KR20040019750A - 죽염을 유효성분으로 함유하는 비만 세포를 매개로 하는염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 죽염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 조성물을 복용함으로써 비만 세포의 활성물질인 TNF-α, IL-1β, IL-6 의 분비를 억제하여 비만세포를 매개로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료에 탁월한 효과를 갖는다.

Description

죽염을 유효성분으로 함유하는 비만 세포를 매개로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical composition comprising Bamboo salt for inflammatory diseases}

본 발명은 비만 세포를 매개로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적인, 죽염을 유효성분으로 함유하여 구성되는 약학 조성물에 관한 것이다.

우리가 일상적으로 경험하는 감기, 설사, 화상 등의 증상들은 모두가 염증에 의해서 일어난다. 감기는 바이러스의 상기도 감염으로 일어나고, 설사도 역시 바이러스나 세균의 소화관 감염으로 일어나며, 화상은 고온이라는 물리적 자극에 의해서 일어난다.

염증은 폐쇄 혈관계를 갖춘 척추 동물들의 특유한 반응으로, 인체 중에서 눈의 각막과 같이 혈관이 없는 조직에서는 염증이 일어나지 않는다. 발적, 종창, 발열, 동통 등은 염증에 동반되는 증상들로 염증의 원인으로는 물리적 자극, 화학적 자극, 병원생물, 면역반응 등이 있다. 그런데, 이렇게 원인은 다양하지만 나타나는 증상은 아주 비슷한데 이것은 곧 인체가 외부의 자극에 응답하는 방법이 각 원인별로 모두 다른 것이 아니라, 염증 반응이라는 동일한 방식으로 반응하고 있음을 의미한다. 과학의 발달과 더불어 오늘날 염증반응에 대한 탐구는 세포 및 분자 수준에서 그 이해의 폭을 넓혀가고 있는데 그 중의 하나가 바로 비만 세포이다.

비만세포는 피부, 호흡기, 위장관의 점막, 임파관 주위, 혈관 주위, 뇌 등 전신의 장기에 널리 분포하며, 알레르기 반응 및 다양한 염증 반응의 원인세포로 알려져 있다. 비만세포는 탈과립을 일으킬 수 있는 자극에 의하여 세포내 과립에 저장되어 있던 화학적 매개 물질들을 유리하게 된다. 그 중에서 히스타민은 가장 빠르게 유리되어 말초혈관 확장작용, 기관지 평활근 수축작용, 선세포의 분비항진 작용 등을 나타내어 즉각형 알레르기 반응 및 염증반응을 일으킨다. 비만세포는 세포막에 있는 여러 가지 수용체를 통해서 활성화된다. 비만세포를 활성화시키는 매개물질로는 컴파운드 48/80, IgE 항체, 프로테인 키나아제 C(PKC) 활성화제인 포르볼(phorbol) 12-미리스테이트(myristate) 13-아세테이트(acetate)(안티-DNP IgE), 칼슘 이오노포어(calcium ionophore)(A23187)등이 있다. 비만세포에서 유리되는 화학적 매개 물질의 양은 히스타민이 가장 많다. 그러나, 알레르기 반응의 새로운 개념인 알레르기성 염증 반응은 이들 화학적 매개물질의 작용만으로는 설명하기 어렵다.

최근에 발표된 많은 병리소견에서 만성 염증성 반응이 알레르기 반응에서 공통적으로 발견되었고, 특히 6시간 전후에 나타나는 후기 반응의 기전이 염증반응으로 이해되고 있기 때문에 비만세포로부터 유리되는 화학적 매개 물질 외에 염증성 사이토킨인 종양괴사인자-알파(tumor necrosis factor, TNF-α), 인터루킨-1(IL-1)과 인터루킨-6(IL-6)가 이러한 알레르기성 염증반응의 유도에 결정적인 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

TNF-α, IL-1α, IL-1β, IL-6 등을 포함하는 염증성 세포 활성 물질은 질병 또는 상처가 진행되는 과정에서 빠르게 유도되고 초기에 발현되는 특징이 있다. 이러한 세포활성 물질은 무수한 치료과정(healing process)을 매개하고 조절한다. 하지만 과잉 발현되었을 경우에는 질병상태를 더욱 악화시키게 된다.

