KR20040041736A - 키토산-히아루론산으로 이루어진 이온성 복합지지체 - Google Patents

키토산-히아루론산으로 이루어진 이온성 복합지지체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 키토산-히아루론산으로 이루어진 복합체 및 이를 이용한 이온성 복합지지체에 관한 것으로, 구체적으로는 키토산과 히아루론산 유도체로 이루어진 복합체, 그의 제조방법 및 키토산-히아루론산 복합체로 이루어진 지지체에 관한 것으로서, 본 발명의 복합체는 키토산과 히아루론산 유도체를 결합시켜 기계적 물성이 우수하며 동시에 연골세포의 재생에 탁월한 효과를 나타내어 조직공학용 생분해성 지지체로 사용할 수 있다.

Description

키토산-히아루론산으로 이루어진 이온성 복합지지체{IONIC COMPOSITE SCAFFOLD COMPRISING CHITOSAN-HYALURONIC ACID}
본 발명은 키토산-히아루론산으로 이루어진 복합체 및 이를 이용한 이온성 복합지지체에 관한 것으로, 구체적으로 키토산과 히아루론산 유도체로 이루어진 키토산-히아루론산 복합체, 그의 제조방법 및 키토산-히아루론산 복합체로 이루어진 지지체에 관한 것이다.
세포간질(Extra cellular matrix; 이하 "ECM"이라 칭한다.) 내에 존재하는 다당체(polysaccharide)는 체내에서 여러 가지 구조적, 유변학적, 물리학적, 생물학적 기능을 수행한다. 그 중 히아루론산(Hyaluronic acid; HA)은 ECM과 세포들 사이의 공간에 광범위하게 분포된 글리코사미노글리칸(gylcosaminoglycan; GAG)으로서 단순한 공간 충진제(space filler)가 아니라 ECM 분자의 3차원 네트워크의 구성요소로 작용하여 결합 단백질(binding protein), 프로테오글리칸(proteogylcan), 성장 인자(growth factor)들과 상호 작용하며 삼투압과 흐름 저항(flow resistance) 및 혈장(plasma)과 매트릭스 단백질(matrix protein)의 선택적인 투과에 미치는 수분 균형을 능동적으로 조절하고 점도가 높아 전단 스트레스(shear stress)로부터 연골조직을 보호하는 윤활제로 작용한다[Larson, N., Leshchiner. E.A, Parent, E .G. and Balazes, E. A.ACS Polymeric Materials Science & Engineering Fall meeting Prceeding,63, p.341(1990); E.Pianigiani, L.Andreassi ,Bimaterials,20, 1689-1694(1999); V.Peguin, L.Robert,Int.J.Biological Macromolecules,22, 17-22(1998); H.Watanabe, Y.Yamada and K.Kimata,J.Biochem,124, 687-693(1998)]. 특히 분자 수준에서 히아루론산은 자유 라디칼 제거제(free radical scavenger)로서 작용하며 악성종양 세포의 표면에 존재하는 CD44와 같은 암세포의 성장과 전이조절에 관여하는 내막 당단백질(integral membrane glycoprotein)로 된 세포막 수용체(cell surface receptor)와 특이적으로 반응하여 암세포의 성장과 전이를 조절한다[R.H.Chen and M.R.Tsaih,Journal of Applied Polymer Science,66,151-159(1997); C.Zeng andI.Stamenkovic,Int.J. of Cancer,77, 196-401(1998)]. 또한 세포 접착(Cell adhesion), 성장(growth), 분화(differentiation), 전위(locomotion)에 영향을 주고 특정한 세포형(cell type)을 활성화시키고, 염증 및 혈전형성, 치료 과정에 관여하여 세포막 주위에서 선택적이고 보호용인 피막으로 작용하기도 한다[David Campoccia and David F.Williams,Biomaterials, 19,2101-2127(1998); K. Pritchard, A. B.Lansley , G. P.Martin, M.Helliwell and L.M.Benedetti,International journal of Pharmaceutics , 129,(1996); Sandy et al. , United States Patent 5,427,954 (1995)].
