KR20040029769A

KR20040029769A - Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ의 항원인 Ｖｉ다당류에대한 항체 측정용 진단시약 조성물

Info

Publication number: KR20040029769A
Application number: KR1020020060180A
Authority: KR
Inventors: 유태현; 박종원; 박성식; 정철윤; 김현성; 김이섭; 김종수; 조민; 원유덕; 김춘태
Original assignee: 녹십자백신 주식회사; 주)녹십자
Priority date: 2002-10-02
Filing date: 2002-10-02
Publication date: 2004-04-08
Also published as: KR100578114B1

Abstract

본 발명은 장티푸스 원인균인S. typhi의 항원 성분인 Vi 다당류에 대한 항체를 측정하기 위한 진단시약용 조성물과 그 조성물을 이용한 항체 측정용 진단시약에 관한 것이다.

본 발명에 의한 항체 진단시약용 조성물 및 그 조성물을 이용한 항체 측정용 진단시약은S. typhi의 항원 성분인 Vi 다당류와 단백질이 중량비로 0.5 내지 3.0 의 비율로 결합된 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서 상기의 Vi 다당류에 결합된 상기의 단백질은 상기의 진단시약용 적혈구와 동등한 성질을 가지는 물질로서 Vi 다당류와 적혈구간의 흡착력을 증대시켜 주기 위한 것이며, 상기의 Vi 다당류는 피검자의 혈청 내에 존재하는 항체와의 반응을 일으키는 기능을 수행하는 반면에, 상기의 단백질 성분은 감작된 진단시약용 적혈구와의 흡착력을 증가시켜주는 기능을 수행한다.

본 발명에 의한 항체 측정용 진단시약은 종래의 항체 측정용 진단시약에 비하여 항체 측정의 민감도와 특이성에 있어서 뛰어난 효과가 있다.

Description

Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉ의 항원인 Ｖｉ다당류에 대한 항체 측정용 진단시약 조성물{Diagnostic reagent composition for detecting antibody for Vi polysaccharide}

본 발명은 장티푸스 원인균인S. typhi의 항원 성분인 Vi 다당류에 대한 항체를 측정하기 위한 진단시약용 조성물과 그 조성물을 이용한 항체 측정용 진단시약에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는S. typhi의 항원인 Vi 다당류에 단백질을 결합시킨 접합체를 이용하여, 혈청내에 존재하는 Vi 다당류에 대한 항체를 측정함으로써,S. typhi의 감염에 의하거나 Vi 다당류 백신에 의해서 생성된 항체를 측정할 수 있는 진단시약용 조성물과 그 조성물을 이용한 항체 측정용 진단시약에 관한 것이다.

장티푸스는S. typhi에 의해서 감염되어 발병하는 전염병으로, 항생제가 개발되기 이전에는 10~20% 치사율을 가지는 전염병이었다.S. typhi는 급성 또는 만성 보균자의 배설물에 오염된 물이나 음식물의 섭취에 의해서 감염 전파되며, 균체는 장 점막에 침투하여 균혈증을 일으키고 10~14일의 잠복기를 거쳐 전신 증상이 발생한다.

Vi 다당류는S. typhi의 항원 성분 중의 하나로S. typhi의 독성과 관련이 있는 것으로 알려져 있고 이를 정제하여 백신으로 사용하고 있다. Vi 다당류 백신 접종 후 혈청에 존재하는 Vi 다당류에 대한 항체를 측정하는 것은 피접종자의 방어능력을 판단하는데 중요한 기준이 된다. 또한S. typhi의 보균자의 혈청에는S. typhi의 다른 항원에 대한 항체는 존재하지 않고 오직 Vi 다당류에 대한 항체만이 존재하기 때문에 보균자를 식별하기 위해서는 Vi 다당류에 대한 항체의 측정은 매우 중요하다.

