KR20040011895A

KR20040011895A - 소의 뇌에서의 신규한 칼슘 비의존적 포스포리파아제 에이투 효소, 이의 용도 및 제조 방법

Info

Publication number: KR20040011895A
Application number: KR1020020045190A
Authority: KR
Inventors: 김대경
Original assignee: 김대경
Priority date: 2002-07-31
Filing date: 2002-07-31
Publication date: 2004-02-11

Abstract

본 발명은 소의 뇌에서의 신규한 칼슘 비의존적 포스포리파아제 에이 투 효소(Ca²⁺independent phospholipase A₂, iPLA₂), 이들의 용도 및 제조방법에 관한 것이다.

본 발명의 iPLA₂는 SDS-PAGE상에서 측정한 분자량이 170kDa이고, pH 9.0∼9.5에서 최대활성을 나타내며, 특이활성도는 21,500 n㏖/분/㎎이고, 기존의 85 내지 88 kDa의 그룹 Ⅵ A PLA₂의 특이적 저해제인 브로모엔올락톤(BEL)에 의해 활성저하가 일어나지 않는 것을 특징으로 하는 효소이다.

따라서 본 발명의 iPLA₂가 관여하는 생리현상의 연구분야 및 iPLA₂가 관련된 질환의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

소의 뇌에서의 신규한 칼슘 비의존적 포스포리파아제 에이 투 효소, 이의 용도 및 제조 방법{Novel Ca2+ independent phospholipase A2, iPLA2,in bovine brain and its use and the preparation method thereof}

본 발명은 소의 뇌에서의 신규한 칼슘 비의존적 포스포리파아제 에이 투 효소(Ca²⁺independent phospholipase A₂, iPLA₂), 이의 용도 및 제조 방법에 관한 것이다.

포스포리파아제 A₂(Phospholipase A₂, PLA₂)는 생물학적인 막의 중요한 구성요소인 포스포리피드(phospholipid)의sn-2 위치의 아실 결합을 가수분해하는 효소로, PLA₂반응의 가수분해산물은 유리 지방산들(free fatty acids) 및 리소포스포리피드(lysophospholipid)이며, 생체 내에서 다양한 생리작용에 관여한다.

PLA₂의 분해산물인 리소포스포리피드는 혈소판-활성인자(platelet-activating factor, PAF)의 전구물질이고, PLA₂에 의해 방출된 지방산들은 에너지의 저장원의 역할을 하며, 특별히, PLA₂에 의한 아라키돈산(arachidonic acid)의 방출은 세포기능의 조절에 있어서 중요한 사건들 중의 하나이다(Irvine, R.F.;Biochem. J.,204, pp3-16, 1982; Dennis, E.A. et al.;FASEB.J.,5,pp2068-2077, 1991).

아라키돈산은 세포내에서 시클로옥시게나아제(cyclooxygenase)와 리폭시게나아제(lipoxygenase)를 포함한 다양한 옥시게나제에 의한 산화를 통하여, 프로스타글란딘, 트롬복산, 류코트리엔 등의 에이코사노이드(eicosanoid)로 변환된다(Drazen,J.M. et al.;P. N. A. S. USA,77, pp4354-4358, 1980; Weichman, B.M. et al.;J. Pharmacol. Exp. Ther.,222, pp202-208, 1982; Clark M.A. et al.;Eur. J. Pharm.,116, pp207-220, 1985; Samuelsson B. et al.;Science,237, pp1171-1176, 1987; Smith W.L. et al.;Am. J. Physiol.,263, ppF181-F191, 1992). 이러한 에이코사노이드들은 호르몬과 같이 배란, 신장 수분평형 및 면역작용 등을 포함하는 다양한 생리 작용의 메신저 역할을 수행하며, 혈관계에서는 염증 반응, 적혈구 조혈, 혈액 응고 및 혈압 조절 등의 현상에 관여한다.

프로스타글란딘은 거의 모든 세포에서 만들어지는 에이코사노이드로, 혈관 수축을 촉진하며, 염증 반응시 통증에 대한 신경세포의 민감성을 높이고, 적혈구의 부피 조절과 여과를 저해한다.

트롬복산은 혈소판에서 생성되는 에이코사노이드로, 혈소판을 응집시키는 한편, 혈류 속도를 감소시켜 혈액응고시간을 확보해 주는 등, 혈전 형성에 관여한다.

류코트리엔은 백혈구에서 생성되며, 염증 반응 유발에서 중요한 역할을 담당하여 알레르기 반응 등을 유발한다.

이들 에이코사노이드는 생체 내에서 반드시 필요한 조절 물질이나, 이들의 과잉 생성은 혈소판의 응집능을 높여 혈관 내 혈전 축적을 초래하고, 혈관의 과도한 수축을 유발할 수 있기 때문에, 동맥 경화, 뇌경색, 협심증, 심근경색, 만성적인 염증 증상, 면역기능장애, 암 등의 질환을 유발하게 된다. 실제로 한국인의 사망 원인 중 혈전과 혈관 수축에 관련된 질환이 암에 이어 2위를 차지하는 것으로 보고되고 있어서, 이들 질환에 대한 대책이 시급하다.

PLA₂는 상기 질환들 유발의 일련의 단계적 반응을 시작시키는 유망한 후보물질로서, PLA₂의 활성도 조절은 상기 질환의 예방 및 치료방법으로 가능하다.

따라서 상기 질환들의 유발 기전을 밝히고, 진단, 예방 및 치료하기 위해서는, PLA₂에 대한 명확한 이해와 함께 상기 효소의 활성을 저해할 수 있는 항체나 저해제에 대한 연구가 필요하다.

