KR20040026278A - 쌀겨로부터 저분자화 된 천연 펩타이드를 포함하는 조성물및 이의 제조방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 벼의 도정 부산물인 쌀겨(rice bran)로부터 영양학적으로 풍부한 천연 아미노산 또는 펩타이드(peptide)를 포함하는 조성물 및 그의 효과적인 제조방법에 관한 것이다. 본 발명은 쌀겨에 알칼리 처리하여 가용 단백질을 용해 및 추출한 다음 불용성 물질을 제거한후 유기산을 이용하여 용해된 단백질을 침전으로 회수한 후, 식물유래의 단백질 분해효소를 처리하여 저 분자성 펩타이드를 제조하고 최종산물을 원심분리 또는 한외여과막을 통해 회수하는 것을 특징으로 한다. 본 발명자는 간단하면서도 고효율의 쌀겨 유래의 저 분자화 된 천연 펩타이드가 포함되는 조성물 제조공정을 개발함으로써 향후 쌀겨로부터 대량으로 천연유래의 필수 아미노산 또는 펩타이드를 포함하는 조성물을 효과적으로 제조할 수 있게 되었고, 성장기에 꼭 필요한 천연형 필수 아미노산 이외에 각종 생리적 기능을 수행하는 비 필수 아미노산, 유기산등 쌀겨에 포함된 각종 저 분자성 유용 성분들을 저 분자화 된 천연 펩타이드와 함께 저렴한 가격으로 제조 공급할 수 있는 기반을 확보하게 되었으며 이러한 천연형 아미노산 펩타이드군이 포함된 조성물은 다양한 식품첨가물 형태로 활용될 수 있다.

Description

쌀겨로부터 저분자화된 천연 펩타이드를 포함하는 조성물 및 이의 제조방법{Process for low molecular weight peptide preparation from rice bran.}

본 발명은 우리 몸의 생리적 활성 유지에 필요한 각종 아미노산, 특히 성장단계에 있는 소아, 청소년 그리고 고품질의 영양수준을 요구하는 노년층에게 적합한 필수아미노산을 포함하는 저 분자 영양물질을 쌀겨로부터 저렴하면서도 대량으로 얻을 수 있는 제조방법에 관한 것이다.

필수아미노산은 우리 몸에서 생성이 되지 않기 때문에 식품을 통해 하루 권장량 범위내에서 매일 일정량을 섭취해 주어야 한다. 그러나 일상적인 음식을 통해 흡수되는 단백질중에서 특히 필수아미노산의 함량은 식품의 종류에 따라 다르며 식생활 패턴에 따라 개인별로 각기 다른 요구량을 지니게 된다. 우리 몸이 필요로 하는 영양소 중에서 단백질은 가장 중요한 영양소라고 할 수 있다. 물론 정상적인 생리활성을 위해선 모든 영양소가 중요하지만 단백질은 그 중에서 가장 중요한 일을 하는 영양소이다. 단백질은 우리 몸에서 생명활동의 촉매인 효소로서, 호르몬으로서, 근육 또는 신경체의 구성성분으로서, 산소공급을 해주는 적혈구 단백질 등 많은 중요한 역할을 수행하는 물질이다.

현재까지 고단백 완전식품으로 잘 알려진 우유에는 약 3.4% 전후의 단백질이 함유되어 있다. 이중 약 80%는 케이신(casein) 이라는 단백질로 구성되어 있고 나머지는 유청단백질로 되어 있으며, 유청 단백질에는 락토알부민, 락토그로부린, 혈청알부민, 면역단백질 등 여러 가지 수용성 단백질이 있다. 우유의 단백질은 각 단백질의 생물학적인 기능은 물론 위와 장에서 소화되어 우리가 반드시 섭취해야 하는 필수 아미노산을 많이 공급해 주는 영양적인 기능이 매우 높은 중요한 성분이다. 또 우유 단백질의 소화율은 97% 이상으로 알려지고 있어서 콩과 같은 식물성 단백질보다 소화가 더 잘되는 단백질로 알려져있다.

한편 쌀겨는 매년 인류에 의해 전세계적으로 생성되는 방대한 양의 바이오매스(biomass)중 하나이다. 우리나라의 벼 생산량은 약 730만 톤으로 이중 쌀겨의 생산량은 약 58만 톤으로 추정된다. 현재 쌀겨는 일부가 미강유 생산에 이용되고 있으나 일부는 동물용 사료로 활용되고 대부분 특별한 용도가 없이 폐기되고 있는 실정이다. 쌀겨에는 가용성 당질이 34∼52%, 조지방이 15∼20%, 조단백질이 11∼15%, 조섬유가 7∼11%, 회분이 7∼10%, 녹말이 14% 정도 들어 있는 것으로 알려져 있다. 특히 쌀겨의 단백질 함량을 보면 우유단백질보다 더 높은 함량을 보여주고 있다. 특히 쌀겨 단백질은 다른 단백질보다 알러지 생성이 낮다고(hypoallergenic) 알려져 있다.

