KR20040084506A

KR20040084506A - 어피니티 칼럼과 디엔에이자임을 이용한 고효율 알엔에이 제조방법

Info

Publication number: KR20040084506A
Application number: KR1020030019636A
Authority: KR
Inventors: 정재준; 이철현; 정해갑; 유준석; 황은하
Original assignee: 한국기초과학지원연구원
Priority date: 2003-03-28
Filing date: 2003-03-28
Publication date: 2004-10-06
Also published as: US20040191872A1; KR100501526B1

Abstract

어피니티 칼럼과 디엔에이자임을 이용하여, 목적 RNA를 대량, 고수율로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 목적 RNA에 대한 분해능 및 정제 효율이 우수한 RNA 제조방법이 개시된다. 상기 RNA 제조방법은 목적 RNA의 3'-쪽에, 올리고-dN 어피니티 칼럼의 올리고-dN 시퀀스와 상보적으로 결합할 수 있는 시퀀스를 부가시킨 부가 RNA를 제조하는 과정; 제조된 부가 RNA를 올리고-dN 어피니티 칼럼에 결합시켜 정제하는 과정; 및 정제된 부가 RNA를 디엔에이자임으로 절단하여 목적 RNA를 얻는 과정을 포함한다. 또한, 상기 RNA 제조방법은 상기 디엔에이자임에 의하여 절단된 RNA 절편을 어피니티 칼럼을 이용하여 제거하는 과정과, DNA 분해효소로 상기 디엔에이자임을 분해한 후, 겔 여과 칼럼을 이용하여 디엔에이자임 분해 산물을 제거하는 과정을 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

Description

어피니티 칼럼과 디엔에이자임을 이용한 고효율 알엔에이 제조방법 {Process for Preparation of RNA using Affinity column and DNAzyme}

본 발명은 RNA 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 어피니티(affinity) 칼럼과 디엔에이자임(DNAzyme)을 이용하여, 목적 RNA를 대량, 고수율로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 목적 RNA에 대한 분해능 및 정제 효율이 우수한 RNA 제조방법에 관한 것이다.

최근 포스트 지놈(Post-genome) 시대에 접어들어, 유전자의 최종 산물인 단백질과 RNA의 기능을 규명하려는 기능 유전체학(functional genomics) 분야가 중요시되고 있으며, 특히 생체 고분자의 입체구조 규명을 통해, 이들의 기능을 신속, 정확하게 파악하려는 구조 유전체학(structural genomics) 분야가 큰 주목을 받고 있다. X-레이 크리스탈로그래피와 NMR을 이용하여 생체 고분자의 입체구조를 규명하는 구조 유전체학의 경우, 고순도 시료가 대량으로 필요하며, 이때 사용되는 RNA 시료는 일반적으로 변성 폴리아크릴아미드 겔을 사용한 분취용 PAGE (preparative polyacrylamide gel electrophoresis)법으로 제조된다. 분취용 PAGE법은 생체외 전사(in vitrotranscription)에 의해 합성된 RNA 생산물을 뉴클레오티드 분해능(nucleotide resolution)으로 정제할 수 있는 유일한 방법으로 통상적으로 이용되고 있으나, 이 방법은 RNA 구조 연구의 속도결정단계라고 불릴 만큼, 많은 시간과 노동을 필요로 한다는 단점이 있다. 분취용 PAGE법은 간단한 컬럼크로마토그래피(column chromatography)법과는 달리, 한번에 여러 플레이트(plate)를 전기영동할 수 있는 하드웨어를 갖춘다 하더라도, 한 사람이 하루에 수행할 수 있는 플레이트의 수는 현실적으로 최대 4개를 넘지 못한다. 또한 분취용 PAGE는 아크릴아미드 겔에 공급(loading)할 수 있는 시료량이 한정되어 있으므로(한 플레이트 당 50 OD 정도), 하나의 시료에 대하여 동일한 전기영동 정제를 수차례 반복해야 하는 단점이 있다. 따라서 시료의 수가 적은 경우는 별 문제가 되지 않으나, 대량으로 다수의 시료를 정제할 경우에는 매우 많은 시간이 소요된다.