종래의 염증성 질환 치료물질은 크게 스테로이드 제제와 비스테로이드 제제로 나누어진다. 스테로이드제는 지금껏 일류가 개발한 약제 중 가장 강력한 항염작용을 지니고 있으나, 장기적으로 사용할 때 반드시 부작용을 수반하는 단점이 있다. 비스테로이드제(Non-steroidal anti-inflammatory drugs)는 항염, 해열 진통작용을 나타내며, 화학적으로 여러 가지 그룹이 있으나, 이들 모두가 카이클로옥시제나아제(cyclooxygenase;COX)억제 작용이 있으며, 그 결과에 의한 프로스타글란딘 합성 억제가 그의 치료 효과의 주역이 된다.

그러나, 위 점막의 프로스타글란딘 합성의 억제는 소화불량, 오심, 위염 등과같은 위장관 장애를 일으키는 경우가 많다. 더욱 심한 유해작용으로는 위장관 출혈과 천공을 일으킨다. 또한, 신장의 프로스타글란딘 합성 억제는 특히, 혈관 수축물질인 카테콜아민과 안지오텐신Ⅱ 방출과 관련된 상태의 환자에서 나트륨 저류, 신혈류량 감소 및 신부전을 일으킨다. 그 외에도 비스테로이드제는 간질성 신염 및 고칼륨 혈증을 일으키며, 수년간 장기 복용시는 신유두괴사 및 만성신부전과 관련이 있다.

한편, 항 히스타민제는 주로 가려움을 줄여주는 역할을 하지만 증세를 근본적으로 호전시키지는 못한다.

따라서, 기존 항염 치료제의 단점을 보완하면서 효과적이고, 실용적이며, 안정성이 있는 염증 질환 예방 및 치료법의 개발이 절실히 요구되고 있는 실정이다.

이에 본 발명자들은 보다 효과적인 염증성 질환의 예방 및 치료제를 개발하기 위하여 지속적인 연구를 한 결과, 죽염이 비만세포에서 분비되는 염증성 세포활성 물질인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 분비 억제와 관련하여 효능이 탁월함을 확인하였고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

도 1a 및 1b는 HMC-1 세포에서의 세포 생존도에 대한 죽염의 효과를 나타낸 그래프이고,

도 2는 RT-PCRDP 의한 HMC-1 세포내 TNF-mRNA의 발현에 있어서 죽염의 억제효과를 나타낸 도이다.

즉, 본 발명은 죽염을 유효성분으로 함유하여 비만세포를 매개로 하는 염증성 질환의 예방 및 치료에 효과적인 약학적 조성물을 제공하는 것으로, 상기 조성물은죽염을 약제학적으로 허용되는 담체와 혼합하여 구성한다.

이하, 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 아래와 같다.

본 발명에 따른 조성물의 유효성분인 죽염(bamboo salt)은 전통적 방법에 의해 죽염 제조공장에서 제조된 식염죽염으로서 9회 구운 죽염으로, 구체적으로는 흰 소금을 넣고 황토로 밀봉하여 800 내지 1500℃로 9번 구운 후 완성된 죽염을 분말화 하고, 그 분말을 약제학적으로 허용되는 담체와 함께 혼합 조성한 후, 통상적인 약제 제조방법을 이용하여 적당한 제형으로 제조할 수 있다.

본 발명에 따른 죽염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물은 효과적인 면에서 분말형태가 가장 바람직하나, 환제, 액제, 분무제, 캡슐제 형태로 제조할 수 있고, 필요에 따라 사용시에 다른 제형으로 바꾸어 사용할 수 있음은 물론이다.

본 발명에 따른 죽염을 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물의 약리 효과는 하기 실험예 1 내지 3으로부터 확인될 수 있으며, 하기 실험예가 본 발명의 범위를 제한하는 것은 아니다.

실시예 1

죽염 분말의 제조

전통적 방식으로 9회 구운 죽염을 분쇄기로 분말하여 죽염 분말을 얻었다.