특히 쌀겨에는 헤미셀루로스(hemicellulose)를 비롯한 식이섬유(dietary fiber)와 이노시톨, 콜린, 나이아신(B3), 토코페롤(E), 싸이아민(B1), 판토텐산(B5) 등 비타민이 풍부히 들어있다. Juliano (1985a. Factors affecting nutritional properties of rice protein. Trans. Natl. Acad. Sci. Technol. (Philipp.), 7:205-216; 1985b. Rice: chemistry and technology, 2nd ed. St Paul, MN, USA, Am. Assoc, Cereal Chem. 774 pp)와 Pedersen & Eggum (1983. The influence of milling on the nutritive value of flour from cereal grains. IV. Rice. Qual. Plant. Plant Foods Hum. Nutr., 33: 267-278)의 연구결과에 따르면 쌀겨에는 다른 부위에 비해서 비타민 B군이 밀집되어 있다. 특히 Bl의 경우는 65%, B3는 80-85% 그리고 B2는 39%가 함유되어 있다. 또한 비타민 E (일명 tocopherol)는 현미 씨눈에 전체의 95%가 존재하는 것으로 보고되고 있다. 특히 Asaf A. et al등은 최근 보고를 통해 쌀겨의 수용성 추출물과 식이섬유 농축 분획을 장기간 복용시 혈당저하를 유도하며 cholesterol, LDL-cholesterol, apollpoprotein B 그리고 중성지질(triglycerides)등을 저하한다고 발표하였다(Journal of Nutritional Biochemistry 13: 175-187, 2002).

이외에도, 쌀겨는 영양학적으로 풍부한 유용 성분들을 과량 함유하고 있다고 알려졌음에도 불구하고 현재까지는 가축의 사료나 버섯 재배용 배지 성분용도로 미약하게 활용이 될 뿐, 아직까지 콩이나 우유제품같이 사람을 대상으로 한 풍부한 단백질의 공급원으로서 개발이 되고 있지 못한 실정이다. 그 이유로서는 첫째로,쌀겨 단백질의 복잡한 구조적 특징을 들수가 있다. 쌀겨 단백질은 37% 알부민(albumin), 36% 글로브린(globulin), 22% 글루테린 (glutelin)과 5% 프로라민(Prolamin)등을 함유하고 있다(Betschart et al. J. Food Sci. 42: 1088∼1093, 1977). 둘째로, 쌀겨 단백질은 용해도가 매우 낮다는 문제이다. 이러한 특성은 쌀겨 단백질이 강하게 응집되어 구성되어 있으며 특히 강력한 황화결합(disulfide bond crosslink)을 하고 있기 때문이기도 하다(Hamada, J. Protease solubilization of proteins in rice bran. Fresented at the IFT Annual Meeting, Anaheim, CA, 1995; Abstract No. 68A-55). 셋째로, 쌀겨 단백질은 높은 파이테이트(Phytate, 1.7%) 농도와 섬유함량(12%)을 함유하고 있다. 이러한 구조체는 단백질 성분을 분리 추출해 내는데 있어서 매우 어려운 점을 제공하게 된다.

최근 들어 국가경제가 발전되고 국민소득이 점차 증가하는 과정에서 노령층의 인구가 지속적으로 증가됨에 따라, 대다수의 국민들이 건강에 상당한 관심을 보이게 되었으며, 식품 선호도에 있어서도 합성물 보다는 자연산을 선호하는 방향으로 바뀌어 가고 있다. 따라서, 현재 활용도가 빈약하고 저렴한 가격으로 자연에서 공급 받을 수 있는 쌀겨로부터 영양학적으로 풍부한 유용성분을 단계적으로 추출하여 개발하는 것은 매우 큰 의미가 있다.

이에, 본 발명자는 유용한 필수아미노산을 천연으로부터 저렴하게 제조하기 위해, 우리나라에서 매년 대량으로 생산되는 도정 부산물인 쌀겨로부터 유용한 물질을 추출하는 연구를 실시하였으며 필수아미노산을 포함하는 유용한 저 분자성 영양물질을 대량으로 생산할 수 있는 제조공정을 완성하게 되었다. 특히 도정과정에서 백미를 얻기 위해 영양분이 집중된 쌀눈 및 겨 부분이 소실되어 낭비되고 있다는 사실에 주목을 하였다. 일반적으로 현미는 단백질, 필수지방산, 비타민, 섬유질 등 영양이 풍부하고 신진대사를 왕성하게 하여 젊음을 지켜주며 장 기능은 물론 체질개선에도 좋은 것으로 알려지고 있다.

특히 쌀겨의 필수 아미노산 함량과 관련하여 대표적인 단백질들의 아미노산 조성연구 결과를 비교해 보면 다음과 같다.