한편, 1-O-알킬-2-아실-sn-글리세로-3-포스포콜린이 PLA₂의 기질일 때, 결과산물은 혈소판-활성인자(PAF)를 위한 전구체(lyso-PAF) 및 다른 강력한 염증매개인자(Ramesha C.S. and Pickett W.C.;J. Biol. Chem.,261, pp7592-7595, 1986; Chao W. et al.;Biochem. J.,261, pp77-81, 1989; Suga K. et al.;J. Biol. Chem.,265, pp12363-12371, 1990; ChaoW. et al.;J. Biol. Chem.,265, pp17576-17583, 1990; Chao W. et al.;Arch. Biochem. Biophys.,282, pp188-197, 1990)가 될 수 있다. 에이코사노이드 및 PAF의 생성은 각각 아라키돈산 및 리소-PAF의 이용 가능 정도에 의해 제한될 수 있다.

다양한 성질을 가진 PLA₂들은 각각의 다른 조직과 세포 타입으로부터 특징이 밝혀졌다. 칼슘이온요구에 따라 PLA₂는 크게 칼슘 의존성 및 칼슘 비의존성형태의 두가지로 분류될 수 있다.

칼슘 의존성 PLA₂는 다시 분비성(secretory) 및 세포내 PLA₂로 나누어진다(Mayer, R. J. and Marshall, L. A.;FASEB J.,7, pp339-348, 1993).분비성 PLA₂의 형태는 세포에서 분비과립에 위치하며, 세포내 유리된 칼슘 농도에서는 활성이 없으며(Mizushima H. et al.;J. Biochem.,105, pp520-525, 1989), 포스포리피드의sn-2 위치에서 아라키돈산에 대한 특이성이 없다.(Hara S. et al.;J. Biochem.,105, pp395-399, 1989; Kramer R.M.;J. Biol. Chem.,264, pp5768-5775, 1989; Schalkwijk C.G. et al.;Biochem. Biophys. Acta.,1044, pp139-146, 1990). 이것은 분비성 PLA₂이 세포활성화 과정에 있어서 아라키돈산의 유리에 중요한 역할을 하지 않는다는 것을 제시한다. 고분자량 형태의 세포질 PLA₂는 정제됨으로써 그 특성이 밝혀졌다(Clark J.D. et al.;P.N.A.S. USA,87, pp7708-7712, 1990; Gronich J.H. et al.;Biochem. J.,271, pp37-43, 1990; Kramer R.M. et al.;J. Biol. Chem.,266, pp5268-5272, 1991; Lesile C.C. et al.;J. Biol. Chem.,266, pp11366-11371, 1991; Kim D.K. et al.;Biochem. J.,294, pp261-270, 1993), 클론화되었다(Clark J.D. et al.;Cell,65, pp1043-1051, 1991; Sharp J.D. et al.;J. Biol. Chem.,266, pp14850-14853, 1991). cPLA₂는 세포내에서 세포질에 존재하며, cPLA₂는 칼슘이온이 10^-7M 이상으로 존재하는 경우에 막으로 이동하여 포스포리피드의sn-2 위치에서 아라키돈산에 대한 높은 선호도를 나타낸다.

칼슘 비의존적 포스포리파아제 A₂(iPLA₂)는 촉매활성을 위하여 유리칼슘이온을 필요로 하지 않고, 많은 장기들(organs)에 넓게 분포한다(Peirik, A.J. et al.;Biochem. Biophys. Acta., 962, pp345-353, 1988). iPLA₂는 최근 분리정제되어 그 특성이 밝혀졌으며(Hirashima, Y. et al.;J. Neurochem.,59,pp708-714, 1992; Hazen, S.L. et al.;J. Biol. Chem.,265, pp10622-10630, 1990; Ackermann, E. J. et al.;J. Biol. Chem.,269, pp9227-9233, 1994; Wang R. et al.; Biochem. J. 304, pp131-137, 1994; Portilla, D. and Dai, G.;J. Biol. Chem.,271, pp15451-15457, 1996), 클론화되었다(Tang, J. et al.;J. Biol. Chem.,272, pp8567-8575, 1997). 개의 심장근육(canine myocardial)의 iPLA₂는 분자량 40kDa이고, 플라스메닐콜린(plasmenylcholine)에 높은 기질선호도를 보이나(Hazen, S.L. et al.;J. Biol. Chem.,265, pp10622-10630, 1990) 아직 클론화되지 않았다. 한편 P388D1 대식세포-유사 세포(P388D1 macrophage-like cell)의 iPLA₂는 분자량이 85kDa이며 분리정제되어 그 특성이 밝혀졌다. 그리고, 몇몇의 종(species) 및 CHO(chinese hamster ovary) 세포와 쥐의 P388D1 대식세포를 포함하는 세포 타입들에서 클론화되었다(Ackermann, E. J. et al.;J. Biol. Chem.,269, pp9227-9233, 1994; Tang, J. et al.;J. Biol. Chem.,272, pp8567-8575, 1997; Balboa, M.A. et al.;J. Biol. Chem.,272, pp8576-8580, 1998). iPLA₂의 이러한 형태를 그룹 Ⅳ PLA₂또는 iPLA₂α라고 부르며 이것들은 디팔미토일-포스파티딜콜린에 기질선호도를 갖고 있다(Ackermann, E. J. et al.;J. Biol. Chem.,269, pp9227-9233, 1994; Tang, J. et al.;J. Biol. Chem.,272, pp8567-8575, 1997). 게다가, 사람 및 래트의 폐로부터 유래한 iPLA₂가 최근에 클론화되었고, 이 iPLA₂는 또한 팔미토일-포스파티딜콜린에 기질선호도를 보이며 28.5kDa의 분자량을 갖는다(Kim, T.S. et al.;J. Biol. Chem.,272, pp2542-2550, 1998; Kim, T.S. et al.;Am. J. Physiol.,274, ppL750-761, 1998). 더욱 최근에 양으로부터 80kDa의 iPLA₂가 래트의 뇌로부터 분리정제되었다(Yang, H.C. et al.;J. Neurochem.,73, pp1278-1287, 1999). 그리고 인간게놈프로젝트 서열 분석 노력에 의해 확인된 단백질 서열의 분석으로 새로운 iPLA₂가 밝혀져 클론화되었다(Marcuso, D.J. et al.;J. Biol. Chem.,275, pp 9937-9945, 2000; Tanaka, H. et al.;Biochem. Biophys. Res. commun.,272, pp320-326, 2000).