실험예 1

염증성 세포 활성물질의 억제 효과

염증성 질환의 종류와 원인은 다양하며, 그 연구 방향도 다양한 각도로 진행되고 있다. 그 중 비만세포에서 사이토카인의 분비량을 조사하는 것은 이와 같은 질환을 연구하는데 좋은 지표가 된다.

TNF-α, IL-1β, IL-6 등은 비만세포가 분비하는 대표적인 사이토카인 들에 속한다. 따라서, 어떤 유효 약물이 이들 사이토카인의 분비를 억제하는 경우 그 약물의 염증 억제 효과를 유추 할 수 있게된다.

이에 본 실험에서는 비만 세포주 인간 비만 세포(HMC-1 cells)를 이용하여 실시예 1에서 제조한 샘플을 인간 비만세포에 처리한 후 그 세포로부터 분비되는 TNF-α, IL-1β, IL-6 양을 분석하였다.

실시예 1에서 제조 샘플이 PMA와 칼슘이오노포어(calcium ionopore) A23187 자극에 의해 생성된 TNF-α와 인터루킨의 분비를 조절하는지 알아보기 위하여 세포를 자극원으로 자극하기 전에 상기 샘플을 세포내 미리 처리하였다. 배양된 상층액 중의 TNF-α, IL-1β, IL-6 의 수준을 조사하기 위해 96 웰(well) 엘리자 플레이트(ELISA plate)에서 엘리자를 이중으로 실시하였다.

사이토카인에 대한 모노클로날 항체, 정제된 항-뮤린 TNF-α, IL-1β, IL-6를 PBS(pH 7.4)로 희석하여 96웰 플레이트에 100㎕씩 각각 코팅한 후 4℃에서 12시간 동안 방치하였다. 이 플레이트를 0.05% 트윈(Tween)을 함유하는 PBS로 세척한 후 1% BSA, 5% 슈크로스(sucrose) 및 0.05% NaN₃를 함유하는 PBS로 1시간 동안 블로킹(blocking) 하였다.

수 차례 세척한 후 원심 분리하여 얻은 상층액과 표준 사이토카인을 첨가하고 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 그 후 각 웰을 재 세척하여 2차 항체 TNF-α, IL-1β, IL-6를 첨가하여 다시 37℃에서 2시간 동안 방치하였다. 웰을 세척한 후 래빗(rabbit) IgG-컨쥬게이트된 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase)와 아비딘 퍼옥시다아제(avidine peroxidase)를 첨가하고 37℃에서 20분간 방치하였다. 웰을 재 세척한 후 PNPP의 ABTS 기질을 첨가하고 발색반응은 ELISA 리더를 사용하여 405 nm에서 측정하였다.

상기와 같은 실험결과 비만세포에 실시예 1에서 제조한 샘플을 처리하였을 때 TNF-α, IL-1β, IL-6 분비는 각각 최고 67, 68, 69%까지 억제되었으며, 이를 표 1에 나타내었다. 이러한 결과는 인간 비만세포에 있어서, 실시예 1에서 제조한 샘플이 TNF-α, IL-1β, IL-6의 분비를 조절한다는 것을 보여준다.

결과적으로, 본 발명의 조성물이 염증성 사이토카인인 TNF-α, IL-1β, IL-6의 발현을 억제하는 기전에 의해 비만세포를 매개로 하는 염증성 질환의 치료에 유용한 조성물임을 알 수 있다.

HMC-1 세포내에서 PMA 와 A23187-자극에 의해 생성되는 TNF-α, IL-1β, IL-6 분비에 관한 죽염의 효과

처리액	농도(㎎/㎖)	억제율(%)
		TNF-α	IL-1β	IL-6
생리식염수	-
죽염	0.01	26.65 ±1.35	7.09 ±0.14	7.13 ±3.45
	0.1	46.12 ±0.15	53.03 ±2.09	45.3 ±1.32
	1	67.04 ±0.08	68.01 ±1.85	69.48 ±0.54
NaCl	1	24.42 ±1.58	-	27.57 ±1.82

PMA와 A23187로 자극된 HMC-1 세포(3×10⁵)를 죽염 또는 염화나트륨의 존재 또는 비존재하에서 6시간 동안 배양하였다. 담체내로 분비된 TNF-α, IL-1β, IL-6은 실험예 1 내지 3에서 평균 ±SEM값으로 나타내었다.

