KR20040073431A - 고정화된 혈소판 결합제를 갖는 혈관 폐색 고형상 제제 - Google Patents

고정화된 혈소판 결합제를 갖는 혈관 폐색 고형상 제제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 일반적으로, 고형상 혈소판 의존성 혈관 폐색 제제를 표적화하고 전달하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다. 특히, 혈소판 결합제로 코팅된 입자 또는 코일 또는 스텐트는 고형 종양 매쓰 또는 AV-기형 또는 동맥류 또는 내피 누출의 혈관계와 같은 혈관계를 표적하도록 지시되고 이어서 고형상 제제는 혈소판과 결합하고 이를 활성화시키고 이어서 혈소판은 또 다른 혈소판과 결합하고 이를 활성화시킨다. 이러한 과정은 고형상 제제에 대해 혈소판 매개 혈전을 신속하게 형성시켜 혈관 폐색을 일으킨다.

Description

고정화된 혈소판 결합제를 갖는 혈관 폐색 고형상 제제{VASCULAR OCCLUSION SOLID-PHASE AGENT WITH IMMOBILIZED PLATELET BINDING AGENT}
혈소판은 체내에서 혈관 손상의 경우에 혈액 손실을 제한하는 작용을 한다. 정상적으로, 혈소판은 응고 과정에 중요한 역할을 하는 다양한 혈장 단백질의 혼합물중에 침지된 혈액의 기타 세포 성분과 함께 전신을 순환한다. 혈관 내피하층에 노출되는 즉시, 복잡한 일련의 반응이 일어나 손상된 혈관으로부터의 혈액의 손실을 제한한다. 노출된 내피하층의 성분과 접촉하는 순환 혈소판은 노출된 표면상에 1) 결합하고 부착하여 2) 이의 표면에 널리 분포하게 되고 3) 과립 내용물의 방출에 의해 입증되는 바와 같이 활성화되고 4) 혈류로부터 기타 순환 혈소판을 모으고 보충하여 5) 효율적인 충전물(plug), 응괴 및/또는 혈전을 형성하여 혈관으로부터출혈을 막는다.
부분적으로 피브리노겐이 피브린으로 전환됨에 의해 정의되는 과정인 응고 캐스케이드(cascade)와는 반대로, 혈소판은 손상된 영역 주변에 유착하여 혈소판 표면상의 특이적 수용체에 결합하는 분자들을 연결시킴으로써 함께 고정되어 있다. 혈소판과 내피하층 사이에 초기 연결과정은 혈소판 표면상의 당단백질 Ib(GPIb) 수용체와 내피하층내에 폰 빌레브란트 인자(VWF)(즉, 고정화된 VWF)간의 상호작용에 의존한다. 혈액을 순환하는 정상적인 혈소판은 흔히 가용성 VWF와 접촉하지만 활성화되지 않거나 가용성 VWF에 결합하지 않기 때문에 이러한 상호작용은 그 자체로서 특이적이다. 시험관내 실험은 가용성 VWF의 표면으로의 고정화가 혈소판의 결합 및 활성화를 촉진시킴을 확인시켜 주었다. 혈소판이 활성화된 경우, 추가의 수용체, 당단백질 IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)은 변화되어 여러 혈장 단백질의 결합을 가능하게 함으로써 혈소판/혈소판 결합을 촉진시킨다. 피브리노겐 이외에, 가용성 VWF는 활성화된 GPIIb/IIIa 수용체에 결합하여 고정화되고 GPIb 및 GPIIb/IIIa를 통해 그 밖의 혈소판에 결합할 수 있다.
과활성 혈소판은 부적당한 시기에 혈전 형성을 유도하여 다양한 기관 및 조직으로의 혈액 공급을 감소시킨다. 주요 예는 심장 공급을 위해 협착(좁은) 혈관을 통과하는 혈액에 의해 유도되는 혈전 형성이다. 심근으로의 혈류 감소는 경색증을 유발하여 결국 심장 발작을 일으킨다(심장 세포 사멸). 뇌허혈(일시적 허혈 발작(TIA); 발작(stroke))은 색전 또는 혈전이 뇌에 공급되는 혈관을 폐색시키는 경우 발생한다.
부적절한 항체 매개 과정의 결과로서 혈소판 활성화에 의해 유발되는 기타 병리학적 상태가 존재한다. 헤파린 유도 혈소판감소(HIT)은 혈소판 수의 급격한 감소 및 기존의 병리학적 부위에 혈전 형성을 특징으로 한다. 혈액 순환을 촉진하기 위해 항응고제로서 분별되지 않은 헤파린을 투여받은 환자는 혈소판 과립 단백질과 복합체화된 헤파린에 결합하는 항체를 생산한다. 항체가, 혈소판의 표면상의 헤파린/단백질 복합체에 결합하여 신속한 혈소판 활성화를 유도하여 국소적인 혈전을 형성시킨다. 이어서, 이것은 환부에 경색증을 유도한다.
혈전증은 널리 공지된 암의 결과이다.
과응고성 상태의 존재가 암을 암시하는 것인지는 아직 논쟁의 여지가 있다. 대부분의 신생물의 혈전형성 경향을 입증하기 위해 많은 연구가 수행되었다. 혈전증은 명백한 악성종양 질환을 갖는 환자에게서 가장 빈번한 합병증임이 제안되었다.
성공적인 항종양제를 개발하기 위한 열쇠는, 정상적인 조직에 대한 부적당한 효과를 비교적 적게 발휘하면서 선택적으로 종양 세포를 사멸시키는 제제를 고안할 수 있는 능력이다. 당해 목표는, 신생물과 정상 조직간에 질적인 차이가 거의 없다는 점에서 어려웠다. 이때문에, 수년간에 걸친 많은 연구는 화학치료법 및 진단 모두를 위한 면역학적 표적으로서 작용할 수 있는 종양 특이적 "마커 항원"을 동정하는데 집중되었다. 많은 종양 특이적 또는 준종양 특이적(종양 관련) 마커가 특이적 항체에 의해 인지될 수 있는 종양 세포 항원으로서 동정되었다.
불행하게도, 일반적인 경우, 종양 특이적 항체는 그 자체로서 충분한 항종양효과를 발휘하지 못하여 암치료에서 유용하지 못하다. 임파종에서의 이들의 효능과는 반대로, 면역독소는 암과 같은 고형 종양의 치료시 비교적 효과적이지 못한 것으로 입증되었다. 이에 대한 근본 이유는 고형종양이 일반적으로 항체 크기의 분자에 불투과성이고 종양 g당 주사 투여량의 0.001% 미만의 비(specific) 흡수값이 사람 연구에서 일반적이다. 추가로, 종양 매쓰(mass)에 진입하는 항체는 여러가지 이유때문에 고루 분포하지 못한다. 첫번째로, 종양 세포 및 섬유 종양 기질의 밀집 팩킹이 거대 분자 수송에 대해 상당한 물리적 차단벽을 제공하고 림프관 배출 부재와 관련하여 종양 코어내에 상승된 간질성 압력이 조성되어 유출 및 유체 전도를 감소시킨다. 두번째로, 대부분 종양에서 혈관의 분포가 붕괴되어 있고 불균일하다. 결과로서, 몇몇 종양 세포는 모세관으로부터 멀리 분리되어 있어 항체가 원거리의 종양 세포에 도달하여 이에 결합하기 위해서는 대용량으로 확산되어야만 한다. 세번째로, 종양에 진입하는 항체 모두는 접하게된 처음 종양 세포에 의해 혈관주변 영역에 흡수될 수 있어 보다 먼 부위의 종양세포에는 항체가 전혀 도달하지 못한다.
항체를 사용한 종양 표적화의 결점을 극복하기 위한 한가지 방법은 종양 보다는 차라리 종양의 혈관계로 혈전 유도제를 표적화하는 것이다.
본 발명자는 이러한 방법이 종양 세포를 직접 표적화하는 것 보다 많은 이점을 제공할 것임을 제안한다. 첫번째로, 표적 세포는 직접 혈관에 투여된 치료제에 근접될 수 있어 주사된 용량의 상당 %가 신속하게 국소화될 수 있다. 두번째로, 각각의 모세관은 종양의 주변 코드내에 수천개의 세포에 산소 및 영양물을 제공하기 때문에, 종양 혈관계의 제한된 손상이 연쇄적인 종양 세포의 사멸을 유도할 수 있다.
본 발명은 또한 비정상적인 조직 손상, 비정상적인 출혈(수술동안에 또는 수술후, 분만후), 자궁외 임신, 전치 태반, 유착 태반 및 자궁 섬유종을 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다.
특정 임상적 상황하에서, 조직과 관련된 혈관계의 폐색을 통한 조직으로의 혈액 공급을 억제하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 예는 유행성 출혈 발작, 두렁 통과 이식 수술에서 두렁 정맥 측면 가지의 존재, 흉외 대동맥류의 치료, 혈관 기형의 보정 및 고형 종양의 치료를 포함한다.
혈관 폐색은 색전(embolo)치료법을 포함하는 다양한 기술 및 재료를 사용하여 수행된다. 색전치료법의 예는 폴리비닐 알코올(문헌참조: Boschetti, PCT WO0023054), 아크릴아미드(문헌참조: Boschetti et al, 미국 특허 제5,635,215호; Boschetti et al, 미국 특허 제5,648,100호), 폴리메틸 메타크릴레이트(문헌참조: Lemperle, 미국 특허 제5,456,693호), 콜라겐(문헌참조: Conston et al, 미국 특허 제5,456,693호) 및 코일(문헌참조: Mariant, 미국 특허 제5,639,277호)로 이루어진 물리적 충전물을 포함하는 다양한 재료로 이루어진 입자의 용도를 포함한다. 색전치료법은 이들 물질을 카테터에 의해 표적 혈관계로 전달하는 것을 포함한다. 소정의 영역에서 혈관계는 대동맥으로부터, 점진적으로 보다 소형의 직경을 갖는 세동맥, 후소동맥으로 및 모세관으로 진행하기 때문에, 전달된 물질(색전)은 소형 혈관에 머무르게 되어 의존성 조직으로의 혈액 공급을 차단시킬때까지 계속 혈류에서순환한다.
본 발명은 신규하고, 포유동물 기원의 폰 빌레브란트 인자(VWF)로 코팅된 마이크로입자 또는 코일 또는 스텐트 (stent)와 같은 고형상 물질을 사용하여 부적당한 의학적 필요성을 충족시킨다. 이와 같은 방식으로, 치료학적 이득은, 고형상 혈소판 결합제를 표적 부위로 전달하고 효율적인 혈전 형성을 개시하여 관련 혈관계를 폐색시킴에 의해 성취될 수 있다.
발명의 요약
본 발명은, 국소 혈소판 활성화를 통해 혈전 형성을 유도하는 고형상 제제를 사용하여, 근본적으로 과형성물 또는 신생물이거나 동맥-정맥 기형을 갖거나 출혈성인 조직 및/또는 기관 및 관련 혈관계를 치료하기 위한 치료학적 방법 및 조성물에 관한 것이다. 조성물은 코일 또는 스텐트 또는 입자와 같은 고형상 제제상에 혈소판을 포획하는 제제를 포함한다. 본 발명의 몇몇 양태에서, 고형상 제제는 혈소판을 포획하고 활성화시키는 2가지 기능을 갖는다. 당해 방법은 고형상 입자상에 국소적으로 혈소판을 응집시키고 혈소판을 활성화시켜 후속적으로 혈전의 혈성을 유도함으로써 표적 영역으로의 혈액 공급을 제한하는 방법을 사용하지만, 전반적 또는 전신적 혈전유발 상태를 유도하지 않는다.
혈전증은 환자의 이환율 및 치사율에 상당히 기여하는 것으로 공지되어 있기때문에 환자에게서 혈전증의 의도적인 유도는 일견하여 모순적인 것으로 보인다. 본 발명의 고형상 혈소판 매개 폐색은, 신체 고유 능력을 사용하여 고정화된 폰 빌레브란트 인자(VWF) 또는 기타 국소적 작용의 혈소판 활성화 제제에 응답하여 혈전을 형성시키는 혈전의 부위 특이적 유도를 기초로한다. VWF가 가용성 형태로 혈액을 순환하지만 내피하층의 일부로서 분자가 노출되거나 내피하층의 노출된 콜라겐에 결합하는 경우 혈소판을 포획하여 혈소판의 활성화를 유도할 수 있다.