iPLA₂는 기존의 알려진 번역후 변형 부위(posttranscription modification site)에서 일치되는 서열을 갖고 있음에도 불구하고(Tang, J. et al.;J. Biol. Chem.,272, pp8567-8575, 1997), iPLA 활성도는 ATP에 의해 조절되고(Hazen, S.L. et al.;Biochem. J.,280, pp581-587, 1991), 포스포푸룩토키나아제(Hazen, S.L. et al.;J. Biol. Chem.,268, pp9892-9900, 1993) 또는 칼모듈린(Wolf, M.J. and Gross, R.W.;J. Biol. Chem.,271, pp20989-200992, 1996) 또는 PKC(Akiba, S. et al.;J. Biol. Chem.,274, pp19906-19912, 1999)와 관련이 있다고 보고되고 있으나 조절 기작은 아직 밝혀진 바 없다.

그렇지만, 세포에서 iPLA₂의 기능은 아직 잘 알려지지 않았으나, iPLA₂는 막포스포리피드 리모델링(Balsinde, J. et al.;P.N.A.S. USA,92, pp8527-8531, 1995), 허혈(ischemia)(Ford, D. A. et al.;J. Clin. Invest.,88, pp331-335, 1991), 과산화수소-유도 세포손상(Goligorsky, M.S. et al.;Arch. Biochem. Biophys.,301, pp119-128, 1993) 및 노화(senescence)(Kim, S.S. et al.;Neuroscience Res., 1997), 림프구 증식(Roshak, A.K. et al.;J. Biol. Chem.,275, pp35692-35698, 2000), Fas-유도 세포자살(Atsumi, G. et al.;J. Biol. Chem.,273, pp13870-13877, 1998) 같은 세포내 복잡한 과정에 연관되어 있다고 보고되고 있다. 포유동물에서 아라키돈산의 유리는 에이코사노이드라고 하는 오타코이드(autacoid)를 생산하여 프로스타글란딘의 일종인 트롬복산 A2는 혈전증에 관여하고, 프로스타글란딘, 로이코트리엔 등은 염증에 관여하며, 이러한 아라키돈산 대사물은 뇌조직에서 생성되어 뇌졸중, 뇌부종 등에 밀접한 관련이 있음이 알려져 있다.

최근에, 우리는 소의 뇌의 균질분쇄액의 10,000g 의 상층액에서 iPLA₂활성을 발견하였다. 생화학적인 특성이 있는 정제된 균질혼합액은 그룹 Ⅳ iPLA₂및 기존의 iPLA₂와는 다른 특성을 확인하였다..

이에 본 발명자들은 iPLA₂의 활성을 가진 새로운 단백질을 검색 및 분리하기 위해 노력한 결과, 소의 뇌에서 기존의 iPLA₂와는 생화학적 특성이 다른 iPLA₂의 활성을 가진 단백질 분획을 분리 정제하여, 170kDa의 신규한 iPLA₂를 분리 정제하는데성공하여 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 신규한 iPLA₂효소, 이들의 용도 및 제조 방법을 제공하고자 한다.

도 1 은 iPLA₂의 분리 및 정제 방법을 개략적으로 나타낸 도이고,

도 2a 는 DEAE-셀룰로오스 음이온 교환 컬럼 통과 분획에 따른 iPLA₂의 활성도를 나타낸 그래프이고,

도 2b 는 페닐-5PW 소수성 컬럼 통과 분획에 따른 iPLA₂의 활성도를 나타낸 그래프이고,

도 2c 는 헤파린-세파로스 친화성 컬럼 통과 분획에 따른 iPLA₂의 활성도를 나타낸 그래프이고,

도 2d 는 G-3000 PW 젤 여과 컬럼 통과 분획에 따른 iPLA₂의 활성도를 나타낸 그래프이고,

도 2e 는 모노Q-음이온 교환 컬럼(I) 통과 분획에 따른 iPLA₂의 활성도를 나타낸 그래프이고,

도 2f 는 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC 컬럼(I) 통과 분획에 따른 iPLA₂의 활성도를 나타낸 그래프이고,

도 2g 는 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC 컬럼(II) 통과 분획에 따른 iPLA₂의 활성도를 나타낸 그래프이고,

도 2h 는 모노Q-음이온 교환 컬럼(II) 통과 분획에 따른 iPLA₂의 활성도를 나타낸 그래프이고,

도 3 은 항-170kDa 단백질 단일클론항체를 제조한 것을 나타낸 도이고,

도 4 는 소의 뇌에서 분리정제된 iPLA₂의 SDS-PAGE 양상을 나타낸 도이고,

도 5 는 뇌조직형 칼슘 비의존적 PLA₂에 대한 칼슘의 농도별 효과를 나타낸 그래프이고,

도 6 은 뇌조직형 iPLA₂의 pH에 대한 의존도를 나타낸 그래프이고,

도 7a 는 일반적 iPLA₂활성 억제제인 AACOCF3 및 브로모엔올락톤(BEL)에 의한 뇌조직형 iPLA₂의 활성 억제 양상을 나타낸 그래프이고,

도 7b 는 AACOCF₃농도증가에 따른 뇌조직형 iPLA₂의 활성 억제 양상을 나타낸 그래프이다.

상기 목적에 따라, 본 발명은 소의 뇌에서의 신규한 효소인 칼슘 비의존적 포스포리파아제 에이 투 효소(Ca²⁺independent phospholipase A₂, iPLA₂), 이의 용도 및 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 상기 iPLA₂는 SDS-PAGE상에서 측정한 분자량이 170kDa이고, pH 9.0∼9.5 에서 최대활성을 나타내며, 특이활성도는 21,500 n㏖/분/㎎이고, 기존의 85 내지 88 kDa의 그룹 Ⅵ A PLA₂의 특이적 저해제인 브로모엔올락톤에 의해 활성저하가 일어나지 않음을 특징으로 하는 효소이다.