특히, 생체외 전사 합성에서는 목적한 RNA 생산물의 시퀀스(sequence) 보다 뉴클레오티드(nucleotide) 개수가 하나 적거나, 하나 많은 전사체(transcript)인 n±RNA가 합성되는 경우가 많으며, 이들의 유동성(mobility)이 목적 RNA와 비슷한 경우에는, 겔에 공급하는 시료의 양을 감소시켜, 정제의 정밀도를 향상시킬 수밖에 없으므로, 겔 정제 과정은 더욱 더 많은 시간을 필요로 한다. 분취용 PAGE를 사용하여 RNA를 제조하는 경우의 또 다른 단점은 정제 과정에서 RNA의 손실이 일어날 수 있으며, 제거되지 못한 n±RNA와 일부 잔존한 아크릴아미드 성분이 NMR 측정 등 추후의 분석에 영향을 줄 수 있다는 것이다.

또한 최근에는, 단백질과 기능성 RNA를 엔코딩(encoding)하는 유전자에 대한 정보가 급속도로 늘어나고 있으므로, RNA 시료를 고효율로 제조하여, 많은 유전자에 대한 연구를 한꺼번에 수행할 수 있는 고효율(high-throughput: HTP) RNA 제조방법의 개발이 요망되고 있다.

따라서 본 발명의 목적은 대량, 고수율로 목적 RNA를 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 목적 RNA에 대한 분해능 및 정제 효율이 우수한 고효율 RNA 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 많은 시간과 노동을 필요로 하지 않으므로, 경제적으로 유용한 RNA 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 디엔에이자임의 RNA 절단 기능을 설명하기 위한 모식도.

도 2는 본 발명의 일 실시예에 따라, RNA 정제를 위해 추가로 합성하였던 꼬리 및 머리 부분을 서로 다른 2개의 디엔에이자임을 이용하여 절단하는 과정을 설명하기 위한 모식도.

도 3은 본 발명의 일 실시예에 따라, 소정의 시퀀스를 목적 RNA의 3'-쪽 및/또는 5'-쪽에 부가시킨 부가 RNA의 PAGE 결과를 나타낸 사진.

도 4는 어피니티 칼럼을 이용한 RNA 정제 생성물의 PAGE 결과를 나타낸 사진.

도 5는 디엔에이자임을 이용한 RNA 절단 반응 생성물의 PAGE 결과를 나타낸 사진.

도 6은 어피니티 칼럼을 이용하여 RNA 절편을 제거시킨 생성물의 PAGE 결과를 나타낸 사진.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 목적 RNA의 3'-쪽에, 올리고-dN 어피니티 칼럼의 올리고-dN 시퀀스와 상보적으로 결합할 수 있는 시퀀스를 부가시킨 부가 RNA를 제조하는 과정; 제조된 부가 RNA를 올리고-dN 어피니티 칼럼에 결합시켜 정제하는 과정; 및 정제된 부가 RNA를 디엔에이자임으로 절단하여 목적 RNA를 얻는 과정을 포함하는 RNA 제조방법을 제공한다.

또한, 상기 RNA 제조방법은 상기 디엔에이자임에 의하여 절단된 RNA 절편을 어피니티 칼럼을 이용하여 제거하는 과정과, DNA 분해효소로 상기 디엔에이자임을 분해한 후, 겔 여과 칼럼을 이용하여 디엔에이자임 분해 산물을 제거하는 과정을 더욱 포함하는 것이 바람직하다.

이하, 첨부된 도면을 참조하여 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.

