KR20040062946A - 세포를 포함하는 주사가능한 칼슘염 골충전제 - Google Patents

Abstract

본 발명은 칼슘 염 입자, 칼슘염에 친화력이 있는 유기 결합제, 줄기세포, 골형성세포(osteogenic cells) 및 골조상세포(osteoprogenitor cells)의 그룹에서 선택된 세포 및 약학적 허용가능한 완충액을 포함하는 골 충전제에 관한 것이다. 본 발명의 골 충전제의 큰 장점은 주사기 바늘을 통해 골 결손부위에 주입할 수 있는 주사가능한 포뮬레이션이라는 것이다.

Description

세포를 포함하는 주사가능한 칼슘염 골충전제{INJECTABLE CALCIUM SALT BONE FILLER COMPRISING CELLS}

재생 외과 의사에게 있어서 골결손의 성공적인 종결이 핵심 과제로 남아있다. 골결손은 종양에 두번째로 자주 발생하는 반면, 선천성 장애, 신생물 및 감염으로부터 일어날 수 있다. 자생 세포, 동종 조직 및 보형물을 포함하는 골결손을 치료하는데 다양한 물질들이 사용되어져 왔다. 이러한 다양한 접근법은 특히 상당한 크기의 결손에서, 골보전(bone integrity)을 치료하기 위한 최적의 방법이 없음을 증명한다.

재생 외과의사는 골결손의 치료를 위한 적합한 물질의 선택외에도, 접근 가능성의 문제에도 직면하였다. 골결손의 위치는 통상적으로 환자의 골구조에서 인체 내부에 있기 때문에, 결손 부분에 재생 물질을 삽입가능하게 하기 위해서 종종 환자에게 외상을 일으키거나 불쾌함을 야기하는, 상당한 상처를 주어야 한다.

골결손을 치료하는데 사용되는 통상의 구조물(constructs)은, 살아있는 골조직의 지지 작업을 수행할 수 있어야 하기 때문에, 단단한, 경직 구조를 갖는다. 또한, 완전한 결손은 외과 수술로 치료하는 것이 바람직하기 때문에, 이들은 골 결손 크기에 의존한다. 따라서, 치료하여야 하는 결손 면적이 클 수록, 결손 부위에 구조물을 삽입가능하게 하기 위한 손상 개구부(opening of the wound)도 더 크다.

이러한 환경에서, 작은 손상 개구부를 통해 환자의 인체로 구조물을 삽입할 수 있는 유연성을 지닌 골조직 치료 기능에 적합한 물질이 필요하지만, 골조직의 지지 기능을 도울 수 있는 이러한 기계적 특성을 지니지 않고도, 결국 실제 골조직으로 전환되는 것이 바람직하다.

미국 특허 제 6,129,761호는 히알루론산을 기재로하는 하이드로겔, 합성 변형된 알기네이트 또는 하이드로겔을 형성할 수 있는 또 다른 교차 결합 가능한 폴리머를 포함하는 주사가능한 하이드로겔 조성물 및 골세포, 근육 세포, 섬유아세포 또는 기관(organ) 세포와 같은 분리세포들을 개시한다.

국제 특허 출원 제 95/21634호는 지지조직, 치아 물질(tooth substance), 뼈조직 또는 오스테오아티큘러(osteoarticular) 조직의 재흡수/대용(substitution)을 위한 생체 적합물질을 개시한다. 상기 조성물은 주사가능하고, 칼슘 포스페이트 입자의 무기상 및 셀룰로스-유도 폴리머 수용액을 포함한다. 칼슘 포스페이트 입자는 20/80-70/30의 비율의 트리칼슘 포스페이트β와 히드록시아파티트의 혼합물 또는 칼슘-티타늄-포스페이트가 되어야 한다.

미국 특허 제 6,287,341호는 두개의 칼슘 포스포네이트를 생리액(physiological liquid)과 혼합하여, 골결손에 적용하여 임플란트 부위에 경질화 시키는 페이스트 또는 퍼티를 제공함으로써 골결손을 치료하는 방법을 개시한다. 상기 경질화(hardening)는 두개의 칼슘 포스페이트간의 반응의 결과로서 일어난다. 상기 페이스트 또는 퍼티는 골아세포(osteoblasts), 파골세포(osteoclasts), 연골세포(chondrocytes), 골세포(osteocytes) 또는 섬유모세포(fibroblasts)와 같은 살아있는 세포를 포함할 수 있음을 언급하고 있다. 그러나 이들 세포들은 페이스트 또는 퍼티를 경질화하는 동안의 혹독한 상태를 견딜 수 있을거라 생각되지 않는다.