또한, 본 발명의 iPLA₂는, 소의 뇌를 분쇄하여 얻은 균질혼합액을 원심분리하여 수득한 상층액에 약산을 가하여 원심분리한 다음 침전물을 수득하고; 상기 침전물을 완충액에 현탁시킨 후 음이온 교환수지 컬럼으로 여과하고; 용출된 단백질을 소수성 컬럼크로마토그래피, 친화성 컬럼, 젤 여과 FPLC, 음이온교환컬럼(I),젤 여과 FPLC 2회 및 음이온교환컬럼(II)을 순서대로 이용하여 정제함으로써 신규의 iPLA₂를 분리 정제 하는 단계를 포함하는 iPLA₂의 제조 방법을 제공한다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 소의 뇌에서 기존에 알려져있는 형태와는 다른 iPLA₂를 분리하였고, 상기 iPLA₂는 SDS-PAGE상에서 측정한 분자량이 170kDa이고, pH 9.0∼9.5에서 최대활성을 나타며, 기존의 85 내지 88 kDa의 그룹 Ⅵ A PLA₂의 특이적 저해제인 브로모엔올락톤에 의해 활성저하가 일어나지 않는 것을 특징으로 하는 효소이다.

상기 효소는 10^-3M 이상의 칼슘농도에서 활성도가 현저히 감소하는 특징을 제공한다.

또한 상기 효소는 사람 또는 소 등의 포유동물로부터 유래하여 제공될 수 있다.

본 발명의 신규한 iPLA₂를 소의 뇌로부터 분리정제하는 방법을 설명하면,

예를 들어 소의 뇌 무게(㎏)의 약 3∼8배의 완충액을 가한 뒤, 분쇄하여 얻은 균질혼합액을 원심분리하고, 이에 수득한 상층액에 아세트산 등과 같은 약산을 가하여 pH 5.0으로 조정하여 원심분리한 다음 침전물을 수득하는 1단계;

상기 침전물을 완충액에 현탁시킨 후 DEAE-셀룰로오스 등과 같은 음이온 교환수지 컬럼으로 여과하고; 용출된 단백질을 페닐-5PW 등과 같은 소수성 컬럼크로마토그래피, 헤파린-세파로스 등과 같은 친화성 컬럼, G-3000 PW 등과 같은 젤여과FPLC, 모노-Q 등과 같은 음이온교환컬럼(I), 슈퍼로스 12 등과 같은 젤 여과 FPLC 2회 및 모노-Q 등과 같은 음이온교환컬럼(II)을 순서대로 이용하여 정제함으로써 신규의 iPLA₂를 분리 정제 하는 제 2단계를 포함한다.

상기의 iPLA₂분리정제하는 과정을 통하여 특이 활성은 약 3000배 가량 증가하였다. 이 활성을 가진 부분을 SDS-PAGE를 수행하여 170kDa 위치에 활성과 일치하는 밴드를 찾아내었다.

본 발명자는 이 170 kDa의 단백질을 이용하여 항 iPLA₂-항체를 제조하기 위하여 하이브리도마 세포주를 얻어내어, 170 kDa 위치의 단백질만을 특이적으로 인식하는 항체를 얻어낼 수 있었다.

따라서, 본 발명의 iPLA₂는 뇌졸중, 뇌부종, 알쯔하이머, 파킨슨씨병 및 허혈 등의 퇴행성뇌질환, 염증성 질환, 혈액응고로 인한 혈관질환 등을 비롯하여 관련된 생리현상의 연구 및 iPLA₂와 관련된 질환의 예방 또는 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

그 예로 본 발명의 iPLA₂의 발현, 기능 및 조절 기전이 밝혀지게 되면, iPLA₂에 의한 대사산물들의 작용 경로와 이들이 관여하는 질병의 발생 기전 또한 밝혀질 수 있다. 또한 본 발명의 iPLA₂에 돌연변이를 일으켜 활성을 저하시키거나 비활성화시킴으로써, iPLA₂가 관여하는 질병을 진단, 예방 및 치료할 수 있다.

본 발명의 iPLA₂에 의한 생리작용의 연구에 유용하게 사용될 수 있으며, 이들을 유효성분으로 함유하는 조성물은 iPLA₂와 관련된 질환의 진단, 예방 또는 치료에 이용될 수 있다.

본 발명의 iPLA₂를 유효성분으로 함유하는 조성물은, 유효성분으로 본 발명의 iPLA₂뿐만 아니라 이들과 유사한 기능을 지닌 물질 또는 유도체를 함께 첨가할 수 있으며, 필요에 따라 다른 유효성분을 추가로 함유할 수 있다.

본 발명의 iPLA₂를 유효성분으로 함유하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 iPLA₂를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 iPLA₂를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.

본 발명에 따른 iPLA₂를 유효성분으로 함유하는 조성물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽,에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 iPLA₂를 유효성분으로 함유하는 조성물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 1주에 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 어쥬반트 유전자 조성물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 iPLA₂를 유효성분으로 함유하는 조성물은 경구, 비경구(경피, 피내, 근육내 및 정맥내 포함), 직장 및 흡입 중에서 선택되어지는 경로에 의해 투여될 수 있으며, 바람직하게는 근육내 주사법으로 투여될 수 있다.

이하, 본 발명은 다음의 실시예 및 실험예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의해 제한되지는 않는다.