고형상 혈소판 결합제와 환자로부터 유래된 혈액(생체외) 또는 혈류내의 혈액(생체내)과의 접촉은 혈소판 결합 및 국소적인 활성화를 유도하여 혈소판이 고형상 제제에 결합하게 되고 이어서 혈전을 유도하여 폐색 혈관에 의해 조직으로의 혈액 공급이 중단된다. 종양 세포 및 과형성 조직을 포함하는 세포는 국소적인 혈액 공급이 중단된 결과로서 쇠퇴하거나 사멸한다. 고정화된 VWF(가용성 VWF가 아님)이 순환하는 혈소판에 결합하고 이를 활성화시킨다는 사실을 바탕으로, 당해 방법은 전신 혈소판 활성화 및 혈전증을 회피한다. 따라서, 본 발명의 방법 및 조성물은 암, 과형성 세포, 과도한 출혈 또는 동정맥(AV) 기형과 같은 병리학적 증상을 치료하기 위한 간접적인 수단이다.
본 발명은 고형 종양, 과형성 조직, 과도한 출혈 및 AV 기형, 및 혈소판(휴지기 및/또는 활성화된)이 치료학적 역할을 수행할 수 있는 임의의 기타 질환 또는 증상을 치료하기 위한 기존의 방법을 개선시킨다.
기존의 병리학적 증상(즉, 헤파린-유도된 혈소판감소증[HIT])과 유사한 방식으로, 국소적인 혈소판 활성화는, 사람 Fc 단편을 고형상 제제에 포함시키거나 도입시키는 Fc 매개 작용에 의해, 또는 선택된 항체를 표적 영역으로 지향시킴으로써 증진될 수 있다. HIT 증후군에서 혈소판의 활성화는 국소적인 혈전을 유도하여 환부 영역으로의 혈액 공급을 중단시킨다. 이것은 환부 조직의 사멸을 유도한다.
부위 특이적 혈전 형성의 정도 또는 범위는 다양한 방식으로 조절될 수 있다. 항혈소판 제제(예를 들어, GPIIb/IIIa 억제제, 아스피린, 디피리다몰 등)를 사용한 혈소판 활성화의 억제는 한정된 적정가능한 방식으로 혈전 유도 경향을 감소시킨다. 국소적 혈류, 혈압 및 조직 온도를 변화시키는 것은 또한 국소적 혈소판 활성화 및 자극을 조절하는 수단으로서 작용할 수 있다.
전형적인 혈관 종양은 고형 종양, 특히, 암종이고, 이는 풍부한 혈액 공급을 요구한다. 본 발명과 관련된 예시적인 고형 종양은 폐, 유방, 난소, 위, 췌장, 후두, 식도, 고환, 간, 귀밑, 담즙관, 결장, 직장, 경부, 자궁, 내피, 신장, 방광, 전립선, 갑상선, 두부경부의 원발성 악성 종양, 흑색종, 교종, 신경아세포종, 신경내분비 종양등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본 발명과 관련된 기타 증상은 상기 언급된 종양 유형, 암 통증, AV-기형, 자궁 섬유종, 골반 울혈, 월경과다, 정맥류, 객혈, 동맥류, 내장 동맥류, 위동맥류 및 내피 누출(endoleak)의 2차(전이성) 종양을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 방법은 재조합 또는 포유동물 기원의 VWF로 코팅된 코일 또는 스텐트를 제조하고 VWF 코팅된 제제를 동물(사람 환자, 동물 환자 또는 시험 동물) 혈류로 도입하는 것을 포함하며; 이어서, VWF는 목적하는 표적 부위로 전달되거나 집합된다. 코일 또는 스텐트는, 다양한 시간동안, 코일 또는 스텐트내에 또는 코일 또는 스텐트의 표면상에 VWF를 보유할 수 있는 임의의 적합한 물질로 구성될 수 있다.
고형 종양의 비제한적인 증식 문제에 대한 해결은 종양내 혈관을 공략하는것이다. 당해 방법은 직접 종양 세포를 표적화하는 방법 보다 몇가지 이점을 제공한다. 첫번째로, 종양 혈관은 직접적으로 혈관 투여된 치료제에 접근할 수 있어 주사된 용량의 상당 %가 신속하게 국소화될 수 있다. 두 번째로, 각각의 모세관은 종양의 주위 코드내에 수천개의 세포에 산소 및 영양물을 공급하고 있기 때문에 종양 혈관계의 제한된 손상은 광범위하게 종양 세포를 사멸시킬 수 있다. 최종적으로, 혈관은 다양한 종양에서 유사하므로 다수 유형의 암을 치료하기 위한 하나의 시약을 개발할 수 있다.
본 발명은 개시 반응으로서 혈소판 활성화를 사용하여 혈관 폐색을 유도함으로써 치료학적 이점을 유도하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물 및 방법은 고형상 혈소판 결합제를 표적 부위로 전달하여 혈소판이 이에 결합하고 활성화됨으로써 국소 혈전을 형성시킴을 포함한다. 국소 혈전에 의한 표적 조직의 혈관계의 폐색은 필수 산소 및 영양물을 고갈시켜 조직을 퇴화시키고 결과적으로 조직을 사멸시킨다.
본 발명은 소정의 부위에 혈소판을 포획하고 혈소판을 활성화시키며 혈소판의 고유 기능을 사용하여 이로운 치료학적 결과를 성취하기 위한 조성물 및 방법을 제공한다. 본 발명에 따라, 혈소판은 순환하는 혈소판일 수 있거나 외부 공급원으로부터 수득한 혈소판일 수 있다. 본 발명에 따라, 혈소판은 특정 부위로 표적화될 수 있고 이어서 혈전 형성을 유도하는 혈소판의 고유 기능을 사용하여 당해 부위로의 혈액 공급을 중단하거나 붕괴시키거나 감소시킬 수 있다. 동시에, 감소된 혈류는 종양과 같은 질환 또는 증상으로의 영양물 공급을 감소시켜 질환의 크기를 감소시킨다. 종양 크기의 감소는 명백한 치료학적 이득이 될 수 있음은 명백하다. 몇몇 경우에, 표적 영역으로의 혈액 공급의 감소는 통증을 완화시킨다.
본 발명은 또한 혈소판에 결합하고 이를 활성화시킬 수 있는 고형상 제제를 사용하여, 선택적으로 표적화될 수 있는 소정의 조직, 예를 들어, 과형성 조직으로 혈소판을 표적화시키는 것을 포함한다. 본 발명의 이러한 양태에서, 표적화는, 소정의 부위 또는 조직에 특이적으로 결합하는 표적 잔기, 예를 들어, 리간드 등을 포함하는 고형상을 포함한다. 본 발명의 또 다른 양태에서, 표적화는, 예를 들어, 카테터, 스텐트 또는 코일에 의해 종양 부위에 또는 이 근처에 본 발명의 조성물을 전달하는 것을 포함한다. 소정의 선택된 부위에 혈소판을 활성화시켜 조직 또는 부위로의 영양물 공급을 감소시킴으로써 치료학적 이득을 야기할 수 있다.
본 발명은, 고형상 제제상에 혈소판을 포획하고, 혈소판의 활성화를 유도하며 혈전을 형성시킴으로써 혈전 형성을 유도하는 조성물 및 방법을 제공한다. 표적 혈관계내에 혈전 형성은 하류 조직으로의 혈액 공급을 감소시킨다. VWF 함유 고형상(예를 들어, 코팅된 입자) 위에 혈소판을 포획함으로써, 본 발명의 조성물 및 방법은 암, 과형성, 자궁 섬유종, 골반 울혈, 월경과다, AV-기형, 신경 색전증, 고환정맥류, 혈담, 내장 동맥류, 동맥류, 내피 누출등을 치료하는데 사용될 수 있다. 추가로, 본 발명의 조성물 및 방법은 조성물의 수용자에게 치료학적 이득을 제공한다.
본 발명의 바람직한 양태에서, VWF는 포유동물 기원이다. 본 발명의 가장 바람직한 양태에서, VWF는 사람 기원이다. 본 발명의 추가의 가장 바람직한 양태에서, VWF는 돼지 기원이다.
VWF는 천연, 합성, 재조합 펩타이드 서열 또는 펩타이드 서열 또는 VWF의 생물학적 활성 부분에 상당하는 펩타이드 서열이다. 본 발명의 추가의 가장 바람직한 양태에서, VWF는 재조합 기원이다.
본 발명은 또한 혈소판에 결합하는 혈소판 결합제의 능력은 손상되지 않는한은, 직접적으로 또는 스페이서를 통해 간접적으로 혈소판 결합제(예를 들어, VWF)를 고형상에 결합시키는 조성물을 제공하는 것이다. 본원에 사용되는 스페이서는, 고형상 제제의 표면으로부터 혈소판 결합제를 물리적으로 분리하는 특정 그룹의 불활성 또는 활성 분자를 언급한다. 예시된 스페이서는 하기에 기술된다. 직접 결합은 공유적으로 또는 비공유적으로 일어날 수 있다. 간접적인 결합은, 펩타이드 스페이서 암, 항체 스페이서, 항체 단편 스페이서, 융합 단백질 스페이서 또는 탄수화물 스페이서를 포함하지만 이에 제한되지 않는 스페이서를 통해 일어날 수 있다. 이들 스페이서는 정상적으로, 입자와 VWF간의 연결체로서 작용하지만 스페이서는 또한, 혈소판 활성화 정도를 변화시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, Fc 성분이 스페이서로서 사용되어 고형상 제제상에서 혈소판의 활성화를 증진시킬 수 있다. VWF는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 고형상 제제로 커플링될 수 있다. 커플링 제제의 예는 글루타르알데하이드 및 카보디이미드를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 활성 표적화제 없이 조성물을 포유동물의 혈관계내에 위치시키는 방법은, 수퍼셀렉티브 (superselective) 마이크로카테터를 사용하여 전달한 후 혈류 유도된 위치화에 의해 선택된다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 혈관 내피 조직 또는 표적 조직상에서 표적 항원 또는 부위에 결합하여 고형상 제제가 선택된 부위에 위치할 수 있도록 하는 표적 제제 또는 잔기를 포함할 수 있다. 예시된 표적화제 또는 잔기는 당업자에게 널리 공지되어 있고 항체, 리간드, 수용체, 호르몬, 렉틴 및 카드헤린 또는 이의부분 또는 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 표적화제는 비오틴, 비오틴 유사체 및/또는 펩타이드 성분을 갖는 항체 또는 항체 유사 분자를 포함한다. 본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 항체 또는 항체 유사 분자는 성장 인자/수용체 복합체에 대해 지향된다.
본 발명에 따른 조성물은 또한 하나 이상의 하기 성분을 포함한다: 하나 이상의 혈소판 결합 조정제(예를 들어, 억제제 또는 증진제), 하나 이상의 혈전 형성 조절제 또는 조정제 또는 하나 이상의 보체 캐스케이드 성분.
본 발명에 따른 방법은 또한 소정의 부위에서 혈소판에 결합할 수 있는 고형상 제제를 투여하는 것을 포함할 수 있고; 또한 포획된 혈소판의 활성화를 유도하고, 항원 결정인자 및 혈소판 결합 부위를 갖는 이작용성 결합제를 투여하고, 본 발명의 하나 이상의 조성물의 온도를 변화시키거나 소정의 부위의 온도를 변화시켜 혈전 형성을 조절하는 것을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 방법은 추가로 하나 이상의 하기의 단계를 포함할 수 있다: 하나 이상의 혈소판 결합 조정제를 투여하는 단계, 하나 이상의 혈전 형성 조정제를 투여하는 단계, 하나 이상의 보체 캐스케이드 성분을 투여하는 단계, 고형상을 소정의 부위로 결합시키고/시키거나 혈소판 결합 잔기 또는 성분을 고형상에 결합시키기 위해 하나 이상의 리간드 및/또는 항-리간드를 투여하는 단계.
