KR20030092446A - 씨형 간염 활성 억제를 갖는 조릿대 추출물을 포함하는조성물 - Google Patents
씨형 간염 활성 억제를 갖는 조릿대 추출물을 포함하는조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 조릿대(Lophatherum gracile BRONGN.)의 추출물을 사용하여 C형 간염 바이러스(HCV)의 복제에 필수적인 C형 간염 바이러스 유래 RNA 복제효소(RNA-dependent RNA polymerase)의 활성 저해제를 스크리닝하고 세포 독성을 검토하여, C형 간염의 예방과 치료에 효과적인 의약품 및 건강보조식품을 제공한다.
Description
본 발명은 C형 간염 질환에 효과적인 약학 조성물 및 건강보조식품에 관한 것이다.
일반적으로 간염은 약물, 알콜 또는 바이러스가 원인이 되어 간 기능의 이상을 유발하는 질병으로서, 황달, 발열, 복통 등의 증상과 혈청중 아미노 트란스퍼라제(amino transferase)의 증가를 척도로 임상적으로 진단되며 바이러스가 원인일 경우에는 원인 바이러스에 대한 항원 및 항체를 면역학적 방법으로 검정함으로서 진단할 수 있다.
바이러스성 간염의 주원인인 A형 및 B형 간염 바이러스는 1970년대에 분리 및 동정되었고, 1989년에는 이에 대한 진단 시약과 백신의 개발이 이어져 바이러스성 간염의 진단과 예방에 큰 진전을 가져왔다. 그러나 이러한 진단 시약과 백신의 개발에도 불구하고 수혈후 바이러스성 간염환자가 여전히 발생하였는데, 이들은 기존의 간염 바이러스와는 다른 비-A형 및 비-B형 간염(NANBH) 바이러스로 분류되었으며(Alter. H. J. et al; Science, 2, p838, 1975), 상기 NANBH 바이러스는 발견된 지 10년이 지난 후에 미국의 카이론사에 의해 침팬지의 혈청으로부터 최초로 분리되었으며, 그 후로 C형 간염 바이러스로 동정되었다(Choo. Q. L. et al; Science, 244, pp359-362, 1989).
C형 간염 바이러스(hepatitis C virus, 이하 'HCV'라 약칭함)는 비-A형 또는 비-B형 간염을 유발하는 것으로 알려진 간염의 주요 원인이 되는 바이러스로서, 사람에 침입하여 급성 또는 만성 간염을 일으킬 뿐만 아니라 간경화 또는 간암으로의 이행에도 관여를 하며(Alter. H. J. et al; New Eng. J. Med., 327, pp1899-1905, 1992), 간경화증 및 간암 등과 관련된 바이러스성 간염의 주된 원인이 되는 바이러스이고, 수혈 후 발병하는 간염의 70 내지 80% 정도가 HCV에 의한 것으로 알려져 있다.
HCV 바이러스는 비-A형 또는 비-B형 간염 환자의 혈장을 침팬지에 접종시켜 분리함으로써 회수할 수 있다. 이렇게 얻어진 HCV는 하나의 양성가닥으로 된 단일의 선형 RNA(single linear RNA)를 가지고 있으며, 상기 RNA는 9400개의 염기로 이루어진 양성가닥 리보핵산 형태의 유전자를 가지고 있고, 몇 개의 구조 및 비구조 단백질로 이루어진 하나의 폴리펩타이드(Polypeptide)를 암호화하고 있다 (Hough M. et al; 유럽특허공개(A1)0318216호, 1989 공개 : Okamoto H. et al; J. Gen. Virol, 60, p1679, 1990). 상기와 같은 유전자 구조를 고려할 때, HCV는 플래비바이러스(flaviviruses) 또는 페스티바이러스(pestiviruses)와 상당한 유사성을 나타내며, 플래비비리대(Flaiviridae)에 속하는 새로운 속(genus)으로 분류되었다. 상기 유전자로부터 암호화되는 HCV 유래 폴리펩타이드는 아미노 말단부터핵-외피(E1)-외피/비구조1(E2/NS1)-비구조3(NS3)-비구조4(NS4)-비구조5(NS5) 단백질의 순으로 구성되어 있음이 밝혀져 있다(Choo, et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, pp2451-2455, 1991 : Kato, et al; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp9524-9528, 1990 : Simonetti, et al; An. Int. Med., 116, pp97-102, 1992).