Vi 다당류에 대한 항체를 측정하기 위해서 수동적혈구응집 진단시약이 개발되어 사용되고 있다 (Journal of the Korean Society for Chemotherapy(1993), Vol. 11, Vol. 2, p. 185-191). 일반적인 Vi 다당류에 대한 항체 측정용 수동적혈구응집 진단시약은 Vi 다당류가 감작된 적혈구를 포함하고 있다. 적혈구 표면에는 Vi 다당류가 흡착되어 있고, 이 흡착된 Vi 다당류와 Vi 다당류에 대한 항체가 반응을 하여 격자모양의 침전을 형성하게 된다. 즉, 적혈구와의 격자 모양의 침전물의 형성 여부에 따라 Vi 다당류에 대한 항체의 농도가 결정된다.

수동적혈구응집 진단이 적혈구의 표면에 흡착된 항원성분과 그에 대한 항체와의 반응을 통하여 이루어지기 때문에, 적혈구 표면에 흡착된 항원성분의 양은 그 진단시약이 측정할 수 있는 항체 양의 최소값을 결정짓는데 매우 중요하다. 즉, 적혈구 표면에 항원성분이 많이 흡착될수록 측정할 수 있는 항체가의 최소값은 낮아지게 된다. 이는 진단시약의 민감도가 증가한다고 표현될 수 있다. 또한 항원성분이 적혈구에 많이 흡착 될수록 항체와 항원성분과의 특이적인 반응이 항체와 적혈구간의 비특이적인 반응보다 우세하게 되므로 진단시약의 특이성이 증가된다.

현재 사용되고 있는 종래의 수동적혈구응집 진단시약의 경우, Vi 다당류를 적혈구에 흡착되는 항원성분으로 사용하고 있다. 그런데, 상기의 Vi 다당류는 친수성적인 성질만을 가지고 있으므로, 친수성과 소수성 성질을 모두 가지고 있는 단백질로 구성된 적혈구와는 서로 결합하려는 힘이 약하게 된다. 따라서, 종래의 수동적혈구응집 진단시약의 경우에는 많은 양의 Vi 다당류를 적혈구표면에 흡착시키는 것은 매우 어렵다. 이로 인해 종래의 진단 시약은 항체 측정의 민감도와 특이성에 있어서 한계를 드러내고 있는 단점이 있는 것이다.

본 발명은 상기와 같은 종래의 진단시약의 단점을 개선하기 위하여, Vi 다당류의 항체에 대한 측정의 민감도와 특이성을 대폭적으로 향상시킬 수 있는 진단시약용 조성물 및 그 조성물을 이용한 항체 측정용 진단시약을 제공하고자 한다.

따라서, 본 발명의 목적은 상기의 과제를 해결하기 위하여,S. typhi의 항원 성분인 Vi 다당류와 단백질 접합체가 결합된 항체 진단시약용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 목적은 피검자의 혈청내에 존재하는S. typhi에 대한 항체를 신속히 측정하기 위하여 상기의 진단시약용 조성물을 적혈구에 결합시킨 항체 측정용 진단시약을 제공하는 것이다.

본 발명은S. typhi의 항원 성분인 Vi 다당류와 단백질이 결합된 접합체를 포함한 항체 진단시약용 조성물을 제공한다.

본 발명에 의한 항체 진단시약용 조성물은S. typhi의 항원 성분인 Vi 다당류와 단백질이 결합한 접합체로서, Vi 다당류와 단백질의 중량비는 0.5 내지 3.0인 것을 특징으로 한다. 본 발명에 있어서 상기의 Vi 다당류에 상기의 단백질을 결합시키는 이유는, 상기의 Vi 다당류가 오직 친수성 성질을 가지고 있는데 반하여 진단시약용 적혈구는 단백질로서 친수성과 소수성을 모두 가지고 있어서, 상기의 Vi 다당류가 진단시약용 적혈구에 흡착되는 힘이 약할 수밖에 없는 단점이 있으므로, 상기의 진단시약용 적혈구와 동등한 성질을 가지는 물질인 단백질을 Vi 다당류에 결합시킴으로써 흡착력을 증대시켜주기 위한 것이다. 이로써, 상기의 Vi 다당류는 피검자의 혈청 내에 존재하는 항체와의 반응을 일으키는 기능을 수행하는 반면에, 상기의 단백질 성분은 감작된 진단시약용 적혈구와의 흡착력을 증대시켜주는 기능을 수행하는 것이다.