상기의 표에서 보면 쌀겨 단백질은 기존의 우유 단백질이나 콩 단백질에 비해서 아미노산의 조성에 있어서 큰 차이를 보이고 있지 않다. 오히려 시스테인의 경우는 우유보다도 월등함을 보이고 있다. 이전에서도 기술한 바와 같이 쌀겨 단백질은 강력한 황화결합을 통해 응집되어 있기 때문에 시스테인의 함량이 높다. 그러한 이유로 인해서 쌀겨 단백질은 우리 몸에 들어가 소화계에서 소화되는 비율이 낮다는 주장도 있어 왔다. 본 발명에서는 이러한 문제점을 개선하고자 추출 및 단백질 제조공정에서 식물성 유래의 단백질 분해효소를 사용하여 고분자 단백질을 분자량 6,000 이하의 저 분자로 전환하는 공정을 도입하여 제조단계에서 대부분 저 분자 펩타이드로 전환하는 처리를 통해 체내에서의 이용률을 높이고자 하였다.

쌀겨로부터 단백질을 고수율로 회수하고자 하는 시도는 1969년부터 몇 편의 학술논문을 통해 발표된 바가 있으나 모두 공통적으로 탄수화물 분해효소(carbohydrases)를 통해 비단백질을 제거한 다음 단백질을 회수하려는 시도였다. 사용된 대표적인 탄수화물 분해효소(carbohydrases) 효소로서는 셀룰레이즈(cellulase), 펙티네이즈(pectinase), 헤미셀룰레이즈(hemicellulase) 그리고 비스코엔자임 엘(viscoensyme L) 등이다. 1985년에 Richardson and Hyslod는 파이테이즈(phytase)를 이용하여 단백질 회수율을 증가시키고자 시도를 한바가 있고((Enzymes. InFood Chemistry,Fennema, O.R., Ed.; Marcel Dekker: New York, 1985; pp 371-476) 1999년에 Wang et al 등은 파이테이즈(phytase) 와 자일러네이즈(xylanase)를 복합적으로 적용하여 단백질을 회수하려고 노력하였다(J. Agric. Food Chem. 1999, 47, 411-416). 그러나 이러한 효소 중 일부는 비교적 고가이며 저급 순도의 효소들은 곰팡이나 박테리아 발효를 통해 대량으로 배양한 용액을 구입하여 처리해야 하므로, 최종산물을 식품으로 사용하기에는 안전성 문제가 제기될 수가 있다. 이러한 효소를 사용하였다 하더라도 분리된 단백질의 용해도 및 회수 효율성에 문제가 있을 수도 있는데, Shih et al등이 발표한 자료에 따르면 알파 아밀레리즈(alpha-amylase), 셀롤레이즈(cellulase), 해미셀룰레이즈(hemicellulase)를 각각 쌀겨에 처리하여 얻은 수용성 상등액과 불용성 침전물의 전기영동 결과는 어느 효소를 처리하였든 간에 상당량의 고분자 쌀겨 단백질이 여전히 불용성 분획에 존재하고 있음을 보여주고 있어서 이러한 효소계를 이용한 단백질 회수율에 여전히 상당한 문제가 있음을 암시하고 있다(Nahrung 43(1999) Nr. 1, S. 14-18).

이와 같이 쌀겨에는 우리 몸에 유익한 많은 성분들이 포함되어 있고 함량으로 보아도 적절한 제조공정이 확보되면 충분히 건강식품 등으로 활용할 수 있는 이러한 도정 부산물을 효율적으로 가공 이용하는 연구가 거의 이루어지지 않았기 때문에 제대로 활용되지 못하고 있는 실정이었다. 이에, 본 발명자는 농가에서 생산되어 버려지는 엄청난 양의 바이오매스(biomass)로부터 유용성분을 추출하여 건강식품으로 활용할 수 있는 방법을 연구하게 되었고, 현재까지 특허 공개 및 공고된 관련 자료를 조사해 본 결과, 쌀겨로부터 단백질 또는 펩타이드의 추출 및 제조방법에 대해서는 전혀 제공이 된 바가 없었기에 제조공정 연구를 통해 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명의 특징은 쌀겨에 알칼리 처리를 하여 추출되는 단백질의 함량을 최대로 얻는 최적의 방법을 제시하고 있다. 또한 본 발명에서는 알칼리 용해물의 침전유도 과정에서 복합 유기산을 침전유도 물질로 사용함으로써 단백질이 포함된 천연형 저 분자성 물질과 유기산이 복합되어 제조되는 제조방법을 제시하고 있다. 특히 본 발명은 유기산중에서 구연산을 사용하였는데 구연산은 우리 몸에 산소의 이용율을 높여주는 데 필요한 성분이며 신진대사를 활발하게 하고 에너지 방출을 도우며, 몸 속의 찌꺼기를 제거하는 기능을 수행한다고 알려져 있다. 또 다른 유기산으로서는 식초산을 사용하였는데 식초산은 우리 몸에서 변비를 예방하며 동맥경화를 억제하고 유산을 분해하여 피로를 제거하는 탁월한 기능이 있다. 이와 같이 본 발명에서는 자연계에서 매년 생성되는 엄청난 쌀겨 바이오매스(biomass)에서 유래된 천연형 저 분자화 된 펩타이드가 포함된 조성물의 제조방법을 제공하고 있다.