그러나, 히아루론산은 상술한 우수한 특성을 가짐에도 불구하고 생체흡수성이 너무 높고, 기계적 물성이 낮아 조직공학용 지지체로 활용되지 못하고 있는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 히아루론산의 기계적 물성을 향상시키기 위한 연구를 수행한 결과, 신남모일기가 치환된 히아루론산 유도체와 키토산으로 이루어진 복합체 및 이를 이용한 조직공학용 생분해성 지지체를 제조하였으며, 상기 복합체가 우수한 기계적 물성을 가지고 있으며 동시에 연골세포의 재생에 탁월한 효과를 나타냄을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 키토산과 히아루론산 유도체로 이루어진 복합체, 그의 제조방법 및 상기 복합체로 이루어진 지지체를 제공하는 것이다.
도 1은 본 발명의 히아루론산 유도체의 UV 스펙트럼을 나타낸 그래프이며,
(a) 신남모일기가 치환된 테트라부틸암모늄 히아루로네이트
(b) 신남모일기가 치환된 히아루로네이트
도 2는 본 발명의 히아루론산 유도체의 적외선 스펙트럼(IR spectrum)을 나타낸 그래프이며,
도 3은 본 발명의 히아루론산 유도체의1H-NMR 스펙트럼을 나타낸 그래프이며,
(a) 히아루론산
(b) 신남모일기로 치환된 히아루로네이트(치환도 4 %)
도 4는 본 발명의 키토산-히아루론산 복합체 및 지지체의 팽윤 거동을 나타낸 그래프이며,
(a) 키토산 및 신남모일기가 치환된 히아루로네이트로 이루어진 키토산-히아루론산 유도체복합체
CHA01 : 치환도 1.1 %,
CHA02 : 치환도 2.5 %,
CHA03 : 치환도 4.2 %
(b) 키토산-히아루론산 복합체로 이루어진 지지체.
도 5는 본 발명의 키토산-히아루론산 지지체의 SEM 사진이며,
(a) 150 배율, (b) 200 배율
도 6은 본 발명의 키토산-히아루론산 지지체 상에서의 연골세포 배양 결과를 나타낸 사진이다.
(a) Hematoxylin and Eosin 염색
(b) Van geison collagen염색
(c) Van geison collagen염색
상기한 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 키토산과 히아루론산 유도체로 이루어진 복합체, 그의 제조방법 및 상기 복합체로 이루어진 지지체를 제공한다.
이하 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.
본 발명은 키토산과 히아루론산 또는 키토산과 히아루론산 유도체로 이루어진 복합체를 포함한다.
더욱 구체적으로, 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 기본단위로 하는 히아루론산과 그 유도체의 개질된 카르복실기(carboxyl) 부분과 화학식 4으로 표시되는 화합물을 기본단위로 하는 키토산의 아미드기(amide) 부분이 교차 이온결합을 형성하여 이루어진 키토산-히아루론산 복합체를 포함한다.
본 발명의 히아루론산 유도체는 상기 화학식 1에서 출발하여 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 기본단위로 하여 이루어지며, 수평균분자량이 50,000∼400,000인 고분자 화합물을 사용한다. 상기 히아루론산 유도체는 히아루론산에 신남모일기가 치환된 것으로, 자외선에 의한 가교효과를 가지고 있으며, 이때 신남모일기의 치환도는 0.1∼49.9 %이다. 상기 신남모일기의 치환도의 범위를 초과하면, 가교 후의 생물학적 물성이 변하며, 상기 치환도의 범위 미만이면, 가교가 되지 않는다.
키토산은D-글루코사민 단위로 구성된 다당류로서, 면역학적으로 항균성과 상처치유능력을 가지는 무독성의 생분해성 물질이다. 본 발명의 키토산은 통상적으로 제조할 수 있는 것을 사용할 수 있으며, 일예로 게(crab)에서 추출한 것을 사용한다.