국제 특허 출원 제 00/07639호는 골전구체 조성물을 개시한다. 골결손 부위내로 주사하기에 적합한 것으로 칼슘 시멘트가 언급된다. 상기 시멘트는 모노베이직 칼슘 포스페이트 모노하이드레이트 및 β-트리칼슘 포스페이트를 기재로 하며, 추가로 바이오폴리머 폼(foam), 콜라겐, 세포외부 기질 성분, 치료제, 바이오폴리머 섬유, 또는 살아있는 세포를 포함할 수 있다. 주사 후, 칼슘 시멘트를 경화(setting)시켜야 하는데, 이것은 주변에 존재하는 살아있는 세포에 해를 미칠 수 있다.

본 발명은 재생술(reconstructive surgery) 분야에 관한 것으로서, 특히 환자의 골결손(osseous defects) 치료에 관한 것이다.

본 발명의 목적은 조직 재생(tissue repair)을 위해 사용할 수 있는, 세포를 포함하는 골충전제를 제공하기 위한 것이며, 여기서, 세포 손상 위험(예컨대, 칼슘 포스포네이트 상 제공으로 인해)은 실질적으로 없어진다. 목적 골충전제는 무균상태하에서 주사기 바늘을 통해 환자의 골결손 부위에 주사하고 용이하게 진행 될 수 있는 이러한 특성들을 지녀야 한다. 추가로, 예컨대 주사기를 통해 주사하는데 있어서, 상기 세포들을 실질적으로 손상시키지 않아야 한다는 것도 요구된다. 본 발명의 그밖의 목적과 장점은 이하 상세한 설명으로부터 명백해 질 것이다.

본 발명에 따라, 칼슘 염 입자, 칼슘염에 친화력이 있는 유기 결합제, 줄기세포, 골유도세포(osteogenic cells) 및 골조상세포(osteoprogenitor cells)의 그룹에서 선택된 세포 및 약학적 허용가능한 완충액을 포함하는 주사가능한 골충전제를 제공한다.

본 발명의 골충전제는 주사가능하며, 이는 주사(injection)를 통해 골결손부위에 투여할 수 있다는 것을 의미한다. 이러한 목적을 위해서는, 주사기를 사용하는 것이 바람직하다. 상기 골충전제는 매우 유연하기 때문에 주사기 바늘을 통해 통과할 수 있다. 이로 인해, 원하는 부위에 충전제를 주입하는데 단지, 매우 작은 상처만을 내도 된다는 큰 장점이 있으며, 이에 따라 환자는 상당한 불편과 가능한 외상을 겪지 않아도 된다.

또한, 골충전제중 칼슘 염 입자의 존재는 처음부터 생체내에서 골형성을 가능하게 한다. 결과로서, 상기 충전제는 최후로 자가 이식한 골 조직으로 전환되고 초기 단계에 골의 지지 작용을 도울 수 있다. 또한, 칼슘 염 입자들은 추가 칼슘 염이 부착된 생체내에서 시딩 크리스탈(seeding crystals)의 종류로서 작용할 수 있다는 것을 발견하였다. 따라서, 골충전제는 이식후 바로 경질화되어 적절한 강도를 제공한다.

놀랍게도, 또한, 실질적으로 세포 생존력에 악영향 없이 골충전제를 주사하는 방식으로, 살아있는 세포를 본 발명의 골 충전제의 포뮬레이션으로 주입할 수 있다는 것도 발견된 바 있다. 실제로, 골충전제에 세포가 존재하는 것은, 골결손부위에 골충전제를 투여한 후 생체내에서 골형성을 야기하는 비율에 현저한 긍정적인 영향을 준다.