본 발명에 따라 고효율로 RNA를 제조하기 위해서는, 먼저 올리고-dN 어피니티 칼럼의 올리고-dN(oligodeoxynucleotides) 시퀀스와 상보적으로 결합할 수 있는 시퀀스가 목적 RNA의 3'-쪽(tail)에 부가된 부가 RNA를 제조한다. 이때 필요에 따라서는, 목적 RNA의 5'-쪽(head)에도 목적 RNA의 전사 수율(transcription yield)을 향상시키기 위한 소정의 시퀀스를 부가시킬 수 있다. 이와 같은 부가 RNA는 통상의 RNA 합성법으로 제조할 수 있으며, 예를 들면 T7 RNA 중합효소(polymerase)와 화학적으로 합성한 DNA 템플레이트(template)를 사용하여, 생체외 전사(in vitrotranscription) 방법으로 제조할 수 있다. 이와 같이, 목적 RNA의 3'-쪽에 소정의 시퀀스를 부가시켜 RNA를 제조하면, 통상적인 poly A₂₀을 부가하는 경우에 발생할 수 있는 RNA 밴드의 끌림 현상(smearing)을 방지할 수 있다. 상기 목적 RNA의 3'-쪽에 부가되는 시퀀스는, 올리고-dN 어피니티 칼럼의 올리고-dN 시퀀스에 따라 달라지며, 예를 들면 AAGAAGCCCUUCAG 등의 염기서열을 가질 수 있고, 상기 목적 RNA의 5'-쪽에 부가되는 시퀀스는 T7 RNA 중합효소의 특성을 고려하여 전사 수율을 향상시키도록 실험적으로 선정할 수 있으며, 구체적으로는 GGGAGA, GGAGACGC 등과 같이 G 또는 GG로 시작하는 염기서열을 가질 수 있다.

다음으로, 생성된 부가 RNA를 올리고-dN (oligodeoxynucleotides) 어피니티 칼럼을 이용하여 정제한다. 본 발명에 사용될 수 있는 올리고-dN 어피니티 칼럼은 자동화된 핵산합성기를 이용하여, 폴리스티렌 (polystyrene), CPG(Controlled pore glass), 셀룰로오스 등의 수지 입자 표면에서 올리고-dN을 합성하여 제조할 수 있다. 올리고-dN 어피니티 칼럼을 이용하여 부가 RNA를 정제하는 과정을 구체적으로 설명하면, 먼저, 바인딩 버퍼 용액, 예를 들면 250 mM NaCl, 20 mM 소듐포스페이트 버퍼(pH 7.0)의 존재 하에, 부가 RNA를 포함하는 RNA 생성물을 올리고-dN 어피니티 칼럼에 투입하여, 부가 RNA를 어피니티 칼럼에 결합(annealing)시킨다. 다음으로, 부가 RNA가 결합된 칼럼을 250 mM NaCl, 20 mM 소듐포스페이트(pH 7.0) 등의 세척버퍼(washing buffer)로 수회 세척하고, 1 mM 소듐포스페이트(pH 7.0) 등의 용출 버퍼(elution buffer)를 첨가하여, 정제된 부가 RNA를 칼럼으로부터 분리하여 정제한다.

이와 같이 정제된 부가 RNA를 디엔에이자임(DNAzyme)으로 절단하여 목적 RNA를 얻는다. 디엔에이자임은 도 1에 나타낸 바와 같이, 목적 RNA의 양쪽 7-8 염기와 각각 와트슨-클릭 염기쌍(Watson-Crick base-pairing)을 이루고, Mg²⁺-의존성 촉매 영역(dependent catalytic domain)으로서, 15-뉴클레오티드(nucleotide) 시퀀스인 5'-GGCTAGCTACAACGA-3'를 포함하고 있는 RNA-절단 데옥시리보자임이며, RNA의 비결합(unpaired) 퓨린(A, G)과 결합(paired) 피리미딘(C, U)사이의 포스포다이에스테르 결합(phosphodiester linkage)을 절단하는 기능을 한다. 만일 목적 RNA의 5'-쪽 및 3'-쪽에 각각 소정의 시퀀스가 부가된 경우에는, 도 2에 나타낸 바와 같이 2개의 서로 다른 디엔에이자임을 이용하여 부가된 시퀀스, 즉 RNA 정제 또는 수율 증가를 위해 추가로 합성하였던 꼬리 또는 머리 부분을 절단한다. 이때 사용되는 디엔에이자임은 부가된 시퀀스를 절단할 수 있도록 별도로 디자인된 것이다. 이와 같이 부가된 시퀀스를 절단할 수 있는 디엔에이자임을 이용하여, 부가된 시퀀스를 절단하기 전에, 탈염(desalting) 칼럼을 이용하여 염 등의 불순물을 제거할 수도 있다. 또한 2개의 서로 다른 디엔에이자임이 사용될 경우, 이들은 동시에 또는 순차적으로 절단 반응에 사용될 수 있으며, 부가된 시퀀스의 절단 반응은 반응액이 40mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl 및 60mM MgCl₂용액으로 숙성(incubation)된 상태에서 수행되는 것이 바람직하다.