본 발명에 있어서 사용될 수 있는 단백질로서는 혈청에 존재하는 항체를 측정하기 위한 것이기 때문에, 상기의 단백질 성분은 체내에서 항체가 존재하지 않거나 면역이나 항체 생성을 목적으로 인간에게 투여된 적이 없는 것이 바람직스럽다. 이러한 예로서, 본 발명에서 사용될 수 있는 단백질로서는 알부민, 글로불린, 헤모글로빈 등의 혈장유래 단백질; 인슐린, 성장 호르몬, GCFS 등의 호르몬 단백질; 콜라젠, 엘라스틴, 케라틴 등의 구조 단백질; 카제인 등의 영양 단백질; 뱀의 독소 또는 식물성 독 단백질인 리신 등의 독성 단백질 등을 들 수 있다. 상기의 단백질은 인간유래 단백질인 것이 바람직스럽다. 또한, 상기의 단백질은 알부민이 가장 바람직스러운 성분이라고 할 수 있다.

본 발명에 의한 상기의 항체 진단시약용 조성물은S. typhi의 항원에 대한 항체를 측정하기 위한 진단시약에 특히 적합한 성질을 갖는다.

또한, 본 발명은 상기의 항체 진단시약용 조성물을 이용한S. typhi의 항원에 대한 항체를 측정하기 위한 진단시약을 제공한다.

본 발명에 의한 항체 측정용 진단시약은S. typhi의 항원인 Vi 다당류와 단백질의 접합체를 적혈구에 흡착시키는 것을 특징으로 하고 있다. 본 발명의 항체 측정용 진단시약에 있어서, 상기의 Vi 다당류와 단백질의 접합체의 기본적인 기능은 상기의 진단시약용 조성물에 있어서와 동일하다.

따라서, 본 발명에 의한 항체 측정용 진단시약에 있어서, 상기의 단백질 성분은 적혈구와 흡착되는 성질이 강하므로, 상기 단백질 성분의 접합체를 통하여 그 항원성분이 적혈구에 대한 흡착력을 증가시킴으로써 민감도와 특이성을 향상시킬 수 있는 것이다.

다시 말하면, 본 발명은 상기의 단백질 성분을 매개로 하여 Vi 다당류가 진단시약의 적혈구에 더욱 더 많은 양이 흡착되어지고, 더 많이 흡착된 Vi 다당류는 그 만큼 혈청 내에 존재하는 더 많은 양의 항체와 응집반응을 일으키게 되므로, 항체에 대한 민감도와 특이성이 더욱 증가되는 것이다.

이하, 본 발명에 의한S. typhi의 항원에 대한 항체를 측정하기 위한 항체 진단시약의 제조방법에 관하여 설명한다. 본 발명에 의한 항체 진단시약의 제조방법은 1차적으로 항체 진단시약용 조성물을 제조하는 공정과; 2차적으로 상기의 진단시약용 조성물을 이용하여 감작된 적혈구에 흡착시키는 진단시약을 제조하는 공정으로 구성되어 있다.

상기의 항체 진단시약용 조성물의 제조방법은 가). 단백질 성분을 활성화시키는 단계와; 나). Vi 다당류에 상기의 활성화된 단백질 성분을 결합시키는 단계로 진행될 수 있다. 본 발명의 명세서에 있어서는, 그 설명의 편의상 단백질 성분 약 200㎖ 정도를 기준으로 하여 설명한다.

가). 단백질 성분의 활성화 단계 :

단백질 성분을 칭량하여 약 200㎎ 정도를 취하고, 이것을 생리식염수 용액 40∼80mL에 용해한 후, 2∼8℃의 저온으로 냉각한다. 상기의 단백질 용액에 냉각된 10 ㎎/mL EDAC [1-Ethyl-3(3-dimethylamino-propyl)carbodiimide]용액 2∼8 mL를 첨가하고, 여기에 다시 냉각된 10 ㎎/mL ADH [Adipic acid dihydrazide]용액 40∼160 mL를 첨가한다. 첨가 후, 상기의 용액을 pH 5.1 내지 pH 5.5로 조정하고, 2∼8℃의 저온에서 약 2 시간 내지 4시간 정도 반응시킨다.