상기 언급한 바와 같이, 본 발명의 골충전제는 칼슘 염 입자를 포함한다. 충전제에 의해 치료하려는 골결손 부위에 따라, 당업자는 칼슘염을 적절하게 선택할 수 있다. 가능한 선택은 예컨대, 몬티트(monetite), 브러시트(brushite)(CaHPO₄), 칼슘 피로포스페이트 및 칼슘 카보네이트이다. 바람직하게는 칼슘 포스페이트 염, 특히 히드록사아파티트, β-칼슘 포스페이트 및 예컨대 60/40의 질량비로, 이들의 혼합물을 사용할 수 있다. 이들 물질 모두는 살아있는 골에서 자연적으로 생성하며, 따라서 생물체에 의해 쉽게 허용된다. 특히 우수한 결과가 히드록시아파티트를 사용하여 달성된 바 있다.

칼슘 염 입자의 중요한 변수는 이들의 입경으로 밝혀졌다. 바람직하게는 입자의 직경은 100 내지 600㎛, 더욱 바람직하게는 200 내지 400㎛를 갖는다. 덧붙인 실시예에서 나타낸 바와 같이, 생체내에서 유도된 골형성 비율과 정도 및 칼슘 염 입자의 크기간에 밀접한 관계가 있음를 발견하였다.

요구되는 크기의 칼슘염 입자를 통상적으로 칼슘염을 분쇄하고 적당한 메시 크기(right mesh size)로 체질함으로써 만들 수 있다. 소결된 칼슘 염을 사용하고, 소결하기 전에 임의로 워터 텀블링(water tumbled)시켜 조밀한 물질(dense material)을 얻는 것이 바람직하다. 조밀하고 매그러운 칼슘염 입자를 사용하는 것이 바람직하며, 이로써 이는 생체내에서 염증 위험을 현저하게 줄일 수 있다.

본 발명의 골 충전제에 존재하는 또 다른 중요한 물질은 유기 결합제이다. 상기 결합제는, 주사가능한 골 충전제를 형성하기 위한 균일한 페이스트 형성이 가능하기 위해 칼슘염에 대하여 충분히 친화력을 가져야 한다. 또한, 상기 결합제는 생물체에 주입할 수 있는 물질이어야 함을 알아야 할 것이다.

바람직하게는, 상기 결합제는 일단 살아있는 뼈의 기능을 떠맡기에 충분할 정도로 칼슘염의 침적(deposition) 및/또는 골 형성이 일어나면 사라지도록, 생분해가능한 것이 좋다.

또한 상기 결합제는 골 충전제의 점도에 기여하여야 한다. 이는 한편으로는 칼슘염 입자들을 한데 모아 유지시킴으로써 충분한 통합성(integrity)을 갖는 페이스트를 형성시키게 하고, 다른 한편으로는 주사기 바늘을 통해 투여될 수 있도록 골 충전제에 충분한 유연성을 부여해준다.

본 발명의 골 충전제에서 유기 결합제로서 사용될 수 있는 적합한 물질의 구체에로는 알기네이트, 덱스트란, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 혈장(plasma, blood plasma), 생체 결합제(biogenic binders), 히알루론산, 및 이들의 혼합물을 들 수 있다. 특정 구체예는 소듐 알기네이트, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 피브린 접착제 및 트란스글루타미나제가 있다. 소듐 알기네이트를 사용하는 것이 바람직하며, 이는 상기 결합제가 골 충전제의 매우 용이한 포뮬레이션을 가능하게 한다는 것이 발견되었기 때문이다.

선택된 결합제의 특성에 따라, 골 충전제의 중량을 기초로, 0.5 내지 10 wt.%, 더욱 바람직하게는 3 내지 7wt.%의 범위의 양으로 본 발명의 골 충전제에 존재하는 것이 바람직하다.

혼입할 수 있는 적합한 세포는 줄기세포, 골유도세포 및 골조상세포이다. 골 충전제에 혼입되는 세포는 골충전제를 궁극적으로 투여하려는 환자로부터 생체검사를 통해 얻는 것으로, 즉, 자가이삭한 세포를 사용하는 것이 바람직하다.