이와 같이 목적 RNA와 RNA 정제를 위해 추가로 합성하였던 꼬리 또는 머리 부분 RNA가 절단되면, 절단된 RNA 절편을 흡착하는 어피니티 칼럼을 이용하여 디엔에이자임 반응 생성물로부터 절단된 RNA 절편을 제거하고, 다음으로 DNase I 등의 DNA 분해효소를 이용하여 디엔에이자임을 분해한 후, Superdex 75 HR과 같은 겔 여과 칼럼 등의 칼럼으로 디엔에이자임 분해 산물을 제거하여, 최종 목적 RNA 절편을 정제할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다. 그러나, 본 발명이 하기 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

A. RNA 합성

C형 간염 바이러스 (HCV I)의 3'-논코딩 영역(noncoding region: 3'-NCR)중, 모든 유전자형(genotype)에서 상당 정도 보존되는 2차 구조를 가지며, 약 100개의 뉴클레오티드로 구성된 하기 구조식 1의 코어 엘리먼트(core element) 부위 중에서, SLI 도메인(domain) RNA를 합성하였다.

[구조식 1]

합성되는 RNA의 수율을 높이기 위하여, 5'-쪽은 GGAGACGC의 염기서열로 시작하도록 하였고, 3'-쪽은 poly A₂₀대신 AAGAAGCCCUUCAG의 염기서열로 합성되도록 시퀀스를 디자인하고, 화학적으로 합성한 DNA 템플레이트(template)와 T7 RNA 중합효소(polymerase)를 사용하여 하기 염기서열 1을 가지는 부가 RNA(서열 목록 1)를 합성하였으며, 또한 5'-쪽에 결합된 GGAGACGC 염기서열이 제외된 염기서열 2를 가지는 RNA(서열 목록 2)를 합성하였다. 하기 염기 서열에서, 부가되는 시퀀스와 SLI 도메인 RNA는 디엔에이자임이 작용할 수 있는 2개의 염기에 의하여 결합되어 있다.

[염기서열 1]

5'-GGAGACGCGCAGAGUGCUGAUACUGGCCUCUGUAAGAAGCCCUUCAG-3'

[염기서열 2]

5'-GCAGAGUGCUGAUACUGGCCUCUGAAGAAGCCCUUCAG-3'

도 3은 합성된 RNA의 PAGE 결과를 나타낸 사진으로서, 제1 레인의 밴드는 염기서열 1의 47-mer RNA를 나타내고, 제2 레인의 밴드는 염기서열 2의 38-mer RNA를 나타낸다. 도 3으로부터, 5'-쪽을 GGAGACGC로 시작하도록 하고, 3'-쪽은 poly A₂₀대신 AAGAAGCCCUUCAG의 염기서열로 합성되도록 디자인하면, 합성되는 RNA의 수율을 높일 수 있고, RNA poly A₂₀으로 인하여 발생되었던 RNA 밴드의 끌림 현상(smearing)을 방지할 수 있음을 알 수 있다.

B. 어피니티 칼럼(affinity column) 및 디엔에이자임(DNAzyme)의 제조

자동화된 핵산합성기를 이용하여, 폴리스티렌-라텍스(polystyrene-latex) 입자의 표면에 올리고-dN(oligo-dN)을 합성하여, 올리고-dN 어피니티 칼럼을 제조하였다. 디엔에이자임으로는 하기 염기서열 3을 가지는 32-mer DNA(서열목록 3)와 하기 염기서열 4를 가지는 33-mer DNA(서열 목록 4)를 합성하였다.