이때, 상기의 반응조건에서 반응온도를 2∼8℃의 저온으로 유지하는 이유는 상기의 단백질 성분 중에 존재하는 EDAC와 반응한 후, 단백질의 아민기보다는 ADH와 반응하도록 하기 위한 것이다. 다시 말해서, 상기의 반응온도를 상온에서 진행할 경우엔, 단백질 성분 중의 EDAC와 반응한 아세테이트기가 다른 단백질의 아민기와 직접 결합함으로써 소망하는 활성화된 단백질을 얻는 것이 곤란해지기 때문에, 이러한 부반응을 억제하고, 소망하는 반응물을 고효율로 얻기 위함이다. 이 점은 종래의 반응조건과 매우 다른 점이다.

상기의 반응액을 중성(pH 7)으로 조정하여 반응을 정지시키고, 원심분리하여 상청액을 회수한다. 회수된 상청액을 생리식염수로 투석하고, 투석이 끝난 용액을 필터로 제균 여과하여, 활성화된 단백질 성분을 얻는다.

나). Vi 다당류와 단백질 성분의 접합 단계

Vi 다당류를 칭량하여 약 100㎎ 정도를 취하고, 이것을 생리식염수 용액 10∼30 mL 에 용해한 후, 2∼8℃의 저온으로 냉각한다. 상기의 Vi 다당류 용액에 냉각된 8 ㎎/mL EDAC 용액 3∼7 mL 를 첨가하고, 그 위에 냉각된 상기의 가).단계에서 제조된 활성화된 단백질 용액 50∼200 ㎎ 을 첨가한다. 첨가 후, 용액의 pH를 5.1 내지 5.5로 조정하고, 2∼8℃의 저온에서 약 2 시간 내지 4시간 정도 반응시킨다. 상기의 반응조건에서 2∼8℃의 저온으로 냉각시키는 이유는 상기의 가). 단계에서와 동일하다. 즉, Vi 다당류의 아세테이트기가 더욱 고효율로 활성화되어, 소망하는 반응물을 더 많이 얻기 위한 것이다.

상기 반응액의 pH를 6.5 내지 7.5로 조정하여 반응을 정지시키고, 원심분리하여 상청액을 회수한다. 회수된 상청액을 컬럼 크로마토그래피를 사용하여 Vi 다당류와 단백질이 결합된 접합체를 분리한다. 분리된 Vi 다당류와 단백질을 생리 식염수 용액을 이용하여 투석을 실시하고, 투석이 끝난 용액을 필터로 제균여과하여, Vi 다당류 및 단백질의 접합체를 얻는다.

본 발명에 있어서, 상기의 다당류와 단백질을 결합시켜 접합체를 제조하는 방법은 최근에 백신의 개발을 목적으로 보고된 바 있으나(Infection and Immunity(1997), Vol. 65, Vo. 6, p. 2088-2093), 상기의 방법을 이용하여 혈청내에 존재하는 항체를 측정하기 위한 진단시약용 조성물의 제조방법으로서 소개되거나, 그러한 방법을 암시한 사실은 없다. 더구나, 본 발명에 있어서 상기의 제조방법은 각 단계에서 반응온도를 현저하게 낮추어 냉각상태에서 진행함으로써, 단백질의 활성화를 더욱 향상시킨 점에 그 특징이 있는 것이며, 또한 어느 누구도 시도한 적이 전혀 없었던 항체 측정용 진단시약의 제조방법에 응용한 점에 그 특징이 있는 것이다.

이어서, 항체 측정용 진단시약의 제조방법으로 이행되어진다. 본 발명에 의한 항체 측정용 진단시약의 제조방법은 상기의 각 단계를 거쳐 항체 측정용 조성물을 제조한 다음, 항원부착용 적혈구를 제조하는 단계와 상기의 항원부착용 적혈구 표면에 상기의 항체 진단시약용 조성물을 흡착시키는 단계로 진행되어진다.

