KR20040073815A - 코리네박테리아의 성장촉진 폴리펩티드, 이를 코딩하는핵산 분자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 코리네박테리아의 성장촉진 폴리펩티드, 이를 코딩하는 핵산 분자, 이 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터 및 이 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주, 상기 폴리펩티드의 제조방법, 상기 폴리펩티드를 이용한 코리네박테리아 균주의 성장촉진 방법 및 코리네박테리아 균주의 발효에 의한 L-아미노산의 제조 방법에 관한 것이다.

Description

코리네박테리아의 성장촉진 폴리펩티드, 이를 코딩하는 핵산 분자 및 이의 용도 {Growth stimulating polypeptide derived from Corynebacteria, nucleic acid molecule coding for said polypeptide and use thereof}

본 발명은 코리네박테리아 균주의 성장촉진 인자(Corynebacterium growth promoting factor)로 기능하는 폴리펩티드(이하, Gpf 폴리펩티드로 표시될 수 있다), 이 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자(이하, gpf 핵산 분자로 표시될 수 있다), 이 핵산 분자를 포함하는 재조합 발현 벡터, 이 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 균주, 상기 폴리펩티드의 제조방법, 상기 코리네박테리아 균주의 성장촉진 폴리펩티드를 이용한 코리네박테리아 균주의 성장촉진 방법 및 이와 같은 효과에 의한 L-아미노산의 생산성 증대 방법에 관한 것이다.

코리네박테리아 균주(Corynebacteria), 특히 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)은 L-아미노산 생산에 많이 이용되고 있는 그람 양성의 미생물이다. L-아미노산, 특히 L-리신은 동물사료, 사람의 의약품 및 약제산업에 사용되고 있으며 코리네박테리아 균주의 발효에 의해 생성되고 있다. 이와 같이 코리네박테리아 균주를 이용한 L-아미노산의 제법은 중요하기 때문에 그 제조방법을 개선하기 위해 많은 시도가 행해지고 있다.

미생물의 L-아미노산 생산성 향상을 위해 지금까지는 돌연변이 유발법, 선별법 및 돌연변이체 선택법을 사용하여 왔다. 그러나, 이러한 방법들에 의해 생산성은 어느 정도 향상되지만 균주의 생장속도는 저하되고 특이 아미노산에 대한 영양요구성이 요구된다.

다른 방도로서, 재조합 DNA 기술을 이용하여 각각의 L-아미노산 생합성-관련 유전자를 증폭시켜 L-아미노산 생성에 미치는 효과를 연구하고 L-아미노산 생산 코리네박테리움 균주를 개량하려는 연구가 많이 있어 왔다[Kinoshita, 및 lutamic Acid Bacteria" in : Biology of industrial Microorganisms, Demain and Solomon(Eds), Benjamin Chummings, London, UK, 1985, 115-142; Hiliger, BioTec 2, 40-44(1991); Eggeling, Amino Acids 6, 261-272(1994); Jetten and Sinskey, Critical Reviews in Biotechnology 15, 73-103 (1995); 및 Sahm et al, Annuals of the New York Academy of Science 782, 25-39 (1996)]. 최근에, 독일에 소재하는 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트는 코리네형 박테리아로부터 L-아미노산의 생산성을 증대시키기 위해 사용될 수 있는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 유전자를 소개하였다. 예를 들면, 데구사-휠스 악티엔게젤샤프트의 대한민국 특허공개 제2001-51915호 및 제2001-62279호에는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 sucC 및 sucD 유전자 및 zwa2 유전자를 감쇠발현(underexpression)시켜 코리네형 박테리아로부터 L-아미노산의 생산성을 증대시키는 방법이 기술되어 있다. 다른 예로는, 대한민국 특허공개 제 2001-62272호에는 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유래된 zwa1 유전자를 과발현(overexpression)시킴으로써 코리네형 박테리아로부터 L-아미노산의 생산성을 증대시키는 방법이 기술되어 있다. 그러나, 이들 유전자에 의해 코딩된 단백질의 기능, 특히 균주의 성장을 촉진하는 기능에 대해서는 어떠한 언급도 없다.

한편, 마이코박테리움 균주(Mycobacterium)는 적은 접종량으로는 액체배지에서 배양할 수 없다. 하지만, 세포를 배양한 배양액중 성장초기에 해당하는 배양액에서 분리한 단백질에 의해 성장을 촉진시킬 수 있다[Zhonghe Sun and Ying Zhang,Journal of Bacteriology 181, 7626-28(1999)]. 마이크로코코스 균주(Micrococcus)는 코리네박테리아 균주와 같이 성장말기에 탄소원 고갈 등에 의해 잠복기로 접어든다. 잠복기에서는 모든 활동들이 멈춘 상태이며 1년 이상 죽지않고 살 수 있다. 잠복기에 있는 세포들을 소생시키기 위해서는 특이 단백질이 필요하며 이 단백질은 성장초기에 발현된다. 또한 이 단백질은 성장을 촉진시키는 기능도 가지고 있다[Mukamolova, G.V., Kaprelyants, A.S., Young, D.I., Young, M. and Kell, D. B. (1998)Proc. Natul. Acad. Sci.USA95, 8916-8921]. 이 단백질을 코딩하는 유전자는 rpf(resuscitation promoting factor, 소생 촉진 인자) 유전자이다.

본 발명의 목적은 마이크로코코스 균주의 rpf와 같은 코리네박테리아 균주의 성장촉진 인자를 개발하고, 이를 이용하여 코리네박테리아 균주의 성장촉진 방법 및 이러한 효과에 의한 L-아미노산 생산성 증대 방법을 제공하는데 있다.

