였다. 관심있는 DNA 단편을 갖는 대장균 콜로니를 선별하였다. Quiagen Plasmid Mini Kit(퀴아젠)를 이용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 플라스미드를 추출하고 정제하였다. 제조된 플라스미드를 각각 pEF20 및 pEF47로 명명하였다.

플라스미드 pEF20 및 pEF47을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 생성된 형질전환체를 대장균 JM109/pEF20 및 대장균 JM109/pEF47(FERM P-19160)이라 명명 표시하였다. 이들을 일본 이바라키 305-8566 츠쿠바시 히가시 1-초메 1-1 AIST 츠쿠바 센트럴 6 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터에 2002년 12월 18일(원기탁일) 이래로 수탁번호 FERM P-19160으로 기탁하고, 독립행정법인 산업기술총합연구소 특허생물기탁센터에 FERM BP-8285(국제기탁기관으로의 이관 청구일: 2003년 1월 29일)로 기탁하였다.

주형으로 플라스미드 pEF20 및 pEF47, Dye Termination Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(퍼킨엘머) 및 ABI Prism 310 Genetic Analyzer(퍼킨엘머)를 이용하여 키트에 첨부된 설명서에 따라 디데옥시 방법을 사용하는 사이클 서열결정 방법에 따라 뉴클레오타이드 서열을 결정하였다.

그 결과, 클론번호 20의 파지 DNA가 A2 유전자의 번역 개시점의 상류 173 bp 위치로부터 출발하는 서열을 포함하고 있는 것으로 나타났다. 따라서, 게놈 DNA의 상류 서열이 포함되어 있지 않기 때문에 프로모터 서열이 포함되지 않았다고 할 수 있다.

클론번호 47에 관하여, 파지 DNA는 A2 유전자의 번역 개시점의 약 1.3-kb 상류 위치로부터 출발하는 서열을 포함하였다. 그 서열을 서열번호 3에 나타내었다.

클론번호 47의 결정된 뉴클레오타이드 서열(서열번호 3)을 cDNA 서열(서열번호 1)과 클러스터링 분석에 의해 얻은 EST 서열과 비교하고, 전사 인자, 코딩 부위 및 인트론/엑손 서치 결과, 클론번호 47의 서열이 프로모터 서열, 인트론 서열 및 터미네이터 서열을 포함한 것으로 밝혀졌다.

구체적으로는, 3764-bp DNA 서열에서, 87번 내지 859번 위치의 서열이 5' 연결 부위이고, 860번 내지 877번 위치의 서열이 제1 엑손이며, 878번 내지 1331번 위치의 서열이 제1 인트론이며, 1332번 내지 2961번 위치의 서열이 제2 엑손이고, 2962번 내지 3764번 위치의 서열이 3' 연결 부위이다. 또한, 5' 연결 부위가 프로모터 서열을 포함하고 3' 연결 부위가 터미네이터 서열을 포함하는 것으로 나타났다.

코작 규칙(Kozak, M., Cell, 44: 283-292(1986))에 따른 서열과 유사한 서열(ATCATGG)이 개시 코돈을 포함한 1365번 내지 1371번 위치의 부위에서 발견되었다. 고등식물의 핵 유전자에 대한 폴리(A) 부가 신호, CAYTG(Joshi, C. P., Nucl. Acids Res., 15: 9627-9640(1987))가 2951번 내지 2965번 위치의 부위(CATTG)에서 발견되었고, 또 다른 폴리(A) 부가 신호 AATAAA와 유사한 서열(AATAGA)이 2897번 내지 2902번 위치 부위에서 발견되었다.

상기 서치 결과, 서열번호 3의 860번 내지 877번 위치의 서열과 1332번 내지 2961번 위치의 서열은 A2 유전자의 cDNA에 상응한다. 그 서열을 서열번호 2에 나타내었다. 서열에서, 65번 내지 1404번 위치의 서열이 A2 폴리펩타이드 코딩 서열(정지 코돈 포함)이다. 이 서열에 의해 코딩되는 499 개 아미노산으로 구성된 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 A1 유전자의 ORF에 의해 코딩되는 폴리펩타이드의아미노산 서열(서열번호 8)과 동일하다. 이들 결과에 기초하여, 이 실시예에서 얻은 DNA 단편은 또한 연장 인자로 기능하는 아미노산을 코딩하는 DNA 단편인 것으로 여겨진다.

실시예 6: 프로모터 서열의 활성 조사

(1) 프로모터 활성을 측정하기 위한 플라스미드의 제작

프로모터 활성을 β-글루큐로니다제 유전자의 일시적 발현 시 GUS 활성을 검출함으로써 결정할 수 있도록, 프로모터 활성을 측정하기 위한 플라스미드 벡터를 아래와 같이 제작하였다.