특히 저 분자성 펩타이드의 제조를 위해서, 본 발명에서는 침전 회수된 추출물에 대해 식물유래의 단백질 분해효소를 처리해 줌으로써 저 분자성 펩타이드 제조가 가능하게 되었으며 그렇게 함으로써 체내에서의 흡수율을 증가시키는데 기여할 수가 있어서, 유아나 청소년, 또는 소화능력이 약화된 노년층에서도 본 발명에 따른 천연형 필수 아미노산 펩타이드 조성물의 섭취가 용이하게끔 적용한 것을 특징으로 하고 있다.

본 발명자는 최근 들어, 미국 FDA(Food and Drug Administration) 또는 유럽 EMEA(The European Agency for the Evaluation of Medicinal Product)같은 식품의약품 허가기관에서 동물유래의 물질사용에 대해 매우 민감하고 까다로운 반응을 보이고 있다는 사실에 주목하여 본 발명의 제조에 있어서 동물유래의 단백질 분해효소보다는 질병의 전염문제가 전혀 없는 식물유래의 단백질 분해효소를 선별하여 사용하였다.

결국, 본 발명의 목적은 신진대사를 활성화시키는 천연유래 펩타이드가 포함된 저 분자성 조성물 및 그의 제조방법을 제공하는 것이다.

도 1은 쌀겨로부터 저 분자 펩타이드를 포함하는 조성물의 제조방법을 도시한다

이하에서는, 본 발명의 펩타이드을 포함하는 조성물 및 그의 제조방법을 공정별로 구체적으로 설명하고자 한다.

제 1공정: 멸균 및 유화과정

본 발명의 시작 물질은 현미 또는 그의 일부분이 포함된 쌀겨가 될 수 있으며 증기살균(steam sterilization or steam inactivation)을 통해 멸균하고 동시에 원료 내에 함유된 각종단백질 분해효소, 그의 억제제 또는 지방을 분해하는 lipase와 같은 효소를 불활성화 시켜줌으로써 보다 안정적인 원료(stabilized rice bran)를 만들 수 있다. 또한 본 공정은 알칼리공정에서 최대의 단백질 추출 회수율을 얻기 위해 쌀겨를 유화(softening)해 주는 기능도 있다. 예를 들면, 100℃ 에서 6분 이상 증기로 가열해 주면 트립신 효소 억제제는 불활성화된다. 본 공정의 가동 조건은 고압 멸균장치(autoclave)를 이용하거나 100℃의 수증기를 최소 20분 이상 통과시켜 줌으로써 공정을 완성하게 된다.

제 2공정: 단백질 추출과정

최적의 단백질 추출량을 얻기 위해 본 공정에서는 쌀겨 g당 30ml 내지 100ml범위의 물을 첨가한 다음 용액의 pH를 10이상, 바람직하게는 12이상 되게 조절한다. 이때 사용 가능한 pH 조절용액으로는 암모니아수(NH₄OH), 수산화칼슘(CaOH₂), 수산화칼륨(KOH) 또는 수산화나트륨(NaOH) 용액이 될 수 있다. 용해 및 교반 시간은 통상적으로 10분 내지 2시간 이내가 적당하다.

제 3공정 불용성 물질 제거과정

쌀겨의 알칼리 추출 용해한 액으로부터 가용성 단백질을 최대로 회수하기 위해서는 불용성 쌀겨와 용해된 단백질 용액을 분리해 주어야 한다. 이를 위해서 본 공정에서는 내부에 특수필터가 장착된 탈수기를 이용하여 알칼리 추출용액을 회수하게 된다 회수된 추출용액은 다음 단계인 침전유도과정으로 이동되며 얻어진 불용성 쌀겨 물질은 베타-시토스테롤(β-sitosterol)을 포함하는 식물성스테롤(phytosterol) 추출을 위해 별도의 공정으로 이동 보관된다.

제 4공정: 침전유도 및 회수과정

탈수기로부터 회수된 알칼리 추출용액의 pH를 저하시켜 침전물을 회수하는데 있어서, 용해도 차이를 이용한 침전과 동시에 용해된 단백질의 등전점 (isoelectric PH) 침전을 이용한다. 이러한 목적을 달성하기 위해, 본 발명자에 의해 확인된 알칼리 추출액의 적절한 pH 하강범위는 pH 3 내지 6 이 적당하며 이 범위 내에서 최고로 많은 침전물을 얻을 수가 있다.

