JP2003325174A - 無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質またはペプチドの製造方法、およびこれを用いて製造したタンパク質またはペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 タンパク質の合成効率に優れる、無細胞抽出
液を用いた無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質
またはペプチドの製造方法を提供する。 【解決手段】 目的ペプチドまたは目的タンパク質のコ
ード配列と相補的な配列を有する環状ｓｓＤＮＡを鋳型
として、ＲＮＡポリメラーゼ反応を行うことによって、
１つのｍＲＮＡに前記環状ｓｓＤＮＡの相補的配列を複
数転写した１つ以上のｍＲＮＡを合成し、このｍＲＮＡ
を鋳型として、無細胞抽出液を使用した無細胞タンパク
質合成系により目的のペプチドまたはタンパク質を製造
する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明が属する技術分野】本発明は、無細胞タンパク質
合成系におけるタンパク質またはペプチドの製造方法、
およびそれを用いて製造したタンパク質またはペプチド
に関する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子工学の進歩により、目的タンパク
質を大量に合成する方法として、形質転換体を用いた方
法が一般的になってきている。このような形質転換体を
用いた合成方法としては、例えば、目的タンパク質のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡをプラスミドに連結し、
この組換え体を大腸菌に導入して大量培養する方法があ
げられる。しかしながら、このような方法は、例えば、
時間や手間がかかり、発現産物に毒性がある場合
に、大腸菌の生育低下に伴なってタンパク質の収率が低
下する、合成されたタンパク質の不溶化が起こり易い
等の欠点も問題となっており、全てのタンパク質合成に
適用することは困難であった。

【０００３】このような従来の細胞系を用いた合成方法
の問題を克服する新たなタンパク質合成方法として、近
年、試験管内でタンパク質を合成する、いわゆる無細胞
タンパク質合成系（生体外タンパク質合成系とも呼ばれ
る）が開発されている。この方法は、目的タンパク質を
コードする鋳型ＤＮＡ、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ
（アデノシン３リン酸）等を加えて、生体のタンパク質
合成系つまりセントラルドグマを試験管内で再現しよう
とするものであり、前述のような細胞系における問題を
解消し、例えば、生細胞では生産できないタンパク質を
合成できる等の利点がある。

【０００４】現在、このような無細胞タンパク質合成方
法について、より一層高い収率および優れた再現性でタ
ンパク質を合成できることが望まれている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】そこで、本発明の目的
は、さらにタンパク質またはペプチドの合成効率に優れ
る無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質またはペ
プチドの製造方法の提供である。

【０００６】

【課題を解決するための手段】前記目的を達成するため
に、本発明のタンパク質またはペプチドの製造方法は、
無細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合成系において、
ＤＮＡから１以上のｍＲＮＡを転写し、前記ｍＲＮＡか
ら、翻訳して目的タンパク質若しくは目的ペプチドを合
成するタンパク質またはペプチドの製造方法であって、
前記ＤＮＡは、前記目的タンパク質若しくは目的ペプチ
ドのコード配列と相補的配列を有し、ＲＮＡポリメラー
ゼ反応により、１つのｍＲＮＡに前記ＤＮＡの相補的配
列を複数転写することを特徴とする。

【０００７】前述のように、無細胞タンパク質合成系で
は、生細胞を用いたタンパク質合成に比べてタンパク質
の合成収率が低いという問題があったため、これらの問
題を回避すべく、近年では、ｍＲＮＡからタンパク質合
成を行う翻訳工程を効率良く行なうための改良がなされ
ていた。しかしながら、本発明者らは、従来とは全く異
なり、前記翻訳工程ではなくＤＮＡからｍＲＮＡの転写
工程に着目した。つまり、翻訳工程の効率を向上するの
ではなく、ｍＲＮＡの転写効率を向上させることによっ
てＲＮＡの発現量を増加させ、これによってタンパク質
の発現量を増加するべく鋭意研究を行なったのである。
そして、前述のように前記ＤＮＡを鋳型として転写した
ｍＲＮＡは、一つのｍＲＮＡに、前記ＤＮＡに対する相
補的配列を複数有するため、このようなｍＲＮＡを無細
胞タンパク質合成系に用いれば、効率よく目的タンパク
質やペプチドを発現できることを見出したのである。つ
まり、例えば、通常のプラスミド等の転写によって得ら
れるｍＲＮＡは、鋳型ＤＮＡを一回転写すると一旦転写
が終了するため、得られる複数のＲＮＡは、それぞれ、
ＤＮＡに対する相補的配列を１つだけ有するものとなる
が、これに対して、本発明における前記ｍＲＮＡは、図
１に示すように、例えば、ＤＮＡを鋳型(同図において
（−）鎖)として、転写が連続して行われて合成される
ため、前記ＤＮＡに対する相補的配列（＋）を複数有す
るｍＲＮＡ（同図においてポリ（＋）鎖）となる。この
ように、本発明のｍＲＮＡが前記ＤＮＡに対する相補的
配列を複数有することに起因して、必然的にタンパク質
の合成量も増加するのである。したがって、本発明のｍ
ＲＮＡを無細胞タンパク質合成系に用いれば、短時間で
タンパク質合成の効率を向上することも可能になる。ま
た、本発明の無細胞タンパク質合成系における製造方法
は、生命体が用いている遺伝暗号（コドン−アンチコド
ン）を使用するため、短鎖のオリゴペプチドから、生体
内で重要な遺伝子調節を行っているタンパク質等、様々
なタンパク質の合成に適用可能である。さらに、前述の
ようなタンパク質の翻訳工程の効率向上に着目した従来
の方法と組み合わせることによって、より一層タンパク
質合成効率の向上を図る事も可能となる。前述の図１に
示すように、ＤＮＡの相補的配列が連続したＲＮＡを転
写する方法を、ローリング・シンクロナイゼーション法
という。