또한, 본 발명은 키토산-히아루론산 복합체의 제조방법을 포함한다.
본 발명은 화학식 1을 기본단위로 하는 히아루론산 유도체 및 화학식 2를 기본단위로 하는 히아루론산 유도체를 각각 제조한다.
구체적으로, 상기 반응식 1에서 보는 바와 같이, 화학식 1을 기본단위로 하는 히아루론산 유도체의 제조에 있어서,
히아루론산을 염기와 반응시켜 히아루로난 염(화학식 5)을 제조하는 단계(단계 1),
상기 히아루로난 염과 테트라부틸암모늄 히드록사이드를 반응시켜 테트라부틸암모늄 히아루로네이트(화학식 6)를 제조하는 단계(단계 2),
상기 테트라부틸암모늄 히아루로네이트를 신남모일 클로라이드를 용매 존재하에서 반응시켜 신남모일기가 치환된 테트라부틸암모늄 히아루로네이트(화학식 2)를 제조하는 단계(단계 3), 및
상기 신남모일기가 치환된 테트라부틸암모늄 히아루로네이트와 키토산을 혼합, 교반 후 농축하여 키토산-히아루론산 복합체를 제조하는 단계(단계 4)로 이루어진 것을 특징으로 하는 키토산-히아루론산 복합체의 제조방법을 포함한다.
단계 1에서 사용되는 염기는 수산화나트륨이 바람직하며, 단계 3에서 사용되는 용매는 DMF가 바람직하다.
또한, 하기 반응식 2에서 보는 바와 같이, 화학식 3을 기본단위로 하는 히아루론산 유도체의 제조에 있어서, 히아루론산을 촉매 및 용매 존재하에 신남모일 클로라이드와 반응시켜 신남모일기가 치환된 히아루로네이트를 제조하는 단계(단계 1), 및
상기 신남모일기가 치환된 히아루로네이트와 키토산을 혼합, 교반 후 농축하여 키토산-히아루론산 복합체를 제조하는 단계(단계 2)로 이루어진 것을 특징으로 하는 키토산-히아루론산 복합체의 제조방법을 포함한다.
단계 1에서 사용되는 촉매는 테트라부틸암모늄 수소 설페이트가 바람직하며, 사용되는 용매는 DMF와 트리에틸아민의 혼합용매가 바람직하다.
상기 화학식 3의 히아루론산 유도체는 하기 반응식 3에서 나타낸 바와 같이, 화학식 1의 히아루론산과 염기와 반응시킨 후 신나모일 클로라이드와 반응시켜 얻을 수 있다. 상기 반응에서 사용되는 용매는 물과 DMF의 혼합용매이고, 사용되는 염기는 피리딘 또는 트리에틸아민이 바람직하다. 이하 키토산-히아루론산 복합체의 제조방법은 상기에서 기재된 바와 동일하게 반응시켜 얻을 수 있다.
또한, 본 발명은 키토산-히아루론산 복합체로 이루어진 지지체를 포함한다.
본 발명의 키토산-히아루론산 복합체는도 4(a)에서 보는 바와 같이, 30분만에 최대 수분을 함유하게 되며, 일단 최고 수준으로 수분을 함유하게 된 이후에는 두달간 함수율의 변화가 없다. 또한 신남모일기의 치환도가 낮을수록 가교밀도가 낮아지기 때문에 팽윤이 더 많이 발생하며, 이는 히아루론산 단독으로 사용하였을 때보다 더욱 우수한 기계적물성을 나타낸다.