이때 사용 가능한 침전 유도물질 또는 pH 저하용 물질로서는 식초산(acetic acid), 구연산(citric acid)과 같은 유기산을 단독 또는 복합하여 사용할 수 있다. 형성된 백색의 침전체는 500g 이상의 중력으로 5분 이상의 가동조건에서 원심분리를 통해 침전물로 회수가 가능하다.

제 5공정: 식물성 단백질 분해효소 처리공정

회수된 침전물을 물에 현탁하고 현탁액의 pH를 5 내지 8범위로 조절한 다음 식물성 단백질 분해효소 처리를 하게 된다. 대량생산 공정에서는 인산 완충용액(phosphate buffer)을 사용할 수가 있으며 식물성 단백분해 효소는 야자수 줄기에서 얻는 파파인(papain) 효소와 파인애플 줄기에서 얻는 브로머레인(bromelain) 효소를 사용할 수 있다.

제 6공정: 한외여과(ultrafiltration) 또는 원심분리를 통한 저 분자성 펩타이드 물질의 회수

단백질 분해효소의 작용에 의해 저 분자화 된 쌀겨 펩타이드는 공중사막 또는 한외여과 막을 이용하여 저 분자화 된 펩타이드를 회수할 수가 있다. 이전 공정에서 얻어진 용액을 MWCO(molecular weight cut-off) 50,000 내지 10,000의 막 구경을 지닌 한외여과 막(ultrafiltration membrane, UF)을 사용하여 용액에 함유된 저 분자 성 펩타이드 물질을 분리한다. 원하는 최종산물은 본 한외여과막의 침투액(filtrate)으로부터 회수하게 된다. 또한 본 반응산물인 저 분자성 펩타이드는 식물유래 효소반응 액을 원심분리를 통해 상등 액으로 부터 회수가 가능하다.

제 7공정: 분말제조 및 건조

본 발명에서의 마지막 공정으로서 한외여과막 통과액 또는 원심분리로부터의 상등액은 통상적으로 분무건조기(spray dry)를 통해 분말 형태로 회수할 수 있다.

이와 같이 제조된 쌀겨 유래 저 분자성 펩타이드를 포함하는 조성 물은 건강식품의 원료 또는 식품첨가물 형태로 사용될 수가 있다. 이하 실시 예에 의하여 본 발명은 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시 예에 국한되지 않는다는 것은 당 업계에서 통상의 지식을 가지 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1

수증기로 멸균처리 및 안정화한 쌀겨 1.5g을 각각 50ml 용량의 falcon tube에 담고 물을 첨가하여 수용성 단백질을 용해하였다. 각 용액의 pH는 10N 가성소다 용액을 적절히 희석하여 첨가하였고 해당 pH까지 조절한 다음 최종 50ml까지 물을 보충해 주었다. 최종적인 각 용기의 pH는 아래의 그림과 같다. 각 용기의 추출시간은 모두 동일하게 30분으로 하였으며 주기적으로 교반해 주면서 실험을 실시하였다. 주어진 30분이 경과한 뒤 각 용기로부터 용해 액을 1ml씩 취한 다음 10,000g에서 5분간 원심 분리하여 얻은 상등 액에 존재하는 단백질 농도는 280nm 파장에서의 흡광도 측정을 통해 단백질 함량으로 비교하여 결정하였다. 각 시료의 측정파장에서의 값은 증류수에 대비하여 측정하였다.

결과를 보면 쌀겨에 처리한 알칼리 조건은 용액의 pH가 상승할수록 가용성 단백질이 많이 용해되고 있음을 보여주고 있다. 특히 pH 10이상에서는 용해 단백질 농도가 크게 증가함을 보이고 있다.

실시예 2

실시 예1에서와 동일한 방식으로 시료를 준비하되 추출용액의 pH를 12 이상으로 조절하고 30분간 알칼리 추출을 한 다음, 불용성물질을 제거한 후 구연산을 적절히 희석하고 차별적으로 가해 줌으로써 각 용액의 pH를 차별적으로 저하시켰다. 각 용기의 최종적인 PH는 아래의 그림에 표시하였다. 각각의 최종 pH에서 각 용기로부터 1ml씩 용액을 취한 다음 10,000g에서 5분간 원심 분리하여 얻은 상등 액의 단백질 추출농도를 아래의 단백질 농도를 구하는 식에 의하여 결정하였다. 각시료의 측정파장에서의 값은 증류수에 대비하여 측정하였다.

결과를 보면 상등 액에 존재하는 단백질의 양은 pH 6이하에서 급격히 낮아짐을 알 수가 있으며 이는 대부분의 가용성 단백질이 이 pH 범위 대에서 침전을 형성함을 보여준다 특히 3.5 내지 4.5 범위에서 최대의 침전을 얻을 수가 있다.