【０００８】なお、本発明において、前記ＤＮＡから１
つ以上のｍＲＮＡが転写されてもよく、各々のｍＲＮＡ
が前記ＤＮＡの相補的配列を複数転写していればよい。

【０００９】本発明の製造方法において、前記ＤＮＡ
は、環状一本鎖ＤＮＡ（ｓｓＤＮＡ）であることが好ま
しい。環状ｓｓＤＮＡであれば、前述のようにＲＮＡポ
リメラーゼ反応によって、１つのｍＲＮＡに前記ＤＮＡ
の相補的配列を複数転写することが容易だからである。

【００１０】また、前記一つのｍＲＮＡには、前述のよ
うに前記ＤＮＡの相補配列が複数転写されるが、得られ
るｍＲＮＡは、前記ＤＮＡに対して相補的な配列を少な
くとも２つ以上有していればよい。また、前記ｍＲＮＡ
における前記相補的配列の数の上限は、特に制限され
ず、例えば、ｍＲＮＡ合成における反応時間やＤＮＡの
配列等に応じて変化すると考えられる。

【００１１】本発明の製造方法において、前記ＤＮＡの
塩基数は、３０〜１０００ｎｔの範囲であることが好ま
しい。

【００１２】本発明の製造方法において、例えば、無細
胞タンパク質合成系として大腸菌等の細菌由来の系を使
用する場合、前記細菌由来のリボゾームがｍＲＮＡの開
始を認識してタンパク質合成を確実に行うために、前記
ＤＮＡは、ＳＤ配列に相補的な配列を有することが好ま
しい。

【００１３】本発明の製造方法において、前記ＤＮＡ
は、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｃ）およびポリ（Ｔ）からなる
群から選択された少なくとも一つの配列を有することが
好ましく、この中でも好ましくはポリ（Ｔ）配列であ
る。ＤＮＡとして環状ｓｓＤＮＡを使用する場合、例え
ば、このような配列を有するｓｓＤＮＡを用いれば、環
化を容易に行って前記環状ｓｓＤＮＡを調製できるから
である。また、これらの配列の塩基数は、例えば、５〜
５０ｎｔの範囲であることが好ましい。

【００１４】本発明の製造方法において、前記ＤＮＡ
は、プロモーター配列を有していてもよく、前記プロモ
ーターとしては、例えば、Ｔ７プロモーター、tacプロ
モーター、lac UV5プロモーター、taqプロモーター等が
ある。

【００１５】本発明の製造方法において、前記ｍＲＮＡ
は予め別途調製してもよいが、例えば、前記ｍＲＮＡの
転写と、目的タンパク質合成または目的ペプチド合成と
を、同じ反応系で行うことが好ましい。このようにして
ｍＲＮＡを合成すれば、そのままタンパク質等の合成を
行なうことができるため、迅速かつ簡便に目的タンパク
質等の製造を行うことができる。

【００１６】次に、本発明のタンパク質またはペプチド
は、前記本発明のタンパク質またはペプチドの製造方法
により製造したタンパク質またはペプチドである。前述
のような方法によれば、優れた効率でタンパク質を合成
できるため、得られたペプチドやタンパク質を各種用途
に供することができる。

【００１７】

【発明の実施の形態】本発明は、例えば、目的タンパク
質のコード配列と相補的配列を有する環状ｓｓＤＮＡを
調製し、これを鋳型として無細胞タンパク質合成系にお
いて、ｍＲＮＡ合成（転写）およびタンパク質合成（翻
訳）させることによって行うことができる。以下に本発
明の製造方法の一例を示す。

【００１８】（１）鋳型となる環状ｓｓＤＮＡの作製 転写の鋳型となる環状ｓｓＤＮＡは、例えば、前駆体と
なる直鎖状ｓｓＤＮＡを準備し、これを環化することに
よって調製できる。この環状ｓｓＤＮＡは、ｍＲＮＡ合
成の鋳型となるため、所望のｍＲＮＡと相補的配列とな
るように設計する。