pBI221(클론텍)을 비교를 위한 대조 플라스미드 벡터로 사용하였다. 벡터의 35S 프로모터 부분(HindⅢ 위치부터 XbaⅠ 위치의 단편)을 HindⅢ 위치부터 전사 개시 위치 바로 앞 위치까지 인트론 없이 pEF47의 EF-1α A2 유전자의 프로모터 서열로 대체하여(서열번호 9) 프로모터 서열이 β-글루큐로니다제 유전자에 연결된 벡터를 제작하였다. 구체적으로는, 서열번호 9의 서열을 아래와 같이 얻었다. 약 0.8 kbp 단편을 주형으로 플라스미드 pEF47과 프라이머 M13 RV(다카라 바이오) 및 5' 말단에 XbaⅠ 위치를 갖도록 합성된 프라이머 EF47X2(서열번호 12)를 사용하여 PCR 증폭에 의해 얻었다. 약 0.8-kbp 단편을 제한효소 HindⅢ와 XbaⅠ으로 완전 분해시키고 전기영동 후 아가로스 젤로부터 약 0.8-kbp 단편을 절개하고 정제하였다. 이 DNA 단편을 제한효소 HindⅢ 및 XbaⅠ으로의 완전 분해에 의해 35S 프로모터 부분이 pBI221로부터 제거된 벡터 단편에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 생성된 플라스미드를 p47GUS-IL이라 명명하고,p47GUS-IL로 형질전환된 대장균 JM109를 대장균 JM109/p47GUS-IL이라 명명하였다. p47GUS-IL은 PCR과 뉴클레오타이드 서열 분석에 의해 HindⅢ 위치부터 전사 개시 위치 직전 위치까지의 프로모터 서열(서열번호 9)을 갖는 것으로 확인되었다.

비교를 위한 대조 플라스미드 벡터 pBI221의 35S 프로모터 부분을 프로모터 서열, 제1 엑손, 제1 인트론 및 제2 엑손부터 ATG 직전 위치까지(서열번호 3의 87번 내지 1367번 위치)의 부분을 포함하는 서열로 대체하여 프로모터 서열(서열번호 9)과 하류 제1 인트론(서열번호 10)을 포함하는 서열이 β-글루큐로니다제에 연결된 벡터를 제작하였다. 구체적으로는, 프로모터 서열, 제1 엑손, 제1 인트론 및 제2 엑손부터 ATG 직전 위치 부분(서열번호 3의 87번 내지 1367번 위치)을 포함하는 서열을 아래와 같이 얻었다. 약 1.3 kbp 단편을 주형으로 플라스미드 pEF47 및 프라이머 M13 RV(다카라 바이오) 및 5' 말단에 XbaⅠ 위치를 갖도록 합성된 프라이머 EF47X(서열번호 13)를 사용하는 PCR 증폭에 의해 얻었다. 약 1.3-kbp 단편을 제한효소 HindⅢ 및 XbaⅠ을 사용하여 완전 분해시키고, 전기영동 후 약 1.3-kbp 단편을 아가로스 젤로부터 절개하고 정제하였다. DNA 단편을 제한효소 HindⅢ 및 XbaⅠ로의 완전 분해에 의해 pBI221로부터 35S 프로모터 부분이 제거된 벡터 단편에 결찰시켰다. 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 JM109를 형질전환시켰다. 생성된 플라스미드를 p47GUS라 명명하고, p47GUS로 형질전환된 대장균 JM109를 대장균 JM109/p47GUS로 명명하였다. p47GUS가 PCR 및 뉴클레오타이드 서열 분석에 의해 서열번호 3의 87번 내지 1367번 위치의 서열을 갖는 것으로 확인되었다.

(2) 프로모터 활성의 결정

프로모터 활성을 벡터 pBI221, p47GUS-IL 및 p47GUS를 포르피라 예조엔시스 우에다 TU-1으로 입자 총으로 도입하고 세포 내에 축적된 청색 인디고틴 염료의 존재를 직립 현미경을 이용하여 관찰하는 β-글루큐로니다제의 일시적 발현으로 인한 GUS 활성에 대한 조직화학적 어세이를 수행함으로써 결정하였다.

벡터를 세포로 도입하기 위하여 금 입자를 DNA로 코팅하는데 사용된 과정은 하기하는 바와 같다. 60 ㎎의 금 입자를 1.5-㎖ 마이크로퓨지 튜브에서 칭량하였다. 1 ㎖의 신선하게 제조된 70% 에탄올을 가하였다. 튜브를 튜브 믹서 VORTEX GENIE 2(사이언티픽 인더스트리즈)를 사용하여 5 분간 교반하고 실온에서 15 분간 방치하였다. 튜브를 데스크탑 원심분리기 Chibitan(밀리포어)에서 5 초간 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 1 ㎖의 멸균수를 가하였다. 튜브 믹서를 사용하여 1 분간 교반한 후, 튜브를 1 분간 방치하여 금 입자를 침강시켰다. 튜브를 데스크탑 원심분리기에서 2 초간 원심분리하고 상등액을 제거하였다. 이 과정을 3회 반복하였다. 50% 글리세롤을 금 입자의 최종농도가 60 ㎎/㎖이 되도록 가하였다. 금 입자를 50% 글리세롤(60 ㎎/㎖)에 재현탁하고 응집물을 파쇄하기 위하여 튜브를 튜브 믹서로 5 분간 격렬히 교반하였다. 50 ㎕의 현탁액(약 3 ㎎의 금 입자 함유)을 1.5-㎖ 마이크로퓨지 튜브로 옮겼다. 10 ㎕의 DNA(1 ㎍/㎕), 50 ㎕의 2.5 M CaCl₂및 20 ㎕의 0.1 M 스퍼미딘을 튜브 믹서를 이용하여 튜브를 격렬히 교반하면서 가하고, 교반을 3 분간 더 계속하였다. 튜브를 1 분간 방치하여 금 입자를 침강시키고 테스크탑 원심분리기에서 2 초간 원심분리하여, 상등액을 제거하였다.140 ㎕의 70% 에탄올을 펠렛이 흐뜨러지지 않도록 가하고, 상등액을 제거하였다. 그 후, 140 ㎕의 100% 에탄올을 펠렛이 흐뜨러지지 않도록 가하고, 상등액을 제거하였다. 48 ㎕의 100% 에탄올을 가하고 혼합하였다. 8 ㎕의 현탁액을 1 라운드의 도입을 위해 사용하였다.