본 발명은 또한 혈소판을 내피 막 성분으로 표적화하기 위한 고형상 제제, 혈소판에 결합하는 결합제, 내피 막 성분에 결합하는 리간드, 리간드 컨쥬게이트,리간드 또는 리간드 컨쥬게이트에 결합하는 항리간드, 혈소판 결합 조정제(증진제 및/또는 억제제), 혈전 형성 조정제, 보체 캐스케이드 성분, 보체 캐스케이드 성분 유도인자 및 항리간드를 포함하는 혈소판에 결합하는 결합제를 포함하는 성분 모두 또는 일부를 함유할 수 있지만 이에 제한되지 않는 키트를 포함한다. 키트는 이작용성 결합제 및/또는 결합제-리간드-컨쥬게이트 및/또는 혈소판-결합제-항리간드 컨쥬게이트를 포함할 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 조성물을 소정의 선택된 부위에 전달하는 임의의 기작을 포함하고 전신, 국소, 경구 또는 국부적인 기작을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 몇몇 양태에 따라, 결합제는 소정의 부위에서 혈소판을 포획하기 위해 사용된다.
정의
본원에 사용된 바와 같이, 고형상 제제는 혈소판 결합제와 결합하고, 이를 함유하거나 보유하는데 적합한 임의의 고형 물질을 언급한다. 혈소판 결합제는, 혈소판 결합 활성이 예를 들어, 표적 부위에 또는 부위내에 보유되도록 고형상 제제에 부착될 수 있다. 고형상 제제는 코일, 스텐트 또는 입자, 예를 들어, 비드 등일 수 있고 이 모두는 당업자에게 널리 공지되어 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 입자는 혈소판 결합제를 함유하거나 보유할 수 있는 고형상 물질의 일부 또는 개별적인 부분을 언급한다. 본 발명의 바람직한 방법은 재조합 또는 포유동물 기원의 VWF로 코팅된 입자를 제조하는 단계 및 VWF 코팅된 입자를 사람 환자, 동물 환자 또는 시험 동물과 같은 동물의 혈류로 도입하는 단계를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "입자"는 직접적으로 또는 간접적으로(예를 들어, 리간드를 통해) 혈소판에 결합할 수 있는 임의의 고형상 물질을 언급한다. 입자는 크기와 관련하여 균일하거나 불균일할 수 있다. 특히, 당해 입자는 구형(난형을 포함) 또는 불규칙한 구형일 수 있다. 입자는 무제한 또는 다양한 시간동안 입자내에 또는 입자 표면상에 VWF를 보유할 수 있는 임의의 적합한 물질로 구성될 수 있다. 예시적인 물질은 단독으로 사용되거나 배합하여 사용되는, 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 락티드-글리콜리드 공중합체, 폴리카프롤락톤, 락티드-카프롤락톤 공중합체, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리안하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 알부민, 콜라겐, 겔라틴, 폴리사카라이드, 덱스트란, 전분, 메틸 메타크릴레이트, 메타크릴산, 하이드록시알킬 아크릴레이트, 하이드록실알킬 메타크릴레이트, 메틸렌 글리콜 디메틸아크릴레이트, 아크릴아미드, 비스아크릴아미드, 셀룰로스계 중합체, 에틸렌 글리콜 중합체 및 공중합체, 옥시에틸렌 및 옥시프로필렌 중합체, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리비닐피리딘, 자기 입자, 형광성 입자, 동물 세포, 식물 세포, 거대 응집 및 미세 응집 알부민, 변성된 단백질 응집체 및 리포좀을 포함한다. 본 발명에 사용하기에 적합한 고형상 물질은 당업자에게 널리 공지되어 있고 상기 언급된 당해 예시된 물질로 제한되지 않아야 한다.
스텐트 또는 코일을 형성하기 위한 예시적인 물질은 단독으로 사용되거나 배합되어 사용되는 폴리비닐 알코올(PVA), 폴리스티렌, 폴리카보네이트, 폴리락티드, 폴리글리콜리드, 락티드-글리콜리드 공중합체, 폴리카프롤락톤, 락티드-카프롤락톤 공중합체, 폴리하이드록시부티레이트, 폴리알킬시아노아크릴레이트, 폴리언하이드라이드, 폴리오르토에스테르, 폴리사카라이드, 덱스트란, 전분, 메틸 메타크릴레이트, 메타크릴산, 하이드록실알킬 아크릴레이트, 하이드록실알킬 메타크릴레이트, 메틸렌 글리콜 디메타크릴레이트, 아크릴아미드, 비스아크릴아미드, 셀룰로스계 중합체, 에틸렌 글리콜 중합체 및 공중합체, 옥시에틸렌 및 옥시프로필렌 중합체, 폴리비닐 아세테이트, 폴리비닐피롤리돈 및 폴리비닐피리딘, 자기 물질, 형광성 물질, 금, 백금, 팔라듐, 레늄, 로듐, 루테늄, 스테인레스강, 텅스텐, 티타늄, 니켈 및 이의 합금등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
고형상 물질의 바람직한 크기는 사용되는 물질의 유형에 의존한다. 예를 들어, 당업자는, 고형상이 스텐트 또는 코일인 경우, 당해 크기가 혈관(예를 들어, 동맥)내에 적합한 직경을 갖는 것이 바람직하다는 것을 인지할 것이다. 전형적으로 직경은 약 15mm 이하 또는 이를 초과할 수 있다. 고형상이 비드와 같은 입자인 경우, 직경은 약 7mm 이하, 바람직하게는 약 1㎛ 내지 약 5mm, 심지어 보다 바람직하게는 약 20㎛ 내지 약 300㎛일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 고형상 물질의 크기는 당업자에게 널리 공지되어 있고 상기 언급된 예시된 크기로 제한되지 않아야 한다.
본원에 사용된 바와 같이, 결합제 또는 표적화 잔기는 하나의 물질이 또 다른 물질에 결합하기 위한 하나 이상의 고형상의 화학적 또는 생물학적 분자 또는구조를 언급한다. 특히, 결합제 또는 고형상 제제는 한정된 집단의 세포, 전형적으로 조직 및/또는 관련 혈관계 또는 암 세포 및/또는 관련 혈관계상의 리간드, 수용체 또는 리간드/수용체 복합체에 결합한다. 결합제로서의 분자의 기능은 부착에 대한 구조적 기작에 의해 제한되지 않아야 한다. 예를 들어, 결합제는, 결합제를 표적 세포 또는 세포 집단에 연결시키는 수용체, 항원 결정인자 또는 에피토프, 효소 기질 또는 기타 생물학적 구조에 결합할 수 있다. 결합제는 컨쥬게이트일 수 있고 면역학적 컨쥬게이트, 화학적 컨쥬게이트(공유 또는 비공유), 융합 단백질등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 리간드 결합제는 서로간에 특이적으로 결합하는 것으로 입증된 상보적 세트의 분자를 언급한다. 리간드/항 리간드 쌍은 일반적으로 비교적 높은 친화성으로 결합하고 이러한 이유때문에 본 발명에 사용하는 것이 매우 바람직할 수 있다. 매우 널리 공지된 리간드/항 리간드 쌍은 비오틴과 아비딘이다. 본원에 사용된 바와 같이, 아비딘은 아비딘, 스트렙트아비딘, 뉴트라비딘, 이의 유도체 및 유사체 및 이의 기능적 등가물을 언급한다. 아비딘은 다가 또는 1가 방식으로 비오틴에 결합할 수 있다. 또 다른 예시된 리간드/항 리간드 쌍은 동종친화성 펩타이드, 이종친화성 펩타이드, "류신 지퍼(zipper)", 아연 핑거 단백질/ds DNA 단편, 효소/효소 억제제, 합텐/항체, 리간드/리간드 수용체 및 성장 인자/성장 인자 수용체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 선택된 부위, 소정의 부위, 표적화 및 예비 표적화 세포 모두는 고형상 제제에 대한 혈소판의 축적이 치료학적으로 이로운 결과를제공하는 부위를 언급한다. 전형적으로, 이것은 표적화 잔기의 표적 부위 국소화를 포함한다. 당해 부위는 고형 종양의 혈관계, 양성 종양의 혈관계, 과형성 조직의 혈관계, AV 기형, 혈관 동맥류 및 내피 누출을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 혈소판 결합제를 포함하는 고형 제제는 카테터, 마이크로카테터 또는 바늘 및 주사기에 의해 전달될 수 있다. 카테터 또는 마이크로카테터에 의한 전달은 대부분 흔히 동맥 회로를 통한 접근에 의해 성취되지만 정맥 회로를 통한 고형 제제의 전달이 또한 바람직할 수 있다. 한 예로서, 입자, 코일 또는 스텐트 형태의 고형제 제제는 동맥 또는 정맥 회로를 통해 카테터에 의해 표적 부위로 전달될 수 있다. 동맥 회로를 사용한 고형 제제의 전달이 유리한데 그 이유는 표적 조직내의 적용된 제제의 모세관 망 하류가 제제를 포획하는 수단으로서 작용하여 제제가 전신 순환계에 진입하는 것을 차단하기 때문이다. 고형 제제는 또한 고형 제제와 결합된 표적화 제제를 사용하여 동맥 회로내에 국소화될 수 있다. 정맥계를 사용한 고형 제제의 전달이 또한 바람직할 수 있다. 정맥계에서 고형 제제의 국소화 전달은, 고형 제제와 결합된 표적화 제제를 사용하여, 고형 제제를 표적화 부위에 결합시켜 성취될 수 있다. 고형 제제는 또한 수술 과정 동안에 표적 부위로 전달될 수 있다. 한 예로서, 입자 형태의 고형 제제는 주사기 및 바늘에 의해 표적 부위로 전달될 수 있다. 추가의 예로서, 코일 또는 스텐트 형태의 고형 제제는 수술 과정동안에 수작업으로 표적 부위에 위치할 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이, 혈전은 피브린내에 포집된 혈액 세포의 반고체 응집체 및 고형상 제제에 활성적으로 결합하는 혈소판 기원의 혈소판 응집물을 언급한다. 본 발명에 따라, 혈전은, 소정의 부위에 활성화된 혈소판이 축적되는 직접적인 결과로서 형성된다. 혈전증은 전형적으로 혈관내에 혈전의 형성을 언급한다. 혈전성은 혈전증을 일으키는 경향이 있거나 혈전을 형성하는 물질을 언급한다.
본원에 사용된 바와 같이, 색전은 혈류를 통해 이동하고 크기 제약을 통해 결국, 혈관내 매쓰 부위로부터 원거리의 혈관 또는 모세관에 정체되는 혈관내 매쓰를 언급한다. 색전술은 능동적 과정을 의미하지는 않지만 대신 소혈관 및 모세관에 정체하게 되는, 혈류를 통해 이동하는 혈관내 매쓰에 의해 혈관이 폐색되는 수동적 과정을 언급한다.
반대로, 본 발명은, 혈소판이 활성적으로 혈소판 결합제를 통해 고형상 표면으로 유인되는 즉시 고형상 물질이 표적 혈관계로 전달됨을 포함한다. 본원에 참조문헌으로 포함되는 인용 특허 문헌에 기재된 색전 물질과 반대로, 본 발명의 제제는, 고형상 물질에 대해 혈소판이 신속하게 축적되기 때문에 표적 혈관계로 매우 근접하게 전달되어야만 한다.
예로서, 제조원[Draximage(Kirkiand, Quebec, Canada)]에 의해 공급되는 바와 같은 거대 응집 알부민(MAA)은 색전 영상화 제제로서 사용된다. MAA는 크기가 10㎛ 내지 70㎛이고 최대 크기가 150㎛인 입자로 이루어지고 이들은 나트륨 퍼테크네테이트 Tc 99m으로 방사선 표지되어 있어 신티그램촬영 영상화를 가능하게 한다. MAA 입자는 정맥내로 주사되고 색전으로서 혈류를 통해 이동하며 폐포 모세혈관상내에 포집된다. 본 발명의 방법을 사용하여, MAA 상에 VWF를 고정화시키고 이어서입자를 혈관계에 주사하여 즉각적으로 혈소판이 입자에 결합하게 하여 주사 부위에 인접한 혈관계를 폐색시킨다.