실시예 3

실시예 1과 같이 안정화된 쌀겨 1.5g을 취한 뒤 각기 다른 용기에 넣고 첨가한 물의 부피를 아래의 그림과 같이 달리 처리하였다. 용액의 pH를 12 이상으로 조절하고 10분간 방치한 다음 불용성 물질을 제거하고 용해된 상등 액에 존재하는 탄수화물의 양을 Dubois M. et al의 방법에 따라서 결정하였다(Colorimetric method for determination of sugars and related substances.Anal. Chem. 1956, 28 pp350-356). 이때 표준 품은 glucose와 fructose를 각각 0, 10, 20, 30, 40, 50, 60ug씩 준비하여 시료와 동시에 분석하였으며 측정시료의 정량 값은 각 표준품에 대입하여 얻은 값의 평균치로 계산을 하였다. 페놀-황산 처리를 통해 발색을 유도한 후 490nm에서 정량을 하였으며 얻어진 값을 총 부피로 환산을 하여 아래의 그림에 표시하였다.

결과를 보면 처리한 물의 부피가 증가할수록 수용성 탄수화물의 총량이 낮아지는 경향이 있으며 총 당분의 회수량이 919mg 내지 1163mg 범위 내에서 얻어지고 있음을 보이고 있다. 따라서 처리하는 부피를 최소화하면서 많은 양의 당 추출물을 얻을 수 있는 범위는 바람직하게는 쌀겨 g당 30ml 내지 70ml 범위이다.

실시예 4

쌀겨 3g을 100ml의 물에 현탁한 후 용액의 pH를 12 이상으로 조절하고 30분간 방치하였다. 불용성 물질을 제거한 후 빙초산을 가하여 용액의 pH를 4.24까지 저하한 후 4ml씩 취하여 4개의 용기에 각각 분주하였다. 10,000g에서 5분간 원심분리하여 상등 액은 버리고 침전물을 취한 다음 이를 원심 분리형 진공건조기(speed vac)에서 24시간동안 진공건조하였다. 얻어진 건조 침전물의 중량을 측정한 결과 침전물은 건조 전의 중량대비 평균 15%선으로 얻어졌다. 이를 아래의 표에 나타내었다.

위의 표로부터 초기 4ml에 함유된 침전건조물의 평균중량은 24.25mg이었고 이를 총 추출부피 100ml로 환산하면 약 606mg의 침전물이 얻어졌다. 따라서 초기에 사용된 쌀겨의 무게가 3g이므로 초기중량 대비 약 20%의 추출효율을 얻었다.

실시예 5

실시예 4에서 유기산으로 pH 4.24까지 조절된 시료를 가지고 원심 분리하여 침전을 회수하는데 있어서, 침전으로 단백질이 분리되기 전의 총 단백질량 대비 원심분리 후 각 상등 액과 침전물로 분포되는 단백질의 함량변화를 조사하였다. 단백질 정량은 80%의 빙초산 2.5ml에 측정시료를 20ul ∼ 50ul범위 내에서 적절히 가하여 vortex하여 충분히 용해한 후 실시예 2의 단백질 농도 계산식을 이용하여 결정하였다. 그 결과 유기산 처리를 통해 얻는 침전물에 존재하는 단백질의 함량은 9 : 1 (침전물 : 상등액)의 비로 분포됨을 확인하였다.

이러한 결과는 15% SDS-PAGE를 통한 전기영동 결과에서도 확인이 되었다.

실시예 6

실시예 4에서 얻은 침전 건조물에 함유된 단백질의 함량을 계산하기 위하여 4개의 용기에서 얻은 각각의 침전물에 100mM NaOH 용액을 첨가하여 최종 1㎖가 되게 하였다. 실시예 4에서 각 용기의 평균 건조 침전물 중량은 24.25mg을 확인한 바 있다. 100mM NaOH 용액에 용해된 단백질을 얻기 위해 충분히 용해한 직후, 각 용기를 10,000g에서 5분간 원심분리 하고 얻은 상등액을 각각 20ul씩 취하여 실시예 5에서와 같이 80% 빙초산 용액 2.5ml에 넣고 충분히 흔들어 맑게 용해한 다음 동일한 방법으로 단백질 농도를 결정하였다.

그 결과 100mM NaOH 용액 1ml에 용해된 단백질의 양은 19.2mg, 21.1mg, 22.7mg, 25.4mg으로 얻어 졌으며 평균 22,11mg의 단백질을 함유하고 있는 것으로 나타났다. 이를 통해 건조중량으로 얻어진 무게의 약 91%는 단백질로 결정되었다.