본 발명자들은 마이크로코코스 루테우스의 rpf 유전자와 상동성 대조실험(homology search)을 미국국립보건원 진뱅크(NIH GenBank)의 블라스트(BLAST)에서 수행하여 상당히 높은 유사성을 가진 유전자(등록번호 제AX133781호 및 제NC_003450호)를 얻고 이 유전자로부터 발현된 폴리펩티드의 일부 영역이 코리네박테리아의 성장촉진 및 잠복기 세포의 부활을 촉진시키는 기능을 나타낸다는 것을 발견하였다. 이에, 본 발명자들은 상기 기능을 갖는 폴리펩티드를 코리네박테리아 균주의 발효에 적용하여 그들 균주의 성장을 촉진하고 나아가 아미노산의 생산을 증대시킬 수 있었다.

도 1은 본 발명의 Gpf 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자를 포함한 재조합 발현 플라스미드 pQE30-gpf의 지도이다.

도 2는 본 발명의 재조합 Gpf 폴리펩티드를 대장균에서 발현하고 정제시킨 후 SDS/PAGE 겔을 건 결과이다. (SM: 크기 마커; NI: 유도 없음; I: IPTG 유도; CL: 세포 용해물; LO: 로딩 아웃; WO: 세척; E: 용출)

도 3은 본 발명의 재조합 Gpf 폴리펩티드가 코리네박테리아 야생주의 성장을 촉진시킴을 보여주는 성장 곡선이다.

도 4는 본 발명의 재조합 Gpf 폴리펩티드가 코리네박테리아 생산균주의 성장을 촉진시킴을 보여주는 성장 곡선이다.

도 5는 gpf 유전자와 다른 미생물들의 유사 유전자들과의 상동성 결과이다.

본 발명에 따른 코리네박테리아 균주의 성장을 촉진하는 기능을 갖는폴리펩티드의 아미노산 서열 및 이를 코딩하는 핵산 분자의 염기서열은 각각 서열번호 2 및 서열번호 1로 기술된다. 본 발명의 서열번호 2는 GenBank 데이터베이스에 제AX133781호로 등록된 폴리펩티드의 아미노산 서열 48번 내지 199번에 해당하고, GenBank 데이터베이스에 제NC_003450호로 등록된 폴리펩티드의 아미노산 서열 42번 내지 199번에 해당한다. 상기 GenBank AX133781호의 zwa1 유전자(서열번호 3)는 EP1111062 및 이의 상응하는 대한민국 특허공개 제 2001-62272호에 청구되어 있다. 그러나, 이들 특허공보에는 코리네박테리아 균주에서 zwa1 유전자를 과발현시켰을 때 아미노산의 생성이 증가함을 밝히고 있으나 본 발명에서 밝힌 바와 같이 zwa1 유전자로부터 코딩된 단백질에 의해 코리네박테리아 균주의 성장이 촉진된다는 것에 대하여는 어떠한 언급도 없다.

따라서, 한 가지 관점으로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 분리된 폴리펩티드를 제공한다.

다른 관점으로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 분자 또는 이의 유전자 코드의 축퇴성 영역내의 염기 서열 또는 이들과 하이브리드화하는 염기 서열 또는 중성 센스 돌연변이를 포함하는염기서열을 포함한 분리된 핵산 분자를 제공한다.

또 다른 관점으로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 분리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 유전자 코드의 축퇴성 영역내의 염기 서열 또는 이들과 하이브리드화하는 염기 서열 또는 중성 센스 돌연변이를 포함하는 염기서열을 포함한 핵산 분자를 포함한 재조합 발현 벡터를 제공한다.

또 다른 관점으로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 분리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 유전자 코드의 축퇴성 영역내의 염기 서열 또는 이들과 하이브리드화하는 염기 서열 또는 중성 센스 돌연변이를 포함하는 염기서열을 포함한 핵산 분자를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주를 제공한다.

또 다른 관점으로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 분리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 유전자 코드의 축퇴성 영역내의 염기 서열 또는 이들과 하이브리드화하는 염기 서열 또는 중성 센스 돌연변이를 포함하는 염기서열을 포함한 핵산 분자를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주를 상기 폴리펩티드를 생성하기에 적절한 조건하에서 배양하고 회수하여 상기 폴리펩티드를 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로, 본 발명은 코리네박테리아 균주의 배양시 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 분리된 폴리펩티드를 첨가하여 코리네박테리아 균주의 성장을 촉진하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로, 본 발명은 코리네박테리아 균주의 배양시 서열번호 2의아미노산 서열을 포함한 분리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 유전자 코드의 축퇴성 영역내의 염기 서열 또는 이들과 하이브리드화하는 염기 서열 또는 중성 센스 돌연변이를 포함하는 염기서열을 포함한 핵산 분자를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주를 동시 배양하여 코리네박테리아 균주의 성장을 촉진하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 분리된 폴리펩티드를 첨가하여 코리네박테리아 균주를 L-아미노산을 생성하기에 적절한 조건하에서 배양하고 L-아미노산을 회수하여 L-아미노산을 제조하는 방법을 제공한다.