이러한 키토산-히아루론산 복합체를 이용한 지지체는도 4(b)에서 보는 바와 같이, 필름상태(도 4(a))에서보다 수분의 흡수가 더욱 빠름을 알 수 있다. 이는 지지체가 다공성 구조체이기 때문이며, 이러한 다공성 구조는 지지체 제조시 농축된 용액의 농도에 따라 다양한 크기의 공극을 얻을 수 있으며, 또한 용액을 냉동시키는 온도와 동결건조의 온도에 따라 공극크기에 영향을 미친다. 통상적으로 용액의 농도는 진할수록 형성된 공극의 크기는 작아지며, 냉동시키는 온도 및 동결건조온도를 조절함에 따라 공극의 크기를 20∼500 ㎛까지 다양하게 조절할 수 있다.
또한, 본 발명의 키토산-히아루론산 복합체는 36.5℃의 물과 생리식염수에서 2개월 이상 물리적으로 안정한 상태를 유지할 수 있으며, 세포들에 대한 독성이 검출되지 않으며, 또한 연골세포들을 양호하게 성장시킴을 알 수 있다(도 6참조).
상기 키토산-히아루론산 복합체로 이루어진 지지체의 구조는 배양액에서 배양되는 동안 안정하게 유지되며, 이로부터 얻어진 조직의 구조를 검토한 결과, 본 발명의 지지체는 장기간에 걸쳐 세포가 완전히 재생될 때까지 구조적으로 안정하며, 연골세포의 재생을 촉진시키기 위한 여분의 성장인자들(Tenascin, Fibronectin, Collagen(type 2))을 첨가하지 않더라도 연골세포를 재생시킬 수 있음을 알 수 있다.
본 발명의 키토산-히아루론산 복합체로 이루어진 지지체는 상기와 같은 효과를 나타내어 조직공학용 생분해성 지지체로 유용하게 사용할 수 있다.
상기 지지체는 본 분야의 통상적인 방법으로 얻을 수 있으며, 일예로 키토산-히아루론산 복합체 용액을 몰드에 붓고, -80℃의 냉동고에서 동결건조하여 얻을 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 본 발명의 키토산-히아루론산 복합체의 제조 I
(단계 1) 히아루론산 유도체의 제조
본 발명의 히아루론산(hyaluronic acid)은 분획 분자량이 12,000인 투석막과 분획분자량이 3500인 투석막을 사용하여 18㏁ 탈이온수로 3일간 투석하여 히아루론산에 포함되어 있는 저분자량의 펩티드를 제거한 후, -80℃에서 동결건조하여 사용하였다. GPC로 측정한 히아루론산의 분자량은 170,000이었다.
키토산은 게(crab)에서 추출한 것으로 상용화된 것(Chitosan, Sigma Chemicals Co.)을 사용하였다.
동결건조시킨 히아루론산(화학식 4) 1 g을 100 ㎖의 증류수에 녹인 후 상기 히아루론산 용액을 음이온 수지를 15 ㎝ 높이로 채운 컬럼에 통과시켜 나트륨이 제거된 용액을 제조하였다. 얻어진 용액을 10℃에서 교반 중인 테트라부틸암모늄 히드록사이드(tetrabutylammonium hydroxide)의 12.5 % 용액 30 ㎖에 적하한 후 즉시 회수하여 동결건조하였다. FT-IR 및1H-NMR 측정으로 히아루론산에 존재하던 -COOH가 염으로 치환되었음을 확인하였다.
제조된 테트라부틸암모늄 히아루로네이트(화학식 6) 1 g을 DMF(100 ㎖)와 피리딘(20 ㎖)의 혼합용액에 용해시키고, 질소분위기 하에서 신남모일 클로라이드(cinnamoyl chloride) 5 ㎖를 20 ㎖의 DMF에 희석시켰다. 상기 테트라부틸암모늄 히아루로네이트 용액에 신남모일 클로라이드 용액을 적하하고 8 시간이상 빛을 차단한 채로 4℃에서 반응시켰다. 반응이 종료된 후 최종 생성물을 메틸알코올을 이용하여 침전시키고 여과한 뒤 하룻밤 동안 진공건조기에서 건조시켰다. 얻어진 백색 분말을 물에 녹여 분획 분자량이 8,000인 투석튜브를 이용하여 18 ㏁의 탈이온수로 3일간 투석하여 미반응물을 제거한 후 동결 건조하여 최종적으로 백색 분말의 신남모일기가 치환된 테트라부틸암모늄 히아루로네이트(cinnamoylated tetrabutylammonium hyaluronate; CHT, 화학식 1)를 얻었다. 이때 수평균분자량은 170,000이며, 신남모일기의 치환도는 9.6%이었다(하기 반응식 1 참조).