전 세계적으로 약 2%의 인구가 감염된 것으로 추정되고 있으며, 새로이 HCV에 감염되는 환자의 수가 매년 약 백만명 정도에 이르는 것으로 추정되며, 특히 아프리카, 일본 및 한국에는 전체 인구의 1.5 내지 2.0%가 만성 보균자인 것으로 알려져있다. 현재 백신이나 효과적인 치료제가 없어 계속하여 감염이 확산되고 있는 실정이다. 이에 따라 간암으로 인한 사망률을 증가시키는 요인 중 하나로 치료제의 개발이 시급한 실정이다. 세계적으로 항 바이러스 및 백신 시장은 1998년 기준 53억 달러이며, 2008년까지 항 바이러스 약품 시장은 110억 달러로 증가될 것으로 예상된다. 현재 HCV 치료제 시장은 10억 달러 규모로 인터페론 및 라이바비린(ICN과 쉐링사 공동 개발 약품)이 있다. 향후 C형 간염 바이러스 감염환자의 증가와 더불어 커질 것으로 추산되어 HCV 치료제 개발은 상업성이 대단히 높다고 전망되어지고 있다.
현재 HCV의 만성적 감염을 효과적으로 치료하기 위한 치료방법은 아직까지 개발되어 있지 않고, 거의 α-인터페론을 HCV의 치료제로 투여하는 것이 시행되고 있으나 이 치료법은 최근 들어 인터페론-내성 서열(Interferon resistance sequence)을 갖는 HCV에 대해서는 효과가 없는 것으로 나타나고 있어 새로운 치료제의 개발이 요구되는 실정이다. 새로운 형태의 HCV 치료제는 AIDS 바이러스와 같은 RNA 바이러스의 치료제로서 단백질 분해효소 혹은 RNA 중합효소와 같은 단백질에 대한 저해제를 이용하는 것이 가장 효과적일 것이다.
한편 본 발명에 사용되는 조릿대(Lophatherum gracile BRONGN.)는 다년생 초본(多年生 草本)으로 국내 중부 이남의 산과 일본 등지에서 자생하는 식물로서, 담죽엽(淡竹葉)이라 하고 알려진 성분으로는 아룬도인(arundoin), 사이린드린 (cylindrin), 타락세롤(taraxerol)이나 프리델린(friedelin)과 같은 트리터페노이드(triterpenoids)와 페놀성 성분, 아미노산 및 유기산 등이 함유되어 있으며, 해열(解熱)작용, 이뇨(利尿)작용 및 당뇨병, 고혈압, 위염, 위궤양, 만성 간염, 암 등에 효과가 있다고 알려져 있다. (정 보섭, 신 민교; 도해 향약(생약)대사전, 영림사, p221, 1998)
조릿대는 민간요법을 통해 간에 이롭다는 것이 알려졌으나, 실제로 상기한 문헌들 및 연구 보고들에서 조릿대의 C형 간염에 대한 치료효과는 전혀 보고된 바 없다.
이에 본 발명자들은 국내 자생 약용식물로부터 HCV의 치료제를 얻기위해 노력하던 중, 기존에 해열, 이뇨, 당뇨병 및 위염등의 질환에 사용되어 온 조릿대의 극성 및 비극성 용매 가용추출물이 HCV의 단백질 분해효소에 대해 강한 저해활성을 나타낸다는 사실을 알아내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 C형 간염의 예방 및 치료효과를 나타내는 약학 조성물 및건강보조식품을 제공하는 것이다.