본 발명은, 혈소판 결합제의 사용을 통해 고형상 물질의 표면으로 혈소판을 확보시켜 고형상 물질의 유효 크기를 증대시킴으로써 혈관 폐색을 유도하는 기존의 방법을 개선시킨 것이다. 예를 들어, 혈류로 주사되는 VWF를 함유하거나 이것으로 코팅된 입자는 이의 표면상에 혈소판을 신속하게 축적시켜 주사 부위에 인접하여 적층되고 활성화된 혈소판의 '양파 (onion) 효과'를 발생시킨다. 따라서, 본 발명은 최소수의 소형 입자를 혈류로 전달시킬 수 있고 전달되는 즉시, 입자내에 또는 입자상에 혈소판 결합제에 활성적으로 결합하는 혈소판의 축적으로 인해 입자의 크기가 신속하게 성장하게 된다. 추가로, 입자 결합 혈소판은 서로 상호작용함으로써 크기가 증가된 응집체를 형성하여 밀집된 매트릭스를 형성함으로써 표적 혈관계를 효과적으로 폐색시킨다.
본 발명은 추가로, 혈소판 결합제에 의해 고형상 물질의 표면에 혈소판을 확보하여 혈관 폐색을 유도하는 기존의 방법을 개선시킨다. 따라서, 본 발명의 제제는, a) 제제가 정체되는 혈관 또는 모세관의 외곽에 맞게 성형되고 b) 고형 불투과성 3차원 매트릭스를 형성하여 혈관내에 밀집된 불투과성 봉입체를 형성함으로써 하류의 혈관 및 조직으로의 혈액 전달을 최대한으로 억제하는 생체내 효과를 갖는다.
예를 들어, 혈류로의 혈소판 결합 입자의 도입은 하기의 반응 순서를 통해 진행된다: a) 단일층의 혈소판이 입자의 표면에 형성되어 (i) 직경이 증가된 입자및 (ii) 본원에 '단일층 표면 활성화된 혈소판' 입자(S-SAP 입자)로서 정의된, 현탁액중의 인접 혈소판에 결합하고 이를 활성화시키는 성질을 갖는 활성화된 혈소판으로 코팅된 입자를 형성하는 단계, b) 혈류중에 이동하는 혈소판이, 본원에 다중 적층된 혈소판 입자'(M-SAP 입자)로서 정의된, 양파형 층을 형성하는 S-SAP 입자에 결합한 혈소판과 상호작용하는 단계, c) M-SAP가, 본원에 'M-SAP 매트릭스'로서 정의된 보다 큰 응집체를 형성하는 혈소판/혈소판 상호작용을 통해 서로간에 상호작용하는 단계.
추가의 예로서, 표면 결합 혈소판 결합제(예를 들어, VWF)를 함유하거나 이를 갖는 무정형 혈소판 결합 입자(예를 들어, MAA)의 혈류로의 도입은 하기의 반응 순서를 통해 진행된다: a) 단일 혈소판이 입자의 매트릭스상에 및 매트릭스내에 결합하여 (i) 직경 및 강도가 증가된 입자, (ii) 현탁액중에 인접 혈소판에 결합하고 이를 활성화시키는 성질을 갖는 활성화된 혈소판으로 코팅되어 이를 함유하는 입자를 형성하는 단계, b) 혈류중에 이동하는 혈소판이 입자에 결합되고/되거나 입자내에 결합된 혈소판과 상호작용하여 입자내에 및/또는 입자상에 응집체를 형성하는 단계, c) 표면 결합 혈소판을 함유하고/하거나 갖는 입자가 서로 상호작용하여 거대 입자 응집체를 형성하는 단계.
본원에 사용된 바와 같이, 치료학적 이점을 제공하는 치료학적으로 유익한 이란 수용 동물의 생리의 바람직한 변화를 언급한다. 본 발명의 바람직한 양태에서, 변화가 검출될 수 있다. 본 발명에 따라, 활성화된 혈소판 또는 혈소판 조절을 포함하는 임의의 생물학적 기작은 유익한 치료학적 결과를 성취하기 위해 사용되거나 이용될 수 있다. 본 발명에 따라 수득된 예시적인 치료학적 이점은 혈전의 형성, 혈소판 매개 폐색의 형성, 과형성 조직 또는 세포의 제거, 종양 및/또는 종양 세포의 제거, 과형성 조직 크기의 감소, 종양 크기의 감소, 화학치료요법 및/또는 방사선 치료등과 같은 추가의 치료요법에 민감해지도록 과형성 조직 또는 종양의 유도, 과형성 조직 또는 암으로의 영양물 공급의 중단 또는 감소, AV-기형의 복구, 내피 누출로 인한 혈액 손실의 감소 또는 차단 및 혈관 동맥류의 복구를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, "투여"란 고형상 제제를 함유하는 조성물을, 전형적으로 포유동물의 소정의 세포, 세포들, 또는 조직으로 전달시키는 임의의 작용을 언급한다. 투여는 생체내, 시험관내 또는 생체외에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 조성물은 주사 또는 내시경 또는 카테터를 통해 투여될 수 있다. 투여는 또한 본 발명에 따른 조성물을 직접 세포에 적용하는 것을 포함한다. 예를 들어, 수술 과정동안에, 종양 또는 과형성 조직의 혈관계는 노출될 수 있다. 본 발명의 양태에 따라, 노출된 세포 또는 혈관계는, 예를 들어, 수술 부위, 혈관계 및/또는 세포를 세척하거나 관주하여 본 발명의 조성물에 직접 노출될 수 있다.
고형상 혈소판 결합제는 결합 또는 표적화 제제를 사용하여 특이적 표적 부위로 국소화될 수 있다. 예시된 결합 또는 표적화 제제는 모노클로날 항체; 폴리클로날 항체; 키메라 모노클로날 항체; 사람화된 항체; 유전공학처리된 항체; F(ab)2, F(ab')2, Fab, F(ab'), Dab, Fv, sFv, scFv, Fc 및 최소 인지 단위체로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 항체의 단편; 모노클로날 항체(SC-Mab)의 반응 부위를 나타내는 단일쇄; 종양 결합 펩타이드; 수용체 단백질을 포함하는 단백질; 펩타이드; 폴리펩타이드; 당단백질; 지단백질등, 예를 들어, 성장 인자; 림포킨 및 사이토킨; 효소, 면역 조절제; 호르몬, 예를 들어, 소마토스타틴; 리간드(이의 상보적인 항 리간드와 쌍을 이룸); 올리고뉴클레오타이드; 이펙터 기능을 매개하는 분자와 결합된 상기 언급된 것중 어느 하나; 및 상기 언급된 것중 어느 하나의 모사체 또는 단편을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 한정된 표적 세포 집단에 결합하는 능력을 보유한 상기 열거된 표적화 잔기의 유사체는 또한 청구된 발명의 범위내에서 사용될 수 있다. 추가로, 합성 표적화 잔기가 디자인될 수 있다.
본 발명의 실시예 유용한 모노클로날 항체는 온전한 항체 및 이의 단편을 포함한다. 당해 모노클로날 항체 및 단편은 하이브리도마 합성, 재조합 DNA 기술 및 단백질 합성과 같은 통상적인 기술에 따라 생산 가능하다. 유용한 모노클로날 항체 및 단편은 임의의 종(사람을 포함함)으로부터 유래하거나 하나 이상의 종으로부터 기원하는 서열을 사용하여 키메라 단백질로서 형성될 수 있다. 문헌[참조: Kohler and Milstein, Nature, 256:495 - 97, 1975; Eur. J. Immunol., 6:511-19, 1976]을 참조한다. 고형상 제제를 표적 부위로 국소화시킬 수 있는 바람직한 결합 및/또는 표적화 제제는 항체 또는 항체 유사 분자이고 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 보다 바람직한 결합제는 과형성 조직 또는 세포(예를 들어, 종양) 또는 과형성 조직 또는 세포와 관련된 혈관계상의 리간드/수용체 복합체에 결합하는 항체이다. 가장 바람직한 결합제는 종양 매쓰상에 또는 이와 인접한 종양 혈관계상의 성장 인자/성장 인자 수용체 복합체에 결합하는 항체 또는 항체 유사 분자이다.본 발명의 바람직한 양태에서, 결합제(즉, 항체 또는 항체 유사 분자)는 VEGF/VEGF 수용체 복합체에 결합한다. 본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 항체 또는 항체 유사 분자 결합은 리간드/수용체(즉, 성장 인자/성장 인자 수용체) 상호작용에 의해 형성된 신규 에피토프(숨겨진 또는 이전에 유용하지 못한 에피토프)를 인지한다. 본 발명의 추가의 바람직한 양태에서, 항체 또는 항체 유사 분자의 성장 인자/성장 인자 수용체 복합체로의 결합은 성장 인자 또는 성장 인자 수용체의 기능에 영향을 주지 않는다.
올리고뉴클레오타이드, 예를 들어, 표적 세포 핵산(DNA 또는 RNA) 부분과 상보적인 안티센스 올리고뉴클레오타이드는 또한 본 발명의 실시에서 표적화 잔기로서 유용하다. 세포 표면에 결합하는 올리고뉴클레오타이드가 또한 유용하다.
상기 언급된 분자의 기능적 등가물은 또한 본 발명의 표적화 잔기로서 유용하다. 하나의 표적화 잔기의 기능적 등가물은 표적화 잔기-표적 세포 결합의 적절한 배위 및/또는 배향을 모방하도록 디자인된 유기 화학적 구조물의 "모사체" 화합물이다. 또 다른 표적화 잔기의 기능적 등가물은 컴퓨터 원조 분자 모델링을 사용하여 작제된 "최소" 폴리펩타이드로서 정의된 짧은 폴리펩타이드 및 변화된 결합 친화성을 갖는 변이체이고 당해 최소 폴리펩타이드는 표적 잔기의 결합 친화성을 나타낸다.
면역글로불린의 Fv 단편은 표적화된 종양 치료를 목적하는 경우 온전한 면역글로불린 보다 많은 상당한 이점을 갖고 이것은 고형 종양 조직으로의 우수한 병변 침투 및 보다 신속한 혈액 제거 뿐만 아니라 잠재적으로 낮은 Fc 매개된 면역원성을 포함한다. 예시된 단일쇄 Fv(scFv) 결합제는 리간드/수용체 복합체를 인지하는 항체의 가변 영역으로부터 분리된 유전자로부터 공학처리될 수 있다.
본 발명의 양태는 정상적인 비종양 관련 혈관계와 비교하여 종양 관련 혈관계 내피 세포의 세포 표면에서 발견되고, 발현되며, 결합 가능하고, 국재화된 마커에 대해 결합 친화성을 갖는 표적화 제제를 포함한다. 추가로, 표적화 제제가 결합 친화성을 갖는 특정 마커는, 종양 관련 내피 세포 보다는 종양 관련 혈관계의 성분과 결합될 수 있다. 예를 들어, 당해 마커는 기저막 또는 종양 관련 연결 조직상에 위치할 수 있다.
조직 부위의 면역 염색에 의해 평가되는 바와 같이, 정상적인 내피 세포의 표면과 거의 반응하지 않고 종양 혈관계에 대해 비교적 고도의 특이성을 갖는 항체 또는 기타 결합제 또는 잔기를 제조하고 이를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 또한 모든 혈관계에 공통적인 에피토프에 결합할 수 있는 항체 또는 기타 결합제 또는 잔기를 제조하고 이를 사용하는 것이 바람직할 수 있다.
본 발명에 따른 표적화 제제의 존재 또는 부재하에 고형상 혈소판 결합제를 포함하는 임의의 조성물은 생체내에서 치료학적으로 유익한 혈전 형성 및/또는 세포 사멸 또는 퇴화를 개시하는데 사용될 수 있다. 조성물은 하나 이상의 보조제, 하나 이상의 담체, 하나 이상의 부형제, 하나 이상의 안정화제, 하나 이상의 투과제(예를 들어, 세포막을 통과하는 이동을 조정하는 제제), 하나 이상의 영상화 시약, 하나 이상의 이펙터 및/또는 생리학적으로 허용되는 식염수 및 완충액을 포함할 수 있다. 일반적으로, 보조제는 보다 현저한 면역 반응을 유발하기 위해 면역원과 혼합된 물질이다. 조성물은 또한 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 약제학적으로 허용되는 담체는 식염수, 멸균수, 인산 완충 식염수등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 환자에 전달하기 위해 적합한 기타 완충제, 분산제 및 불활성 비독성 물질이 본 발명의 조성물중에 포함될 수 있다. 조성물은 투여하기에 적합한 용액일 수 있고 전형적으로 멸균된 비발열성이고 바람직하지 못한 입자를 갖고 있지 않다. 조성물은 통상적인 멸균 기술에 의해 멸균될 수 있다.