【００１９】前記直鎖状ｓｓＤＮＡの長さは、環化に影
響がなければ特に制限されず、例えば、３０〜１０００
ｎｔの範囲が適当である。

【００２０】そして、前記直鎖状ｓｓＤＮＡは、例え
ば、少なくとも発現させる目的タンパク質のコード領域
の塩基配列（開始コドンおよび終結コドンを含む）に相
補的な配列を有していればよい。前記コード領域に相補
的な配列の長さは、目的タンパク質のアミノ酸残基数に
より異なり、適宜決定できる。

【００２１】前記コード領域に相補的な配列は、例え
ば、従来公知のクローニング方法等によって自然界より
単離してもよいし、既に公知となっているアミノ酸配列
や塩基配列の情報を基に化学的に合成してもよい。前記
配列情報に関しては、各種文献だけでなく、例えば、米
国国立衛生研究所（ＮＩＨ）により管理されている「ジ
ェンバンク」等の各種データーベースを利用することも
できる。

【００２２】前記直鎖状ｓｓＤＮＡの配列は、さらに、
前記コード領域に相補的な配列の他に、ｓｓＤＮＡの環
状化を容易にする配列を含むことが好ましい。このよう
な配列としては、例えば、ポリ（Ａ）配列、ポリ（Ｃ）
配列およびポリ（Ｔ）配列のように同じ塩基から構成さ
れたポリマー配列等があげられる。なお、これらの配列
の存在によって、ｓｓＤＮＡが環状化し易くなることの
メカニズムは不明である。

【００２３】これらの配列の中でも、より好ましくは前
記同じ塩基から構成されたポリマーであり、特に好まし
くはポリ（Ｔ）配列である。例えば、ポリ（Ｔ）配列の
ように同じ塩基から構成されていれば、ｓｓＤＮＡを容
易に環状化できるだけでなく、環状ｓｓＤＮＡに相補的
なポリヌクレオチド配列の連続転写に影響を与えること
もない。つまり、前記環状ｓｓＤＮＡの転写により合成
された、前記ポリ（Ｔ）配列に相補的なｍＲＮＡ中のポ
リ（Ａ）配列は、ｍＲＮＡの二次構造に対する影響が非
常に少なく、例えば、ステムループ構造を形成し難いた
め、ステムループ構造による転写終結の問題等が起こら
ない。そのため、前記環状ｓｓＤＮＡの転写が一回ごと
に終結せず、連続的に行われ、前記環状ｓｓＤＮＡ配列
に相補的なポリヌクレオチド配列を複数有する長鎖のｍ
ＲＮＡを形成できるのである。この長鎖ｍＲＮＡは、転
写の回数（ｎ）だけ、前記ポリヌクレオチド配列（Ｘ）
が連なった構造［（Ｘ）_n］となる。

【００２４】前記ｓｓＤＮＡの環状化を容易にするポリ
（Ｔ）等の配列の長さは、特に制限されないが、例え
ば、５〜５０ｎｔの範囲が適当である。

【００２５】さらに、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの配列は、
例えば、プロモーター、エンハンサー等の転写効率に関
与する配列や、Shine-Dalgano(ＳＤ)配列に相補的な配
列等を有してもよい。これらの配列は、例えば、目的の
タンパク質の種類や、後述する無細胞タンパク質合成系
の種類等に応じて適宜決定できる。

【００２６】前記プロモーターの種類としては、Ｔ７プ
ロモーター、tacプロモーター、lacUV5プロモーター、t
aqプロモーター等が好ましく、これらの中でも特にＴ７
プロモーターが好ましい。

【００２７】一方、転写反応のＲＮＡポリメラーゼとし
て、例えば、Ｔ７ポリメラーゼや、E.coli ＲＮＡポリ
メラーゼを使用する場合には、プロモーターがなくても
転写を開始できることから、プロモーター配列を含まな
くともよく、特にこのような環状ｓｓＤＮＡの場合は、
プロモーター配列を有していない方が、転写効率に優れ
好ましい。

【００２８】具体的には、無細胞タンパク質合成を、大
腸菌等の細菌の無細胞抽出液を用いて行う場合、直鎖状
ｓｓＤＮＡが、例えば、タンパク質のコード領域に相補
的な配列の３’側下流に、前記ＳＤ配列に相補的な配列
を有することが好ましい。これは、大腸菌等の細菌にお
いて翻訳が始まる際、リボソームが、ｍＲＮＡの開始コ
ドン（ＡＵＧ）の５’側上流にあるＳＤ配列と塩基対相
互作用することによって、前記開始コドン（ＡＵＧ）を
認識する必要があるためである。このＳＤ配列に相補的
な配列は、特に制限されず、従来公知のＳＤ配列をもと
に設定できる。

【００２９】また、この直鎖状ｓｓＤＮＡは、後述する
ように、その３’末端と５’末端とをライゲーションさ
せて環状化を行うが、環状ｓｓＤＮＡのどの配列部分を
前記直鎖状ｓｓＤＮＡの両末端に設定するかは特に制限
されない。具体例としては、例えば、図２に示すよう
に、ＳＤ配列の相補配列の一部を直鎖状ｓｓＤＮＡの
３’末端とし、残りの部分を５’末端として、後述する
ライゲーションによって完全にＳＤ配列に相補的な配列
となるように設定してもよい。