또 다른 관점으로, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 분리된 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자 또는 이의 유전자 코드의 축퇴성 영역내의 염기 서열 또는 이들과 하이브리드화하는 염기 서열 또는 중성 센스 돌연변이를 포함하는 염기서열을 포함한 핵산 분자를 포함한 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주를 코리네박테리아 균주와 함께 코리네박테리아 균주가 L-아미노산을 생성하기에 적절한 조건하에서 동시 배양하고 L-아미노산을 회수하여 L-아미노산을 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한 분리된 폴리펩티드는 공지된 DNA 재조합 기술(Sambrook et al, Molecular Cloning, A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989))에 의해 용이하게 제조될 수있다. 본원에서 사용된 용어 "분리된"은 천연 환경으로부터 분리되어짐을 의미하며, 용어 "폴리펩티드"는 펩티드 결합을 통해 2개 이상의 아미노산을 포함한 펩티드 또는 단백질로 이해된다. 우선, 통상적인 방법에 따라, 상기 펩티드를 코딩하는 DNA 서열을 작제한다. DNA 서열은 적절한 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 작제한다. 다르게는 DNA 서열은 본 분야에 공지된 표준 방법에 의해, 예를 들면 자동 DNA 합성기(예, 바이오써치, 어플라이드 바이오시스템스 등으로부터 구입할 수 있는 것)를 사용하여 합성할 수 있다. 예로서, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드는 문헌[Stein et al., Nucl. Acids Res. 16:3209 (1988)]에 기술된 방법에 의해 합성할 수 있다. 메틸포스포네이트 올리고뉴클레오티드는 조절된 유공 유리 중합체 지지체를 사용하여 제조할 수 있다[Sarin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85:7448-7451 (1988)]. 작제된 DNA 서열은 이 DNA 서열에 작동가능하게 연결되어(operatively linked) 그 DNA 서열의 발현을 조절하는 하나 또는 그 이상의 발현 조절 서열(expression control sequence)을 포함하는 벡터에 삽입시키고, 이로부터 형성된 재조합 발현 벡터로 숙주를 형질전환 또는 형질감염시키며, 생성된 형질전환체 또는 형질감염체를 상기 DNA 서열이 발현되도록 하기에 적절한 배지 및 조건하에서 배양하고, 배양물로부터 상기 DNA 서열에 코딩된 실질적으로 순수한 펩티드를 회수한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염"은 임의의 코딩 서열이 실제로 발현되든 아니든 발현 벡터가 숙주 세포에 의해 수용되는 것을 의미한다. 본원 명세서에 사용된 용어 "형질감염된 숙주" 및 "형질전환된 숙주"는 DNA의 세포로의 도입을 의미한다. 그 세포는 '숙주 세포'로 불리우며 원핵 또는 진핵생물 세포일 수 있다. 전형적인 원핵 숙주 세포는 이. 콜라이의 각종 균주를 포함한다. 전형적인 진핵 숙주 세포는 포유동물, 예를 들면 세포이다. 용어 '벡터'는 적합한 숙주 내에서 DNA의 발현을 실시할 수 있는 적합한 조절 서열에 작동가능하게 연결된 DNA 서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미한다. 그러한 조절 서열은 전사를 실시하기 위한 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드가 현재 벡터의 가장 통상적으로 사용되는 형태이므로, 본 발명의 명세서에서 "플라스미드" 및 "벡터"는 때로 상호교환적으로 사용된다. 용어 "조절 서열"이라는 표현은 특정한 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열의 발현에 필수적인 DNA 서열을 의미한다. 예를 들면, 원핵생물에 적합한 조절 서열은 프로모터, 임의로 오퍼레이터 서열 및 리보좀 결합 부위를 포함한다. 진핵세포는 프로모터, 폴리아데닐화 시그날 및 인핸서를 이용하는 것으로 알려져 있다.

핵산은 다른 핵산 서열과 기능적 관계로 배치될 때 '작동가능하게 연결'된다. 이것은 적절한 분자(예를 들면, 전사 활성화 단백질)가 조절 서열(들)에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된 유전자 및 조절 서열(들)일 수 있다. 예를 들면, 전서열 또는 분비 리더 (leader)에 대한 DNA는 폴리펩티드의 분비에 참여하는 전단백질로서 발현되는 경우 폴리펩티드에 대한 DNA에 작동가능하게 연결되고; 프로모터 또는 인핸서는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 서열의 전사에 영향을 끼치는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결되거나; 또는 리보좀 결합 부위는 번역을 용이하게 하도록 배치되는 경우 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다. 일반적으로, "작동가능하게 연결된"은 연결된 DNA 서열이 접촉하고, 또한 분비 리더의 경우 접촉하고 리딩 상 내에 존재하는 것을 의미한다. 그러나, 인핸서는 접촉할 필요가 없다. 연결은 편리한 제한 효소 부위에서 라이게이션(연결)에 의해 수행된다. 그러한 부위가 존재하지 않는 경우, 통상의 방법에 따른 합성 올리고뉴클레오티드 어댑터 또는 링커를 사용한다.

본원 명세서에 사용된 용어 "발현 벡터"는 이종 DNA의 단편이 삽입된 재조합 캐리어로서 일반적으로 이중 가닥의 DNA 단편을 의미한다. 여기서, 이종 DNA는 숙주 세포에서 천연적으로 발견되지 않는 DNA인 이형 DNA로서 정의된다. 발현 벡터는 일단 숙주 세포내에 있으면 숙주 염색체 DNA와 무관하게 복제할 수 있으며 벡터의 수 개의 카피 및 그의 삽입된 (이종) DNA가 생성될 수 있다.

당업계에 주지된 바와 같이, 숙주세포에서 형질감염 유전자의 발현 수준을 높이기 위해서는, 해당 유전자가, 선택된 발현 숙주내에서 기능을 발휘하는 전사 및 해독 발현 조절 서열에 작동가능하도록 연결되어야만 한다. 바람직하게는 발현조절서열 및 해당 유전자는 세균 선택 마커 및 복제 오리진을 더 포함하는 하나의 발현 벡터내에 포함되게 된다. 발현 숙주가 진핵세포인 경우에는, 발현 벡터는 진핵 발현 숙주내에서 유용한 발현 마커를 더 포함하여야만 한다.