다). 항원 부착용 적혈구를 제조하는 단계

본 발명에서 사용될 항원 부착용 적혈구의 제조는 통상의 방법으로 실행될 수 있다. 본 발명에 있어서는, 항원 부착용 적혈구로서 면양 적혈구를 사용하는 것이 바람직하다. 면양 혈액을 헤파린이 첨가된 채혈백에 채혈한 후 완충용액으로 2내지 4회 정도 세척하여 면양적혈구만을 분리한다. 이때, 완충용액으로서는 PBS(Posphate buffered saline)가 바람직하다. 분리된 면양적혈구를 최종 농도가 5∼10%(v/v)가 되도록 상기의 완충용액에 현탁한 다음, 다시 탄닌산을 8∼15%가 되도록 첨가한 후, 37℃에서 30분간 반응시킨다. 상기의 현탁액을 2∼8℃의 저온으로 냉각한 후, 0.1∼1.0 % 글루타알데히드에 넣고 간헐 요동하면서 1∼3시간 정도 반응시켜 면양적혈구를 고정시킨후, 상기의 완충용액으로 2∼4번 세척한다. 세척된 면양적혈구에 탄닌산을 첨가하여 면양적혈구의 농도가 3∼8%, 탄닌산의 농도가 8∼15%가 되도록 하여 35∼38℃에서 0.5∼2시간 정도 혼합한다. 그 후 면양적혈구를 상기의 완충용액으로 2∼4회 정도 세척하여, 감작된 항원 부착용 면양적혈구를 얻는다.

라). 적혈구 표면에 항체 진단시약용 조성물을 흡착시키는 단계

이어서, 본 발명에 의한 항체 측정용 진단시약을 제조하는 과정으로 이행되어진다. 이 단계에서는 먼저 상기의 완충용액에 상기의 나). 단계에서 얻은 Vi 다당류 및 단순 단백질 접합체를 혼합하여, Vi 다당류 농도가 2∼8 mg/mL이 되도록 희석한다. 그 후 상기의 항원 부착용 면양적혈구 현탁액(면양적혈구 농도 5%)에 넣고 진탕하면서 2∼8℃의 저온에서 0.5 내지 3 시간동안 반응시켜 면양적혈구 표면에 흡착시킨다. 이것을 다시 상기의 완충용액으로 2∼4회 정도 세척한 후, 면양적혈구 농도가 0.3∼1.0 %가 되도록 희석 완충용액에 현탁한다. 이때, 상기의 희석 완충용액으로서는 PBS pH 7.2, 0.3% 토끼 혈청이 바람직하다. 이로써, 본 발명에 의한 항체 측정용 진단시약으로서 수동적혈구응집 진단시약이 완성되는 것이다.

상기의 제반 공정을 거쳐 최종적으로 수득된 제품은 Vi 다당류 함량과 단순 단백질 함량의 비가 0.5∼3.0의 값을 갖는다. (이때, Vi 다당류의 함량 측정은 라켓 면역전기영동(Rocket immunoelectrophoresis)법에 의하였고, 단순 단백질의 함량 측정은 라우리(Lowry)법에 의하였음을 밝혀둔다.)

이하, 본 발명을 바람직한 실시예에 의하여 상세하게 설명한다. 다만, 본 발명의 명세서에서 제시된 하기의 실시예는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 제공된 것일 뿐, 본 발명의 기술사상이 하기의 실시예에 한정되는 것이 아님은 명백하다.

본 발명의 실시예에 있어서는, 상기의 단순 단백질로서 소알부민을 사용하였고, 적혈구로서는 면양 적혈구를 사용하였다. 또한, 본 발명에서는 종래의 항체 측정용 진단시약과의 효능 대비를 위하여, 비교 실험으로서 Vi 다당류를 흡착시킨 기존의 수동적혈구 응집 진단시약을 제조하여 사용하였다.