* P<0.05: 생리식염수 값과 현저히 다름

실험예 2

세포독성 확인 실험

실시예 1에서 제조한 샘플의 세포독성 실험은 MIT 분석을 통하여 관찰하였다. 인간 비만세포 2.5×10⁴을 4웰 플레이트에 주입하고 실시예 1에서 제조한 샘플을 농도별로 처리하고 24시간 동안 배양한 후에 보존액을 제거하였다. 여기에 보존액 500㎕를 넣고 MIT(5㎎/㎖)20㎕를 가한 후 4시간 동안 다시 배양하였다. 생성된 포마잠을 DMSO로 녹여서 ELISA 리더를 사용하여 540nm에서 측정하였다. 그 결과, 죽염은 세포 생존율에 영향을 미치지 않음을 확인하였고, 그 효과를 도 1의 a 및 b로 나타내었다.

도 1a 및 1b는 HMC-1 세포에서의 세포 생존도에 대한 죽염의 효과를 나타낸 것으로, 여기서 세포 생존도는 HMC-1 세포에 죽염과 염화나트륨을 0.01 내지 1㎎/㎖로 처리한 후 24시간 동안 MIT 분석에 의해 평가된 값이다. 생존할 수 있는 셀의 %는 각 조건에서 95% 이상으로, 도면에 표시된 데이터는 3가지 실험의 평균 ± SEM을 나타내는 것이다.

실험예 3

비만세포에서 종양괴사인자-알파(TNF-α)발현 억제 실험

비만세포가 분비하는 사이토카인 중 TNF-α는 대표적 염증성 사이토카인의 하나이다. 따라서, 실험예 1에서 관찰한 이 염증성 사이토카인의 분비 억제를 다른 방법으로 확인하기 위하여 RNA 수준에서의 TNF-α 발현 억제 여부를 관찰하기로 하였다. 이에 본 실험에서는 실시예1에서 제조한 샘플을 증류수로 녹여서 인간 비만세포(HMC-1)에 처리한 후 그 세포로부터 TNF-α의 발현 조절 여부를 RT-PCR을 이용하여 조사하였다. 총 RNA는 이지-블루(Easy-Blue)를 사용하여 비만세포로부터 분리하였다.

TNF-α의 프라이머는 5'CGG GAC GTG GAG CTG GCC GAG GAG3' ; 5'CAC CAG GTT ATG GTT ATC TCT CAG CTC3'이고 β-액틴(5' GTG GG CGC CCC AGG CAC CA3' ; 5' GTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC3')으로 실험의 안정성을 확인하였다. PCR을 위한 아닐링 온도는 60℃, TNF-α와 β-액틴의 증폭된 단편 크기는 각각 355bp, 661bp였다. 생성물은 1.5% 아가로스겔에 전기 영동하여 에티디움 브로마이드(ethidium bromide)로 염색하였다. PMA+A23187로 HMC를 자극했을 때 자극하지 않은 세포에 비해 TNF-α mRNA가 대폭 증가하였는데, 죽염을 함께 처리하였을 때 TNF-α의 발현이 현저하게 감소됨을 알 수 있었고, 이를 도 2에 도시하였다. 도 2는 RT-PCRDP 의한 HMC-1 세포내 TNF-mRNA의 발현에 있어서 죽염의 억제효과를 나타낸 것으로, 총 RNA는 HMC-1 세포들로부터 분리하였고, HMC-1 세포들을 PMA와 A23187로 자극하기 전에 30분간 죽염으로 미리 처리하였다.

도 2에서 레인 1은 대조군, 레인 2는 PMA+A23187, 레인 3은 PMA와 죽염(1㎎/㎖)을 나타내는 것이다.

이상에서 상술한 바와 같이, 죽염을 유효성분으로 함유하는 조성물을 투여함으로서 비만 세포의 활성물질인 TNF-α, IL-1β, IL-6 의 분비를 억제하여 염증성 질환에 우수한 효과를 나타낸다.

Claims (2)

1. 죽염을 유효성분으로 함유하는 염증성 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 염증성 질환은 비만세포를 매개로 하는 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.