반응식 1
(단계 2) 키토산-히아루론산 복합체의 제조
게 키틴으로부터 추출한 키토산(화학식 4) 1 g을 5 % 아세트산 용액(또는 5 % 시트르산 용액) 100 ㎖에 용해시키고, 상기 단계 1에서 제조된 신남모일기가 치환된 테트라부틸암모늄 히아루로네이트(화학식 2)를 1 g을 증류수 100 ㎖에 용해시켰다. 상기 두 용액을 교반하여 균질한 용액을 형성시킨 후 화학식 1의 히아루론산 유도체 용액을 천천히 키토산 용액에 첨가하였다. 상기 혼합용액을 40℃에서 1일 동안 교반하였다. 교반이 완료된 후 회전증발기를 이용하여 용액을 농축하여 키토산-히아루론산 복합체를 제조하였다.
화학식 1
화학식 2
화학식 3
화학식 4
<실시예 2> 본 발명의 키토산-히아루론산 유도체의 제조 II
(단계 1) 히아루론산 유도체의 제조
히아루론산(화학식4) 1 g을 TBHS(tetrabutylammonium hydrogen sulfate) 1 g이 용해된 DMF 100 ㎖에 용해시켰다. 얻어진 용액에 트리에틸 아민(triethyl amine) 30 ㎖를 첨가시킨 후 교반하고, 신남모일 클로라이드(cinnamoyl chloride)와 DMF의 혼합용액(1:1, v/v) 50 ㎖를 천천히 적하하였다. 상기 반응은 차광한 상태로 4℃에서 8 시간동안 수행하였다. 반응이 종결된 후 최종 생성물을 아세톤을 이용하여 침전시키고, 하룻밤 동안 진공건조기에서 건조시켰다. 얻어진 백색 분말을 물에 용해시켜 분획 분자량이 3,000인 투석튜브를 이용하여 18 ㏁의 탈이온수로 3일간 투석하여 미반응물을 제거하고, 동결 건조시켜 백색 분말의 신남모일기가 치환된 히아루로네이트(cinnamoylated hyaluronate; CHA, 화학식 2)를 얻었다. 이때 수평균분자량은 165,000이며, 신남모일기의 치환도는 8.7%이었다(하기 반응식 2의 참조).
반응식 2
(단계 2) 키토산-히아루론산 복합체의 제조
게 키틴으로부터 추출한 키토산(화학식 3) 1 g을 5 % 아세트산 용액(또는 100 % 시트르산 용액) 100 ㎖에 용해시키고, 상기 단계 1에서 제조된 신남모일기가 치환된 히아루로네이트(화학식 2)를 1 g을 증류수 100 ㎖에 용해시켰다. 상기 두 용액을 교반하여 균질한 용액을 형성시킨 후 화학식 1의 히아루론산 유도체 용액을 천천히 키토산 용액에 첨가하였다. 상기 혼합용액을 40℃에서 1일 동안 교반하였다. 교반이 완료된 후 회전증발기를 이용하여 용액을 농축하여 키토산-히아루론산 복합체를 제조하였다.
<비교예 1> 키토산-히아루론산 복합체의 제조
비교예로 상기 키토산과 히아루론산(화학식 7)을 상기와 동일한 방법으로 하여 키토산-히아루론산 복합체를 제조하였다.