≪ 실시예 1 ≫

활성화된 소알부민의 제조 :

소알부민 200 mg을 0.15 M NaCl 용액 50 mL에 용해한 후 얼음통을 사용하여 온도를 2-8℃로 낮췄다. 제조된 소알부민 용액에 냉각된 10 mg/mL EDAC 용액 5 mL을 첨가한 후 냉각된 7 mg/mL ADH 용액 100 mL을 첨가하였다. 혼합액의 온도2-8℃로 pH를 5.3으로 유지하면서 3시간 동안 반응을 진행하였다. 3시간 후 용액의 pH를 7.0으로 조정하여 반응을 정지시킨 후 원심분리를 실시하고 상청액을 회수하였다. 상청액을 0.15 M NaCl 용액을 이용하여 투석을 실시하였고, 투석이 끝난 용액은 0.2 ㎛ 필터로 제균여과하였다. 이 용액을 활성화된 소알부민이라고 하였다.

≪ 실시예 2 ≫

Vi 다당류 및 소알부민 접합체의 제조 :

다당류 100 mg을 0.15 M NaCl 용액 20 mL에 용해한 후 얼음통을 사용하여 온도를 2-8℃로 낮췄다. 제조된 Vi 다당류 용액에 냉각된 8 mg/mL EDAC 용액 5 mL을 첨가한 후 100 mg에 해당하는 냉각된 활성화된 소알부민 용액을 첨가하였다. 혼합액의 온도를 2-8℃로 pH를 5.3으로 유지하면서 3시간 동안 반응을 진행하였다. 3시간 후 용액의 pH를 7.0으로 조정하여 반응을 정지시킨 후 원심분리를 실시하고 상청액을 회수하였다. 상청액을 Sephacryl S-1000 HR 컬럼을 사용하여 Vi 다당류와 소알부민이 결합된 접합체를 분리하였다. 분리된 Vi 다당류와 소알부민을 0.15 M NaCl 용액을 이용하여 투석을 실시하였고 투석이 끝난 용액은 0.2 ㎛ 필터로 제균여과하였다. 이 용액을 Vi 다당류 및 소알부민 접합체라고 하였으며, 항체 진단시약용 조성물로서 설명된 것이다.

≪Vi 다당류 및 소알부민 접합체의 함량 측정≫

상기의 실시예2에 의하여 수득된 Vi 다당류 및 소알부민 접합체에 대하여, 상기 Vi 다당류의 함량 측정은 라켓 면역전기영동법으로, 상기 소알부민의 함량 측정은 라우리(Lowry)법으로 각각 측정하였으며, 그 측정 결과는 다음과 같았다.

Vi 다당류 함량 : 290 ㎍/mL

소알부민 함량 : 240 ㎍/mL

Vi 다당류와 소알부민의 함량 비 (Vi 다당류/소알부민) = 1.2

《실시예 3》

항원 부착용 면양적혈구 제조 :

면양 혈액을 헤파린이 첨가된 채혈백에 채혈한 후 완충용액인 PBS로 3회 세척하여 면양적혈구만을 분리하고, 이 면양적혈구를 최종 농도가 8%(v/v)가 되도록 PBS에 현탁한 다음, 탄닌산을 10%가 되도록 첨가한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 위 현탁액을 4℃로 냉각한 후, 0.4 % 글루타알데히드에 넣고 간헐 요동하면서 2시간 동안 반응시켜 면양적혈구를 고정시킨 다음, PBS로 2번 세척하였다. 세척된 면양적혈구에 탄닌산을 첨가하여 면양적혈구의 농도가 5%, 탄닌산의 농도가 10%가 되도록 하여 37℃에서 1시간 동안 혼합하였다. 그 후 면양적혈구를 PBS로 2번 세척하였다. 이를 항원 부착용 면양적혈구라고 하였다.

《비교예 1》

종래의 항체 측정용 진단시약의 제조 :

Vi 다당류를 5 ㎍/mL이 되도록 PBS에 녹인 후 면양적혈구 현탁액(면양적혈구 농도 5%)에 넣고 진탕하면서 4℃에서 1시간동안 반응시켜 면양적혈구 표면에 흡착시켰다. 이를 PBS로 두 번 세척한 후 면양적혈구 농도가 0.5 %가 되도록 희석 완충용액 (PBS pH 7.2, 0.3% 토끼 혈청)에 현탁하였다. 이를 Vi 다당류 감작 면양적혈구라고 하였으며, 종래의 항체 측정용 진단시약을 의미한다.