본 발명에 따른 펩티드의 DNA 서열을 발현시키기 위해 매우 다양한 발현 숙주/벡터 조합이 이용될 수 있다. 세균 숙주에 사용할 수 있는 발현 벡터에는 pQE30, pET, pRSET, pBluescript, pGEX2T, pUC벡터, col E1, pCR1, pBR322, pMB9 및 이들의 유도체와 같이 이. 콜라이에서 얻는 것을 예시할 수 있는 세균성 플라스미드, RP4와 같이 보다 넓은 숙주 범위를 갖는 플라스미드, λgt10과 λgt11, NM989와 같은 매우 다양한 파지 람다(phage lambda) 유도체로 예시될 수 있는 파지 DNA, 및 M13과 필라멘트성 단일가닥의 DNA 파지와 같은 기타 다른 DNA 파지가 포함된다. 진핵 숙주에 적합한 발현 벡터로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 SV40, 소 유두종바이러스, 아네노바이러스, 아데노-연관 바이러스(adeno-associated virus), 시토메갈로바이러스 및 레트로바이러스로부터 유래된 발현 조절 서열이 포함된다. 효모 세포에 유용한 발현 벡터는 2μ 플라스미드 및 그의 유도체이다. 곤충 세포에 유용한 벡터는 pVL 941이다.

또한, 본 발명의 DNA 서열을 발현시키기 위하여, 매우 다양한 발현 조절 서열중 어느 것이라도 이들 벡터에 사용될 수 있다. 유용한 발현 조절 서열에는 상술한 발현 벡터의 구조 유전자와 연관된 발현 조절 서열을 포함한다. 유용한 발현 조절서열의 예에는, 예를 들어, SV40 또는 아데노바이러스의 초기 및 후기 프로모터들, lac 시스템, trp 시스템, TAC 또는TRC 시스템, T3 및 T7 프로모터들, 파지 람다의 주요 오퍼레이터 및 프로모터 영역, fd 코드 단백질의 조절 영역, 3-포스포글리세레이트 키나제 또는 다른 글리콜분해 효소에 대한 프로모터, 상기 포스파타제의 프로모터들, 예를 들어 Pho5, 효모 알파-교배 시스템의 프로모터 및 원핵세포 또는 진핵 세포 또는 이들의 바이러스의 유전자의 발현을 조절하는 것으로 알려진 구성과 유도의 기타 다른 서열, 및 이들의 여러 조합이 포함된다. T7 RNA 폴리메라아제 프로모터 Φ10은 이. 콜라이에서 펩티드를 발현시키는데 특히 유용하다.

상술한 발현 벡터에 의해 형질전환 또는 형질감염된 숙주 세포는 본 발명의 또 다른 측면을 구성한다. 본 발명의 DNA 서열을 발현시키는 데에는 매우 다양한 단핵세포성 숙주 세포가 이용될 수 있다. 이들 숙주에는 이. 콜라이, 슈도모나스, 바실러스, 스트렙토마이세스, 진균, 효모와 같은 주지의 진핵 및 원핵 숙주들, 스포도프테라 프루기페르다(SF9)와 같은 곤충 세포, CHO 및 마우스 세포와 같은 동물 세포, COS 1, COS 7, BSC 1, BSC 40 및 BMT 10과 같은 아프리카 그린 원숭이 세포, 및 조직배양된 인간 세포 및 식물 세포들이 포함된다. 바람직한 숙주 생명체에는 이. 콜라이 및 바실러스 서브틸리스와 같은 세균, 그리고 조직배양된 포유동물 세포가 포함된다.

물론 모든 벡터와 발현 조절 서열이 본 발명의 DNA 서열을 발현하는데 모두 동등하게 기능을 발휘하지는 않는다는 것을 이해하여야만 한다. 마찬가지로 모든 숙주가 동일한 발현 시스템에 대해 동일하게 기능을 발휘하지는 않는다. 그러나 당업자라면 과도한 실험적 부담 없이 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 채로 여러 벡터, 발현 조절 서열 및 숙주 중에서 적절한 선택을 할 수 있다. 예를 들어, 벡터를선택함에 있어서는 숙주를 고려하여야 하는데, 이는 벡터가 그 안에서 복제되어야만 하기 때문이다. 벡터의 복제 수, 복제 수를 조절할 수 있는 능력, 및 당해 벡터에 의해 코딩되는 다른 단백질, 예를 들어 항생제 마커의 발현도 또한 고려되어야만 한다. 발현 조절 서열을 선정함에 있어서도, 여러 가지 인자들을 고려하여야만 한다. 예를 들어, 서열의 상대적 강도, 조절가능성 및 본 발명의 DNA 서열과의 상용성 등, 특히 가능성 있는 이차 구조와 관련하여 고려하여야 한다. 단세포 숙주는 선정된 벡터, 본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물의 독성, 분비 특성, 단백질을 정확하게 폴딩시킬 수 있는 능력, 배양 및 발효 요건들, 본 발명 DNA 서열에 의해 코딩되는 산물을 숙주로부터 정제하는 것의 용이성 등의 인자를 고려하여 선정되어야만 한다. 이들 변수의 범위 내에서, 당업자는 본 발명의 DNA 서열을 대규모 배양으로 발현시킬 수 있는 각종 벡터/발현 조절 서열/숙주 조합을 선정할 수 있다.