본 발명의 바람직한 양태에서, 적합한 조성물은 리간드/수용체 복합체에 결합하는 결합제 또는 표적화제를 포함한다. 본 발명에 따른 표적물로서 유용한 예시된 항원은 폐, 결장, 직장, 유방, 난소, 전립선, 두부, 목, 골, 면역계, 혈액 또는 임의의 기타 해부학적 위치를 포함하는, 암 관련 항원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시된 항원 및/또는 소정의 부위는 VEGF/VEGF 수용체 복합체, FGF/FGF 수용체 복합체 또는 TGF 베타/TGF 베타 수용체 복합체, p-셀렉틴, 시알릴-루이스 X, 엔도텔린, 엔도텔린 수용체, 엔도텔린/엔도텔린 수용체 복합체, 알파-페토단백질, 혈소판-내피 세포 접착 분자(PECAM), CD31, CD34, CD36, 당단백질 Ib(GPIb), 엔도글린, 트롬보모듈린, 내피 백혈구 접착 분자(ELAM), 세포내 접착 분자 1(ICAM-1), MHC-1 및 MHC-II를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 피검체는 사람 또는 동물 피검체일 수 있다.
상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 조성물 및 방법은 혈소판 결합제 또는 성분을 포함한다. 예시적인 혈소판 결합제 또는 성분은 단독으로 또는 배합된, 폰 빌레브란트 인자(VWF), 오스테오폰틴, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 라미닌, 헤파린, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 포스포리파제 A2(PLA2), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 트롬빈, 유리, 시알릴-루이스 X, 피불린-1, 혈소판-내피 세포 접착 분자(PECAM), 세포 상호 접착 분자 1(ICAM-1), 세포 상호 접착 분자 2(ICAM-2), CD11b/CD18(MAC-1), CD11a/CD18(LFA-1), p-셀렉틴 당단백질 리간드 1(PSGL-1)을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 조성물 또는 방법은 혈소판 매개 폐색 증진제를 포함할 수 있다. 혈소판 매개 폐색 증진제는 상기 주지된 바와 같은 이작용성 분자의 일부를 형성하는 잔기일 수 있고 본 발명에 따른 조성물중의 한 성분일 수 있고/있거나 본 발명의 조성물과는 별도로 투여될 수 있다.
예시적인 혈소판 매개 폐색 증진제는 리스토세틴, 트롬빈, 헤파린 유도 혈소판감소증(HIT) 항체 또는 이의 일부, 항인지질 항체(APA) 또는 이의 일부, Fc 매개 기작을 통한 온전한 항체 분자, 항LIBS 항체, 항CD9 항체, 에피네프린, 트롬빈 수용체 활성화 펩타이드(TRAP), 프로테이나제 활성화된 수용체(또한 프로테아제 활성화된 수용체, PAR로서 공지됨) 효능제, 카텝신 G, 엘라스타제, 아라키도네이트, 혈소판 활성화 인자(PAF), 트롬복산 A2(TxA2), TxA2 모사체, 포스포리파제 A2(PLA2), 단백질 키나제 C(PKC)의 활성화제, 아데노신 디포스페이트(ADP), 사이클로-옥시게나제 1(COX-1)의 유도인자, 사이클로-옥시게나제 2(COX-2)의 유도인자, 콜라겐, 폰 빌레브란트 인자(VWF), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 헤파린, 헤파린 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 이오노포어, 보체 캐스테이드 성분(예를 들어, C5b-9)혈소판 마이크로입자, 혈소판 막 분획물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
상기 주지된 바와 같이, 본 발명의 조성물 또는 방법은 혈소판 매개 폐색 지연제등을 포함할 수 있다. 혈소판 매개 폐색 지연제는 상기 주지된 바와 같이 이작용성 분자의 일부를 형성하는 잔기일 수 있고 본 발명에 따른 조성물중의 한 성분일 수 있고/있거나 본 발명에 따른 조성물과 별도로 투여될 수 있다.
예시적인 혈소판 매개 폐색 지연제는 아스피린, 이부프로펜, 아세트아미노펜, 케토프로펜, 티클로피딘, 클로피도그렐, 인도메타신, 디피리다몰, 오메가-3 지방산, 프로스타사이클린, 산화질소, 산화질소 유도인자, 산화질소 신타제의 유도인자, 매트릭스 메탈로프로테이나제 억제제(MMPI, TIMP), 항GPIIb/IIIa 제제, 항□v□3 제제, 항□2□1 제제, 항CD36 제제, 항GPVI 제제, 아우린트리카복실산, 트롬빈 수용체 길항제, 트롬복산 수용체 길항제, 스트렙토키나제, 우로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가로, 막 상 전이 온도(즉, 15℃미만) 이하로 냉각된 혈소판은 비가역적으로 활성화된다는 것은 공지되어 있다. 환자에게 수혈되는 경우, 혈소판은 정상적으로 기능하지만 혈소판은 체내로부터 신속하게 제거된다(즉, 정상적으로 순환하는 혈소판의 수명이 7 내지 10일인 것과는 대조적으로 약 24시간 이내). 이들 혈소판이 신속하게 제거되지만 이들은 높은 친화성으로 고정화된 VWF에 결합한다. 따라서, 냉각된 혈소판의 수혈은 표적 부위에서 혈전 형성을 증진시키기 위한 추가의 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명의 한 양태는, 상기 주지된 바와 같이 냉각된 혈소판을 투여함으로써 혈소판 매개 폐색을 조절하는 것을 포함한다.
상기 주지된 바와 같이, 표적 잔기는 결합쌍의 한 구성원이거나 이에 결합할 수 있다. 본 발명에 따른 방법은 국소 부위에 표적 잔기의 축적, 최적의 표적 대 비표적 축적, 결합쌍의 제2 구성원의 축적 및 결합 및/또는 비결합된 물질의 제거를 위해 충분한 시간을 요구할 수 있다.
본 발명에 따라, 2개, 3개 또는 그 이상의 표적화 단계 또는 국소화 단계가 사용될 수 있다. 많은 이들 프로토콜은 당해 기술 분야에 널리 공지되어 있다[문헌참조: 비오틴/아비딘 프로토콜을 사용하는 미국 특허 제5,578,287호]. 예시적인 다단계 프로토콜은 결합제 리간드를 투여하는 단계, 비결합된 결합제를 제거하고 결합된 결합제 리간드를 국소화하기 위해 항리간드를 투여하는 단계 및 활성제 리간드를 투여하는 단계를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 본원에 사용된 바와 같이, 활성제는 활성이거나 활성이 되어 치료학적 이점을 제공하는 임의의 치료제를 언급한다.
본 발명의 방법에 따라, 결합제는 리간드/수용체 복합체와 결합할 수 있어야만 하고 임의의 면역학적으로 적합한 경로에 의해 환자에게 투여될 수 있다. 예를 들어, 결합제는 정맥내, 동맥내, 피하내, 복강내, 경막내, 방광내, 피내, 근육내 또는 림프관내 경로에 의해 환자에게 도입될 수 있다. 조성물은 고형, 용액, 정제, 에어로졸 또는 다단계 제형일 수 있다. 리포좀, 장기 순환 리포좀, 면역리포좀, 생분해성 미소구, 마이셀등은 담체, 비히클 또는 전달 시스템으로서 사용될 수 있다. 보다 추가로, 당해 기술분야에 널리 공지된 생체외 방법을 사용하여, 혈액, 혈장 또는 혈청은 환자로부터 분리될 수 있고 임의로 환자의 혈액내 항원을 정제하는 것이 바람직할 수 있고 혈액 또는 혈청은 이어서 본 발명에 따른 결합제 또는 고형상 제제를 포함하는 조성물과 혼합될 수 있고 처리된 혈액 또는 혈청은 환자에게 다시 수혈한다. 임상의는 가장 효과적인 투여 경로를 결정하는데 있어서 이들 상이한 경로와 관련된 반응을 비교할 수 있다. 본 발명은 결합제를 환자에게 도입하는 임의의 특정 방법으로 제한되지 않아야 한다.
투여는 1회, 1회 이상, 또는 장시간동안 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물은 심각한 질환 상태, 즉, 생명을 위협하거나 위독하게 생명을 위협하는 질환 상태에 있는 환자에게 사용될 수 있기 때문에, 과량의 고형상 제제가 목적하는 경우, 투여될 수 있다. 본 발명의 조성물의 주사를 위한 희석 기술을 포함하는, 약제학적 조성물을 투여하기 위한 실질적인 방법 및 프로토콜은 널리 공지되어 있고 당업자에게 명백하다. 이들 몇몇 방법 및 프로토콜은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Co.(1982)]에 기재되어 있다.
고형상 제제는 기타 결합제와 배합하여 투여될 수 있거나 기타 치료 프로토콜 또는 제제, 예를 들어, 화학치료제, 색전제(예를 들어, 겔발포제 또는 폴리비닐 알코올(PVA))와 배합되어 투여될 수 있다.
당해 기술 분야에 널리 공지되어 있는 바와 같이, 치료제 또는 치료제 컨쥬게이트를 생체내 투여하는 것과 관련된 단점은 비표적물 또는 바람직하지 못한 표적물과 결합한다는 것이다. 따라서, 비표적 결합을 최소화하고 치료제 또는 활성제에 대한 비표적물의 노출을 최소화하고/하거나 비결합된 결합제, 리간드 또는 활성제의 제거를 최대화하기 위한 성질을 갖는 투여 조성물이 바람직할 수 있다. 더욱이, 전형적으로, 이들 성질의 최적화가 고용량의 활성제, 치료제 또는 이전에 비활성화된 제제를 활성화시키는 과정의 성분을 투여할 수 있도록 한다. 당업자는 독성 역치이하로 안정성을 유지하면서 최고의 가능한 용량을 투여하기 위한 최적의 계수를 선택하는데 매우 능숙하다.
따라서 본 발명의 바람직한 양태에 따라, 비활성화된 혈소판은 축적하거나 고형상 제제에 결합하여 소정의 부위에 축적되도록 유도되고 이어서 적당히 국소화된 혈소판이 선택적으로 활성화된다.
본 발명의 바람직한 양태에 따라, 활성화된 혈소판은 축적하거나 고형상 제제에 결합하거나 고형상 제제에 결합된 혈소판을 통해 소정의 부위에 축적되도록 유도된다.
본 발명의 효과는 혈전 형성을 결정하는 통상적인 분석, 혈전 형성, 종양 괴사, 종양 크기, 종양 형태학, 및/또는 종양 괴사를 유도하는 혈전 형성의 형태계량학적 연구, 혈류 연구(예를 들어, 혈관조영술, 도플러 초음파, 방사선사진, CT 스캔, MRI)에 의해 모니터될 수 있다. 당업자는, 치료학적 이점을 평가하거나 모니터하기 위한 또 다른 시험이 수행될 수 있음을 인지할 것이다.
하기 열거된 선천성 및 병리학적 증상에 대해, 과도 출혈 및 혈전을 갖는 환자의 경향을 보완하기 위해 본 발명의 조성물 또는 방법을 변형시키는 것이 바람직할 수 있다는 것은 당업자가 인지할 것이다. 이들 상황하에서, 본 발명의 방법 또는 조성물을 증진시키거나 약화시키는 변형제를 사용할 수 있다. 이들 변형제의 사용은 출혈 또는 응고 에피소드를 최소화시킬 것으로 예상된다. 더욱이, 변형제를 사용함으로써 정상적인 상황(즉, 정상적인 지혈)항에서 본 발명에 따른 조성물의 투여를 조절할 수 있다.