《실시예 4》

본 발명에 의한 항체 측정용 진단시약의 제조 :

Vi 다당류 및 소알부민 접합체의 Vi 다당류 농도가 5 ㎍/mL이 되도록 PBS에 희석한 후 면양적혈구 현탁액(면양적혈구 농도 5%)에 넣고 진탕하면서 4℃에서 1시간동안 반응시켜 면양적혈구 표면에 흡착시켰다. 이를 PBS로 두 번 세척한 후 면양적혈구 농도가 0.3∼1.0 %가 되도록 희석 완충용액 (PBS pH 7.2, 0.3% 토끼 혈청)에 현탁하였다. 이를 Vi 다당류와 소알부민 접합체 감작 면양적혈구라고 하였으며, 본 발명에 의한 항체 측정용 진단시약을 의미한다.

《종래의 진단시약과 본 발명의 진단시약의 Vi 항체가 측정》

본 발명에 의한 방법으로 제조된 진단시약의 효능성을 조사하기 위해서, 다음과 같은 방식으로 그 효능을 측정하였다.

먼저, Vi 다당류로 이루어진 타이포박스주[녹십자백신㈜, 이 백신은 Vi 다당류를 정제하여 제조된 백신이다.]를 10명의 성인을 대상으로 하여 접종하였고, 4주일 후에 상기 10명의 접종한 성인으로부터 채혈하여 혈청을 분리한 다음, 본 발명에 의한 수동적혈구응집 진단시약과 종래의 수동적혈구응집 진단시약을 각각 이용하여 상기 10명의 성인 혈청에 대해 Vi 다당류에 대한 항체가를 정량적으로 측정 비교하였다.

실험을 위하여, 각각의 시료 혈청을 마이크로 플레이트의 각 웰 내에서 시료 희석액을 사용하여 희석하였고, 각 웰에는 시료 25 ㎕가 있도록 하였다. 양성대조시료도 같은 방법으로 희석하였고, 음성대조로는 시료 희석액을 사용하였다.

희석된 시료가 들어있는 각 웰에, 본 발명에 의한 진단시약(Vi 다당류 및 단백질 접합체 흡착 면양적혈구액)과 종래의 진단시약(Vi 다당류 흡착 면양적혈구액)을 각각 25 ㎕씩 떨어뜨린 후 2시간 동안 정치하였다. 2시간 후 각각 응집상이 형성되었고, 응집상을 육안으로 관찰 판독하였다. 음성대조시료의 응집상과 비교하여 명백히 크고 주변에 많은 입자상 침전이 있거나, 혈구응집이 균일하게 일어나 막모양을 이루고 응집상의 일부가 중심으로 향하면 양성으로 판정하였다. 양성을 나타내는 최소 희석 배수를 시료의 항체가로 하였다.

실험 결과, 항체가 증가률의 차이로부터 본 발명의 통하여 개발된 수동적혈구응집 진단시약이 기존의 방법으로 제조된 진단시약에 비해서 민감도가 높다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 접종전의 항체가값의 비교로부터 본 발명으로 진단시약의 특이성을 높일 수 있음을 확인하였다(하기의 [표1] 참조).

[표1] 타이포박스주의 접종 전과 후의 Vi 다당류에 대한 항체가

접종자번호	종래의 항체 측정용 진단시약	본 발명의 항체 측정용 진단시약
접종자번호	접종전	접종후	항체가 증가률	접종전	접종후	항체가 증가률
1	10	20	2	5	80	16
2	10	40	4	5	160	32
3	10	40	4	5	80	16
4	40	80	2	20	160	8
5	10	20	2	10	160	16
6	10	40	4	5	160	32
7	10	20	2	10	80	8
8	5	20	4	5	80	16
9	10	40	4	10	160	16
10	10	20	2	5	80	16

본 발명은 단백질 성분의 접합체를 통하여 항체와의 반응을 일으키는 항원성분의 변화 없이 그 항원성분이 적혈구에 대한 흡착력을 증대시킬 수 있게 되었고, 그로 인하여 Vi 다당류가 적혈구에 흡착되는 양을 증가시켜 민감도와 특이성을 향상시킬 수 있었다.