본 발명의 DNA 서열에 의해 코딩되는 펩티드는 다양한 통상의 방법: HPLC, FPLC 등을 사용하는 정상 또는 역파지의 액체 크로마토그래피; 친화성 크로마토그래피(무기 리간드 또는 모노클로날 항체 등); 크기별 배제(size exclusion) 크로마토그래피; 고정된 금속 킬레이트(immobilized metal chelate) 크로마토그래피; 겔 전기영동 등을 이용하여 발효 또는 세포 배양액으로부터 분리 및 정제하여 실질적으로 순수한 펩티드를 수득함으로써 얻을 수 있다. 당업자는 본 발명의 범위를 벗어나지 않는 범위 내에서, 가장 적합한 분리 및 정제 기술을 용이하게 선정할 수 있을 것이다. 본원에서 사용된 용어 "실질적으로 순수한 펩티드"는 본 발명에 따른펩티드가 세균으로부터 유래된 어떠한 다른 단백질도 실질적으로 포함하지 않는 것을 의미한다.

다른 방도로서, 본 발명의 폴리펩티드는 생화학 분야의 숙련가에게 일반적으로 널리 알려져 있는 화학적 합성에 의해 쉽게 제조될 수 있다(Creighton, Proteins: Structures and Molecular Principles, W.H. Freeman and Co., NY (1983)). 대표적인 방법으로서 이들로 한정되는 것은 아니지만 액체 또는 고체상 합성, 단편 응축, F-MOC 또는 T-BOC 화학법이 포함된다(Chemical Approaches to the Synthesis of Peptides and Proteins, Williams et al., Eds., CRC Press, Boca Raton Florida, (1997); A Practical Approach, Atherton ＆ Sheppard, Eds., IRL Press, Oxford, England, (1989)). 본 발명에 따른 펩티드는 보호된 아미노산간의 응축반응(condensation reaction)에 의하여 통상의 고체상 방법으로 C-말단으로부터 시작하여 제1의 아미노산, 제2의 아미노산, 제3의 아미노산과 같이 서열에 따라 순차적으로 진행하면서 합성할 수 있다. 응축 반응 후 보호기 및 C-말단 아미노산이 연결된 담체를 산분해(acid decomposition) 또는 아미놀리시스(aminolysis)와 같은 공지의 방법에 의해 제거할 수 있다. 상기 언급된 펩티드 합성법은 문헌에 상세히 기술되어 있다(Gross and Meienhofer's, The Peptides, vol 2., Academic Press (1980)). 본 발명에 따른 폴리펩티드의 합성을 위해 사용할 수 있는 고체상의 담체는 생화학 분야에서 통상 사용되는 담체로서 대표적으로는 이들로 한정되는 것은 아니지만 치환된 벤질 형태의 폴리스티렌 수지(polystyrene resinsof substituted benzyl type), 히드록시메틸페닐아세틱 아미드 형태의 폴리스티렌 수지, 치환된 벤즈히드릴폴리스티렌 수지, 펩티드에 결합할 수 있는 기능기를 가진 폴리아크릴아미드 수지 등이 포함된다. 최초 보호 아미노산의 보호기들은 통상의 펩티드 합성에 사용되는 보호기들로서 산 분해, 환원 또는 아미놀리시스와 같은 통상의 방법에 의해 쉽게 제거되는 것들이다. 아미노 보호기들의 구체 예로는 포르밀; 트리플루오로아세틸; 벤질옥시카보닐; (오르쏘- 또는 파라-)클로로벤질옥시카르보닐 및 (오르쏘- 또는 파라-)브로모벤질옥시카르보닐과 같은 치환된 벤질옥시카르보닐; t-부톡시카보닐 및 t-아밀록시카보닐과 같은 지방족 옥시카보닐 등이 있다. 아미노산의 카복실기들은 에스테르기로 전환시킴으로써 보호할 수 있다. 에스테르기로는 벤질 에스테르, 메톡시벤질 에스테르와 같은 치환된 벤질 에스테르; 시클로헥실 에스테르, 시클로헵틸 에스테르 또는 t-부틸 에스테르와 같은 알킬 에스테르 등이 있다. 구아니디노기는 보호기가 필요하지 않지만 니트로; 또는 토실, 메톡시벤젠슬포닐 또는 메시틸렌술포닐과 같은 아릴술포닐에의해 보호될 수 있다. 이미다졸의 보호기로는 토실, 벤질 및 디니트로페릴 등이 있다. 트립토판의 인돌기는 보호기가 없어도 되며 포밀 등으로 보호기를 붙일 수도 있다. 보호기 및 담체로부터 펩티드를 분리하는 것은 여러 스캐빈저 (scavenger)하에 무수 하이드로플루오라이드에 의해 수행될 수 있다. 스캐빈저의 예로는 아니솔, (오르쏘-, 메타-, 파라-)크레솔, 디메틸술파이드, 씨오크레솔, 에탄엔디올 및 머캅토피리딘 등을 들 수 있는데 이들은 펩티드 합성에서 통상 사용되는 것들이다.

본 발명의 한 양태로서, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 게노믹 유전자로부터 연쇄중합반응(PCR)법을 이용하여 gpf 핵산 분자를 분리하였다. 분리된 gpf 핵산 분자는 대장균 플라스미드 pCR2.1(INVITORGEN)에 클로닝하였으며 발현벡터 pQE-30(QIAGEN)에 삽입하여 대장균에서 발현시킨 후 친화성 컬럼(affinity column)을 이용하여 재조합 Gpf 폴리펩티드를 분리 정제하였다. 정제된 재조합 gpf 폴리펩티드는 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032의 성장을 촉진시킴을 확인하였다. 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032외에 다른 코리네박테리움속, 특히 코리네박테리움 글루타미쿰 종의 적당한 균주로는 공지된 야생형균주, 코리네박테리움 써모아미노게네스(C.thermoaminogenes) FERM BP-1539, 브레비박테리움 플라붐(Brevibacterium flavum) ATCC 14067, 브레비박테리움 락토페르멘툼(Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869, 및 이들로부터 제조된 L-아미노산 생산 돌연변이체 또는 균주, 예를 들면, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881, 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC11001이 있다.