【００３０】このような直鎖状ｓｓＤＮＡは、例えば、
従来公知の化学合成法等によって合成し、その５’末端
をリン酸化して調製することができる。また、例えば、
末端をビオチン化したプライマーと、リン酸化したプラ
イマーとを用いてＰＣＲを行い、ビオチン−アビジン相
互作用を用いて二本鎖を一本鎖にすることによって、直
鎖状ｓｓＤＮＡを調製することもできる。

【００３１】つぎに、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの環化は、
例えば、前記直鎖状ｓｓＤＮＡの両末端をＤＮＡリガー
ゼで結合することによって行うことができる。

【００３２】前記ＤＮＡリガーゼは、特に制限されない
が、例えば、T4 DNAリガーゼ、E.coli DNAリガーゼ、Pf
u DNAリガーゼ等があげられ、これらの中でもT4 DNAリ
ガーゼが好ましい。

【００３３】前記DNAリガーゼによるライゲーション反
応は、例えば、split DNAの存在下で行うことが好まし
い。本発明において、前記split DNAとは、前記直鎖状
ｓｓＤＮＡの連結領域の数十塩基と二重鎖を形成できる
相補的な配列からなるＤＮＡをいう。

【００３４】split DNAを用いたライゲーション方法の
一例を図３に基づいて説明する。同図（ａ）に示すよう
に、直鎖状ｓｓＤＮＡを、その両端の塩基配列に相補的
な配列を併せ持つsplit DNAの存在下で反応させる。す
ると、同図（ｂ）に示すように、前記直鎖状ｓｓＤＮＡ
の両端と前記split DNAとが塩基対を形成し、この塩基
対によって直鎖状ｓｓＤＮＡの環化状態が保持される。
つまり、前記split DNAが、直鎖状ｓｓＤＮＡの環化の
アダプターとしての役割を果たす。そして、同図（ｃ）
に示すように、前記split DNAによって環化が保持され
た状態で、ＤＮＡリガーゼにより前記直鎖状ｓｓDNAの
両末端がライゲーションされる。

【００３５】前記split DNAの長さは、特に制限されな
いが、例えば、１０〜４０ｎｔの範囲が適当である。

【００３６】前記ライゲーション反応の条件は、使用す
るＤＮＡリガーゼの種類や直鎖状ｓｓＤＮＡの濃度等に
応じて適宜決定できるが、例えば、0.1〜10μM 直鎖状s
sDNA、0.3〜30μM split DNA、20mM NaCl、1〜15mM MgCl₂、
10mMジチオトレイトール（ＤＴＴ）、10μM ATP、0.33U/
μL DNA リガーゼおよび2.5mM Tris-HCl（pH7.5）を含
む反応溶液において、通常、温度２５℃で１〜１２時間
で反応させればよい。また、前記反応溶液は、市販の製
品を使用してもよい。なお、split DNAの濃度は、直鎖
状ｓｓＤＮＡ濃度よりも高濃度であることが好ましい。

【００３７】このように、split DNAを用いて環状ｓｓ
ＤＮＡを作成した場合、前記図３（ｃ）に示すように部
分的に二本鎖を含むこととなるが、例えば、これを変性
アクリルアミドゲル電気泳動に供して精製することによ
って、前記split DNAを除去した環状ｓｓＤＮＡを得る
ことができる。

【００３８】（２）環状ｓｓＤＮＡを用いた無細胞タン
パク質合成 前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型として、無細胞抽出液を含む
反応溶液を用いた無細胞タンパク質合成系において目的
タンパク質の合成を行う。このように無細胞タンパク質
合成系において、鋳型としてＤＮＡを使用する場合に
は、同じ反応系においてｍＲＮＡ合成（転写）とタンパ
ク質合成（翻訳）が行われる。なお、前記環状ｓｓＤＮ
ＡからｍＲＮＡを予め合成しておき、このｍＲＮＡを鋳
型として、無細胞タンパク質合成系に供することもでき
るが、これについては後述する。

【００３９】前記無細胞抽出液としては、特に制限され
ないが、例えば、大腸菌、小麦胚芽、ウサギ網状赤血球
等の抽出液が使用でき、これらの抽出液は、例えば、材
料に応じ従来公知の方法によって調製できる。具体的
に、大腸菌の無細胞抽出液は、例えば、Ellmanらの方法
（Methods Enzymol.202:301-336（1991））の方法によ
って調製できる。

【００４０】前記反応溶液は、前記無細胞抽出液および
鋳型となる環状ｓｓＤＮＡの他に、例えば、ＲＮＡポリ
メラーゼ、タンパク質を構成する各種アミノ酸、各種緩
衝剤、ATP、GTP、CTPおよびUTP等のエネルギー源、クレ
アチンリン酸、ホスホエノールピルビン酸、クレアチン
キナーゼおよびピルビン酸キナーゼ等のＡＴＰ再生系、
ジチオスレイトール(DTT)、スペルミンおよびスペルミ
ジン等の安定化剤、ＲＮａｓｅ阻害剤等を添加すること
が好ましい。また、これらの添加量は、使用する鋳型の
環状ｓｓＤＮＡの量等に応じて適宜決定できる。