도 1a 는 C형 간염 바이러스(HCV)의 복제 효소 발현 후, 코마시 블루(Coomassie blue) 염색을 통한 전체적인 단백질 양상을 나타낸 도이며, 1b는 C형 간염 바이러스(HCV)의 복제 효소의 웨스턴 블라팅(Western blotting)의 결과를 나타낸 도이며,
도 2 은 10종 식물체에서 얻은 총 27종 추출물(50μM)과 추출물이 첨가되지 않은 상태에서 측정한 효소의 활성(5×105CPM을 100% 기준으로 설정)에 대한 상대 활성 효과를 나타낸 도이며,
도 3 는 각 25μM 농도에서 조릿대 에틸아세테이트 추출물, 꾸지뽕 부탄올 추출물, 까마중 추출물 및 조릿대 부탄올 추출물들의 상대 활성 효과를 나타낸 도이며,
도 4 은 500μM 농도에서 조릿대 추출물의 상대 활성 효과를 나타낸 도이며,
도 5 는 조릿대 에틸아세테이트 추출물의 농도별 상대 활성 효과를 나타낸도이며,
도 6 는 조릿대 에틸아세테이트 추출물의 각 농도별 세포 독성 효과를 나타낸 도이다.
상기 목적에 따라, 본 발명은 C형 간염의 예방 및 치료에 효과적인 조릿대(Lophatherum gracile BRONGN.)의 극성 및 비극성 용매 추출물을 제공한다.
또한, 본 발명은 조릿대의 추출물을 포함하는 C형 간염의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다. 상기의 조릿대 추출물은 물, 메탄올, 부탄올 등과 같은 극성 용매와 에틸아세테이트, 클로로포름과 같은 비극성 용매를 이용하여 순차적으로 추출된 추출물을 의미한다.
조릿대(Lophatherum gracile BRONGN)의 저급 알콜 추출물을 에틸아세테이트, 부탄올, 물을 사용하여 각각 용해되는 성분들을 순차적으로 추출하고, 정제된 HCV 복제효소와 활성 역가 및 활성 저해 효과를 측정하였다.
이하 구체적으로 조릿대 추출물의 분리 공정을 설명하면,
조릿대를 메탄올과 같은 극성 용매로 추출하여 열수로 추출한 후에 감압농축하여 엑스를 얻는 제 1단계;
상기의 엑스를 에틸아세테이트와 같은 비극성 용매로 녹여 현탁시킨 후, 여과하여 에틸아세테이트 가용 추출물 층을 분리하는 제 2단계;
이어서 순차적으로 부탄올, 물 등과 같은 극성 용매를 사용하여 분획 및 여과하고, 부탄올 가용 추출물 및 물 가용 추출물을 얻는 제 3단계;
상기의 에틸아세테이트 가용추출물, 부탄올 가용추출물, 물 가용추출물을 감압농축하여 건조하는 제 4단계를 포함한다.
본 발명의 C형 간염 예방 및 치료용 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.5 ~ 50 중량%로 포함한다.
본 발명의 조릿대 추출물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따른 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 추출물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 추출물의 사용량은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으나, 0.1 내지 100 mg/㎏의 양을 일일 1회 내지 수회 투여할 수 있다. 또한 그 추출물의 투여량은 투여경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이 등에 따라서 증감될 수 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은아니다.
본 발명의 추출물을 포함하는 조성물은 C형 간염의 예방 및 치료를 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조릿대 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있다.
본 발명의 조릿대 추출물 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.
본 발명의 상기 추출물은 C형 간염의 예방을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 일반적으로 본 발명의 건강 식품 조성물은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 10 g, 바람직하게는 0.3 내지 1 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.
상기 외에 본 발명의 조성물은 여러가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
본 발명은 다음의 실시예에 의거하여 더욱 상세히 설명되나, 본 발명이 이에 의해 제한되지는 않는다.
실시예 1. 식물 추출물 제조 및 라이브러리 구축
21종의 시료(100g)를 메탄올 추출 단계를 거친 뒤, 에틸아세테이트, 부탄올, 물로 순차적으로 유용물질을 추출하여 총 63종의 추출물로 구성되는 추출물 라이브러리를 구축하고 완료하였다.
1차 추출에 사용된 시료는 함초, 산청목잎, 주엽나무, 산청목, 찔래버섯, 호깨나무, 꾸지뽕, 호깨잎, 까마중, 조릿대로, 각각의 시료 100g을 정선하여 마쇄한 후에, 20% 메탄올 0.2 ℓ를 넣고, 50 ℃ 에서, 2시간 동안 2회 환류 가열하여 얻어진 추출액을 감압농축기(Eyela, N-1000, 일본)로 감압농축하여 건조된 추출물을 얻고 이를 50 ㎖의 물에 현탁하여 이를 여과지(whatman,미국)로 여과하였다.