참조예 1. iPLA ₂ 활성 분석

기질로서 1-스테아로일-2-[1-¹⁴C]아라키도노일-sn-글리세로-3-포스포콜린(1-Stearoyl-2-[1-¹⁴C]arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine, 2-[1-¹⁴C]AA-GPC) (55 mCi/mol, Amersham사) 및 1-아실-2-[1-¹⁴C]아리키도노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(1-acyl-2-[1-¹⁴C]arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, 2-[1-¹⁴C]AA-GPE) (55.6 mCi/mol, Amersham사)은 질소하에서 건조된 후 에탄올에 재용해시켰다. PLA₂의 활성분석을 위한 표준배양시스템(100㎕)은 PLA₂시료, 200 mM Tris-HCl, pH 8.0, 5 mM EDTA 및 0.45 nmol 기질 (대략 55,000 cpm)을 포함하였다. 37℃에서 15분 내지 30분간 반응시켰으며, 560㎕의 변형된 돌의 시약(Dole's reagent, n-heptane:isopropyl alcohol:1N H₂SO₄= 400:390:10 (v:v:v))및 110㎕의 물을 첨가하여 반응을 중지시킨 후, 볼텍싱하여 혼합한 후 원심분리하였다. 그 다음 150㎕의 상층액을 새 마이크로튜브에 옮겨서, 또 800㎕의 n-헵탄 및 6㎎ 이하의 실리카겔을 첨가하였다. 이 시료를 볼텍싱하여 혼합하고 다시 원심분리하여 800㎕의 상층액을 β-신틸레이션 용액(INSTA GEL-XF) 2.5㎖ 내로 넣었고, 팩카드 트리-카브 액체 신틸레이션 카운터(Packard Tri-Carb scintillation counter, PACKARD사, 호주)로 방사능활성정도를 측정하였다.

실시예 1. 소의 뇌에서 Ca ²⁺ -비의존적인 PLA ₂ (iPLA ₂ )의 분리 정제.

1.1 Ca²⁺-비의존적 PLA₂효소 원료의 제조

Ca²⁺-비의존적 PLA₂는 소의 뇌에서 정제되었다. 소의 뇌는 지역도축장으로부터 신선한 것을 구입하여 -70℃에서 얼려 보관하였다. 뇌 600g 정도를 5배의 분쇄완충액 Ⅴ(homogenizing buffer Ⅴ, 50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 50mM KCl, 3mM MgCl₂, 1 mM EDTA 및 10mM 2-mercaptoethanol)에 녹여 분쇄기로(polytron PT-MR6000, Kinematica사, 스위스) 분쇄한 후, 10000×g에서 60분간 원심분리하였다. 상층액을 1:30 비율로 희석된 아세트산을 사용하여 pH 5.0으로 맞춘 후, 다시 10000×g에서 15분간 원심분리하였다. 생성된 침전물을 완충액A에 재용해시켰다.

1.2 DEAE-셀룰로오스 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피

이 현탁액(pH 5.0)은 미리 완충액 A(50 mM Tris/HCl, pH 7.5, 1 mM EDTA 및 10mM 2-mercaptoethanol)로 평형시킨 DEAE-셀룰로오즈(DE52, Whatman사, 영국) 음이온 교환 컬럼(2.5㎜×12.5㎝; bed volume 200㎖)에 통과시켰으며, 페리스탈틱 펌프(peristaltic pump, Eyela사, 일본)을 사용하였고, 유속 2㎖/분의 속도로 조절되었다. 현탁액 통과 후, 완충액 A로 컬럼을 씻어내었고, 수세된 젤은 1.0M NaCl의 농도구배를 갖는 완충액 A로 용출되었으며, 용출된 단백질 분획은 30㎖씩 수득되었다. 각 분획들 중 20㎕는 참조예 1의 방법에 따라(반응시간 15분) iPLA₂의 활성을 분석하는데 사용되어졌고, iPLA₂활성을 갖는 분획번호 33 - 42 분획들은 수집되어 다음 단계에 사용되었다(도 2a 참조).

1.3 2M KCl 추출 및 페닐-5PW 소수성 컬럼 크로마토그래피

DEAE-셀룰로오스 컬럼의 활성 풀(active pool)은 최종농도 2.0M KCl로 조정하여 4℃에서 2시간동안 섞어준 다음, 100000×g, 4℃에서 1시간 동안 원심분리하였다.

상기의 원심분리한 상층액을 1.0M NaCl을 포함한 완충액 A로 미리 평형시킨 페닐-5PW 컬럼(21.3㎜ × 15㎝)에 통과시킨 후, 동일한 완충액 A로 씻었다. 컬럼은 완충액 B(25mM Glycine-NaOH, pH 9.0, 1mM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol)의 직선상의 농도구배를 사용하여 유속 5㎖/분으로 용출되었으며, 5㎖씩의 분획들을 수득하였다. 각 분획들 중 20㎕는 참조예 1의 방법에 따라(반응시간 15분)을 iPLA₂의 활성을 분석하는데 사용되어졌고, iPLA₂활성을 갖는 분획번호 107 - 111 분획들은 수집되어 다음 단계에 사용되었다(도 2b 참조).

1.4 헤파린-세파로스 CL-6B 친화 컬럼 크로마토그래피

상기의 페닐-5PW 컬럼의 활성 풀(active pools)을 아세트산(1:30 비율로 증류수에 희석)을 사용하여 pH 6.2로 조정한 후에, 완충액 S(50mM Na.Acetate/HCl, pH 5.6, 1mM EDTA, 10mM 2-mercaptoethanol)로 미리 평형시킨 헤파린-세파로스 CL-6B 컬럼(5㎖)에 통과시킨 후, 동일한 완충액으로 씻었다. 컬럼은 1.0M NaCl을 포함한 완충액 A의 직선상 농도구배를 사용하여 유속 3㎖/분의 속도로 용출되었으며, 3㎖씩 분획들을 수집하였다. 각 분획들 중 20㎕는 참조예 1의 방법에 따라(반응시간 30분) iPLA₂의 활성을 분석하는데 사용되어졌고, iPLA₂활성을 갖는 분획번호 29 - 32 분획들은 수집되어 다음 단계에 사용되었다(도 2c 참조).

1.5 G 3000-PW 젤 여과 HPLC

상기의 헤파린-세파로스 CL-6B 친화 컬럼의 활성 풀을 1.0M NaCl을 포함한 완충액 A로 미리 평형시킨 G 3000-PW 젤 여과 HPLC 컬럼(21.5㎜ × 60㎝)에 통과시켰고, 동일한 완충액을 사용하여 유속 5㎖/분의 속도로 컬럼을 용출시켰다. 5㎖씩 분획들을 수집하였고, 각 분획들 중 40㎕는 참조예 1의 방법에 따라(반응시간 15분) iPLA₂의 활성을 분석하는데 사용되어졌고, iPLA₂활성을 갖는 분획번호 23 - 25 분획들은 수집되어 다음 단계에 사용되었다(도 2d 참조).