본 발명의 골 충전제의 형성을 돕기 위하여, 일반적으로 완충액을 사용하고 혼입하는 것이 바람직하다. 또한,상기 완충제는 본 발명의 골 충전제의 몰삼투압이 골충전제를 투입하고자 하는 골결손주위의 몰삼투압과 유사하도록 작용할 수 있으며, 이로써 이식 부위에 살아있는 조직세포상에 충전제의 원하지 않는 임펙트를 피할 수 있다. 대체로 충분하게 약학적으로 허용가능한 여하한 액체를 사용할 수 있을지라도, 필수적으로 세포에 삼투압을 야기지시키지 않고 생체적합적인 완충액(바람직하게는 약 pH 7.4에서)을 포함하는 살린 용액를 사용하는 것이 바람직하다. 특히 바람직하게는 완충액으로서 포스페이트 완충액 살린(PBS;phosphate buffer saline)를 사용하는 것이 좋다.

완충액의 사용량은 선택된 결합제의 점도와 요구되는 골충전제의 점도에 의존한다. 일반적으로 골충전제를 30-70 wt.%, 바람직하게는 40-60 wt.%의 함유량의 고형제를 갖도록 배합한다.

상당한 어려움 없이 본 발명의 골충전제를 주사기 바늘을 통해 통과시키기 위해서, 일반적으로 상기 브룩필드 점도(Brookfield viscosity)를 30,000과 100,000 센티푸아즈 사이에 둔다.

본 발명의 골충전제의 제조에 있어서, 먼저 유기 결합제와 완충액의 겔을 제조하는 것이 유리하다는 것이 입증된 바 있다. 이 목적으로, 상기 결합제를 완중용액과 혼합하거나 완충액에 용해시킨다. 바람직하게는, 결합제에 따라, 혼합하는 동안 결합제가 덩어리를 형성하지 않게 주의를 기울여야 한다. 준비된 겔에 칼슘염 입자를 첨가하고 이들을 혼합하여 균일한 페이스트를 형성시켜 목적의 골 충전제를 만든다.

바람직한 구체예로, 세포를 유기 결합제와 완충액에 의해 형성된 겔에 첨가하기 전에 칼슘 염 입자상에 세포를 시딩한다. 칼슘염 입자, 유기 결합제 및 완충액을 모은 후 상기 세포를 주입할 수 도 있다. 마지막 구체예로, 충전제를 환자내부로 주사하기 전에 상기 세포를 실제로 칼슘 염 입자에 부착시킬 수 있지만, 이들을 별도(separate) 성분으로서 주사 가능한 골 충전제 일부가 되도록 하는 것도 가능하다. 상기 세포를 칼슘 염 입자에 부착할 경우, 상기 입자를 세포로 코팅할 수 있다.

여하한 통상의 방법으로 세포를 칼슘염 입자에 시딩할 수 있다. 바람직하게는 유기 결합제 및 완충액에 의해 형성된 겔과 함께 상기 세포를 수반하는 칼슘 염 입자를 배합하기 이전에 상기 세포를 한개 이상 계대배양(one or more passage)하는 것이 좋다.

충분한 유동성을 유지하기 위하여, 상기 배양은 예컨대, 유럽 특허 출원 제 1 002 859호에 기재된 바와 같이 동적인 상태(dynamic condition)하에서 수행시키는 것이 바람직하다. 배양하는 동안, 요구된 바와 같이, 증식과 분화가 일어날 수 있다.

종종 풍부한 세포외부 기질이 생산되며, 이는 세포들과 함께 군집화(cluster)할 수 있다. 배양을 위해, 여하한 적합한 배양 배지, 예컨대 WO01/48147호에 기재된 배양 배지를 사용할 수 있다. 바람직한 구체예로, 이 배양 배지를 본발명의 골충전제의 포뮬레이션에 사용된 완충액과 함께 요구된 정도로 혼합할 수 있다.

본 발명의 주사가능한 골 충전제는 골유도 인자를 추가로 포함하는 것이 바람직하다. 이 인자는 통상적으로 골 충전제의 중량을 기초로 0.01 내지 3 wt.%의 범위의 양으로 혼입된다. 적합한 골유도인자의 구체예는 BMP와 같은 성장 인자를 포함한다.

또한, 혈관신생 인자(angiogenic factor)를 골충전제에 혼입시키는 것이 바람직하다는 것도 밝혀진 바 있다. 혈관신생 인자를 세포들을 포함하지 않은 골 충전제에, 그리고 세포들을 포함하는 골 충전제 모두에 사용할 수 있다. 혈관신생 인자는 통상적으로 골충전제의 중량을 기초로, 0.01 내지 3 wt.%의 범위의 양으로 혼입된다. 적합한 골유도 인자의 구체예는 FGF, VEGF 및 PDGF와 같은 성장 인자를 들 수 있다.