상기에서 얻은 추출물을 0.1ℓ의 에틸아세테이트를 가하여 2회에 걸쳐서 분획하여, 에틸아세테이트 가용 추출물층과 물 가용 추출물층을 분리한다. 이때 얻어진 물 가용 추출물층은 다시 순차적으로 부탄올과 물을 가하여 분획하여, 결과적으로 에틸아세테이트 가용 추출물, 부탄올 가용 추출물 및 물 가용추출물을 얻었다.
2차 추출한 시료목록은 생강나무, 접골목, 소태나무, 목천초, 청미래덩굴, 야생뽕잎, 하수오, 작두콩, 줄풀, 복령, 오미자로 상기 1차 추출시와 방법을 동일하게 시행하여 약제 각 시료당 3종류의 용매에 용출되는 에틸아세테이트 가용 추출물, 부탄올 가용 추출물 및 물 가용추출물을 얻었다.
이렇게 1, 2차로 얻어진 63종의 추출물들을 감압농축 후 건조시켜 추출물 라이브러리를 구축하였다.
참조예. HCV 복제효소 재조합 단백질의 발현 정제
C형 간염 바이러스(HCV) 복제효소인 NS5B 단백질의 발현을 위해, 이들 유전자를 pTrcHisB벡터에 클로닝하고, 대장균 BL21에 형질전환시킨 뒤 히스 ×6(His(histidine) × 6)와 융합된 재조합 단백질을 발현시켰다.
선별된 대장균 형질전환체를 루리아-버타니배지(Luria-Bertani medium, 100㎍/㎖ 암피실린 첨가), 온도 37℃에서 배양하면서 600nm에서의 흡광도가 0.8일 때,0.5mM IPTG(isopropyl- β -D-thiogalactopyranoside)를 첨가한 배지에 25℃에서 배양하면서 6 내지 12시간 단백질 발현을 유도한 후 배양액으로부터 세포를 회수하였다. 원심분리하여 얻은 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 1회 세척한 뒤, 용해 버퍼(50mM 나트륨-인산 완충액(pH 8.0), 1% Nonidet P-40, 10mM 메르캅토에탄올, 10% 글리세롤, 10mM 이미다졸)에 현탁하여 초음파분해(sonication)로 세포를 파쇄하고, 원심분리(12000rpm, 30분, 4℃)하여 침전된 세포잔여물을 제거하고 상등액을 취하였다. 이로부터 얻은 상등액을 친화적컬럼(affinity column)인 Ni2+-NTA(nitrilotriacetic acid) 컬럼(Qiagen사, 미국)에 흡착시킨 후 이를 100 내지 500mM 이미다졸로 용출시키고 버퍼A(50mM 트리스-염산 pH 8.0, 50mM 염화나트륨, 5mM 염화마그네슘, 1mM DTT)에 투석시킨 뒤 동일 버퍼로 처리한 이온교환컬럼인 헤파린-아가로즈 컬럼(heparine-agarose column)에 결합시키고, 0.1 내지 1.0M 염화나트륨이 함유된 버퍼 A로 용출시켰다. 얻어진 분획을 유사한 방법으로 이온교환컬럼인 세파로즈 컬럼(Sp-Sepharose column, Amersham Pharmacia Biotech)을 사용하여 최종 정제하였다. 상기 최초 추출물(crude extract), 침전물, 상등액과 정제된 단백질은 전기영동(10% SDS-PAGE) 후 코마시 블루(commassie blue)로 염색하여 단백질의 발현을 확인하였다. 10% SDS-PAGE 젤 상에서 분리된 단백질을 단백질 전기블럿터(protein electroblotter, Hoefer사)를 이용하여 나이트로셀룰로오스막(Amersham Pharmacia Biotech)에 옮긴 후 N-말단에 부착된 히스 잔기들을 인식하는 항체(anti-His6antibody, Santa Cruz biotechnology, Inc.)를 1차 항체로 사용하고 퍼록시데이즈 - 표지 이차항체(peroxidase-labelled secondary antibody, Roche)를 첨가하여 반응시키고 최종적으로 각각의 항원을 웨스턴 블럿팅키트(ECL western blotting kit, Amersham Pharmacia Biotech)를 사용하여 웨스턴 블럿(western blot) 분석을 하였다. 그 결과는 도 1a, 1b에서 보이는 것같이 NS5B이 정제된 단백질 분획에서 높은 농도로 존재함을 볼 수 있었다. 이 정제된 분획을 사용하여 C형 간염 바이러스 복제효소의 활성을 저해하는 약용식물 추출물 스크리닝을 시행하였다.