포르피라 예조엔시스 우에다 TU-1의 배양된 단일 조류 엽상 배우체를 통기 하에(0.2-㎛ 필터로의 여과에 의해 멸균된 공기, 0.25 ℓ/분) ESL 배지를 함유하는 2 ℓ의 단순화된 배양 용기(후지모리 코교)에서 15 ℃, 10 시간 명기(관량 80 μE/㎡/s; 백색형광등) 및 14 시간 암기의 단일 조건 하에서 환류현탁 상태에서 배양하였다. 배지를 7 일마다 교환하였다. 엽상 배우체를 약 2 ㎠ 조각으로 자르고, ESL 배지에 도말하면서 1/4 조각의 글래스 마이크로화이버 GF/C(47 ㎜ 와트만) 상에 놓았다. 이들을 ESL 배지로 적신 여과지(90 ㎜, 와트만)가 적층된 부흐너 펀넬(70-㎜ 여과지, MT) 상에 위치시키고, 여과 플라스크와 흡착용 흡입기를 이용하여 과량의 물을 제거하면서 흡입시켰다. 흡착된 엽상 배우체 조각을 ESL 아가 배지 상에 위치시키고, DNA-코팅된 금 입자를 첨부된 설명서에 따라 입자 총 GIE-Ⅲ(다나카)를 이용하여 도입하였다. 슛팅 조건은 아래와 같았다: 배출구와 샘플 간 거리: 7 내지 9 ㎝; 슛팅 압력: 0.5 내지 6.0 kgf/㎠; 슈팅 시간: 0.015 초. 세 개의 샘플을 각 조건의 도입에 사용하였다.

도입 후, 샘플을 글래스 마이크로화이버로부터 벗겨내고, 도입된 벡터에 따라 분류하고, 15 ℃에서 14 시간 명기 및 10 시간 암기의 장일 조건 하에서 2 일간 배양하였다. 그 후, 고정화 용액(2% 파라포름알데히드, 0.1 M Na-포스페이트(pH7.0), 1 mM EDTA, 1.5 M D-솔비톨)을 이용하여 고정화와 세척 용액(0.1 M Na-포스페이트(pH 7.0), 1.5 M D-솔비톨)에서 3 라운드의 세척을 수행하였다. X-Gluc 용액(2 mM X-Gluc(5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-글루큐로나이드, 50 mM Na-포스페이트(pH 7.0), 10 mM EDTA, 0.5 mM K₄Fe(CN)₆, 0.5 mM K₃Fe(CN)₆, 1.5 M D-솔비톨, 0.5% 트리톤 X-100)을 세포 또는 조직이 완전히 젖도록 가하였다. 혼합물을 37 ℃의 인큐베이터 MIR-253(산요)에서 밀봉된 적당한 용기에서 밤새 인큐베이션하였다. 프로모터 활성을 나타내는 β-글루큐로니다제 활성(GUS 활성)을 직립 현미경을 이용하여 관찰된 세포에 축적된 청색 인디코틴 염료 존재에 기초하여 결정하였다.

그 결과, 벡터 pBI221이 도입된 샘플 중에서, GUS 활성이 9 ㎝의 배출구-샘플 거리로 얻어진 두 개의 샘플에 대해 관찰되었다. 벡터 p47GUS-IL의 경우, GUS활성은 두 샘플, 8 ㎝의 배출구-샘플 거리로 얻어진 하나와 9 ㎝의 배출구-샘플 거리에서 얻어진 나머지 하나에 대해 관찰되었다. 따라서, 이 벡터의 프로모터(서열번호 9)가 프로모터 활성을 갖는 것이 증명되었다.

벡터 p47GUS의 경우, GUS 활성은 7 개의 샘플, 7 ㎝의 배출구-샘플 거리로 얻어진 하나, 8 ㎝의 배출구-샘플 거리에서 얻어진 3 개, 9 ㎝의 배출구-샘플 거리에서 얻어진 3 개에서 관찰되었다.

GUS 활성이 관찰된 샘플에 대해 세포로부터의 염료 탈색을 수행하였다. 그 결과 축적된 청색 인디코틴 염료가 9 ㎝의 배출구-샘플 거리와 벡터 p47GUS의 일시적 도입에 사용된 12 가지 압력 조건(0.5 내지 6.0 Kg/㎠) 중 하나로 얻어진 샘플에서 약 1 주 후에도 남아있었다(도 4). 도 4에서, "A"는 탈색 전 얻은 결과를 나타내고 "B"는 탈색 7 일 후 얻은 결과를 나타낸다. 따라서, 벡터에 프로모터(서열번호 9)의 하류에 있는 제1 인트론(서열번호 10)을 포함시킴으로써 가장 효율적인 유전자 발현과 매우 높은 발현 유도가 가능한 것으로 여겨진다.

본 발명에 따르면, 조류로부터 유래된 프로모터가 최초로 제공된다. 그 다음, 이 프로모터를 이용하는 조류에서의 유전자 발현이 가능해졌다. 본 발명에 따르면, 조류로부터 유래된 터미네이터와 인트론이 최초로 제공된다. 이들을 이용하여, 조류에서 유전자 발현효율의 증가가 가능해졌다. 따라서, 본 발명은 유전공학 기술을 이용하여 조류에서 유용한 물질의 생산뿐만 아니라 유전공학 기술을 이용한 조류의 육종도 가능하게 한다.

더욱이, 본 발명은 조류로부터의 신규한 연장 인자에 대한 유전자를 제공한다. 이 유전자를 이용하여, 유전공학 기술을 이용한 연장 인자의 생산이 가능하게 되었다.