본 발명은 또 다른 관점으로서 재조합 Gpf 폴리펩티드를 이용하여 L-아미노산 생산 균주의 성장을 촉진시키는 방법으로서, 코리네박테리아 균주의 발효에 의한, L-아미노산, 특히 L-아스파르트산, L-아스파라긴산, L-호모세린, L-트레오닌, L-이소루이신 및 L-메티오닌, 특히 L-라이신의 생산성을 향상시키는데 사용된다.

본 발명에 따라 재조합 Gpf 폴리펩티드를 첨가하는 것에 추가하여 여러 공지 기술을 사용하여 L-아미노산의 생성을 유리하게 할 수 있다. 예를 들면 원하지 않는 부반응(side-reaction)이 일어나지 않도록 하는 것이며 이러한 기술은문헌[Nakayama: "Breeding of Amino Acid Producing Micro-organisms" in: Overproduction of Microbial Products, Krumphanzl, Sikyta, Vanek (eds.), Academic Press, London, UK, 1982]에 기술되어 있다.

본 발명에 따라 사용되는 코리네박테리아 균주는 배치 공정(batch process) 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정(fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식 또는 회분식으로 배양할 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel, (Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991); 및 Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig/Wiesbaden, 1994)]에 기술되어 있다.

사용되는 배양 배지는 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 코리네박테리아 균주에 대한 배양 배지는 문헌["Manual of Methods for General Bacteriology" by the American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)]에서 찾아 볼 수 있다. 사용될 수 있는 당원으로는 글루코즈, 사카로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 펩톤, 효모 추출물, 육즙, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 대두밀 및 요소 또는 무기 화합물, 예를 들면 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄이 포함된다. 질소원 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용할 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 배양 배지는 성장에 필요한 황산마그네슘 또는 황산철과 같은 금속염을 함유해야 한다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다. 또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식으로 또는 연속식으로 첨가될 수 있다.

수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다. 또한, 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 소포제를 사용하여 기포 생성을 억제할 수 있다. 호기 상태를 유지하기 위해 배양물내로 산소 또는 산소-함유 기체 (예, 공기)를 주입한다. 배양물의 온도는 보통 20℃ 내지 45℃, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃이다. 배양은 원하는 L-아미노산의 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속한다. 이러한 목적으로 보통 10 내지 160 시간에서 달성된다.

L-아미노산은 음이온 교환 크로마토그래피 및 후속으로 닌히드린 유도체화에 의해 분석할 수 있다(Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190).

본 발명은 하기 실시예를 통해 더욱 구체적으로 설명된다. 그러나, 이들 실시예에 의해 본 발명이 한정되어서는 안된다.

실시예 1

gpf 유전자 검색, 염기서열 분석 및 클로닝

마이크로코코스 균주의 rpf 유전자의 염기서열을 미국 NCBI GenBank의 데이터베이스에서 BLAST 방법을 통해 상동성있는 염기서열을 검색한 결과 서열번호 3의 염기 서열을 갖는 유전자를 얻었다. 이 유전자는 코리네박테리움 글루타미쿰 게노믹 DNA 데이터베이스로부터 발견된 것으로 GenBank 입수번호(Accession Number)는 NC-003450이다. 582 염기쌍의 개방형 판독프레임을 가지고 있으며 gpf 유전자로 명명하였다. gpf 유전자는 199개의 아미노산으로 구성된 폴리펩티드(서열번호 3의 아미노산 잔기 7번 내지 199번)를 암호화한다.

gpf 유전자와 마이크로코코스 균주의 rpf 유전자, 마이코박테리움 튜버쿨로시스(Mycobacterium tuberculosis)와 마이코박테리움 레프래(M. leprae) 균주의 rpf 유전자사이의 상동성 결과는 인터넷상에서 제공되는 클러스털 W (ClustalW, ver. 1.82 ,http://clustalw.genome.ad.jp/)로 수행하여 얻었다. 이 결과는 도 5에 나타나 있다.

gpf 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 신호펩티드(signal petides) 검색 프로그램 (SignalP ,V2.0 ,http://www.cbs.dtu.dk/services/

SignalP-2.0/)으로 검색한 결과 그를 구성하는 199개의 아미노산중에서 N 말단으로부터 41개의 아미노산이 신호펩티드인 것으로 밝혀졌다. 이 사실은 gpf 유전자에 의해 코딩되는 폴리펩티드가 세포밖으로 배출되는 것임을 알려준다(M.L. vanRoosmalen et al, Journal of Bacteriology 182, 5765-70, 2000).

아래 표 1에 기술된 한 쌍의 프라이머로 연쇄중합반응(PCR)(Sambrook et al, Molecular Cloning, a Laboratory Manual (1989), Cold Spring Harbor Laboratories)을 변성(denaturing)은 94℃에서 20초 동안, 어닐링(annealing)은 52℃에서 20초 동안, 중합(polymerization)은 72℃에서 1분 동안의 조건하에 30회 실시하여 코리네박테리움으로부터 1240 염기쌍의 zwa1 유전자를 증폭한 뒤 TOPO Cloning Kit(Invitrogen)을 이용하여 대장균 플라스미드 pCR2.1에 클로닝하여 pCR-gpf 플라스미드를 얻었다.