실험예 1. 추출물들의 C형 간염 바이러스 복제효소의 활성억제기능 측정
C형 간염 바이러스 복제효소인 RNA의존성 RNA 복제효소의 활성 측정의 조건은 하기의 문헌을 참고하였다(JW Oh et al.; Journal of Virology, 73(9), pp7694-7702, 1999).
참조예에서 정제된 C형 간염 바이러스 복제효소 단백질인 NS5B과 동질다체(homopolymeric) RNA를 사용하여 국내 특이 식약용 식물체 유해 추출물 활성역가 평가를 하였다. Homopolymeric RNA는 C형 간염바이러스의 NS5B단백질에 대해 프라이머 의존성 방식으로 기질로 작용하는 폴리A RNA(Pharmacia)와 올리고(U)20 프라이머(Pharmacia사)를 사용하여 RNA를 합성하는 반응을 하였다. 반응의 자세한 사항은 다음과 같다.
1㎍ 의 폴리메릭 RNA 폴리(A)(pharmacia)와 NS5B 효소 2p㏖, 그리고 각각 10uM ATP, CTP, GTP, UTP를 반응에 첨가하였고, 합성되는 RNA를 표지하기 위해 10μCi의 32P-UTP나 3H-UTP(3000 Ci/m㏖, NEN Life science Products)를 반응 버퍼(50mM 트리스-염산(pH 8.0), 50mM 염화나트륨, 100mM 포타슘 글루타메이트, 5mM 염화마그네슘, 1mM 디티오트레이톨(DTT;dithiothreitol), 20 ㎍ / ㎖ 액티노마이신 D(sigma), 20유니트(unit) 알엔아제 저해제(RNase inhibitor, Promega사), 10% 글리세롤)에 넣어 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 그 후, 10㎍의 송아지 흉선 DNA(Calf thymus DNA)와 함께 합성된 고분자 RNA 반응물을 5% 트리클로로아세틱산(TCA;trichloroacetic acid)로 침전시킨 후, GF/C 유리필터(Whatman사)로 여과하였다. 필터를 차가운 5% 티시에이(TCA)용액으로 씻고, 1% TCA용액으로 씻은 후 95% 에탄올로 씻어 건조시킨 다음 필터에 남아있는 방사능양을 신틸레이션카운터(scintillation counter; LC 600IC, Beckman사)를 사용하여 활성 저해 효과를 측정하였다.
실험예 2. 제 1차 시료 추출물의 HCV 복제효소 활성저해 효과 검토
실시예 1의 방법을 통해 10종 식물체에서 얻은 총 27종 추출물에 대한 효과를 측정해 본 결과, 추출물이 첨가되지 않은 상태에서 측정한 효소의 활성(5×105CPM을 100% 기준으로 설정)보다 추출물 첨가시 (50μM 최종농도, 분자량 100으로 추정한 시료의 농도) 낮은 활성(50-60% 상대활성)을 보이는 시료 4개를 검출(조릿대 에틸아세테이트 추출물, 꾸지뽕, 까마중, 조릿대 부탄올 추출물)할 수 있었다(도 2 참조). 이들 4종의 시료를 더 낮은 농도인 25μM로 효소활성반응에 첨가하여역가를 분석해 본 결과, 조릿대 에틸아세테이트 추출물과 꾸지뽕 부탄올 추출물이 약 15%의 활성 저해 효과를 지니고 있음을 확인하였다(도 3 참조).