서열목록 프리 텍스트

서열번호 1: A1 유전자의 cDNA 서열

서열번호 2: A2 유전자의 cDNA 서열

서열번호 3: A2 유전자의 게놈 DNA 서열

서열번호 4: 프라이머 PYEFRT1

서열번호 5: 프라이머 PYEFR1

서열번호 6: 프라이머 PYEFRT4

서열번호 7: 프라이머 PYEF1

서열번호 8: A1의 아미노산 서열

서열번호 9: A2 유전자의 프로모터 부위

서열번호 10: A2 유전자의 인트론 1

서열번호 11: A2 유전자의 터미네이터 부위

서열번호 12: 프라이머 EF47X2

서열번호 13: 프라이머 EF47X

SEQUENCE LISTING <110> TAKARA BIO INC. <120> Promoter, intron and terminator derived from algae <130> 663658 <150> JP 2002-52885 <151> 2002-02-28 <150> JP 2002-374188 <151> 2002-12-25 <160> 13 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 1644 <212> DNA <213> Porphyra yezoensis Ueda <220> <223> cDNA sequence of A1 gene <400> 1 caccatcccg ctcgacctac cggttgttgc ccagtcccgt cccgcgcgga gtgagagcag 60 cccacctagt ctctcatcat ggggaaggag aagcagcatg tgtccattgt ggtcattggc 120 cacgtcgact ctggcaagtc gacgaccacc ggccatctga tctacaagtg cgggggtatc 180 gagaagcgcg cgattgagaa gttcgagaag gaggctgctg agatgggcaa gggctcgttc 240 aagtacgcgt gggtgctgga caaactgaag gccgagcgcg agcgcggtat caccattgac 300 attgctctgt ggaagttcga gacggagaag tacagcttca ctatcattga cgccccgggt 360 caccgtgact tcatcaagaa catgatcacg ggcacgtcgc aggcggatct ggccatcctg 420 gtcattgctt cgccgccggg cgagtttgag gcgggtatct cccagaacgg gcagacccgc 480 gagcacgcgc tgctggccta caccctgggc gtcaagcaga tgattgtggc ttgcaacaag 540 atggacgaca agaacgtcaa ctggtcgcag gaccgctacg aggaggtgtc caaggagatg 600 gacctgtacc tgaagaaggt cgggtacaac cccgccaagg tgcccaaggt gccgacgtcg 660 ggctggacgg gtgagaacct gttcgagagg accgataaga cgcacgccct cggcaagtgg 720 tacaagggcc cgtgcctgct ggaggctctg gacaactgcg acccgccgaa gcgcccggtt 780 gacaagccgc tgcgcctgcc cctccaggac gtctacaaga tcggcggcat tggcacagtg 840 ccggtgggcc gtgtggagac tgggctcatc aagcccggca tggtcgtgac gtttgcgccc 900 tcgggcctgt cgactgaggt gaagtcggtc gagatgcacc acgaggcgct gccccaggcc 960 ggccccggcg acaacgttgg cttcaacgtc aagaacgtgt cggtcaagga cctgaagcgc 1020 ggctacgtgt gcggtgactc gaagaacgac ccgccgaagg ggtgcgcttc gttcaacgcc 1080 caggtcatca tcctgaacca ccctggtgag atccacgctg gctacgcgcc ggtgctggat 1140 tgccacacgg cgcacattgc gtgcaagttc tcggagctga tcctgaagat ggaccgccgc 1200 tcgggcaaga agctggagga cacgcccaag atgatcaagt ccggtgacgc tgctatggtg 1260 aagatggttg cctccaagcc gatgtgcgtg gaggccttca cccagtaccc gccgctgggc 1320 cgctttgccg tgcgtgacat gcgccagacg gtcgctgttg gtgtcatcaa gtcggtggag 1380 aagaaggagg ttgagggcaa gatgaccaag tcggcggcca agaaatagca gccaattgtg 1440 ctcgcttcgg cgtcgtgtat ggcatcgtgg gtggacttgt tttttgcggt gcgatctagt 1500 cacgcgctct tacgcctcgc gtgtggggtc ctggcggtgg tgcgtggcga ctgtcggtct 1560 cccgtgatgg accgtttgta ctattcgacc cttgcgaagg ggagaatagg agtgtagttt 1620 accctcttgt tttgtatctt tttg 1644 <210> 2 <211> 1648 <212> DNA <213> Porphyra yezoensis Ueda <220> <223> cDNA of sequence of A2 gene <400> 2 ccgtcttccc cgccgattac gtcttgagtt tacctgttca cctagccttt catcatgggg 60 aaggagaagc agcatgtgtc cattgtggtc attggccacg tcgactctgg caagtcgacg 120 accaccggcc atctgatcta caagtgcggg ggtatcgaga agcgcgcgat tgagaagttc 180 gagaaggagg ctgctgagat gggcaagggc tcgttcaagt acgcgtgggt gctggacaaa 240 ctgaaggccg agcgcgagcg cggtatcacc attgatattg ctctgtggaa gttcgagacg 300 gagaagtaca gcttcactat cattgacgcc ccgggtcacc gtgacttcat caagaacatg 360 atcacgggca cgtcgcaggc ggatctggcc atcctggtca ttgcttcgcc gccgggcgag 420 tttgaggcgg gtatctccca gaacgggcag acccgcgagc acgcgctgct ggcctacacc 480 ctgggcgtca agcagatgat tgtggcttgc aacaagatgg acgacaagaa cgtcaactgg 540 tcgcaggacc gctacgagga ggtgtccaag gagatggacc tgtacctgaa gaaggtcggg 600 tacaaccccg ccaaggtgcc caaggtgccg acgtcgggct ggacgggtga gaacctgttc 660 gagaggaccg ataagacgca cgccctcggt aagtggtaca agggcccgtg cctgctggag 720 gctctggaca actgcgaccc gccgaagcgc ccggttgaca agccgctgcg cttgcccctc 780 caggatgtct ataagatcgg cggcattggc acagtgccgg tgggccgtgt ggagactggg 840 ctcatcaagc