1.6 모노-Q 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 I

G3000-5PW 젤 여과 HPLC의 활성 풀을 완충액 A로 미리 평형시킨 모노-Q 음이온 교환 컬럼(5.0㎜ × 5.0㎝)에 통과시킨 후, 동일한 완충액을 사용하여 씻어내었다. 컬럼은 1.0M NaCl을 포함한 완충액 A의 직선상 농도구배를 사용하여 유속 1㎖/분의 속도로 용출되었으며, 1㎖씩 분획들을 수집하였다. 각 분획들 중 20㎕는 참조예 1의 방법에 따라(반응시간 30분) iPLA₂의 활성을 분석하는데 사용되어졌고, iPLA₂활성을 갖는 분획번호 31 - 33 분획들은 수집되어 다음 단계에 사용되었다(도 2e 참조).

1.7 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC I

모노-Q 음이온 교환 컬럼의 활성 풀들을 센트리콘 10(Centricon 10, Amicon사, 미국)을 사용하여 대략 200㎕ 정도로 농축시킨 후, 1.0M NaCl을 포함한 완충액 A로 미리 평형시킨 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC 컬럼에 통과시켰다. 그 다음 동일한 완충액을 사용하여 유속 0.5㎖/분의 속도로 용출시켜, 0.5㎖ 씩 분획들을 수집하였다. 각 분획들 중 40㎕는 참조예 1의 방법에 따라(반응시간 15분) iPLA₂의 활성을 분석하는데 사용되어졌고, iPLA₂활성을 갖는 분획번호 16 - 20 분획들은 수집되어 다음 단계에 사용되었다(도 2f 참조). 뚜렷한 단백질의 분자량을 측정하기 위하여, β-아밀라아제(β-amylase, 분자량 200,000)와 알코올 탈수소효소(alcohol dehydrogenase, 분자량 150,000), 우혈청알부민(bovine serum albumin, 분자량 66,000), 탄산 무수화효소(carbonic anhydrolase, 분자량 29,000) 및 시토크롬 C(분자량 12,4000)을 표준품으로 같은 조건에서 실험에 사용되었다.

1.8 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC II

상기의 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC 컬럼의 활성 풀들을 센트리콘 10(Centricon 10, Amicon 사, 미국)을 사용하여 대략 200㎕ 정도로 농축시킨 후, 완충액 A로 미리 평형시킨 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC 컬럼에 통과시켰다. 그 다음 동일한 완충액을 사용하여 유속 0.5㎖/분의 속도로 용출시켜, 0.5㎖ 씩 분획들을 수집하였다. 각 분획들 중 20㎕는 참조예 1의 방법에 따라(반응시간 15분) iPLA₂의 활성을 분석하는데 사용되어졌고, iPLA₂활성을 갖는 분획번호 14 - 18 분획들은 수집되어 다음 단계에 사용되었다(도 2g 참조).

1.9 모노-Q 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피 II

상기의 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC 컬럼(II)의 활성 풀들을 완충액 P(25mM Imidazole-HCl, pH 7.3, 0.5mM EDTA, 1.5mM MgCl₂)로 미리 평형시킨 모노-Q 음이온 교환 컬럼(II)에 통과시킨 후, 동일한 완충액으로 씻어내었다. 컬럼을 1.0M NaCl를 포함하는 완충액 S의 직선상 농도구배를 사용하여 유속 0.5㎖/분의 속도로 용출하였으며, 0.5㎖ 씩 분획들을 수집하였다. 각각 분획들 중 20㎕는 참조예 1의 방법에 따라(반응시간 15분) iPLA₂의 활성 분석을 시행하였다.

상기 컬럼 크로마토그래피 결과를 정리하여 표 1에 나타내었다.

정제단계	총 단백질양(㎎)	총 활성(p㏖/분)	특이활성도(n㏖/분/㎎ 단백질)	증가배수	수율(%)
10,000×g 상층액	4,800	34.5	7.2	1.0	100
pH 5.0- 추출물	500	29.3	58.6	8.1	84.9
DE 52	138	17.1	123.6	17.2	49.4
페닐-5PW	15	1.77	114.9	16.0	5.1
헤파린- 세파로스	6.5	2.40	369.2	51.3	7.0
G3000PW	3.1	2.00	643.1	89.3	5.8
모노 Q (I)	1.6	1.61	1,006.3	139.8	4.6
슈퍼로스 (I)	0.21	1.32	6,285.7	873.0	3.8
슈퍼로스 (II)	0.14	0.80	5,714.3	793.6	2.3
모노 Q (II)	0.02	0.43	21,500.0	2,986.1	1.2

표 1에 나타난 바와 같이, 소의 뇌 현탁액은 8번의 컬럼 정제 중, 초기 상층액의 특이활성도(7.2 n㏖/분/㎎ 단백질)에서 마지막 모노 Q (Ⅱ) 컬럼을 거친 정제분획의 특이활성도(21,500 n㏖/분/㎎ 단백질)는 약 3000배 가량 증가함으로, 본 발명의 신규한 iPLA₂의 분리정제가 효과적으로 수행되었음을 확인할 수 있었다.

실시예 2. 단백질 분석

PLA₂를 정제하는 동안 단백질의 양을 조사하기 위하여, 280nM에서 흡광도를 측정하였다. 각각의 시료의 단백질 양은 브래드포드시약(Bio-Rad사, 미국)을 사용하여 측정하였으며, 표준량으로 우혈청알부민(BSA)을 이용하였다.