본 발명은 또한 바늘과 저장기(reservoir)가 있는 주사기를 포함하며, 여기서 저장기는 상기 골 충전제를 함유한다는 것을 알아야 한다. 또한 주사기가 살균 상태하에 유지되어야 한다는 것도 알아야 한다.

물론, 본 발명은 골결손 치료에서 상기 골 충전제의 용도를 추가로 포함하며, 여기서, 이 골 충전제는 주사에 의해 결손부위로 주입된다.

본 발명은 이하 실시예에 의해 더욱 명료해질 것이며, 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

4차 계대배양된(fourth passage) 염소 골수 세포를 200 mg 당 200,000 세포의 농도로 212 내지 300 ㎛의 크기를 갖는 조밀하게 소결된 히드록시아파티트 과립상에 시딩하였다. 상기 세포를 알파-MEM, 15% 우태아 혈정(foetal bovine serum), 0.2mM 아스코르브산-2-포스페이트, 2mM L-글루타민, 10nM 덱사메타손, 10mM 베타-글리세로포스페이트 및 페니실린/스텝토미신을 포함하는 골형성(osteogenic)배양 배지에서 7일간 골조(scaffold)상에서 성장시켰다. 그 다음 상기 세포-코팅된 과립을 58% 알기네이트 겔과 42% 세포 코팅된 히드록시 아파티트(w/w)의 비율로 PBS(소듐 염 알긴산, 고점도, 시그마 A7128)에서 3% 알기네이트 겔과 혼합시켰다. 그 다음 이 페이스트를 누드 마우스(HsdCP:NMRI-nu, Harlan)에 임플란트하였다. 수술 4주후, 상기 샘플을 회수하여 조직학적으로 관찰하였다.

이식하기 직전에 세가지 성분, 히드록시아파티트 과립, 세포 현탁액 및 알기네이트 겔을(상기 언급된 바와 같이) 결합함으로써 얻어진 페이스트를 임플란트하여 비교 연구를 수행한 후, 실험 4주 후 조직학 연구를 수행하였다.

두 개의 실험 모두의 조직학 평가에서 섬유 조직이 임플란트된 물질 페이스트를 에워싸고 있었음을 보였다. 염증성 반응의 징후를 괄찰할 수 없었고, 생쥐 또는쥐에 페이스트의 이식간의 조직학적 차이를 관찰할 수도 없었다. 임플란트의 주위에, 초기 단계의 조직 내생(ingrowth)와 혈관 형성이 관찰 되었다. 도 1은 피셔(Fischer) 쥐의 이식 4주 후 알기네이트 겔과 혼합된 히드록시아파티트 과립 주위의 조직 반응을 나타낸다. 섬유 조직 캡슐화 및 염증 반응이 없음을 알 수 있었다.

본 연구로부터, 골수 세포와 결합되거나 코팅되고 알기네이트와 같은 주사가능한 담채와 혼합된 히드록시아파티트 과립이 생체적합적인 주사가능한 골충전제를 초래한다는 것으로 결론지을 수 있다.

실시예 II

브라운(Braun) 멀티믹서 또는 혼합기로 PBS와 알긴산을 혼합하였다. 알기네이트가 덩어리로 될 수 있기 때문에, 일반적인 믹서를 사용하는 것은 바람직하지 않다. 혼합기로 30초간 혼합한 다음, 손으로 5초간 혼합하여 벽에 붙은 알기네이트 덩어리화를 방지한 다음, 추가 30초간 혼합하였다. 혼합으로 인해 얻어진 겔에서 많은 기포가 생길 수 있다. 5초간 진공로/펌프에 의해 겔에서 이들을 땔수 있다. 이로 인해, 약간의 물이 증발할 것이다. 손실량은 ±0.16%이다(증발이 생길 수 있는 표면상에서의 진행(course)에 의존함).

따라서, 얻어진 겔에서, 혼합을 통해 히드록시아파티트 입자(HA)를 주입하였다. 히드록시아파티트 아파티트의 크기 차이외에, 히드록시아파티트 입자의 양 차이를 관찰하였고 주사 가능성에 대해 평가하였다.