Gpf_F(서열번호 4)	5-CCG AAA TAT TCC AAA TAT GTA ACA TAA ATC-3
Gpf_R(서열번호 5)	5-GCT AAG AAA CTT AAA AAA GAG GCA ACC CGT-3

실시예 2

대장균에서의 본 발명의 재조합 Gpf 폴리펩티드 발현 및 정제

대장균에서 재조합 Gpf 폴리펩티드를 생성하기 위해서 41개의 신호펩티드를 제외한 아미노산을 암호화하는 유전자 단편을 하기 표 2에 기술된 한 쌍의 프라이머를 사용하여 상기와 동일한 방법으로 PCR을 변성은 94℃에서 20초 동안, 어닐링은 52℃에서 20초 동안, 중합은 72℃에서 1분 동안의 조건하에 30회 실시하여 증폭하였다.

Recombi_gpf_F(서열번호 6)	5-TCT GCA GGA TCC GCA CCT GAT TCC GAC TGG-3
Recombi_gpf_R(서열번호 7)	5-GCT AAG AAG CTT AAA AAA GAG GCA ACC CGT-3

증폭된 718 염기쌍의 DNA 단편을 제한 효소 BamH I과 Hind III으로 절단한 뒤 같은 제한효소로 절단한 pQE30(QIAGEN) 발현벡터에 클로닝하여 pQE-gpf(도 1)라는 발현벡터를 얻었다. pQE-gpf를 대장균 M15[pREP4](QIAGEN)에 도입하여 재조합 Gpf 폴리펩티드 발현 균주를 개발하였다. 이 형질전환 균주 M15[pREp4](pQE-gpf)는 Korean Culture Center of Microorganism에 2003년 1월 29일자로 국제기탁되었고 기탁번호는 KCCM 10459이다.

발현균주를 루리아 버타니(LB) 배지("Manual of Methods for General Biotechnology", the American Society for Bacteriology (Washington DC, USA, 1981))에 배양하며 IPTG(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside)에 의해 발현이 유도되어 과량의 재조합 Gpf 폴리펩티드를 생산시켰다. 배양시킨 발현균주를 초음파분쇄기로 세포를 파괴한 뒤 고속원심분리하여 상등액을 얻는다. 상등액을 Ni-NTA 컬럼을 이용한 친화성 크로마토그래피 방법으로 정제하였다. 정제방법 및 재조합 단백질 발현은 공지 방법(Wahle,S et al,QIAGEN News 1999, 4, 3; Schmitt J et al, Molecular Biology Reports 18, 223-30)에 따라 Ni2+-킬레이트화 크로마토그래피 후 분획을 4-20% SDS-PAGE (변성 조건은 8M 우레아)하여 수행했다. 정제된 재조합 단백질은 도 2에서 보는 바와 같이 하나의 밴드로 정제되었다.

실시예 3

성장촉진 평가시험

실시예 2에서 발현 정제된 재조합단백질이 성장을 촉진시키는지를 확인하기 위해 다음과 성장촉진평가 실험을 수행하였다. 먼저, 코리네박테리움 글루타미쿰 ATCC13032 야생균주와 라이신 생산균주 코리네박테리움 글루타미쿰 KFCC10881 균주를 루리아 버타니 배지에서 24시간 동안 30℃에서 배양한 후 세포를 원심분리하여 얻었다. 얻어진 세포를 같은 양의 최소배지(포도당 10g, (NH4)2SO4 2g, 요소 2g, KH2PO4 1g, K2HPO4 3g, MgSO4·7H2O 0.5g, FeSO4·7H2O 10mg, MnSO4·7H20 10mg, 바이오틴 100 g, 티아민HCl 100g, CaCl2·2H2O 100 g, Na2B4O7·10H2O 80g, (NH4)MoO27·4H2O 40g, ZnSO4·7H2O 10g, CUSO4·7H2O 300g, MnCl2·4H2O 10g, FeCl3·6H2O 1mg, 한천 20g, 증류수 1리터당(pH7.0))로 현탁시킨 후 다시 원심분리하여 세포만 얻었다. 이 과정을 5번 반복한 뒤 최종적으로 최소배지에 처음 양의 10분의 1로 현탁시켰다. 세척한 균주를 바이오스크린 C(Labsystems)를 이용하여 성장촉진 실험을 하였다. 세척한 균주를 최종 흡광도(600nm) 값이 0.1이 되도록 세포를 희석하였다. 재조합 Gpf 폴리펩티드는 야생균주인 경우는 최종농도 3 마이크로몰/리터로 사용하였고 생산균주는 30 마이크로몰/리터와 30000 마이크로몰/리터로사용하였다. 실험결과 재조합 Gpf 폴리펩티드가 야생균주 코리네박테리움 글루타미쿰의 성장을 촉진시킴을 발견했다(도 3). 생산균주인 경우는 Gpf 폴리펩티드를 넣어주지 않을 때는 성장이 되지않지만 넣어준 경우에 성장이 됨을 알 수 있으며 Gpf 폴리펩티드의 양에 비례하여 성장이 더 빨리 촉진됨을 알 수 있다(도 4).

본 발명의 신규한 Gpf 폴리펩티드는 코리네박테리아 균주의 성장속도를 촉진시킴으로써 L-라이신 등의 아미노산 생산성을 향상시킬 수 있다.