<실시예 3> 본 발명의 키토산-히아루론산으로 이루어진 지지체의 제조
상기 실시예 1 및 2의 키토산-히아루론산 복합체의 용액을 몰드에 붓고, -80℃의 냉동고에서 냉동시켰다. -80℃에서 3일간 동결건조하여 지지체를 제조하였다.
<실험예 1> 본 발명의 히아루론산 유도체의 구조적 분석
본 발명의 히아루론산 유도체의 구조적 분석을 위해, FT-IR(Mattson 5000 GL-5020, Unicam Co.), UV 분광기(UV100, Unicam Co,),1H-NMR(Unity Inova500MHz, Varian Co.)을 이용하였다.
상기 결과는도 1∼도 3에 나타내었으며, 구체적으로도 1은 UV 스펙트럼을 나타내었으며,도 2는 IR 스펙트럼을 나타내었으며,도 3은1H-NMR 스펙트럼을 나타내었다.
도 1(a)및도 1(b)에서 보는 바와 같이, 실시예 1 및 실시예 2의 단계 1에서 제조된 각각의 히아루론산 유도체에 포함된 신남모일기(cinnamoyl group)로 인한 270 ㎚ 부근에서 UV 흡수 피크의 강도가 커지는 현상이 나타났으며, 이는 히아루론산에 치환된 신남모일기의 치환도에 따른 것으로 신남모일기의 도입을 확인할 수 있다.
또한,도 2의 FT-IR 스펙트럼에서 보는 바와 같이, 1640 ㎝-1에 새로이 나타나는 -C=C- 이중결합 피크로 신남모일기의 도입을 정성적으로 확인하였다. 테트라부틸암모늄으로 치환한 후에는 2960 ㎝-1, 1550 ㎝-1, 1100 ㎝-1부근에서 새로운 IR 피크를 확인할 수 있었다. 신남모일 클로라이드와의 반응 종료 후에도 잔존하는 테트라부틸암모늄기를 여전히 IR 피크에서 확인할 수 있었다.
도 3(a)는 히아루론산 유도체의1H-NMR 스펙트럼이며,도 3(b)는 히아루론산의1H-NMR 스펙트럼이다.도 3(a)의 경우, -COOH와 -OH,D-글루쿠론산과N-아세틸-D-글루코사민 반복단위의 프로톤(proton)들에 의한 화학적 이동이 11∼12 ppm 사이의 -COOH 피크, 3.9 ppm의 -OH 피크로 확인할 수 있었다. 반복단위인D-글로쿠론산은 3∼4 ppm에서 여러 개의 피크가 합쳐진 넓은 피크로 나타났으며,N-아세틸-D-글루코사민은 1.8 ppm과 1 ppm에서 R-NH와 R-CH3에 기인하는 피크로 나타났다. 히아루론산을 신남모일 클로라이드와 반응시키면 7∼8 ppm 사이에서 방향족 고리와 3∼4 ppm 사이 -C=C- 이중결합에 기인하는 피크들이 나타났다. 테트라부틸암모늄으로 치환하면, 11∼12 ppm 사이에서 나타나는 피크는 사라지고, 1∼2 ppm 사이의R-CH3피크와 3∼4 ppm 사이의 R-N- 피크들이 강하게 나타나는 경향을 보이고 있다. D2O 용매에 의해 4.8 ppm에서 공통적으로 큰 피크가 나타났다.
<실험예 2> 본 발명의 키토산-히아루론산 복합체 및 지지체의 가수분해 실험
지름 1cm,높이 0.8cm 크기의 원주형 지지체의 초기무게를 측정하여 Wo로 두고 37도의 PBS에 담근후 incubator에서 흔들어주면서 일정시간이 지날때마다 건져올려 건조한 뒤 무게를 측정하였다.
결과는도 4에 나타내었다.
도 4에서 보는 바와 같이, 본 발명의 키토산-히아루론산 복합체는 30분만에 최대 수분을 함유하게 되었으며, 일단 최고 수준으로 수분을 함유하게 된 이후에는 두달간 함수율의 변화가 없다.