【００４１】前記ＲＮＡポリメラーゼの種類は特に制限
されず、例えば、鋳型ｓｓＤＮＡにおけるプロモーター
の種類に応じて適宜決定してもよい。具体的には、例え
ば、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ、Ｔ３ＲＮＡポリメラー
ゼ、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼ、E.coli ＲＮＡポリメ
ラーゼ等が使用できる。

【００４２】また、このような無細胞タンパク質合成に
は、市販の無細胞タンパク質合成キットを使用すること
もできる。具体的には、例えば、商品名E.coli S30 Ext
ractsystem(フ゜ロメカ゛社製)、E.coli T7 S30 Extract（フ゜ロ
メカ゛社製）、PROTEIN script-Pro(Ambion社製）等が使用
できる。これらのキットは、それらの使用方法に準じた
条件で使用できる。

【００４３】タンパク質合成の反応条件は、特に制限さ
れず、使用する無細胞抽出液や目的のタンパク質の種類
等に応じて適宜決定できる。

【００４４】このような方法によれば、前記環状ｓｓＤ
ＮＡを鋳型とするｍＲＮＡ合成と、前記ｍＲＮＡを鋳型
とするタンパク質合成とが、並行して同じ無細胞タンパ
ク質合成系において進行する。

【００４５】前記環状ｓｓＤＮＡを鋳型として使用すれ
ば、前述のように、前記環状ｓｓＤＮＡに相補的なポリ
ヌクレオチドが連続して転写され、前記ポリヌクレオチ
ドを複数含む長鎖のｍＲＮＡを得ることができる。この
ように、１分子の環状ｓｓＤＮＡから前記ポリヌクレオ
チド配列を複数含むｍＲＮＡが合成されるため、鋳型Ｄ
ＮＡを一回転写する度にＲＮＡポリメラーゼが解離して
転写が終結する従来の方法に比べて、極めて短時間で効
率よく、複数の前記ポリヌクレオチド配列を合成でき
る。そして、このように目的タンパク質をコードするポ
リヌクレオチド配列を多く含むｍＲＮＡが合成されるこ
とによって、それだけタンパク質合成の鋳型が増加する
ことになるため、タンパク質の合成効率も向上するので
ある。

【００４６】このようにして合成された目的のタンパク
質は、例えば、アフィニティーカラムクロマトグラフィ
ー等の従来公知の方法によって精製すればよい。

【００４７】また、前述のように、前記ｍＲＮＡ合成工
程（転写工程）およびペプチド合成工程（翻訳工程）を
同じ無細胞タンパク質合成系において同時に行うのでは
なく、予め調製したｍＲＮＡを鋳型として、無細胞タン
パク質合成系において目的タンパク質を合成してもよ
い。

【００４８】この場合は、ｍＲＮＡ合成は、前記環状ｓ
ｓＤＮＡを鋳型として、前述のようなＲＮＡポリメラー
ゼによる転写反応によって行うことができる。

【００４９】前記反応には、ＲＮＡポリメラーゼ以外
に、通常、各種ＮＴＰ（ATP、GTP、CTP、UTP）、ＲＮａ
ｓｅインヒビター、各種緩衝剤等を必要とする。また、
反応条件は、使用するＲＮＡポリメラーゼの種類等に応
じて適宜決定できるが、例えば、ｐＨ７．０〜８．５の
範囲、温度３７℃、時間１〜１２時間の範囲が好まし
い。

【００５０】得られたｍＲＮＡを含む反応物は、例え
ば、そのまま次の工程に供してもよいし、各種カラムで
精製してから使用してもよい。

【００５１】そして、得られた前記ｍＲＮＡを鋳型とし
て、前述の無細胞タンパク質合成を行う。なお、使用す
る無細胞抽出物や条件等は同様である。

【００５２】

【実施例】（実施例１）（Ｈｉｓ）₆のコード配列と相
補的な配列を有する環状ｓｓＤＮＡを調製し、無細胞タ
ンパク質合成系において（Ｈｉｓ）₆の合成を行った。

【００５３】（１）環状ｓｓＤＮＡの作製 （直鎖状ｓｓＤＮＡの作製）環状化させる直鎖状ｓｓＤ
ＮＡとして、配列番号１に示す配列（5'-CTGTTTCCT(T)
₂₀CTA(ATG)₆CATAG-3'）（55nt）を設計し、これをＤＮ
Ａ自動合成機（商品名ＤＮＡシンセサイザーModel391：
アブライドバイオシステムズ社製）を用いたホスホロア
ミダイト法によって固相合成し、その５’末端をリン酸
化用ホスホロアミダイト試薬（商品名化学リン酸化試
薬：Glen Reseach社製）によってリン酸化した。なお、
配列番号１において、５’末端の5'-CTGTTTCCTおよび
３’末端のAG-3'が、ＳＤ配列の相補配列であり、CTA(A
TG)₆CATが、終始コドンおよび開始コドンを含むコード
配列の相補配列である。