실시예 3. 170kDa 단백질에 대한 단일클론항체 제조

DEAE-셀룰로오즈 음이온 교환 컬럼의 활성분획들을 센트리콘 10을 사용하여 약 1㎖ 정도로 농축시킨 다음, 시료들을 가지고 상기 라엠리 과정을 거쳐 5% SDS-PAGE을 시행하였다. 분리된 단백질들은 CBB(Coomasie Briliant Blue) 염색으로 가시화 되었으며, 염색된 밴드는 실험용 칼로 잘라 분리하였다. 이 단백질 밴드를 감압동결건조하여 액체 질소가스에서 분말화하였다. 이 시료를 PBS에 재현탁시켜 MPL+TDM+CWS 아주반트(Sigma 사, 미국)와 혼합하여 BALB/C 마우스 복강내에 주사하였다. 3주간격으로 3회 면역화주사(boosting)를 시킨 후에 마우스를 희생시켜 스플린(spleen) 세포를 수득한 다음, 그것을 마우스 골수종세포인 V653 과 PEG50(Sigma사, 미국)을 사용하여 융합시켰다. 그 다음 DEAE-셀룰로오스 음이온 교환 컬럼에서 수득한 활성 분획을 가지고 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSolvent Assay)를 수행하여 생성된 하이브리도마를 스크리닝하였다. 이러한 방법으로 양성 하이브리도마 클론을 수득, 확립하고, 이 하이브리도마 세포를 배양하여 배양배지내의 항체를 수집하였다.

도 3은 헤파린-세파로스 친화컬럼의 iPLA₂활성분획을 사용하여 단일항체 클론에 대한 웨스턴블롯분석을 시행한 결과이다. 레인 1은 표준마커이고, 레인 2는 항-170kDa 항혈청을 사용한 것이며, 레인 3은 마우스 하이브리도마 클론의 배양 배지를 1차 항체로 사용하였고 알칼라인 포스파타아제로 발색시켰다. 레인 3에서 170 kDa 에 해당하는 밴드만이 발색이 되어 170kDa 단백질에 해당하는 단일클론항체임을 확인하였다.

실험예 1. iPLA ₂ 정제분획들의 SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis) 및 웨스턴 블롯 분석

상기 실시예 3의 단일클론항체를 사용하여 각 분획들 중 iPLA₂활성을 갖는 단백질을 포함한 분획을 찾기 위하여, 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC 컬럼(I)의 분획번호 12-21에 해당하는 분획들, 슈퍼로스 12 젤 여과 FPLC 컬럼(II)의 분획번호 12-19에 해당하는 분획들 및 모노-Q-음이온 교환 컬럼(II)의 32-37에 해당하는 분획들의 각각 20㎕, 10㎕, 40㎕를 라엠리 완충액(laemmli's buffer, 0.125mM Tris-HCl, pH 6.8, 4% SDS, 20% 글리세롤, 0.002% 브로모페놀블루)과 혼합하였다. 각 시료들을 95℃에서 5분동안 가열하여 10% 폴리아크릴아마이드 젤에 전기영동시켰다. 각 시료의 분리된 단백질들은 은염색키트(PlusOne silver-staining kit, Phamacia사, 스웨덴)를 사용하여 염색되었으며, 표준 마커로는 미오신 200kDa, β-갈락토시다아제 116kDa, 포스포릴라아제 b 97.4kDa, 우혈청알부민 66kDa, 오브알부민45kDa, 탄산 무수화효소 31kDa을 사용하였다.

활성분획들은 10% SDS-PAGE에서 분리된 후, 실온에서 20mA의 일정한 전류를 사용하여 니트로셀룰로오스 멤브레인(Hybond^TMECL^TMnitrocellulose membrane, Amersham Pharmacia사)에 옮겨졌다. 이 멤브레인을 상온에서 5% 스킴밀크(non-fat dry skim milk)를 함유한 TBS-T(Tris-buffered saline with 0.1% Tween 20)에서 2시간동안 블로킹(blocking)시킨 후, 멤브레인을 6시간 동안 실시예 3의 항-iPLA₂단일클론 항체(1:5000 희석)와 반응시키고, 그 다음 염소 항-마우스 IgG (goat anti-mouse IgG, 알칼라인 포스파타제가 컨쥬게이트된 것, Santa Cruz Biotechnology사, 미국)를 1:2000으로 희석시켜 2시간동안 반응시킨다. 검출은 NBT/BCIP키트(1-step^TMNBT/BCIP kit, Pierce사, 미국)를 사용하여 수행하였다.

도 4의 결과에서, 170kDa 단백질 밴드가 보이는 분획에서 iPLA₂의 활성이 높게 나타나는 상관관계를 볼 수 있다. 마지막 정제 단계인 모노 Q 음이온 컬럼의 활성분획 34, 35에서 실시예 3의 단일클론항체에 대한 170kDa 단백질 밴드가 관찰되고, 이 분획에서 iPLA₂의 높은 활성을 보임을 확인하였다.

실험예 2. iPLA ₂ 의 활성에 대한 칼슘 농도의 영향

헤파린-세파로스 친화 컬럼의 활성분획을 가지고 염화칼슘 농도 10^-8M 부터 10^-2M 까지 여러 가지 조건에서 완충액(200mM Tris, pH 8.0, 5mM EDTA), 2-[1-¹⁴C]AA-GPC를 사용하여 37℃에서 30분 반응시켜, 칼슘 농도별 iPLA₂활성을 측정하였다. 각각의 결과들은 5회의 실험의 평균±표준편차(SD) 나타내었다. 흥미롭게도 본 발명의 iPLA₂활성도는 칼슘 10^-3M 이상의 농도에서는 활성이 현저하게 감소되는 특징을 갖음을 확인할 수 있었다(도 5 참조).

실험예 3. iPLA ₂ 의 활성에 대한 pH 의 영향

헤파린-세파로스 친화 컬럼의 활성분획을 가지고 pH 7.5 에서 10.5 범위에서 그 활성을 측정하였다. pH 7.5 - 9.0 에서는 200mM 트리스-염산 완충액을 사용하였고, pH 9.0 - 10.5 에서는 글리신-염산 완충액을 사용하였으며, 2-[1-¹⁴C]AA-GPC를 사용하여 37℃에서 3분 반응시켜, pH 별 iPLA₂활성을 측정하였다. 각각의 결과들은 5회의 실험의 평균±SD로 나타내었다.