Genia사의 50ml 게니아플렉스 주사기(Geniaplex syringe)로 주사가능성 테스트를 수행하였다. 다르게 언급하지 않는한, 상기 출구는 쓰레티드 루에르허브(threated luer hub)(코드 109302, Genia)이다. 주사기를 고정시켰고 피스톤을 텐실 벤치(tensile bench)의 로드셀(loadcell)에 연결시켰다. 테스트 속도는 75mm/min이다. 메뉴얼-주사의 표준 속도가 그정도이기 때문에, 이 속도를 선택하였다. 모든 결과는 3회 실험한 평균 값이다. 최대(평균)값은 5개의 최대 장력 포인트의 평균이다. 얻어진 결과를 하기 표에 나타내었다.

Claims (19)

1. 칼슘 염 입자, 칼슘염에 친화력이 있는 유기 결합제, 줄기세포, 골형성세포(osteogenic cells) 및 골조상세포(osteoprogenitor cells)의 그룹에서 선택된 세포 및 약학적 허용가능한 완충액을 포함하는 주사 가능한 골충전제.
2. 제 1 항에 있어서, 칼슘 염 입자가 칼슘 포스페이트, 몬티트(monetite), 브러시트(brushite)(CaHPO₄), 칼슘 피로포스페이트, 칼슘 카보네이트 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 것인 골충전제.
3. 제 2 항에 있어서, 칼슘염이 히드록사아파티트, β-칼슘 포스페이트 및 이들의 혼합물인 골충전제.
4. 제 3 항에 있어서, 상기 입자가 100 내지 600㎛, 바람직하게는 200 내지 400㎛의 범위의 직경을 갖는 골충전제.
5. 전 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합제가 알기네이트, 덱스트란, 셀룰로스, 셀룰로스 유도체, 혈장, 생체 결합제(biogenic binders), 히알루론산 및 이들의 혼합물 중에서 선택된 것인 골 충전제.
6. 제 5 항에 있어서, 결합제가 히알루론산, 소듐 알기네이트, 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 피브린 접착제 및 트란스글루타미나제 중에서 선택된 것인 골 충전제.
7. 제 6 항에 있어서, 결합제가 소듐 알기네이트인 골 충전제.
8. 전 항 중 어느 한 항에 있어서, 결합제가 골충전제의 중량을 기초로, 0.5 내지 10 wt.%, 바람직하게는 3 내지 7wt.%의 양으로 존재하는 골 충전제.
9. 전 항 중 어느 한 항에 있어서, 완충액이 포스페이트 완충액 살린(PBS)인 골충전제.
10. 전 항 중 어느 한 항에 있어서, 고형체 함유량이 30-70 wt.%, 바람직하게는 40-60 wt.%인 골충전제.
11. 전 항 중 어느 한 항에 있어서, 점도가 30,000 내지 100,000 센티푸아즈인 골충전제.
12. 전 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 혈관신생 인자(angiogenic factor)를포함하는 골충전제.
13. 전 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포가 칼슘 염 입자상에 시딩(seeding)된 형태로 존재하는 골 충전제.
14. 전 항 중 어느 한 항에 있어서, 추가로 골유도 인자를 포함하는 골 충전제.
15. 바늘과 전 항 중 어느 한 항에 따른 주사가능한 골 충전제를 포함하는 저장기를 포함하는 주사기.
16. 제 15 항에 있어서, 바늘의 길이가 5 내지 20mm이고, 직경이 2 내지 5mm인 주사기.
17. 결합제와 완충액을 혼합하여 겔을 제조하고, 이 겔에 칼슘 염 입자를 첨가하여 균질화시켜 골충전제를 얻는 것을 포함하는 제 1 내지 14 항 중 어느 한 항에 따른 주사가능한 골 충전제의 제조 방법.
18. 제 17 항에 있어서, 세포를 겔에 첨가하기 전에 세포를 칼슘 염 입자상에서 시딩하거나, 칼슘염 입자와 겔을 혼합한후 세포를 주입하는 방법으로서, 이때 세포가 줄기세포, 골형성세포 및 골조상세포 중에서 선택된 것인 방법.
19. 결손 부위(defect)내에 제 1 내지 14 항 중 어느 한 항에 따른 주사가능한 골 충전제를 주사하는 것을 포함하는 골결손 치료 방법.