<110> CJ Corporation <120> Polypeptide of growth stimulating factor isolated from Corynebacterium, nucleic acid molecule coding for it and its use <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 456 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <400> 1 gatcgcctcg cacagtgcga gtccggtggt aactgggcaa tcaacaccgg taacggctac 60 cacggtggtc tgcagttctc cgctagcacc tgggctgctt acggcggcca ggagttcgct 120 acctacgcat accaggcaac ccgtgagcag cagatcgctg ttgcagagcg caccttggct 180 ggtcagggct ggggcgcatg gcctgcttgc tccgcttccc ttggactgaa ctccgctcca 240 acccagcgtg acctctccgc taccacctcc accccagagc cagctgcagc tgcaccagct 300 gttgctgagt acaacgctcc tgcagccaac atcgcagttg gctccaccga cttgaacacc 360 atcaagtcca cctacggcgc tgtcaccggc accctcgctc agtacggcat caccgttcca 420 gctgaggttg agtcttacta caacgctttc gtcggc 456 <210> 2 <211> 152 <212> PRT <213> Corynebacterium glutamicum <400> 2 Asp Arg Leu Ala Gln Cys Glu Ser Gly Gly Asn Trp Ala Ile Asn Thr 1 5 10 15 Gly Asn Gly Tyr His Gly Gly Leu Gln Phe Ser Ala Ser Thr Trp Ala 20 25 30 Ala Tyr Gly Gly Gln Glu Phe Ala Thr Tyr Ala Tyr Gln Ala Thr Arg 35 40 45 Glu Gln Gln Ile Ala Val Ala Glu Arg Thr Leu Ala Gly Gln Gly Trp 50 55 60 Gly Ala Trp Pro Ala Cys Ser Ala Ser Leu Gly Leu Asn Ser Ala Pro 65 70 75 80 Thr Gln Arg Asp Leu Ser Ala Thr Thr Ser Thr Pro Glu Pro Ala Ala 85 90 95 Ala Ala Pro Ala Val Ala Glu Tyr Asn Ala Pro Ala Ala Asn Ile Ala 100 105 110 Val Gly Ser Thr Asp Leu Asn Thr Ile Lys Ser Thr Tyr Gly Ala Val 115 120 125 Thr Gly Thr Leu Ala Gln Tyr Gly Ile Thr Val Pro Ala Glu Val Glu 130 135 140 Ser Tyr Tyr Asn Ala Phe Val Gly 145 150 <210> 3 <211> 1260 <212> DNA <213> Corynebacterium glutamicum <220> <221> -10_signal <222> (383)..(388) <220> <221> -35_signal <222> (360)..(365) <220> <221> CDS <222> (413)..(1009) <400> 3 ccgaaatatt ccaaatatgt aacataaatc acacccgatg attcaggcgg gatgacctgc 60 gacttcaagg tcgcaccaaa gtcagattga tatagatttc gtaaataacg tgacacaatc 120 gtgaccttcg ggttaccgtg tatcccaggc accgcaacag ttcatctgca agtccggctc 180 atcgccaaac cctgtctggg gtcggaagtt 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acc cgt gag 700 Tyr Gly Gly Gln Glu Phe Ala Thr Tyr Ala Tyr Gln Ala Thr Arg Glu 85 90 95 cag cag atc gct gtt gca gag cgc acc ttg gct ggt cag ggc tgg ggc 748 Gln Gln Ile Ala Val Ala Glu Arg Thr Leu Ala Gly Gln Gly Trp Gly 100 105 110 gca tgg cct gct tgc tcc gct tcc ctt gga ctg aac tcc gct cca acc 796 Ala Trp Pro Ala Cys Ser Ala Ser Leu Gly Leu Asn Ser Ala Pro Thr 115 120 125 cag cgt gac ctc tcc gct acc acc tcc acc cca gag cca gct gca gct 844 Gln Arg Asp Leu Ser Ala Thr Thr Ser Thr Pro Glu Pro Ala Ala Ala 130 135 140 gca cca gct gtt gct gag tac aac gct cct gca gcc aac atc gca gtt 892 Ala Pro Ala Val Ala Glu Tyr Asn Ala Pro Ala Ala Asn Ile Ala Val 145 150 155 160 ggc tcc acc gac ttg aac acc atc aag tcc acc tac ggc gct gtc acc 940 Gly Ser Thr Asp Leu Asn Thr Ile Lys Ser Thr Tyr Gly Ala Val Thr 165 170 175 ggc acc ctc gct cag tac ggc atc acc gtt cca gct gag gtt gag tct 988 Gly Thr Leu Ala Gln Tyr Gly Ile Thr Val Pro Ala Glu Val Glu Ser 180 185 190 tac tac aac gct ttc gtc ggc t aaatctagct 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Ser Ala Thr Thr Ser Thr Pro Glu Pro Ala Ala Ala 130 135 140 Ala Pro Ala Val Ala Glu Tyr Asn Ala Pro Ala Ala Asn Ile Ala Val 145 150 155 160 Gly Ser Thr Asp Leu Asn Thr Ile Lys Ser Thr Tyr Gly Ala Val Thr 165 170 175 Gly Thr Leu Ala Gln Tyr Gly Ile Thr Val Pro Ala Glu Val Glu Ser 180 185 190 Tyr Tyr Asn Ala Phe Val Gly 195

Claims (6)

1. 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함하여 코리네박테리아 균주의 성장을 촉진한는 분리된 폴리펩티드.
2. 제1항의 폴리펩티드를 코딩하는 분리된 핵산 분자.
3. 제2항에 있어서, 핵산 분자가 (i) 유전자 코드의 축퇴성 영역내에서 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열에 상응하는 하나 이상의 염기서열, (ii) 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 또는 상기 (i)의 염기 서열과 하이브리드화하는 하나 이상의 상보적인 염기서열 및 (iii) 상기 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 염기서열 내에 중성센스 돌연변이를 포함하는 염기서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 염기서열을 포함한 분리된 핵산 분자.
4. 제2항의 핵산 분자를 포함한 재조합 발현 벡터.
5. 제4항의 재조합 발현 벡터로 형질전환 또는 형질감염된 숙주.
6. 제5항에 있어서, 숙주가 코리네박테리움균, 대장균 또는 바실러스균인 숙주.