ccggcatggt cgtgacgttt gcgccctcgg gcctgtcgac tgaggtgaag 900 tcggtcgaga tgcaccacga ggcgctgccc caggccggcc ccggcgacaa cgttggcttc 960 aacgtcaaga acgtgtcggt caaggacctg aagcgcggct acgtgtgcgg tgactcgaag 1020 aacgacccgc cgaaggggtg cgcttcgttc aacgcccagg tcatcatcct gaaccaccct 1080 ggtgagatcc acgccggcta cgcgccggtg ctggactgcc acacggcgca cattgcgtgc 1140 aagttctcgg agctgatcct gaagatggac cgccgctcag gcaagaagct ggaggacacg 1200 cccaagatga tcaagtccgg tgacgctgct atggtgaaga tggttgcctc caagccgatg 1260 tgcgtggagg ccttcaccca gtacccgccg ctgggccgct ttgccgtgcg tgacatgcgc 1320 cagacggtcg ctgttggtgt catcaagtcg gtggagaaga aggaggttga gggcaagatg 1380 accaagtcgg cggccaagaa atagcagcca acccatccgg ctgtgaggtc gctggtggcc 1440 tcgctcgctg cagaccagat gcgagtcaac caggagcgcg ttatcgcgct cttcgttgtc 1500 aacgctgtca tgactgtcgc gaaggatggg tgccggtccg cagcagtcga ccgcctctac 1560 tactcgacgc tcgcgaaagg gagaatagaa atgtagcgtg cttgtcttgc ttttgctagg 1620 gtgtttcttg aggcttgcat tgtctcgc 1648 <210> 3 <211> 3764 <212> DNA <213> Porphyra yezoensis Ueda <220> <223> Genomic sequence of A2 gene <400> 3 gactgattcg ccagcgcgca attaaccctc actaaaggga acaaaagctg ggtaccgggc 60 cccccctcga ggtcgacggt atcgataagc ttcgctgcca ggctctccat cagcgacttg 120 cggtcggtgc tgtttgggga ccggcgggaa gcgcaccaga atgtgggggg agacaggcag 180 ggctcagaga cacgagtgga gagcattgat cagtaacagt cgcacgtcag actgggtctg 240 cgtggggcca cgaaagcgca aaaatgggcc tagcaggcgc cgtcaacctt ctcaagctca 300 gagcgccgcc aggctgcaca cccccgaggc gacggccagt agcacctgcg ccacggagac 360 accgtctcct gctaacatac ggttgttcgt ccgccatcga gaacagctag gtacagaata 420 ccacgaggaa gggaagaaaa gccttgaatg gcaaagggtg gtcgaaggca agccagagag 480 ggacgttcta catgcaccaa agccagtagg agcgcactac gcggtaagcg gtcgccgaaa 540 gagggggggc gacccacgct cgtcactgca ggttgtattg tgccggtccg caactgccac 600 tggcggtgtt tgtcaagcgg ccaccacgag tctcgagggc tcagcaattg caccgctggc 660 acgcagaatg tggccttccc cgagtttaca gtggtccttt tccccgaaag catccctaaa 720 aaaaggaatt gagcgacggc gacgccgacc gacgtccgcg gcggcggcca caggcgaggg 780 acggaggacc accggccttt taaatgggcg tcgaagacca cgtgctcggc acaccacccc 840 gtcgacatcg ctatcgtacc cgtcttcccc gccgattgta cgtttttttt atcctcccgc 900 cgctcagcct cccgttactc ccgcgcatac gtgtgggcgt gggtgacctg ggtgcgcgca 960 tgggcgtttc cttccctgcc ggtgtgccga gtaacggctg gctggtttgg gtggctcaac 1020 ctttgtggga gagggtcgca cctttgcacc agctggggtg gtttgccgta tgaccaacag 1080 gctcggcaat acggatcatt gtccgactac tggcgtcggg gtgcattcag gcatgcggac 1140 actggaagaa gatcagtggt ggcgccccgg cagttgtcgt tggtcctctg gtatatgcgt 1200 tcgacagttg atcatctctt ctggtgaaga ttgctgacgc tctccggtct cttgcactgt 1260 tgtggtgatt gtttgggcgc atgttctatt cttctgatct gatcgttcct actgtcgacg 1320 gcggatcaca gacgtcttga gtttacctgt tcacctagcc tttcatcatg gggaaggaga 1380 agcagcatgt gtccattgtg gtcattggcc acgtcgactc tggcaagtcg acgaccaccg 1440 gccatctgat ctacaagtgc gggggtatcg agaagcgcgc gattgagaag ttcgagaagg 1500 aggctgctga gatgggcaag ggctcgttca agtacgcgtg ggtgctggac aaactgaagg 1560 ccgagcgcga gcgcggtatc accattgata ttgctctgtg gaagttcgag acggagaagt 1620 acagcttcac tatcattgac gccccgggtc accgtgactt catcaagaac atgatcacgg 1680 gcacgtcgca ggcggatctg gccatcctgg tcattgcttc gccgccgggc gagtttgagg 1740 cgggtatctc ccagaacggg cagacccgcg agcacgcgct gctggcctac accctgggcg 1800 tcaagcagat gattgtggct tgcaacaaga tggacgacaa gaacgtcaac tggtcgcagg 1860 accgctacga ggaggtgtcc aaggagatgg acctgtacct gaagaaggtc gggtacaacc 1920 ccgccaaggt gcccaaggtg ccgacgtcgg gctggacggg tgagaacctg ttcgagagga 1980 ccgataagac gcacgccctc ggtaagtggt acaagggccc gtgcctgctg gaggctctgg 2040 acaactgcga cccgccgaag cgcccggttg acaagccgct gcgcttgccc ctccaggatg 2100 tctataagat cggcggcatt ggcacagtgc cggtgggccg tgtggagact gggctcatca 2160 agcccggcat ggtcgtgacg tttgcgccct cgggcctgtc gactgaggtg aagtcggtcg 2220 agatgcacca