【００５４】（直鎖状ｓｓＤＮＡの環状化）まず、5×
ligation buffer （75mM MgCl₂、100mM NaCl、125mM Tr
is-HC1(pH77.5)）に、１μＭの前記環状化させるssDNA
および３μＭのsplint DNA（配列番号２：5'-AGGAAACAG
CTATGCATC-3'）を添加して、反応溶液を調製した。な
お、反応溶液におけるMgCl₂、NaClおよびTris-HC1の終
濃度は、15mM MgCl₂、20mM NaCl、25mM Tris-HC1であ
る。そして、この反応溶液を９０℃で１０分間インキュ
ベートした後、2時間かけて前記反応溶液の温度を室温
まで戻した。つぎに、前記反応溶液に、最終濃度が10ｍ
M DTTおよび100μM ATPとなるように、1M DTTおよび100
mM ATPを添加し、さらに、最終濃度がO.33units／μLと
なるようにT₄ DNAリガーゼ(400U／μL：New England Bi
olabs社製)を添加して、２５℃で１２時間、ライゲーシ
ョン反応を行った。このsplit DNAおよびＤＮＡリガー
ゼを用いた環状ｓｓＤＮＡの生成反応を図４に示す。

【００５５】（環状ｓｓＤＮＡの精製）前記反応溶液
を、透析チューブ(MWCO 1000：商品名Spectra-Por、Spe
ctrum社製)を用いて透析し、透析後の溶液を凍結乾燥し
た。この凍結乾燥品を７Ｍ尿素水溶液に懸濁し、15% 変
性ポリアクリルアミドゲルにアプライし、環状ｓｓＤＮ
Ａ、直鎖状ｓｓＤＮＡ、splint DNA とを電気泳動によ
り分離した。目的の環状ｓｓＤＮＡ画分のゲルを切り出
し、これを細かく砕き、さらに０．２Ｎ ＮａＣｌ ５〜
１０ｍＬを添加して、２５℃で１２時間シェイクし、環
状ｓｓＤＮＡを抽出した。その後、フィルターを用いて
前記ゲル断片を除去し、得られた溶液を再度前記透析チ
ューブを用いて１２時間透析した後、透析溶液を凍結乾
燥した。この凍結乾燥品を７Ｍ尿素水溶液に懸濁し、７
Ｍ尿素を含む１５％変性ポリアクリルアミドゲル電気泳
動を行った。その結果、図５の電気泳動図に示すよう
に、直鎖状ｓｓＤＮＡ（レーン１）が環化されたことに
よって、環状ｓｓＤＮＡ（レーン２）が生成されている
ことが確認できた。

【００５６】（２） ペプチドの発現 調製した前記環状ssDNAを鋳型として転写・翻訳を行
い、（Ｈｉｓ）₆ペプチドを発現させた。無細胞タンパ
ク質合成システム系としては、以下に示す組成の市販
品：商品名E.coli S30 Extract system(Promega)を使用
し、その使用方法に準じて反応（３７℃、２時間）を行
った。

【００５７】 （E.coli S30 Extract system） 鋳型（調製した環状ssDNA） 3.0μＬ amino acid mixture 2.5μL S30 Premix without amino acid 10.0μL S30 Extract linear 7.5μL Nuclease-free water 5.0μL

【００５８】なお、環状ｓｓＤＮＡを鋳型として使用し
た場合に、これに相補的なポリヌクレオチド配列を複数
有する長鎖のｍＲＮＡが形成されるか否かを別途確認し
た。これは、まず、前記環状ｓｓＤＮＡについて、E.co
li ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写反応（３７℃、３
時間）を行い、得られた転写産物を、２％未変性アガロ
ースゲル電気泳動に供した。前記反応液の組成は、環状
ｓｓＤＮＡ １μＭ、５０Ｕ ＲＮＡポリメラーゼ、５０
０μM ＮＴＰｓ、１２．５U/mL ＲＮａｓｅ阻害剤（プ
ロメガ社製）とした。電気泳動の結果、図６に示すよう
に、転写産物のＲＮＡは、アガロースゲルのウェル付近
に止まったことから、約1000nt以上の長鎖ｍＲＮＡが得
られたことが確認できた（レーン２の矢印）。なお、同
図においてレーン１は、分子量マーカー（726、427、31
1、249bp）である。

【００５９】また、比較例１として、前記環状ｓｓＤＮ
Ａの代りに、（Ｈｉｓ）₆をコードする塩基配列を含むd
sDNAを鋳型とした以外は、前記環状ssDNAと同様にして
ペプチド発現を行った。この比較例のｄｓＤＮＡの配列
は、配列番号３のセンス鎖を持つ、以下の配列となるよ
うに設計し、自動合成機により化学合成した。なお、ア
ンチセンス鎖における 3'-dTTACTCGACAACTGTTAATTAGTAG
GCCGAGCATATTACACACCTTの配列は、E.coli taq promoter
配列である。