조절제, 지연제 또는 본 발명의 방법 및 조성물을 감소시키는 제제의 사용을 정당화 할 수 있는, 예시적인 혈전유발 또는 응고유발 조건은 무엇보다 인자 VLeiden결핍, 항인지질 증후군(APS), 단백질 C 및/또는 단백질 S 및/또는 항트롬빈 III 결핍, 심정맥 혈전(DVT), 슈도-폰 빌레브란트 질환, 유형 IIb 폰 빌레브란트 질환, 말초 혈관 질환(PVD) 및 고혈압을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 증진제 또는 본 발명의 방법 또는 조성물을 증강시키는 제제의 사용을 정당화 할 수 있는, 출혈 위험성이 있는 예시적인 증상은 무엇보다 출혈 위험성이 있는 임의의 증상, 응고 인자 결핍, 혈우병, 혈소판감소증 및 항응고 치료를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 혈전 생성의 조절은 소정의 부위의 온도 변화, 소정의 부위에서 혈액 유동 속도의 변화 및 소정의 부위에서 혈압의 변화중 하나 이상을 포함한다.
상기 기재의 예로서, 당업자는, 혈관 폐색 과정의 개시 즉시, 관련 혈전 유발 조건을 역전시키거나 약화시키는 것이 필요할 수 있음을 인지할 것이다. 이러한 경우에, 혈소판 반응성을 감소시키는 제제의 투여가 혈관 폐색 개시제에 대한 반응을 감소시킨다. 당해 제제는 당업자에게 널리 공지되어 있고 아스피린 또는 아스피린 유사 화합물, 이부프로펜, 아세트아미노펜, 케토프로펜, 티클로피딘, 클로피도그렐, 인도메타신, 오메가-3 지방산, 프로스타사이클린, 산화질소, 산화질소의 유도인자, 산화질소 신타제의 유도인자, 매트릭스 메탈로프로테이나제억제제(MMPI, TIMP), 항-GPIb 제제, 항GPIIb/IIIa 제제, 항-αvβ 제제, 항-α2β1 제제, 항-CD36 제제, 아우린트리카복실산, 트롬빈 수용체 길항제, 트롬복산 수용체 길항제, 스트렙토키나제, 우로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
혈소판 폐색 과정을 증진시키거나 증대시키는 것이 바람직할 수 있는 예시적인 과정은 혈소판감소증(낮은 혈소판 함량) 환자를 포함한다. 이들 환자는 적합한 혈소판 재원을 제공하기 위해 혈소판 제품을 동시 또는 예비 투여(수혈)하여 혈소판 폐색을 성취하는 것이 이로울 것이다. 당업자는, 정상적인 혈소판 기능을 모방하거나 이의 기능과 유사한 모든 수혈 제품이 당해 상황하에서 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 당해 제제는 무작위 공여 혈소판, 분리반출 혈소판, 자가 혈소판, 세척된 혈소판, 혈소판 막 분획물, 냉각된 혈소판, 동결된 혈소판, 혈소판 막 성분을 함유하거나 발현하는 입자, 혈소판 대용물 및 전혈을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
추가의 예로서, 특이적 혈소판 기능 증진제를 사용하여 일단 치료 부위로 표적화된 초기 혈소판 반응성을 촉진시키거나 증진시킬 수 있다. 당업자에게 공지된 제제는 기존의 혈소판 반응성을 증진시키고/시키거나 비가역적 혈소판 부착을 촉진시키기에 충분한 혈소판 반응성을 제한하는 역치 및/또는 혈소판 탈과립 및/또는 혈소판/혈소판 결합 및/또는 기존 혈전에 대한 혈소판 부착을 저하시키는 것으로 입증되었다. 이들 제제는, 리스토세틴, 트롬빈, 헤파린 유도 혈소판감소증(HIT) 항체 또는 이의 일부, 항인지질 항체(APA) 또는 이의 일부, Fc 매개 기작을 통한온전한 항체 분자, 항리간드 유도된 결합 부위(항-LIBS) 항체 또는 이의 일부, 항-CD9 항체 또는 이의 일부, 에피네프린, 트롬빈 수용체 활성화 펩타이드(TRAP), PAR 효능제, 카텝신 G, 엘라스타제, 아라키도네이트, 트롬복산 A2(TxA2) 모사체, TxA2, 포스포리파제 A2(PLA2), 단백질 키나제 C(PKC)의 활성화제, 아데노신 디포스페이트(ADP), 콜라겐, 폰 빌레브란트 인자(VWF), 매트릭스 메탈로프로테이나제(MMP), 헤파린, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 이온수송체, 혈소판 마이크로입자, 혈소판 막 분획물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
종양, 과형성 조직, AV 기형, 동맥류 또는 내피누출을 포함하는 동물의 혈류에 일단 도입되면 고형상 제제는 표적 혈관계에 위치하게 되어 혈소판과 결합하거나 이를 고정화시켜 혈소판을 활성화시키며 이어서 활성화된 혈소판은 폐색이 형성될때까지 또 다른 혈소판을 활성화시킨다. 혈소판 활성화 및 결합은, 백혈구의 활성화된 혈소판으로의 결합을 촉진시켜 표적 혈관계의 폐색을 추가로 증진시킨다.
실시예 1
항원 세포 표면 마커에 대한 모노클로날 항체의 제조 기술은 매우 간단하고 문헌[참조: Kohler and Milstein(1975)]에 예시된 바와 같이 당업자에게 널리 공지된 기술을 사용하여 용이하게 수행될 수 있다. 일반적으로 말해서, 자극된 내피 세포를 사용한 모노클로날 항체의 제법은 하기의 과정을 포함한다. 사람 종양 기원으로부터 유래하는 세포 또는 세포주를 4일 이상동안 조직 배양으로 성장시킨다. 조직 배양 상등액("종양 조건화된 배지")을 종양 세포 배양물로부터 분리하고 최종농도 50%(v/v)로 사람 제대 정맥 내피 세포(HUVEC)의 배양물에 첨가한다. 2일 배양한 후, 비효소적으로 HUVEC를 수거하고 1 내지 2 x 106개 세포를 마우의 복강내로 주사한다. 당해 과정을 2주 간격으로 3회 반복하고 최종적으로 정맥내 경로로 면역화시킨다. 3일 후에, 비장 세포를 수거하고 표준 프로토콜(문헌참조: Kohler and Milstein, 1975)을 사용하여 SP2/0 골수종 세포와 융합시킨다. 적당한 반응성을 갖는 항체를 생성하는 하이브리도마를 제한 희석법에 의해 클로닝한다.
결과적으로 수거된 하이브리도마로부터, 비활성화된 혈관 내피를 인지하는 것 보다 훨씬 크게 활성화된 혈관 내피를 인지하는 항체를 생산하는 하나 이상의 하이브리도마를 선별한다. 궁극적인 목표는 실질적으로 정상적인 내피에 대해서는 결합 친화성을 갖지 않는 항체를 동정하는 것이다. 적합한 항체 생산 하이브리도마는 예를 들어, ELISA, RIA, IRMA, IEF 또는 유사한 면역분석을 사용하여 하나 이상의 종양 활성화된 내피 세포 유형에 대해 스크리닝함으로써 동정한다. 하나의 후보물질을 동정하고 비활성화된 또는 "정상적인" 내피 또는 기타 정상 조직 또는 세포 유형에 대한 반응성이 없는지를 시험한다. 이러한 방식으로, 고려된 특정 적용에서, 바람직하지 않게 고수준의 정상적인 교차 반응성을 갖는 항체를 생산하는 하이브리도마는 배제될 수 있다.
실시예 2
리간드/수용체 복합체, 특히, 성장 인자/성장 인자 수용체 복합체를 특이적으로 인지하는 단일 사슬 항체의 제조 기술을 사용하여 수득한 항체 분자는 성장인자/성장 인자 수용체 복합체를 인지하지만 단독의 성장 인자 또는 성장 인자 수용체에는 결합하지 않는다. 이들 항체는, VEGF 및 VEGF 수용체와 같은 정제된 리간드 및 수용체의 복합체로 마우스를 면역화시켜 형성될 수 있고 수득한 V 유전자를 사용하여 필라멘트형 파아지내 항체 라이브러리를 작제한다. 항체 단편의 파아지 디스플레이를 사용하여 활성화된 내피 세포 항원, 특히, 리간드/수용체 복합체에 대한 재조합 항체 분자를 제조할 수 있다. 파아지 시스템은 척추동물 면역 시스템을 모방한다.
암컷 BALB/c 마우스는, Quil A와 같은 보조제의 존재하에 복합체로서 HPLC 정제된 재조합 VEGF 및 VEGF 수용체(예를 들어, 가용성 VEGF/FLT-1 수용체 또는 VEGF/KDR 수용체)로 면역화시킨다. 적절한 항체 역가에 도달한 후(일반적으로 4번째 부스트 후)에 마우스를 희생시키고 비장을 분리한다. 전령 RNA(mRNA)는 비장으로부터 분리하고 cDNA로 전사시킨다. cDNA의 V 유전자를 증폭시키고 "단일 사슬 Fv"(scFv)로서 어셈블리한다. 적절한 제한 효소로 분해시킨 후, scFv를 파아지미드 벡터에 연결한다. 컴피턴트 이. 콜리 세포를 이어서 이들 파아지미드 라이브러리로 형질전환시키고 헬퍼 파아지(예를 들어, M13K07, Pharmacia)를 감염시킨 후, scFv를 나타내는 파아지 입자를 제조한다. 리간드/수용체 복합체에는 결합하지만 단독의 리간드 또는 수용체에는 결합하지 않는 가용성 scFv를 발현하는 선택된 클론을 스크리닝한다. 표준 ELISA 기술을 사용하여 스크리닝하고 이때, 리간드/수용체 복합체, 리간드 및 수용체를 각각 고형상 항원으로서 사용한다.
실시예 3
본 발명의 이러한 양태를 실시하기 위해 현존하거나 유도성인 표적물로서 사용될 수 있는 다양한 내피 세포 마커가 공지되어 있고 이것은 VEGF/VPF(혈관 내피 성장 인자/혈관 투과성 인자), 내피-백혈구 접착 분자(ECAM-1; Bevilacqua et al., 1987); 혈관 세포 접착 분자-1(VCAM-1; Dustin et al; 1986) 세포내 접착 분자-1(ICAM-1; Osborn et al., 1989); 제제 백혈구 접착 분자-1(LAM-1 제제) 또는 심지어, 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 II 항원[예를들어, HLA-DR, HLA-DP 또는 HLA-DQ(Collins et al., 1984)]을 포함한다. 이들중에서, VEGF/VEGF 수용체 복합체의 표적화가 바람직할 수 있다. 상기 내피 세포 항원을 인지하는 모노클로날 항체 또는 특이적 펩타이드는 VWF로 코팅된 입자와 같은 고형상 제제에 결합할 수 있고 카테터 또는 유사한 전달 장치에 의해 표적 혈관계로 전달될 수 있다. 이로써 입자는 표적 혈관계내 내피 세포에 결합하여 입자상에 혈소판 결합 및 활성화를 유도하고 이어서 입자상에 혈소판을 응집시켜 결국 혈전을 형성한다. 형성된 혈전은 표적화된 혈관계를 폐색시켜 하류 조직으로의 산소 및 영양물의 공급을 차단한다.
실시예 4
고형상 제제상에 고정화된 VWF와의 상호작용을 통해 혈소판을 직접 고형상 제제에 결합시켜 혈소판을 특정 부위로 표적화할 수 있다. 예를 들어, 직경이 약 1㎛ 내지 5mm인 입자상에 재조합 및/또는 사람 및/또는 돼지 VWF를 카테터와 같은 다양한 수단으로 표적 부위로 전달할 수 있다. 혈소판 결합은, VWF 입자가 표적 혈관계로 전달된 후 일어나고 이로써 혈류중에 이동하는 혈소판이 입자와 접촉되고 입자와 결합하여 입자상에 분포하게 되고 또 다른 혈소판과 결합하여 이를 활성화시키고 궁극적으로 혈전을 형성하여 혈관을 폐색시키게 된다. VWF 입자와 결합하는 혈소판은 또한 생체외에서 개시될 수 있고 이로써 혈소판은 체외 혈관에서 입자와 접촉하고 이어서 카테터 또는 유사한 제제 전달 장치에 의해 표적 부위로 전달된다. 입자와 혈소판의 반응이 개시된 즉시(즉, 입자와 결합하는 혈소판), 크기 한계 또는 입자 결합된 혈소판 및/또는 결합된 응고 단백질이 혈관 벽 수용체와 상호작용하기 때문에 입자가 모세관 망을 통과될 수 없도록 입자 크기를 선별한다. 따라서, VWF 입자 크기는 약 1㎛ 내지 약 5㎛의 직경 범위를 가질 수 있다. 가장 바람직하게, 입자의 직경 범위는 5㎛ 내지 2mm이다. 심지어 보다 바람직한 입자의 직경은 20㎛ 내지 300㎛이다.