cgaggcgctg ccccaggccg gccccggcga caacgttggc ttcaacgtca 2280 agaacgtgtc ggtcaaggac ctgaagcgcg gctacgtgtg cggtgactcg aagaacgacc 2340 cgccgaaggg gtgcgcttcg ttcaacgccc aggtcatcat cctgaaccac cctggtgaga 2400 tccacgccgg ctacgcgccg gtgctggact gccacacggc gcacattgcg tgcaagttct 2460 cggagctgat cctgaagatg gaccgccgct caggcaagaa gctggaggac acgcccaaga 2520 tgatcaagtc cggtgacgct gctatggtga agatggttgc ctccaagccg atgtgcgtgg 2580 aggccttcac ccagtacccg ccgctgggcc gctttgccgt gcgtgacatg cgccagacgg 2640 tcgctgttgg tgtcatcaag tcggtggaga agaaggaggt tgagggcaag atgaccaagt 2700 cggcggccaa gaaatagcag ccaacccatc cggctgtgag gtcgctggtg gcctcgctcg 2760 ctgcagacca gatgcgagtc aaccaggagc gcgttatcgc gctcttcgtt gtcaacgctg 2820 tcatgactgt cgcgaaggat gggtgccggt ccgcagcagt cgaccgcctc tactactcga 2880 cgctcgcgaa agggagaata gaaatgtagc gtgcttgtct tgcttttgct agggtgtttc 2940 ttgaggcttg cattgtctcg cgaaaaaaac attgctttcg tacgccactg gtcaacatgg 3000 atattgaacg aggacggtga agactccgtg gggcgccagg aatgcgtgat cagactttct 3060 tgacagctta gctgctttgc aagaggggcg cccatcctgc cccagagccg gtcaagagac 3120 ttaccgctgg cgccgcgcat gaccagcagc gacgcgttaa gacgaggaca cgtccagcca 3180 catggacaag aaaacaaaaa aacaaaacca agaaacgttt gggcaactgg acaaaaacgt 3240 ggccacagca gtccaagatg atcgctccgc aacagacgtc catcgcggca atcttgccgg 3300 agcggccacc ccaaacgtgc catgagaaac aaatcaccac cacaaaaaag agaattccaa 3360 cagagcctga ccatcgacac gcgggggggg gggcagcaac gcgctcgttc ccgggggctc 3420 acccccgccc actgactcca gcacggagcc cgtgggccaa ccactacctg cgcagcggct 3480 ggaatggggg gtccatgttc acgcacaggc cctggccaag acccagctcc atcattggca 3540 aagccagccc caagtcaagg tcgacgtcgg cgttcgcgtt cgcgtctgcg tcggcgtcag 3600 catcagcgtc cgaattgtca gccatgccgg ccctgccccc gtagtccaca tcacgaatgc 3660 tcgtcgggct gtgcccaccc cactgtgcgc tgctctctcc ggattcatcc cgtgtccatg 3720 acgctgcctc cattcgagga nnagactgtc gccagcaaca ccgg 3764 <210> 4 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer PYEFRT1 <400> 4 tcgacctacc ggttgttgc 19 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer PYEFR1 <400> 5 ctgcgaggtg cccgtgatca t 21 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer PYEFRT4 <400> 6 ccgccgatta cgtcttgag 19 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer PYEF1 <400> 7 ggctccttca agtacgcgtg g 21 <210> 8 <211> 449 <212> PRT <213> Porphyra yezoensis Ueda <220> <223> Amino acid sequence of A1 <400> 8 Met Gly Lys Glu Lys Gln His Val Ser Ile Val Val Ile Gly His Val 1 5 10 15 Asp Ser Gly Lys Ser Thr Thr Thr Gly His Leu Ile Tyr Lys Cys Gly 20 25 30 Gly Ile Glu Lys Arg Ala Ile Glu Lys Phe Glu Lys Glu Ala Ala Glu 35 40 45 Met Gly Lys Gly Ser Phe Lys Tyr Ala Trp Val Leu Asp Lys Leu Lys 50 55 60 Ala Glu Arg Glu Arg Gly Ile Thr Ile Asp Ile Ala Leu Trp Lys Phe 65 70 75 80 Glu Thr Glu Lys Tyr Ser Phe Thr Ile Ile Asp Ala Pro Gly His Arg 85 90 95 Asp Phe Ile Lys Asn Met Ile Thr Gly Thr Ser Gln Ala Asp Leu Ala 100 105 110 Ile Leu Val Ile Ala Ser Pro Pro Gly Glu Phe Glu Ala Gly Ile Ser 115 120 125 Gln Asn Gly Gln Thr Arg Glu His Ala Leu Leu Ala Tyr Thr Leu Gly 130 135 140 Val Lys Gln Met Ile Val Ala Cys Asn Lys Met Asp Asp Lys Asn Val 145 150 155 160 Asn Trp Ser Gln Asp Arg Tyr Glu Glu Val Ser Lys Glu Met Asp Leu 165 170 175 Tyr Leu Lys Lys Val Gly Tyr Asn Pro Ala Lys Val Pro Lys Val Pro 180 185 190 Thr Ser Gly Trp Thr Gly Glu Asn Leu Phe Glu Arg Thr Asp Lys Thr 195 200 205 His Ala Leu Gly Lys Trp Tyr Lys Gly Pro Cys Leu Leu Glu Ala Leu 210 215 220 Asp Asn Cys Asp Pro Pro Lys Arg Pro Val Asp Lys Pro Leu Arg Leu 225 230 235 240 Pro Leu Gln Asp Val Tyr Lys Ile Gly Gly Ile Gly Thr Val Pro Val 245 250 255 Gly Arg Val Glu Thr Gly Leu Ile Lys Pro Gly Met Val Val Thr Phe 260 265 270 Ala Pro Ser Gly Leu Ser Thr Glu Val Lys Ser Val Glu Met His His 275 280 285 Glu Ala