실시예 7

쌀겨의 알칼리 추출물로부터 유기산을 이용하여 침전으로 얻어진 단백질의 저 분자화를 위해서 침전물을 50mM Tris (pH 7.0) 완충용액으로 현탁하고 단백질 정량을 실시예 5에서와 동일한 방법으로 측정한 결과 단백질 농도가 24.3mg/ml인 시료를 확보하였다. 한편 식물성단백질 분해 효소인 브로머레인(2.8 units/mg solid)은 미국 시그마(Sigma) 사에서 구입하였다. 265mg 브로머레인 분말을 50mM Tris (pH 7.0) 용액 10ml에 용해한 후 원심 분리하여 상등액을 사용하였다. 상등액의 단백질 농도는 실시예 5에서와 동일하게 측정한 결과 17.3mg/ml로 얻어졌다. 제조된 브로머레인(bromelain) 효소용액은 분주하여 사용 시까지 - 20도 냉동고에 보관하였다. 효소반응 조건은 쌀겨 단백질 10ul (2.43mg 단백질 상당)에 50mM Tris (pH 7.0) 용액 100ul를 첨가한 후 준비된 브로머레인 효소용액 10ul (173ug 단백질 상당)를 첨가한 후 55도로 조정된 오븐에서 반응을 시작하였다. 반응개시 후 11분, 23분, 63분, 90분, 135분에 시료를 취하여 SDS-PAGE 샘플 완충용액(3X) 100ul를 첨가하고 가열하여 반응을 중지시켰으며 모든 반응이 완료된 후 15% SDS-PAGE에서 전기영동을 하여 저 분자화 된 단백질의 분자량 크기를 비교 분석하였다.

상기의 결과를 보면 2번의 고분자 단백질이 주어진 조건에서 모두 분자량 6K이하로 절단되었음을 확인하였다.

실시예 8

실시예 6에서와 같이 유기산을 이용하여 침전으로 얻어진 단백질의 저 분자화를 위해서 이번에는 침전물을 50mM 트리스 (pH 7.0) 완충용액으로 현탁한 쌀겨 단백질에 식물성 단백질 분해 효소인 파파인(papain, 미국 시그마)을 처리하였다. 270mg 파파인을 50mM Tris (pH 7.0) 용액 10ml에 용해한 후 원심 분리하여 상등액을 사용하였다. 상등액의 단백질 농도는 이전과 동일하게 측정한 결과 23.9mg/ml로 얻어졌다. 제조된 파파인 효소용액은 분주하여 사용 시까지 -20도 냉동고에 보관하였다. 효소반응 조건은 쌀겨 단백질 100ul(2.43mg 단백질 상당)에 50mM Tris (pH 7.0) 용액 100u]를 첨가한 후 준비된 파파인 효소용액 10ul (239ug 단백질 상당)를 첨가한 후 70도로 조정된 오븐에서 반응을 시작하였다.

반응개시 후 17분, 24분, 35분, 60분에 시료를 취하여 SDS-PAGE sample buffer(3X) I00ul를 첨가하고 가열하여 반응을 중지시켰으며 모든 반응이 완료된 후 15% SDS-PAGE에서 전기영동을 하여 소화된 단백질의 분자량 크기를 비교 분석하였다.

상기의 결과를 보면 실시예 7에서와 유사하게 2번의 고분자 단백질이 주어진 조건에서 17분 이내에 모두 분자량 6K이하로 절단되었음을 확인하였다.

실시예 9

쌀겨 단백질과 반응하는 브로머레인 효소의 최적 반응 비율을 조사하였다. 2.43mg의 쌀겨단백질에 각기 다른 양의 브로머레인 효소 86.5ug, 17.3ug, 0.173ug을 각각 첨가한 다음 10분간 55도에서 반응을 시킨 후, 이전의 실시 예에서와 마찬가지로 15% SDS-PAGE를 통해 효소반응의 결과를 확인하여 그 결과를 아래의 그림에표시하였다.

그 결과를 보면 10분간의 반응에도 불구하고 쌀겨 단백질과 효소의 정량적인 비가 14,000(w/w) 조건, 즉 0.173ug의 효소를 첨가한 용기에서 분자량 6,000이하의 저 분자 펩타이드가 형성되었고 분자량 22,000 전후의 일부 단백질이 미약하게 존재함을 확인하였다. 따라서 반응시간이 10분 이상 주어진다면 14,000:1 (rice protein : bromelain, w/w) 비율에서도 모든 단백질 기질이 저 분자화 될 수 있음을 확인하였다.