[염기서열 3]

5'-d(AGCACTCTGGGCTAGCTACAACGAGCGTCTCC)-3'

[염기서열 4]

5'-d(GGCTTCTTAGGCTAGCTACAACGAAGTGGCCAG)-3'

C. 어피니티 칼럼을 이용한 RNA 정제

올리고-dN 어피니티 칼럼과 바인딩 버퍼(250 mM NaCl, 20 mM 소듐포스페이트 버퍼, pH 7.0)를 혼합한 후, 합성된 RNA 시료를 넣고, 70℃에서 5분간 방치한 후, 서서히 식히면서 RNA 시료를 칼럼에 결합(annealing)시켰다. RNA 시료가 칼럼에 결합된 후 동일한 버퍼로 용출시켜 비 흡착 물질을 분리한 후, 세척 버퍼(250 mM NaCl, 20 mM 소듐포스페이트, pH 7.0)로 두 번 세척한 후, 용출 버퍼(1 mM 소듐포스페이트, pH 7.0)를 넣고, 70℃에서 5분간 방치한 다음, 흡착된 RNA를 용출시켜 회수하였다.

도 4는 어피니티 칼럼을 이용한 RNA 정제 생성물의 PAGE 결과를 나타낸 사진으로서, 제1 레인의 밴드는 RNA 전사체(transcript), 즉 합성 반응 후 어피니티 칼럼 통과 전의 RNA를 나타내고, 제2 및 제3 레인의 밴드는 어피니티 칼럼 세척액 내의 RNA를 나타내고, 제4 내지 제8 레인의 밴드는 용출 버퍼에 의하여 용출된 용출액 중의 RNA를 나타낸다. 도 4로부터 RNA 합성 시 발생하는 오류 전사체(abortive transcripts, N-1 또는 N+1 mer)가 제거됨을 확인할 수 있다. 도 4에 나타낸 PAGE는 15% 폴리아크릴아미드-7M 우레아 변성 겔을 이용하여 전기영동을 수행하고, 톨루이딘 블루(toluidine blue)로 검출한 것이다.

D. 디엔에이자임을 이용한 RNA-절단

탈염(desalting) 칼럼을 이용하여 얻어진 상등액으로부터 염 등의 불순물을 제거한 후, 합성된 두 디엔에이자임을 0.1x디엔에이자임 반응 버퍼(DNAzyme reaction buffer, 15 mM NaCl, 4 mM Tris-HCl, pH 8.0)와 혼합하여 첨가하고, 회전 침강(spin-down)한 다음, 95℃에서 3-4분간 가열한 후 얼음에서 5분간 방치하고, 25℃에서 10분간 숙성(incubation)하였다. 다음으로 5x 디엔에이자임 반응 버퍼(750 mM NaCl, 200 mM Tris-HCl, pH 8.0)를 1x 가 되도록, 즉 버퍼가 5배 희석되도록 넣어준 후, 37℃에서 1시간 동안 어닐링(annealing) 시킨 후, 60 mM MgCl₂를 첨가하여 37℃에서 4시간 반응시켰다.

반응이 끝난 후, 디엔에이자임과 RNA 절단 생성물을 15% 폴리아크릴아미드-7M 우레아 변성(denaturing) 겔 전기영동을 수행하여 RNA-절단 결과를 확인하였다. 도 5는 이와 같은 방법으로 얻은, 디엔에이자임을 이용한 RNA 절단 반응 생성물의 PAGE 결과를 나타낸 사진으로서, 제1 내지 제3 레인은 밤새(overnight) 숙성한 경우의 PAGE 결과이고, 제4 내지 제6 레인은 1시간 숙성, 제7 내지 제9 레인은 2시간 숙성, 제10 내지 제12 레인은 3시간 숙성 후의 PAGE 결과를 나타낸 것이다. 또한 제1 내지 제12 레인에서, 최상부 밴드는 디엔에이자임의 밴드이고, 중간 밴드는 구조를 규명하고자 하는 목적 RNA이고, 최하부 밴드는 절단된 RNA 절편으로서, RNA 정제를 위해 추가로 합성하였던 꼬리 또는 머리 부분을 나타낸다. 도 5로부터 어피니티 칼럼을 이용한 RNA 정제를 위해 추가로 합성하였던 꼬리(tail) 부분과 구조를 규명하고자 하는 목적 RNA 부분이 디엔에이자임 반응에 의해 절단되었음을 확인할 수 있다.