실시예 5 - 입자
다양한 조성물의 입자는 본 발명의 목적을 위해 고형상 제제로서 사용할 수 있다. 혈소판과 결합하는 능력에 대해 하기의 입자를 시험하였다. 폴리스티렌 미소구체는 제조원[Polysciences Inc.,(Warrington, PA)]으로부터 구입하였고 수동적 접착 과정(0.2M 카보네이트 완충액(pH 9.0 내지 9.6)중에서 인큐베이션)을 통해 또는 카보디이미드 또는 글루타르알데하이드로 유도체화된 비드로의 공유결합을 통해 사람 폰 빌레브란트 인자로 코팅한다. 여러 유형의 비드를 시험하였고 이것은 평평한 폴리스티렌 미소구체(cat. #07310, 17134, 17135, 07312, 07313, 07314), 폴리비드 아미노 미소구체(cat. # 19188), 폴리비드 카복실레이트 미소구체(cat. #17141), 플루오레스브리트 미소구체(cat. #17155, 17156), 폴리스티렌 염색된 미소구체(cat. #15715, 15714, 15716) 및 상자성 입자(cat. # 19829)를 포함한다.모든 비드는 폰 빌레브란트 인자에 결합하고 후속 시험에서 이는 혈소판과 결합한다. 당해 비드로의 혈소판 결합은 응집 계측기 및 상 대조 현미경으로 확인한다.
시험된 기타 입자는 폴리비닐 알코올(PVA) 입자[제조원(Cook, Bloomington, Indiana)] 및 거대 응집 알부민(MAA) 입자[제조원(Edmonton Radiopharmaceutical Centre, Edmonton, Alberta, Canada]를 포함한다. 별도의 실험에서, 폰 빌레브란트 입자는 수동적으로(상기된 바와 같은 카보네이트 완충액) 및 공유적으로(상기된 바와 같이, 글루타르알데하이드 연결) 입자에 결합시킨다. 혈소판의 입자로의 결합은 이어서 응집 계측기, 상 대조 현미경 및 형광 현미경(FITC로 표지된 항CD61 항체)을 사용하여 확인한다.
실시예 6 - 포유동물 VWF의 비교
돼지 VWF, 소 VWF 및 사람 VWF는 2개의 방법을 사용하여 폴리스티렌 입자상에 고정화시킨다. 제1 방법(직접 결합)은 0.2M 카보네이트(pH 9.35)의 존재하에 물질을 고형상 입자에 수동적으로 흡착시키는 것이다. 제2 방법(간접 결합)은 고형상 입자의 표면상에 고정화된 항VWF 항체를 사용하여, 돼지, 소과동물 및 사람 혈장으로부터 각각의 VWF를 분리하는 것으로 이루어진다. 후자의 방법에서, 사용되는 항체(래빗 공급원)는 제조원[Dako(Mississauga, Ontario; cat. # A0082)]으로부터 구입하였고 제조업자에 의해 제공된 정보에 따라 사람, 소과동물 및 돼지 폰 빌레브란트 인자에 결합하는지를 확인하였다. 당해 항체를, 카보네이트 완충액(0.2M, pH 9.35)중에서 수동적 흡착에 의해 폴리스티렌 비드(직경 4.5㎛)에 부착시키고 실온에서 60분동안 각각의 공급 혈장으로 인큐베이션시킨다. 비드를세척하여 결합되지 않은 단백질을 제거하고 비드를 사용하여 사람 및 돼지 기원의 전혈 및 혈소판 풍부 혈장을 투여한다. 유사한 방식으로, 사람, 돼지 및 소과동물 VWF를 각각 상기된 바와 같이 수동적 흡착에 의해 비드에 직접 결합시키고 이를 사용하여 사람 및 돼지 혈소판(전혈 및 혈소판 풍부 혈장[PRP])을 투여한다. 몇몇 실험에서, 돼지 및 사람 PRP를 함께 혼합하고 다양한 제제와 함께 투여한다(하기 참조).
고정화된 VWF VWF 공급원 전혈 PRP 50:50 PRP (인간:돼지)
직접 Ab 포획
- 인간 인간++++돼지 + 인간++++돼지+ +++++
- 인간 인간++++돼지 + 인간++++돼지+ +++++
- 돼지 인간+++++돼지+++ 인간+++++돼지+++ +++++
- 돼지 인간+++++돼지+++ 인간+++++돼지+++ +++++
- 소과동물 인간 +돼지 + 인간 +돼지 + +
소과동물 인간 +돼지 + 인간 +돼지+ +
+ 약한 혈소판 반응, ++ 적당히 약한 혈소판 반응, +++ 적당한 혈소판 반응, ++++ 강한 혈소판 반응, +++++ 매우 강한 혈소판 반응.
실시예 7 - 백혈구 상호작용
돼지 또는 사람 VWF와 결합된 입자는 특징적으로 혈액 공급원에 따라 사람또는 돼지 혈소판에 결합한다. 추가로, 단핵구, 과립구 및 림프구를 포함하는 백혈구는 입자에 결합된 혈소판과 상호작용하는 것으로 관찰되었다(차동 염색 및 현미경 조사에 의해 확인됨).
표적 부위에서 혈소판 활성화는 표적 조직의 감소 또는 사멸을 증진시킬 수 있는 2차 효과를 유도한다. 혈소판 인자 4(PF4)와 같은 활성화된 혈소판에 의한 제제의 방출은 혈관형성을 억제한다. 활성화 후 RNATES와 같은 화학유인제의 혈소판 방출은 표적 조직상에서 백혈구(예를 들어, 호산구, 단핵구)의 효과를 증진시킨다. 활성화 후, 혈소판에 의해 과립 성분(예를 들어, CD62)의 발현은 단핵구 및 다형핵 백혈구(PMN)의 결합을 유도하여 조직 인자 발현(단핵구, 응고촉진제) 및 세포 활성화 및 세포 공격(PMN)을 초래한다. 추가로, 표적 부위에서 활성화된 혈소판에 의한 CD40 리간드(CD40L)의 방출은 단핵구에 의한 조직 인자 발현을 유도하여 국소 과응고 상태를 초래한다.
실시예 8
고형상 제제는 또한 코일 또는 스텐트의 형태를 취할 수 있다. 재조합 또는 포유동물 기원의 VWF는 이들 고형상 제제에 결합할 수 있고 수술 및/또는 카테터를 포함하는 다양한 수단으로 표적 혈관계에 전달될 수 있다. 동맥류와 같은 표적 부위에는 특정 카테터 및 결합된 가이드 와이어를 사용하여 혈류를 통해 도달할 수 있다. 가이드 와이어는 대퇴동맥과 같은 진입부를 통해 부드럽게 주요 혈관을 통해 표적 부위로 밀어 넣어 혈관계로 도입시킬 수 있다. 카테터는 가이드 와이어를 따라 표적 부위로 도입하고 이 즉시, 가이드 와이어를 제거한다. 고형상 혈소판결합 코일을 이어서 카테터 내강으로 밀어 넣어 동맥류에 배치시킨다. 코일에 결합한 VWF는 혈류중에서 이동하는 혈소판에 특이적으로 결합한다. 혈소판은 활성화되고 코일 근처에 신속하게 축적됨으로써 국소 정체된 혈전을 형성하여 동맥류가 붕괴되는 위험성을 감소시킨다.
실시예 9 - 돼지 모델에서 입자 고정화된 VWF의 급성 효과
돼지 신장의 혈관계에서 혈전 형성을 유도하는, 사람 VWF로 코팅된 입자의 효능을 평가하기 위한 연구를 디자인한다. 당해 방법에서, 신장 동맥에 20 내지 22 게이지의 혈관 카테터를 투입한다. 신장 혈관을 수술하여 노출시키고 도플러 유동 탐침을 신장 혈관에 부착시켜 표적 기관 내부 및 외부로 이동하는 혈액을 모니터한다. 신장 동맥 및 정맥으로부터 판독된 이동간에 뚜렷한 차이가 없다. 따라서, 추가로 신장 정맥으로부터의 모든 판독은 혈액이 표적 신장을 통해 이동한다는 것을 암시한다. 사람 VWF는 글루타르알데하이드와 밤새 인큐베이션시켜 사람 MAA에 공유적으로 결합시킨다. 단백질 중양을 기준으로, MAA에 결합되는 VWF의 양을 다양화한 이전의 적정 연구는 1:5 내지 1:80(MAA:VWF)의 비율이 충분히 고정화된 VWF를 제공하여 혈소판 결합 및 활성화를 유도한다는 것을 밝혀내었다. 이를 근거로, 생체내 연구를 위해 1:20(MAA:VWF)의 비율을 선택한다. 상 대조 현미경에 의한 입자 분석은 최종 제제에서 입자 크기의 범위가 30㎛ 내지 250㎛(마이크로미터/혈구계측단위를 사용하여 광학 현미경에 의해 평가된 바와 같음)임을 입증하였다.
MAA/VWF(500㎕ 또는 1ml)에 이어서 사람 PRP(약 200 내지 400 x 106혈소판을 함유하는 500㎕)를 돼지의 신장 동맥에 주사하여 혈류를 급격하게 감소시킨다. 사람 혈소판은 시험 제제 후에, 가능한한 유사하게 사람의 증상을 모방하기 위해 투여한다. 추가로, 돼지 혈소판의 사람 VWF로의 결합이 매우 약한 것으로 판명되었다(상기 실시예 6 참조). 시험 제제를 주사한지 10분이내에 혈류는 기본 수준의 절반 미만으로 감소한다. 시험 제제를 주사한지 15분 이내에 혈류는 기본 수준의 20% 미만으로 감소한다. 기관으로의 혈류는 90분의 모니터링 시간동안에 증가하지 않았다.
역으로, 반대 측면 신장의 신장 동맥으로 주사된 대조 제제(단독의 MAA; 동일한 단백질 농도)는 혈류를 일시적으로 감소시킴을 보여주었다. 혈류는 초기에 50%까지 감소하였지만 신속하게 기본 수준에 인접하게 회복되는데 즉 15분 이내에 본래의 혈류 80% 이상 및 30분 이내에 본래의 혈류 90% 이상으로 회복된다.
표적 혈관계의 조직학적 검사는 시험 기관에서 신장 동맥에 인접한 가지에 큰 혈전이 생성됨을 밝혔으며 대조 신장에서의 신장 혈관계의 혈전은 미약하였다. 대조표준 또는 시험 동물의 간, 폐, 비장, 뇌, 심장 및 안구에서는 어떠한 혈전도 나타나지 않았다.
실시예 10 - 돼지 모델에서 입자 고정화된 VWF의 만성 효과
실시예 9에 명시된 과정과 유사한 방식으로, 2개의 시험 및 2개의 대조 돼지의 신장 동맥에 20 내지 22 게이지의 혈관 카테터를 투입한다. 도플러 유동 프로브를 수술적으로 각각의 동물의 신장 정맥상에 위치시키고 처음 절개 부위를 봉합한 후 가이드 와이어를 동물의 외곽 표피에 노출시킨다. 신장 환부를 통해 이동하는 혈액에 대한 기준선을 설정한 후, 1ml의 MAA:VWF 입자(11mg의 총 단백질)에 이어서 1ml의 사람 혈소판 풍부 혈장(약 460 x 106개의 혈소판(리터 당 혈소판 수 458 x 109개)을 시험 동물의 신장 동맥에 주사하고 동일한 양의 MAA를 대조 동물에 주사한다. 동물을 신진대사용 나무 상자에 옮기고 7일 동안 다양한 시간 간격으로 모니터한다. 하기의 표는 이들 연구로부터 혈액 이동 결과를 제공한다.