【００６０】

【化１】

【００６１】（３）合成ペプチドの精製 目的のペプチドを、前記無細胞タンパク質合成系におけ
る反応生成物からニッケルキレートカラム(商品名HiTra
p Chelating: Amersham Pharmacia Biotech)を用いて精
製した。まず、前記カラムを１ｍＭ Ｎｉ²⁺を含むＰＢ
Ｓ(Phosphate-bufferd saline：pH7.4)により平衡化し
た。そして、前記反応溶液２５μＬを前記ＰＢＳで計１
ｍＬにボリュームアップして、平衡化した前記カラムに
アプライし、さらに１０ｍＬの前記ＰＢＳを流した後、
200mM イミダゾール溶液で溶出を行った。溶出液は１ｍ
Ｌのフラクションごとに回収した。各フラクションごと
に透析チューブ（ＭＷＣＯ500：商品名Spectra-Pro：Sp
ectrum社製）を用いて透析を行い、この透析液を必要に
応じて凍結乾燥した。

【００６２】（４）合成ペプチドの確認 合成ペプチドとして目的の（Ｈｉｓ）₆が合成されてい
るか否かを、商品名MALDI-TOF mass spectrometer（商
品名Voyager：PerSeptive社製）を用いたマススペクト
ル（ＭＳ）によって確認した。ＭＳに使用するペプチド
用マトリックスは、α-cyano-4-hydroxyclannamic acid
s(αCHCA：MW189.17)１０ｍｇに、アセトニトリル５０
０μＬ、水４９７μＬおよび０．１％ＴＦＡ３μＬを添
加して調製した。合成ペプチドのサンプルは、約１０μ
mol／Ｌの濃度となるように調製した。そして、調製し
たサンプルと前記マトリックスとを１：４（体積比）の
割合で混合して、測定に供した。なお、コントロールと
しては、化学合成品である標品（Ｈｉｓ）₆を使用し
た。

【００６３】これらの結果を図７に示す。同図はペプチ
ドのマススペクトルであり、同図（Ａ）が実施例の結
果、同図（Ｂ）がコントロールの結果をそれぞれ示す。

【００６４】（５）合成ペプチド発現量の確認 公知のオルト−フタルアルデヒド（ＯＰＡ）法によっ
て、合成ペプチドの発現量を確認した。ＯＰＡ法は、試
料に水を添加して１０μＬとし、これに下記ＯＰＡ試薬
１００μＬを混合して、室温で１５分放置後、さらに
０．５Ｍ ＮａＣｌ１ｍＬを混合して、その蛍光を測定
した。測定条件は、励起波長３４０ｎｍ、蛍光波長４４
０〜４５５ｎｍとした。

【００６５】（ＯＰＡ試薬）ＯＰＡ１２０ｍｇをエタノ
ール１．５ｍＬに溶解し、１．０Ｍホウ酸カリウム緩衝
液（ｐＨ１０．４）１００ｍＬに加え、さらに、３０重
量％Ｂｒｉｊ３５を０．６ｍＬ添加した。そして、使用
３０分前までに、前記混合液１ｍＬあたり３μＬの２−
メルカプトエタノールを添加して、ＯＰＡ試薬を調製し
た。

【００６６】これらの結果を図８に示す。同図は、合成
ペプチドの発現量を蛍光強度で表わしたグラフである。

【００６７】実施例１における合成ペプチドは、前記図
７（Ａ）のマススペクトルに示すように、前記図７
（Ｂ）のコントロール（Ｈｉｓ）₆のピーク（m/z 882.7
6）と同様のピーク（m/z 882.98）を示している。この
ことから、実施例において環状ｓｓDNAを使用すること
によって、（Ｈｉｓ）₆を合成できることが確認され
た。また、図７（Ａ）においては、前記（Ｈｉｓ）₆の
ピーク以外に、二つのピークが見られるが、これらはそ
れぞれ（Ｈｉｓ）₅（m/z 768.88）および（Ｈｉｓ）₆Ｍ
ｅｔ（m/z 1052.24）を示していると考えられる。

【００６８】なお、実施例１における無細胞タンパク質
合成により得られた合成ペプチド（Ｈｉｓ）₆およびコ
ントロールの化学合成ペプチド（Ｈｉｓ）₆の化学式を
以下に示す。

【００６９】

【化２】

【００７０】そして、実施例１において得られたペプチ
ド（Ｈｉｓ）₆の発現量として、蛍光強度を測定した結
果、前記図８に示すように、dsDNAを用いた比較例に比
べて、環状ssDNAを用いた実施例１によれば、非常に高
い蛍光強度が得られた。具体的には、Fraction１におい
て比較例の約４０倍、Ｆraction２において比較例１の
約４０倍の蛍光強度を示しており、前記蛍光強度は、ペ
プチドの発現量と相関関係にあることからも、極めて優
れた発現量でペプチドが合成されたといえる。このこと
から、実施例１における環状ssDNAによれば、ペプチド
の発現量を増加でき、効率よくペプチド合成が行えるこ
といえる。