Leu Pro Gln Ala Gly Pro Gly Asp Asn Val Gly Phe Asn Val 290 295 300 Lys Asn Val Ser Val Lys Asp Leu Lys Arg Gly Tyr Val Cys Gly Asp 305 310 315 320 Ser Lys Asn Asp Pro Pro Lys Gly Cys Ala Ser Phe Asn Ala Gln Val 325 330 335 Ile Ile Leu Asn His Pro Gly Glu Ile His Ala Gly Tyr Ala Pro Val 340 345 350 Leu Asp Cys His Thr Ala His Ile Ala Cys Lys Phe Ser Glu Leu Ile 355 360 365 Leu Lys Met Asp Arg Arg Ser Gly Lys Lys Leu Glu Asp Thr Pro Lys 370 375 380 Met Ile Lys Ser Gly Asp Ala Ala Met Val Lys Met Val Ala Ser Lys 385 390 395 400 Pro Met Cys Val Glu Ala Phe Thr Gln Tyr Pro Pro Leu Gly Arg Phe 405 410 415 Ala Val Arg Asp Met Arg Gln Thr Val Ala Val Gly Val Ile Lys Ser 420 425 430 Val Glu Lys Lys Glu Val Glu Gly Lys Met Thr Lys Ser Ala Ala Lys 435 440 445 Lys <210> 9 <211> 773 <212> DNA <213> Porphyra yezoensis Ueda <220> <223> Promotor region of A2 gene <400> 9 aagcttcgct gccaggctct ccatcagcga cttgcggtcg gtgctgtttg gggaccggcg 60 ggaagcgcac cagaatgtgg ggggagacag gcagggctca gagacacgag tggagagcat 120 tgatcagtaa cagtcgcacg tcagactggg tctgcgtggg gccacgaaag cgcaaaaatg 180 ggcctagcag gcgccgtcaa ccttctcaag ctcagagcgc cgccaggctg cacacccccg 240 aggcgacggc cagtagcacc tgcgccacgg agacaccgtc tcctgctaac atacggttgt 300 tcgtccgcca tcgagaacag ctaggtacag aataccacga ggaagggaag aaaagccttg 360 aatggcaaag ggtggtcgaa ggcaagccag agagggacgt tctacatgca ccaaagccag 420 taggagcgca ctacgcggta agcggtcgcc gaaagagggg gggcgaccca cgctcgtcac 480 tgcaggttgt attgtgccgg tccgcaactg ccactggcgg tgtttgtcaa gcggccacca 540 cgagtctcga gggctcagca attgcaccgc tggcacgcag aatgtggcct tccccgagtt 600 tacagtggtc cttttccccg aaagcatccc taaaaaaagg aattgagcga cggcgacgcc 660 gaccgacgtc cgcggcggcg gccacaggcg agggacggag gaccaccggc cttttaaatg 720 ggcgtcgaag accacgtgct cggcacacca ccccgtcgac atcgctatcg tac 773 <210> 10 <211> 454 <212> DNA <213> Porphyra yezoensis Ueda <220> <223> Intron 1 of A2 gene <400> 10 gtacgttttt tttatcctcc cgccgctcag cctcccgtta ctcccgcgca tacgtgtggg 60 cgtgggtgac ctgggtgcgc gcatgggcgt ttccttccct gccggtgtgc cgagtaacgg 120 ctggctggtt tgggtggctc aacctttgtg ggagagggtc gcacctttgc accagctggg 180 gtggtttgcc gtatgaccaa caggctcggc aatacggatc attgtccgac tactggcgtc 240 ggggtgcatt caggcatgcg gacactggaa gaagatcagt ggtggcgccc cggcagttgt 300 cgttggtcct ctggtatatg cgttcgacag ttgatcatct cttctggtga agattgctga 360 cgctctccgg tctcttgcac tgttgtggtg attgtttggg cgcatgttct attcttctga 420 tctgatcgtt cctactgtcg acggcggatc acag 454 <210> 11 <211> 803 <212> DNA <213> Porphyra yezoensis Ueda <220> <223> Terminator region of A2 gene <400> 11 gaaaaaaaca ttgctttcgt acgccactgg tcaacatgga tattgaacga ggacggtgaa 60 gactccgtgg ggcgccagga atgcgtgatc agactttctt gacagcttag ctgctttgca 120 agaggggcgc ccatcctgcc ccagagccgg tcaagagact taccgctggc gccgcgcatg 180 accagcagcg acgcgttaag acgaggacac gtccagccac atggacaaga aaacaaaaaa 240 acaaaaccaa gaaacgtttg ggcaactgga caaaaacgtg gccacagcag tccaagatga 300 tcgctccgca acagacgtcc atcgcggcaa tcttgccgga gcggccaccc caaacgtgcc 360 atgagaaaca aatcaccacc acaaaaaaga gaattccaac agagcctgac catcgacacg 420 cggggggggg ggcagcaacg cgctcgttcc cgggggctca cccccgccca ctgactccag 480 cacggagccc gtgggccaac cactacctgc gcagcggctg gaatgggggg tccatgttca 540 cgcacaggcc ctggccaaga cccagctcca tcattggcaa agccagcccc aagtcaaggt 600 cgacgtcggc gttcgcgttc gcgtctgcgt cggcgtcagc atcagcgtcc gaattgtcag 660 ccatgccggc cctgcccccg tagtccacat cacgaatgct cgtcgggctg tgcccacccc 720 actgtgcgct gctctctccg gattcatccc gtgtccatga cgctgcctcc attcgaggan 780 nagactgtcg ccagcaacac cgg 803 <210> 12 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer EF47X2 <400> 12 ggtctagaaa gacgggtacg atagcga 27 <210> 13 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer EF47X <400> 13 cctctagact tctccttccc catgatga 28