돼지 도플러 혈류 (분 당 밀리미터)
일 시험 1 대조표준 1 시험 2 대조표준 2
0 28 70 35 35
1 17 15 11 103
2 32 24 15 71
3 3 109 16 85
4 3 101 17 78
5 3 140 3 65
6 1 140 0 55
7 3 148 2 30
혈전 및 기타 치료 관련 손상을 입증하기 위해 대조표준 및 시험 동물의 주요 기관 및 조직을 조직학적으로 검사한다. 표적 신장의 신장 혈관계를 제외하고는 어떠한 혈전도 관찰되지 않았다.
실시예 11 - 나트륨 퍼테크네테이트 Tc 99m을 사용한 MAA/VWF의 표지화
MAA/VWF 입자는, 글루타르알데하이드(0.0625% v/v, 최종)를 사용하여 사람 VWF[제조원(Alphanate, Alpha Therapeutics Corp)]를 MAA 입자[11mg의 단백질; 주사용 MAA, 제조원(Edmonton Radiopharmaceutical Centre)]에 컨쥬게이션시켜 제조한다. 단백질 비율의 범위는 40:1 내지 20:1(MAA:VWF)이다. 입자의 기능은, 건강한 비치료된(2주 이상) 지원자로부터 유래하는 시트레이트화된 혈소판 풍부 혈장 및 시트레이트화된 전혈을 MAA/VWF 입자와 함께 투입하고(10㎕ 입자 + 100㎕ 혈소판 공급원) 10분동안 500rpm에서 교반시키면서 조사하였다. 상 대조 현미경에 의한 반응의 관찰은 혈소판과 결합하고 이를 활성화시켜 대형 혈소판 및 MAA/VWF 입자 매쓰를 형성하는 입자의 능력을 확인시켜 주었다.
그 후, MAA/VWF 입자를 활성 범위가 88MBq 내지 300MBq인 나트륨 퍼테크네테이트 Tc 99m를 사용하여 표지시켰다. 식염수중의 입자 및 나트륨 퍼테크네테이트 Tc 99m의 동일 용적을 실온에서 10분동안 인큐베이션시켰다. 박층 크로마토그래피를 사용하여 표지 효율을 결정하고 95%를 초과하는 것으로 밝혀졌다.
이어서 입자의 기능에 대한 표지의 효과를 평가하기 위해, Tc 99m 표지된 MAA/VWF 입자를 시험한다. 상 대조 현미경은 Tc 99m 표지된 MAA/VWF 입자가 혈소판과 결합할 수 있고 이를 활성화시킬 수 있음을 확인시켜 주었다. 표지된 입자의 어떠한 기능 활성의 감소는 관찰되지 않았다.
실시예 12 - 돼지 신장 혈관계의 MAA/VWF 혈전에 대한 투시경 연구
대퇴동맥 근접법을 사용하여 MAA/VWF를 신장 혈관계에 전달한다. 일반적인 마취(할로탄)후에 5-Fr 시스 (sheath) 카테터를 18 내지 22kg의 어린 돼지의 대퇴동맥에 삽입하고 투시경으로 왼쪽 신장 동맥에 위치시킨다. 조영 염료의 전달시에, 단지 신장 혈관계의 하부 말단만이 가시화되도록 카테터를 위치시킨다. 0시간째에, 1ml의 MAA/VWF 입자(크기 범위 30 내지 250 마이크론)를 서서히 신장 혈관계에 전달한다. 10초 후에, 1ml의 사람 PRP(420 x 109/ℓ)를 전달하고 카테터를 1ml의 식염수로 세척한다. 카테터를 고정시키고 20분의 대기 시간 후에 제제를 다시 표적 혈관계에 전달한다. 대조 제제가 카테터의 말단에 모여 신속하게 신장의 상부 말단의 혈관계로 이동하는 것이 관찰되었다. 신장의 하부 말단의 혈관계에는 확산되지 않는 대조 제제가 서서히 축적되고(20분 초과) 상부 말단 혈관계에는 신속하게 대조 제제가 상실된다(5초 미만). 마취된 동물과 여전히 제위치에 있는 카테터와 함께, 신장 환부를 수술적으로 절개하고 카테터에 바로 인접한 신장 혈관계를 클램프하고 신장 환부를 제거한다. 세포축 방향의 절개 및 신장 쪽으로 절개하여 신장 동맥을 개방한다. 신장의 하부 말단의 혈관계내에 깊게 연장된 카테터의 말단으로부터 멀리 떨어진 위치에서 거대한 혈전이 나타난다. 신장의 상부 말단의 혈관계내에 어떠한 응고가 나타나지 않는다. 추가로, 환부 신장의 하부 말단은 뚜렷하게 분지되어 있는(이것은 혈액 부동을 암시한다) 반면에, 신장의 상부 말단은 정상적인 적색을 나타낸다.
상기된 과정 후 별도의 실험에서, 카테터를 표적 신장의 하부 말단의 혈관계로 이동시키고 이를 사용하여 1ml의 MAA/VWF 입자에 이어서 1ml의 사람 PRP를 전달한다. 20분 후에, 투시경에 의해 결정되는 바와 같이, 신장의 하부 말단으로의 혈액 이동이 명백히 차단된다. 이전과 같이, 조영 염료는 카테터의 말단에 모인 후에 상부 말단의 혈관계로 신속하게 이동한다. 이어서, 카테터를 재위치시키고 MAA/VWF 이어서 사람 PRP를 상부 말단의 혈관계에 전달한다. 20분 대시 시간 후에, 조영 염료를 다시 주입한다. 투시경은 상부 말단의 혈관계로의 혈류가 차단됨을 보여준다. 조영 염료는 하부 말단의 혈관계로 진입하지 않았다. 이어서 관련 신장 혈관을 갖는 표적 신장을, 동물의 희생 전에 수술적으로 제거한다. 신장을 즉시 절개한 결과, 신장의 상부 및 하부 말단 둘 모두에 혈관의 광범위한 혈전증이 나타났다.
본 발명은 특정 바람직한 양태 측면에서 기재되었지만, 이들 양태로 제한되지 않는다. 여전히 본 발명에 의해 포함되는 또 다른 양태, 실시예 및 변형이, 특히 이전에 기재된 교시를 통하여 당업자에 의해 수행될 수 있다.

Claims (34)

  1. 고형상 제제상에 또는 고형상 제제내에 고정화된 혈소판 결합제에 혈소판을 결합시켜 혈소판을 포획하고,
    혈소판의 활성화를 유도하고,
    혈전을 형성시키는 것을 포함하여 생체내에서 혈소판과 결합한 후에 혈전을 유도할 수 있는 결합제를 포함하는 고형상 제제를, 혈관 종양 또는 과형성 조직을 갖는 포유동물에게 투여하는 것을 포함하여, 혈관 종양 또는 과형성 조직을 치료하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 고형상 제제가 입자인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 고형상 제제가 코일인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 고형상 제제가 스텐트 (stent)인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 혈소판 결합제가 재조합 VWF인 방법.
  6. 제1항에 있어서, 혈소판 결합제가 포유동물 VWF인 방법.
  7. 제6항에 있어서, VWF가 사람 기원인 방법.
  8. 제6항에 있어서, VWF가 돼지 기원인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 고형상 제제가 표적화 잔기를 포함하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 표적화 잔기가 표적 혈관계상의 항원(들)로 지향되는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 고형상 제제가 비오틴 또는 아비딘 또는 이의 모사체 또는 유도체를 포함하는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 고형상 제제가, 혈소판과 결합할 수 있는 혈소판 특이적 성분을 포함하는 방법.
  13. 제12항에 있어서, 혈소판 특이적 성분이 폰 빌레브란트 인자, 오스테오폰틴, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 라미닌, 헤파린, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 포스포리파제 A2, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 트롬빈, 유리, 시알릴-루이스 X, 피불린-1, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, p-셀렉틴 리간드, MAC-1, LFA-1, 상기 성분 중 어느 하나의 일부 및 상기 성분 중 어느 하나의 천연 또는 합성 기능적 등가물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 방법.
  14. 제13항에 있어서, 열거된 성분이, 단독으로 또는 배합되어, 비오틴 모사체, 펩타이드, 사람 Fc 단편과 같은 잔기에 컨쥬게이션되거나 이러한 잔기를 함유하는 방법.
  15. 혈소판 특이적 성분을 포함하는 고형상 제제를 포함하여 생체내에서 혈전 형성을 유도하기 위한 조성물로서, 표적 혈관계로 전달되는 경우, 혈소판 결합 성분이 혈소판을 고형상 제제상에 결합시키고 혈소판의 활성화를 유도하여 혈전을 형성시키는 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 고형상 제제가 입자인 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 입자가 미소구체인 조성물.
  18. 제16항에 있어서, 입자가 거대 응집 알부민인 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 입자 크기가 약 5 내지 약 500마이크론인 조성물.
  20. 제18항에 있어서, 입자 크기가 약 30 내지 약 150마이크론인 조성물.
  21. 제15항에 있어서, 고형상 제제가 코일인 조성물.
  22. 제15항에 있어서, 고형상 제제가 스텐트인 조성물.
  23. 제15항에 있어서, 혈소판 특이적 성분이 폰 빌레브란트 인자, 오스테오폰틴, 피브리노겐, 피브린, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 콜라겐, 트롬보스폰딘, 라미닌, 헤파린, 헤파란 설페이트, 콘드로이틴 설페이트, 포스포리파제 A2, 매트릭스 메탈로프로테이나제, 트롬빈, 유리, 시알릴-루이스 X, 피불린-1, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, p-셀렉틴 리간드, MAC-1, LFA-1, 상기 성분 중 어느 하나의 일부 및 상기 성분 중 어느 하나의 천연 또는 합성 기능적 등가물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 포함하는 조성물.
  24. 제15항에 있어서, 혈소판 특이적 성분이 재조합 VWF인 조성물.
  25. 제15항에 있어서, 혈소판 특이적 성분이 포유동물 VWF인 조성물.
  26. 제15항에 있어서, 혈소판 특이적 성분이 사람 기원인 조성물.
  27. 제15항에 있어서, 혈소판 특이적 성분이 돼지 기원인 조성물.
  28. 제15항에 있어서, 고형상 제제가 표적화 잔기를 함유하는 조성물.
  29. 제15항에 있어서, 표적화 잔기가 표적 혈관계상의 하나 이상의 항원으로 지향되는 조성물.
  30. 제15항에 있어서, 고형상 제제가, 혈소판을 고형상 제제로 결합시키는 리간드를 추가로 포함하는 조성물.
  31. 제15항에 있어서, 고형상 제제가 나트륨 퍼테크네테이트 Tc 99m으로 방사선 표지된 조성물.
  32. 고형상 제제를 리간드/수용체 복합체에는 결합시키지만 단독의 리간드 또는 수용체에는 결합시키지 않는 결합 영역을 포함하는 제1 결합 성분 및 혈소판에 대한 결합 영역을 포함하는 제2 결합 성분을 갖는 고형상 혈소판 결합제를 포함하는, 혈전 형성을 유도하기 위한 조성물.
  33. 결합 성분을 소정의 부위상의 에피토프에 결합시키는 결합 영역을 포함하는 제1 결합 성분 및 혈소판에 대한 결합 영역을 포함하는 제2 결합 성분을 갖는 고형상 제제를 포함하는, 혈전 형성을 유도하기 위한 조성물.
  34. 고형상 제제, 및 혈소판과 결합하는 결합제; 혈소판 특이적 성분을 갖는 고형상 제제; 결합제와 결합하는 리간드; 리간드 컨쥬게이트; 리간드 또는 리간드 컨쥬게이트와 결합하는 항리간드; 혈소판 결합 증진제; 혈전 형성 조정제; 보체 캐스케이드 (cascade) 성분; 보체 캐스케이드 성분 유도인자; 및 항리간드를 포함하는 혈소판에 결합하는 결합제; 방사선핵종; 조영제, 및 이들의 배합물중 하나 이상을 포함하는, 생체내에서 혈전 형성을 유도하기 위한 키트.
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