【００７１】

【発明の効果】このように、本発明の製造方法によれ
ば、前記ＤＮＡを鋳型として転写したｍＲＮＡが、前記
ＤＮＡに対して相補的な配列を複数有するｍＲＮＡであ
るため、効率よく目的タンパク質やペプチドを発現する
ことができる。このような方法によれば、迅速かつ簡便
に所望のタンパク質やペプチドを合成することができ
る。

【００７２】

【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> 株式会社アイ．エス．ティ <120> 無細胞タンパク質合成系におけるタンパク質またはペプチドの製造方法、 および、これを用いて製造したタンパク質またはペプチド <130> R6525 <140> <141> <160> 3 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 55 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:ssDNA <400> 1 ctgtttcctt tttttttttt tttttttttc taatgatgat gatgatgatg catag 55 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:ssDNA <400> 2 aggaaacagc tatgcatc 18 <210> 3 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence:dsDNA <400> 3 aatgagctgt tgacaattaa tcatccggct cgtataatgt gtggaaaaaa aaaaaaagga 60 aacagctatg catcatcatc atcatcatta gaaaaaaaa 99

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明の製造方法における、環状ｓｓＤＮＡか
らｍＲＮＡの転写工程を示す概略図である。

【図２】本発明の実施形態において、環状ｓｓＤＮＡの
前駆体となる直鎖状ｓｓＤＮＡの末端配列の一例を示す
概略図である。

【図３】本発明の実施形態において、直鎖状ｓｓＤＮＡ
を環化して環状ｓｓＤＮＡを調製する工程の一例を示す
概略図である。

【図４】本発明の一実施例において、直鎖状ｓｓＤＮＡ
を環化して環状ｓｓＤＮＡを調製する工程を示す概略図
である。

【図５】前記実施例において、環状ｓｓＤＮＡの生成を
確認した電気泳動図である。

【図６】前記実施例において、環状ｓｓＤＮＡから転写
されたｍＲＮＡの電気泳動図である。

【図７】前記実施例における合成したペプチドのマスス
ペクトルであって、同図（Ａ）は、実施例のマススペク
トル、同図（Ｂ）はコントロールのマススペクトルを示
す。

【図８】前記実施例における合成ペプチドの発現量を蛍
光強度で示したグラフである。

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 無細胞抽出液を含む無細胞タンパク質合
   成系において、ＤＮＡから１以上のｍＲＮＡを転写し、
   前記ｍＲＮＡから、翻訳して目的タンパク質若しくは目
   的ペプチドを合成するタンパク質またはペプチドの製造
   方法であって、前記ＤＮＡは、前記目的タンパク質若し
   くは目的ペプチドのコード配列と相補的配列を有し、Ｒ
   ＮＡポリメラーゼ反応により、１つのｍＲＮＡに前記Ｄ
   ＮＡの相補的配列を複数転写することを特徴とする製造
   方法。
2. 【請求項２】 前記ＤＮＡが、環状一本鎖ＤＮＡ（環状
   ｓｓＤＮＡ）である請求項１記載の製造方法。
3. 【請求項３】 前記ＤＮＡの塩基数が、３０〜１０００
   ｎｔの範囲である請求項２記載の製造方法。
4. 【請求項４】 前記ＤＮＡが、ＳＤ配列に相補的な配列
   を有する請求項１〜３のいずれか一項に記載の製造方
   法。
5. 【請求項５】 前記ＤＮＡが、ポリ（Ａ）、ポリ（Ｃ）
   およびポリ（Ｔ）からなる群から選択された少なくとも
   一つの配列を有する請求項１〜４のいずれか一項に記載
   の製造方法。
6. 【請求項６】 ポリ（Ａ）、ポリ（Ｃ）およびポリ
   （Ｔ）からなる群から選択された少なくとも一つの配列
   の塩基数が５〜５０ｎｔの範囲である請求項５記載の製
   造方法。
7. 【請求項７】 前記ＤＮＡが、プロモーター配列を有し
   ている請求項１〜６のいずれか一項に記載の製造方法。
8. 【請求項８】 プロモーターが、Ｔ７プロモーター、ta
   cプロモーター、lacUV5プロモーターおよびtaqプロモー
   ターからなる群から選択された少なくとも一つのプロモ
   ータである請求項７記載の製造方法。
9. 【請求項９】 無細胞抽出液が、大腸菌、小麦胚芽およ
   びウサギ網状赤血球からなる群から選択された少なくと
   も一つの抽出液である請求項１〜８のいずれか一項に記
   載の製造方法。
10. 【請求項１０】 ｍＲＮＡの転写と、目的タンパク質合
    成または目的ペプチド合成とを、同じ反応系で行う請求
    項１〜９のいずれか一項に記載の製造方法。
11. 【請求項１１】 請求項１〜１０のいずれか一項に記載
    のタンパク質またはペプチドの製造方法により製造した
    タンパク質またはペプチド。