Claims

(a) 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(b) 엄격한 조건 하에서 (a)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(c) (a)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 프로모터 활성을 나타내는 분리된 DNA.
(d) 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(e) 엄격한 조건 하에서 (d)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(f) (d)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 유전자의 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 분리된 DNA.
(a) 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(b) 엄격한 조건 하에서 (a)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는DNA; 및

(c) (a)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 프로모터 활성을 나타내는 제1의 분리된 DNA와,

(d) 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(e) 엄격한 조건 하에서 (d)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(f) (d)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되고, 제1의 분리된 DNA의 하류에 그에 인접하거나 그로부터 1 내지 10,000 뉴클레오타이드의 DNA 단편에 의해 분리되도록 위치한, 조류에서 유전자의 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 제2의 분리된 DNA:

를 갖는 조류에서 프로모터 활성을 나타내는 분리된 DNA.
제3항에 있어서, 서열번호 3의 87번 내지 1367번 위치의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 DNA.
(g) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(h) 엄격한 조건 하에서 (g)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는DNA; 및

(i) (g)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 터미네이터 활성을 나타내는 분리된 DNA.
목적 유전자가 아래 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 발현 가능하도록 연결되어 있는 재조합 DNA:

(1) (a) 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(b) 엄격한 조건 하에서 (a)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(c) (a)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 프로모터 활성을 나타내는 분리된 DNA;

(2) (d) 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(e) 엄격한 조건 하에서 (d)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(f) (d)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 유전자의 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 분리된 DNA; 및

(3) (g) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(h) 엄격한 조건 하에서 (g)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(i) (g)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 터미네이터 활성을 나타내는 분리된 DNA.
제6항에 있어서, 목적 유전자가 (1)의 DNA와 (1)의 DNA 하류에 그에 인접하거나 그로부터 1 내지 10,000 뉴클레오타이드 분리되어 위치한 (2)의 DNA를 갖는 분리된 DNA에 발현 가능하도록 연결된 재조합 DNA.
제7항에 있어서, 목적 유전자가 서열번호 3의 87번 내지 1367번 위치의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 DNA에 발현 가능하도록 연결된 재조합 DNA.
제6항에 있어서, 목적 유전자가 단백질-코딩 핵산, 안티센스 핵산-코딩 핵산, 데코이-코딩 핵산 또는 리보자임-코딩 핵산인 DNA.
아래 (1) 내지 (3) 중 어느 하나를 함유하는 벡터:

(1) (a) 서열번호 9의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(b) 엄격한 조건 하에서 (a)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(c) (a)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 프로모터 활성을 나타내는 분리된 DNA;

(2) (d) 서열번호 10의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(e) 엄격한 조건 하에서 (d)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(f) (d)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 유전자의 전사효율을 증가시키는 활성을 나타내는 분리된 DNA; 및

(3) (g) 서열번호 11의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(h) 엄격한 조건 하에서 (g)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(i) (g)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 조류에서 터미네이터 활성을 나타내는 분리된 DNA.
제10항에 있어서, (1)의 DNA와 (1)의 DNA 하류에 그에 인접하거나 그로부터 1 내지 10,000 뉴클레오타이드 분리되어 위치한 (2)의 DNA를 갖는 분리된 DNA를 함유하는 벡터.
제11항에 있어서, 서열번호 3의 87번 내지 1367번 위치의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 분리된 DNA를 함유하는 벡터.
제10항에 있어서, 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터인 벡터.
제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 DNA가 도입되거나, 제10항 내지 제13항 중 어느 한 항에 정의된 벡터로 형질전환된 조류.
(j) 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(k) 엄격한 조건 하에서 (j)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(l) (j)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA:

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 연장 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 DNA.
(m) 서열번호 2의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA 또는 그의 일부;

(n) 엄격한 조건 하에서 (m)의 DNA 또는 그의 상보 쇄와 혼성화할 수 있는 DNA; 및

(o) (m)의 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖는 DNA

로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 연장 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 분리된 DNA.
서열번호 8의 아미노산 서열을 코딩하는 DNA.
제17항에 정의된 DNA에서 하나 이상의 뉴클레오타이드가 치환, 결실, 삽입 또는 부가된 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 연장 인자 활성을 갖는 폴리펩타이드를 코딩하는 DNA.