실시예 10

실시예 4에서 수행한 알칼리 추출을 통해 가용성 단백질을 모두 추출하고 남은 탈수된 불용성 쌀겨에 99.5% 에탄올을 30ml 첨가하였다. 30분마다 충분히 흔들어 주면서 에탄올 추출을 상온에서 2시간 동안 실시한 후, Careri etl al (Journal of Chromatography A. 935(2001) 249-257)의 방법에 따라 베타-시토스테롤(β-sitosterol)과 스티그마스테롤(stigmasterol) 분석을 실시하였다. 간단히 설명하면, 에탄올 추출액을 에틸 아세테이드(ethyl acetate)와 물의 혼합액에 첨가하여 충분히 교반한 다음 수용층을 회수하고 다시 에틸 에테르(diethyl ether)로 수용층을 3회 추출한 다음 얻은 에칠 에테르를 질소가스로 모두 제거하고 남은 잔유 물에 에틸 에테르를 1ml 첨가하여 재용해 하였다. 표준 베타-시토스테롤은 미국 시그마(Sigma) 사에서 합성 품을 구입하여 에틸 에테르(diethyl ether)로 용해하여 100ug/ml 농도로 만들어 사용하였으며 고압 역상 C8 HPLC 칼럼(reverse phase C8, 0.46 cm x 25 cm, Vydac column)전개를 통해 쌀겨의 불용성 물질에 동 식물성스테롤이 풍부하게 존재함을 확인하였고 쌀겨에서 본 실시예의 방법에 의해 식물성스테롤이 간단히 추출 및 제조 될 수 있음을 확인하였다. 표준품과 에탄올 추출한 시료의 HPLC 전개 결과는 아래의 그림에 나타내었다.

위의 그림은 표준품(10ul, 100ug/ml) 전개 내역이고 아래 그림은 본 발명의 실시예 10에서 추출한 식물성스테롤의 순도 및 함량을 보여준다. 표준품(1ug) 크로마토그램에서 1번 피크는 스티그마스테롤(stigmasterol)이며 2번 피크는 베타-시토스테롤(β-sitosterol)이다. 칼럼 전개조건은 아세토나이트릴-물(86.14, v/v)로 이동상을 구성하고 유속은 분당 0.3ml으로 하였다. 측정파장은 208nm이다.

이상에서 상세히 설명하고 입증하였듯이, 본 발명은 생리활성 물질인 천연유래 필수아미노산 펩타이드를 포함하는 조성물 및 그의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 전 세계적으로 매년 방대한 양이 생산되는 쌀겨로부터 우리 몸에 유익한 저 분자성 생리활성 물질을 포함한 필수아미노산등을 저렴한 가격으로 그리고 대량 생산이 가능케 하는 방법을 제공할 뿐 아니라 일차적으로 쌀겨의 가용 단백질을 추출하고 남은 불용성 물질로부터 이차적으로 콜레스테롤 흡수억제 기능이 있는 식물성 스테롤(phytosterol)을 고 순도로 얻음으로써 두 가지의 유용한 생리물질을 농산 폐기물 자원으로부터 동시에 회수하는 방법을 제공한다. 이로써 향후 국내의 농가수익 개선에 큰 기여를 할 수 있을 뿐 아니라, 그 동안 가축사료 정도로 활용되어온 쌀겨로부터 우리 몸에 유익한 영양성분을 추출하여 공급할 수 기반을 마련하게 되었다. 본 발명에 의한 최종산물은 천연형 필수 아미노산을 포함하는 각종 쌀겨유래의 유기산 및 식이섬유 그리고 식물성 스테롤 등 건강에 유익한 물질이며 저 분자성 완전 건강식품 및 식품 첨가물로 사용이 가능하다.

Claims (3)

1. 쌀겨로부터 알칼리 추출한 후 유기산 처리를 통해 침전으로 회수한 단백질을 식물성 단백질 분해효소로 저 분자화 한 천연형 필수 아미노산 펩타이드를 포함하는 조성물 및 그의 제조방법.
2. 천연형 필수 아미노산 펩타이드 조성물의 제조에 대해서, 알칼리 추출은 쌀겨 Kg당 30리터 내지 100리터의 수용성 추출부피를 유지하는 단계에서 pH 10이상에서, 바람직하게는 pH 12이상에서 최소 10분 내지 2시간 이내로 교반 실시하는 공정; 불용성물질이 제거된 알칼리 추출 액에 대해서 식초산 또는 구연산을 첨가하여 최종용액의 pH가 3 내지 6 이내로, 바람직하게는 4 내지 4.5범위 사이로 조절하여 얻은 쌀겨 단백질을 침전 회수하는 공정, 회수된 쌀겨 단백질 침전체에 대해서 식물성 단백질 분해효소를 처리하는 단계에서 반응 액의 온도는 60 ± 10도임과 동시에 pH는 5 내지 8 범위로, 바람직하게는 pH 6 내지 7범위 이내로 조절하여 처리하는 공정을 포함하는 제 1항의 천연형 필수 아미노산 펩타이드가 포함된 조성물을 제조하는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 식물성 단백질 분해효소는 브로머레인 또는 파파인을 사용하는 것을 특징으로 하며 브로머레인의 경우, 최적의 반응비율은 [쌀겨단백질]/[효소]의 중량 비가 최대 14,000 이하 내지 30 이상의 범위로 유지되면서 처리하는 방법.