다음으로, 절단된 RNA 절편을 흡착하는 어피니티 칼럼을 이용하여 디엔에이자임 반응 생성물로부터 절단된 RNA 절편을 제거함으로써, 목적 RNA와 디엔에이자임을 분리한다. 도 6은 어피니티 칼럼을 이용하여 RNA 절편을 제거시킨 생성물의 PAGE 결과를 나타낸 사진이다. 도 6에서 제1 레인은 디엔에이자임 반응 생성물을 나타내고, 제2 레인은 어피니티 칼럼으로 정제된 목적 RNA와 디엔에이자임을 나타내며, 제3 및 제4 레인의 밴드는 어피니티칼럼 세척액의 RNA를 나타내고, 제5 내지 제9 레인의 밴드는 용출 버퍼에 의하여 용출된 용출액의 RNA, 즉 RNA 절편을 나타낸다. 끝으로, 디엔에이자임을 제거하기 위하여, DNA 분해효소인 DNase I으로 디엔에이자임을 처리한 후, superdex 75 HR 10/30 칼럼을 이용하여 생성된 dNTP와 RNA를 분리하였다.

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이상 상술한 바와 같이, 본 발명에 따른 어피니티 칼럼과 디엔에이자임을 이용한 고효율 RNA 제조방법은 구조연구에 필요한 대량의 RNA를 한번에 고수율로 생산할 수 있을 뿐만 아니라, 종래의 PAGE법에 비하여 현저히 짧은 시간 및 적은 노동력으로 목적 RNA를 제조할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 방법은 목적 RNA의 3'-쪽의 시퀀스 균일성(sequence homology)을 획득할 수 있어서, 뉴클레오티드 분해능으로 정제가 가능하며, 동시에 5'-쪽에 작용하는 디엔에이자임을 필요에 따라 사용함으로써 시작 시퀀스의 제한성을 극복하거나, 합성 수율을 향상시킬 수 있다.

<110> KOREA BASIC SCIENCE INSTITUTE <120> Process for Preparation of RNA using Affinity column and DNAzyme <130> PD3005 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 47 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified SLI domain of C-type hepatitis virus RNA <400> 1 ggagacgcgc agagugcuga uacuggccuc uguaagaagc ccuucag 47 <210> 2 <211> 38 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> modified SLI domain of C-type hepatitis virus RNA <400> 2 gcagagugcu gauacuggcc ucugaagaag cccuucag 38 <210> 3 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNAzyme <400> 3 agcactctgg gctagctaca acgagcgtct cc 32 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNAzyme <400> 4 ggcttcttag gctagctaca acgaagtggc cag 33

Claims

목적 RNA의 3'-쪽에, 올리고-dN 어피니티 칼럼의 올리고-dN 시퀀스와 상보적으로 결합할 수 있는 시퀀스를 부가시킨 부가 RNA를 제조하는 과정;

제조된 부가 RNA를 올리고-dN 어피니티 칼럼에 결합시켜 정제하는 과정; 및

정제된 부가 RNA를 디엔에이자임으로 절단하여 목적 RNA를 얻는 과정을 포함하는 RNA 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 디엔에이자임에 의하여 절단된 RNA 절편을 어피니티 칼럼을 이용하여 제거하는 과정과, DNA 분해효소로 상기 디엔에이자임을 분해한 후, 겔 여과 칼럼을 이용하여 디엔에이자임 분해 산물을 제거하는 과정을 더욱 포함하는 RNA 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 부가 RNA는 T7 RNA 중합효소와 화학적으로 합성한 DNA 템플레이트를 사용하여 제조하는 것인 RNA 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 목적 RNA의 5'-쪽에 목적 RNA의 전사 수율을 향상시키기 위한 소정의 시퀀스를 더욱 부가시킨 것을 특징으로 하는 RNA 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 올리고-dN 어피니티 칼럼은 폴리스티렌, CPG, 셀룰로오스 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 수지 입자 표면에서 올리고-dN을 합성하여 제조한 것인 RNA 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 올리고-dN 시퀀스와 상보적으로 결합할 수 있는 시퀀스는 AAGAAGCCCUUCAG의 염기서열을 가지는 것인 RNA 제조방법.
제1항에 있어서, 상기 디엔에이자임은 비결합 퓨린 염기과 결합 피리미딘 염기 사이의 포스포다이에스테르 결합을 절단하는 것을 특징으로 하는 RNA 제조방법.