도 4(a)는 신남모일기의 치환도가 각각 1.1, 2.5, 4.2인 히아루론산 유도체로 이루어진 키토산-히아루론산 복합체를 필름상으로 만들어 팽윤거동을 확인한 결과로서, 치환도가 낮으면 가교밀도가 낮아지기 때문에 팽윤이 더 많이 발생하나, 치환을 통해 광가교를 일으킨 신남모일화된 히아루론산은 히아루론산 단독으로 사용하였을 때보다 더 우수한 물성을 보이고 있다.
도 4(b)는 지지체의 팽윤거동을 확인한 결과로서, 지지체는 다공성 구조체이기 때문에 필름상태에서보다 수분의 흡수가 빠른 것을 볼 수 있다.
<실험예 3> 본 발명의 키토산-히아루론산 복합체로 이루어진 지지체의 SEM 관찰
만들어진 키토산-히아루론산 복합체는 단면을 금으로 코팅하여 SEM 사진촬영을 하였다. 사용된 기계는 Hitachi S-2400이었고 측정시의 가속전압은 18KV였다.
결과는도 5에 나타내었다.
도 5에서 보는 바와 같이, 본 발명의 지지체는 다공성 구조체를 가지고 있어며, 이로 인해 필름상태보다 수분의 흡수를 빠르게 수행할 수 있다.
본 발명의 지지체는 농축된 용액의 농도에 따라 다양한 크기의 공극(pore)를 얻을 수 있으며, 또한 용액을 냉동시키는 온도와 동결건조 시의 온도도 공극크기에 영향을 미침을 알 수 있다. 일반적으로 용액의 농도는 진할수록 형성된 공극의 크기는 작아지며, 냉동시키는 온도 및 동결건조온도를 조절함에 따라서 형성되는 공극의 크기는 50∼500 ㎛까지 다양하게 조절할 수 있었다.
<실험예 4> 본 발명의 키토산-히아루론산 복합체의 연골세포 재생능 실험
본 발명의 키토산-히아루론산 복합체의 세포독성을 검토하기 위해 본 발명의 지지체에 연골세포를 접종(seeding)하여 일주일간 배양하였다. 결과는도 6에 나타내었다.
제조된 키토산-히아루론산 복합체는 36.5℃에서 2개월 이상 물리적으로 안정한 상태를 유지하였다. 세포들에 대한 독성이 검출되지 않았으며, 연골세포들이 양호하게 성장함을 확인할 수 있었다(도 6참조). 지지체의 구조는 배양액에서 배양되는 동안 안정하게 유지되었고, 이로부터 얻어진 조직의 구조를 검토하기 위해 지지체 조직 내에서 자라난 연골세포가 분화하면서 분비한 콜라겐(collagen)을 염색하여 조직사진을 관찰하였다. 청남색으로 염색된 부분(도 6(a))의 화살표는 세포의 핵부분이고 붉은색으로 염색된 부분(도 6(b) 및 도 6(c))의 화살표는 세포질과 세포가 분비한 콜라겐이다. 따라서 이들 결과로부터 본 발명에서 제조된 생분성 고분자 지지체는 장기간에 걸쳐 세포가 완전히 재생될 때까지 구조적으로 안정하였으며, 연골세포의 재생을 촉진시키기 위한 여분의 성장인자들(Tenacin, Fibronectin, Collagen(type 2))을 첨가하지 않더라도 소기의 목적이 달성 가능한 고분자 지지체임을 알 수 있었다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 키토산-히아루론산 복합체는 기계적 물성이 우수하며, 또한 연골세포의 재생에 탁월한 효과를 나타내어 이를 이용하여 조직공학용 생분해성 지지체를 제조할 수 있다.