항체가 증가률로부터 본 발명에서 개발된 Vi 다당류와 소알부민 접합체로 감작된 수동적혈구 응집 진단시약이 기존의 방법으로 제조된 진단시약에 비해서 민감도가 높다는 것을 확인할 수 있었다.

또한, 접종전의 항체가로부터 본 발명에서 개발된 진단시약이 기존의 방법으로 제조된 진단시약에 비해서 높은 특이성을 보이는 것을 확인할 수 있었다.

Claims

S. typhi의 항원 성분인 Vi 다당류와 단백질이 결합된 접합체를 포함하는 것을 특징으로 하는 항체 진단시약에 적합한 진단시약용 조성물.
제1항에 있어서,

상기의 Vi 다당류와 단백질의 중량비는 0.5 내지 3.0 인 것을 특징으로 하는 항체 진단시약에 적합한 진단시약용 조성물.
제2항에 있어서,

상기의 단백질은 인간유래 단백질인 것을 특징으로 하는 항체 진단시약에 적합한 진단시약용 조성물.
제2항에 있어서,

상기의 단백질은 인간에게 면역이나 항체생성을 목적으로 투여된 적이 없는 것을 특징으로 하는 항체 진단시약에 적합한 진단시약용 조성물.
제2항에 있어서,

상기의 단백질은 알부민, 글로불린, 헤모글로빈 등의 혈장유래 단백질; 인슐린, 성장 호르몬, GCFS 등의 호르몬 단백질; 콜라젠, 엘라스틴, 케라틴 등의 구조 단백질; 카제인 등의 영양 단백질; 뱀의 독소 또는 식물성 독 단백질인 리신 등의 독성 단백질 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 항체 진단시약에 적합한 진단시약용 조성물.
제5항에 있어서,

상기의 단백질은 알부민인 것을 특징으로 하는 항체 진단시약에 적합한 진단시약용 조성물.
감작된 적혈구에S. typhi의 항원인 Vi 다당류 및 단백질의 접합체를 흡착시키는 것을 특징으로 하는 항체 측정용 수동적혈구응집 진단시약.
제7항에 있어서,

상기의 감작된 적혈구에 흡착된 Vi 다당류와 단백질의 중량비는 0.5 내지 3.0 인 것을 특징으로 하는 항체 측정용 수동적혈구응집 진단시약.
제8항에 있어서,

상기의 감작된 적혈구에 흡착된 단백질은 인간유래 단백질인 것을 특징으로 하는 항체 측정용 수동적혈구응집 진단시약.
제8항에 있어서,

상기의 감작된 적혈구에 흡착된 단백질은 인간에게 면역이나 항체생성을 목적으로 투여된 적이 없는 것을 특징으로 하는 항체 측정용 수동적혈구응집 진단시약.
제8항에 있어서,

상기의 감작된 적혈구에 흡착된 단백질은 알부민, 글로불린, 헤모글로빈 등의 혈장유래 단백질; 인슐린, 성장 호르몬, GCFS 등의 호르몬 단백질; 콜라젠, 엘라스틴, 케라틴 등의 구조 단백질; 카제인 등의 영양 단백질; 뱀의 독소 또는 식물성 독 단백질인 리신 등의 독성 단백질 중에서 선택된 것을 특징으로 하는 항체 측정용 수동적혈구응집 진단시약.
제11항에 있어서,

상기의 감작된 적혈구에 흡착된 단백질은 알부민인 것을 특징으로 하는 항체 측정용 수동적혈구응집 진단시약.
제7항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,

상기의 감작된 적혈구는 면양 적혈구인 것을 특징으로 하는 항체 측정용 수동적혈구응집 진단시약.