도 6의 결과에서와 같이, pH 8.5-9.5의 약한 염기성 pH에서 최적의 활성을 보였고, 산성 pH에서는 거의 활성을 보이지 않았다. 그 중 pH 9.5에서 최대 활성이관찰됨을 확인하였다.

실험예 4. iPLA ₂ 의 활성에 대한 활성 억제제의 영향

일반적인 PLA₂억제제 AACOCF₃(Arachidonyl trifluoromethyl ketone)및 그룹Ⅵ A PLA₂특이적 억제제인 BEL(Bromoenol lactone)의 효과를 알아보았다.

헤파린-세파로스 친화 컬럼의 활성 분획 10 ㎕를 100μM BEL 또는 10μM AACOCF₃와 함께 완충액(200mM Tris, pH 8.0, 5mM EDTA)에 넣어 37℃에서 5분 정도 전처리한 후, 2-[1-¹⁴C]AA-GPC를 사용하여 30분 더 반응시켜 iPLA₂활성을 측정하였다. 각각의 결과들은 5회의 실험의 평균 ±SD로 나타내었다.

도 7a 에서 iPLA₂활성도는 10μM AACOCF₃존재하에서 30% 까지 강하게 억제되었으나 100μM 의 BEL에 의해서는 억제되지 않음을 확인할 수 있었다.

그래서, AACOCF₃의 다양한 농도별 iPLA₂활성 양상을 관찰하기 위하여, 10 - 50μM 의 AACOCF₃을 완충액(200mM Tris, pH 8.0, 5mM EDTA)에 넣어 37℃에서 5분 정도 전처리한 후, 2-[1-¹⁴C]AA-GPC를 처리하여 3분 정도 반응시킨 후 iPLA₂활성을 측정하였다. 각각의 결과들은 5회의 실험의 평균±SD로 나타내었다.

도 7b 에서 iPLA₂활성도는 10μM 의 처리시, 활성이 급격하게 30% 로 억제되고, 그 이상의 농도로 처리하였을때는 점차적으로 억제되는 양상을 보였다.

본 발명자는 소의 뇌 분쇄균질액에서 iPLA₂활성를 발견하였으며, 거의 3000배까지 정제하였다. SDS-PAGE의 결과로 iPLA₂활성도를 갖는 밴드는 170kDa의 분자량을 갖고, 상기 생화학적인 결과들은 본 발명의 iPLA₂의 뇌조직형태가 비뇌조직형태의 iPLA₂와는 다르고, 다른 뇌조직형태의 PLA₂와는 다른 신규한 iPLA₂임을 제시한다. 본 발명의 신규한 iPLA₂가 관여하는 생리현상의 연구 분야 및 iPLA₂와 관련된 퇴행성 뇌질환, 뇌의 염증성질환 및 혈관계질환의 진단, 예방 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.

Claims

SDS-PAGE에 의해 측정한 분자량이 170kDa이고, pH 9.0∼9.5에서 효소의 최대 활성을 나타내며, 특이활성도는 21,500 n㏖/분/㎎이며, 그룹 Ⅵ A PLA₂의 특이적 저해제인 브로모엔올락톤에 의해 활성 저하가 일어나지 않는 것을 특징으로 하는 효소 iPLA₂.
제 1항에 있어서, 상기 효소는 10^-3M 이상의 칼슘농도에서 활성도가 현저히 감소하는 것을 특징으로 하는 iPLA₂.
제 1항에 있어서, 상기 효소는 사람 또는 소에서 유래됨을 특징으로 하는 iPLA₂.
소의 뇌 무게(㎏)의 약 3-8배의 완충액을 가한 뒤, 분쇄하여 얻은 균질혼합액을 원심분리하고, 이에 수득한 상층액에 약산을 가하여 pH 5.0으로 조정하여 원심분리한 다음 침전물을 수득하여, 침전물을 완충액에 현탁시킨 후 음이온 교환수지 컬럼으로 여과하고 용출된 단백질을 소수성 컬럼크로마토그래피, 친화성 컬럼, 젤여과 FPLC, 음이온교환컬럼(I), 젤 여과 FPLC 2회 및 음이온교환컬럼(II)을 순서대로 이용하여 정제하는 단계를 포함하는 신규한 iPLA₂의 제조 방법.
제 4항에 있어서, 약산은 아세트산으로부터 선택되어짐을 특징으로 하는 제조 방법.
제 4항에 있어서, 음이온 교환 수지 컬럼으로 DEAE-셀룰로오스 컬럼을 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 4항에 있어서, 소수성 컬럼 크로마토그래피에서 페닐-5PW 소수성 컬럼을 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 4항에 있어서, 친화 컬럼 크로마토그래피에서 헤파린 세파로스 친화 컬럼을 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 4항에 있어서, 젤 여과 FPLC에서 G-3000 PW 젤 여과 컬럼 또는 슈퍼로스 12 젤 여과 컬럼을 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 4항에 있어서, 음이온 교환 컬럼 크로마토그래피는 모노-Q 음이온 교환 컬럼을 사용함을 특징으로 하는 제조방법.
제 1 항의 iPLA₂를 유효성분으로 하는 iPLA₂활성증가용 약학조성물.
제 11항에 있어서, iPLA₂의 활성 저해에 의해 유발되는 질병의 진단, 예방 및 치료용 약학조성물.
제 12항에 있어서, iPLA₂의 활성 저해에 의해 유발되는 질병은 퇴행성뇌질환, 염증질환 및 혈관계 질환인 약학조성물.
제 13항에 있어서, 퇴행성 뇌질환은 뇌졸중, 뇌부종, 알쯔하이머, 파킨슨씨병 및 허혈증이고, 혈관계 질환은 혈전증인 약학조성물.