Claims (10)

  1. 하기 화학식 1, 화학식 2 또는 화학식 3으로 표시되는 화합물을 기본단위로 하는 히아루론산과 그 유도체의 개질된 카르복실기(carboxyl) 부분과 화학식 4으로 표시되는 화합물을 기본단위로 하는 키토산의 아미드기(amide) 부분이 교차 이온결합을 형성하여 이루어진 키토산-히아루론산 복합체.
    화학식 1
    화학식 2
    화학식 3
    화학식 4
  2. 제 1항에 있어서, 상기 히아루론산 또는 히아루론산 유도체의 수평균분자량이 50,000 ∼ 400,000 인 것을 특징으로 하는 키토산-히아루론산 복합체.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 히아루론산 유도체가 신남모일기의 치환도 0.1 ∼49.9 %인 것을 특징으로 하는 키토산-히아루론산 복합체.
  4. 화학식 2를 기본단위로 하는 히아루론산 유도체로 이루어진 키토산-히아루론산 복합체의 제조에 있어서, 하기 반응식 1에서 보는 바와 같이,
    히아루론산을 염기와 반응시켜 히아루로난 염(화학식 5)을 제조하는 단계(단계 1),
    상기 히아루로난 염과 테트라부틸암모늄 히드록사이드를 반응시켜 테트라부틸암모늄 히아루로네이트(화학식 6)를 제조하는 단계(단계 2),
    상기 테트라부틸암모늄 히아루로네이트를 신남모일 클로라이드를 용매 존재하에서 반응시켜 신남모일기가 치환된 테트라부틸암모늄 히아루로네이트(화학식 2)를 제조하는 단계(단계 3), 및
    상기 신남모일기가 치환된 테트라부틸암모늄 히아루로네이트와 키토산을 혼합, 교반 후 농축하여 키토산-히아루론산 복합체를 제조하는 단계(단계 4)로 이루어진 것을 특징으로 하는 키토산-히아루론산 복합체의 제조방법.
    반응식 1
  5. 제 4항에 있어서, 단계 1의 염기가 수산화나트륨이며, 단계 3의 용매가 DMF인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  6. 화학식 3을 기본단위로 하는 히아루론산 유도체로 이루어진 키토산-히아루론산 복합체의 제조에 있어서, 하기 반응식 2에서 보는 바와 같이,
    히아루론산을 촉매 및 용매 존재하에 신남모일 클로라이드와 반응시켜 신남모일기가 치환된 히아루로네이트를 제조하는 단계(단계 1), 및
    상기 신남모일기가 치환된 히아루로네이트와 키토산을 혼합, 교반 후 농축하여 키토산-히아루론산 복합체를 제조하는 단계(단계 2)로 이루어진 것을 특징으로 하는 키토산-히아루론산 복합체의 제조방법.
    반응식 2
  7. 제 6항에 있어서, 상기 단계 1의 촉매가 테트라부틸암모늄 수소 설페이트이고, 용매가 DMF 및 트리에틸아민의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 제조방법.
  8. 화학식 3을 기본단위로 하는 히아루론산 유도체로 이루어진 키토산-히아루론산 복합체의 제조에 있어서,
    하기 반응식 3에서 보는 바와 같이, 히아루론산을 용매 존재하에 염기와 반응시킨 후 신남모일 클로라이드와 반응시켜 신남모일기가 치환된 히아루로네이트를 제조하는 단계(단계 1), 및
    상기 신남모일기가 치환된 히아루로네이트와 키토산을 혼합, 교반 후 농축하여 키토산-히아루론산 복합체를 제조하는 단계(단계 2)로 이루어진 것을 특징으로 하는 키토산-히아루론산 복합체의 제조방법.
    반응식 3
  9. 제 8항에 있어서, 상기 염기가 피리딘 또는 트리에틸아민이며, 용매가 물과 DMF의 혼합용매인 것을 특징으로 하는 키토산-히아루론산 복합체의 제조방법.
  10. 청구항 1의 키토산-히아루론산 복합체로 이루어진 지지체.
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