실험예 3. 조릿대 추출물에 대한 역가 평가 확인
1차 선별실험시 25μM의 최종첨가농도에서도 저해효과를 보인 조릿대 에틸아세테이트 추출물을 500μM 농도에서 저해효과 재확인시험을 진행한 결과, 높은 농도에서 조릿대 에틸아세테이트 추출물의 저해 효과가 대조군과 비교시, 현저히 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 4 참조).
실험예 4. 조릿대 추출물에 대한 농도별 효과 검토
조릿대 에틸아세테이트 추출물의 농도에 따른 HCV 복제효소 활성저해효과를 보기 위하여 일련의 최종 농도 0μM, 50μM, 100μM, 250μM, 500μM 별로 실험예 1에 따라 활성을 측정하였고, 도 5의 결과에서 보듯이 조릿대 에틸아세테이트 추출물은 HCV 복제효소를 시험관내 시험에서 50 내지 100μM을 최종농도로 첨가시 50% 이상 저해하는 것을 보여주었다. 추출물 내 유용성분의 분자량을 100으로 추정하고 몰농도를 계산하였으며 추출물에 일반적으로 수백 내지 수천 종의 물질이 있다고 생각됨으로, 추가 정제 후 IC50(50% 활성저해에 필요한 농도)가 1μM이하의 단일 물질을 찾을 수 있는 가능성이 있다고 보인다(도 5 참조).
실험예 5. 조릿대 추출물의 농도별 세포독성실험
간암세포인 Huh7에 조릿대 추출물의 농도를 증가시키며 처리한 후, 세포에 미치는 독성을 MTT(3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸리움 브로마이드 티아졸일 블루) 시험법으로 측정하여 세포독성이 크지 않음을 확인하였다.
96-웰 플레이트(well plate)에 Huh7 세포를 105정도 넣고, 조릿대 에틸아세테이트 추출물을 100μM, 250μM 넣고 16시간 배양한 후, 2㎎/㎖ MTT 용액을 25㎕를 각각의 웰에 넣고 4시간동안 더 배양하였다. 그 다음 원심분리한 후 상층액을 덜어내고 DMSO를 100㎕첨가하여 침전층을 30분 동안 녹이며 흔들어 준 후 540nm 파장에서 흡광도(Optical Density ; O.D.)를 측정하였다. 결과로 얻어진 흡광도 값을 이용하여, 대조군 O.D.값의 절반에 해당하는 O.D. 값에 대한 농도가 IC50(50% 활성 저해에 필요한 농도)이므로 세포독성 100 %으로 보고 비교하였다.
도 6의 결과를 보면 IC50을 보인 추출물 최종농도 100μM 및 더 높은 250μM 농도에서 대조군과 비교시 세포 독성이 낮음을 확인할 수 있었다(도 6 참조).
결론적으로, 조릿대 추출물 및 극성 및 비극성 가용추출물은 C형 간염의 활성을 저해하는 것을 확인할 수 있었고, C형 간염의 예방과 치료에 효과적임을 재확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 조릿대 추출물 및 극성 및 비극성 가용추출물을 함유한 약학적 제제는 재래로부터 널리 사용되어온 생약으로 독성의 문제가 없으며, C형 간염 질환의 예방 및 치료에 효과적으로 사용될 수 있다.
Claims (10)
- C형 간염의 예방 및 치료 효과를 나타내는 조릿대(Lophatherum gracile BRONGN)의 극성 및 비극성 용매 가용 추출물.
- 제 1항에 있어서, 극성 용매는 물, 부탄올이고 비극성 용매는 에틸아세테이트인 추출물.
- 조릿대 추출물을 유효성분으로 포함하는 C형 간염 예방 및 치료를 위한 약학 조성물.
- 제 3항에 있어서, 조릿대 추출물은 물 또는 부탄올 용매로부터 선택된 극성 용매로 추출된 조성물.
- 제 3항에 있어서, 조릿대 추출물은 에틸아세테이트, 클로로포름 용매로부터 선택된 비극성 용매로 추출된 조성물.
- 제 1항의 조릿대의 극성 및 비극성 용매 가용 추출물을 포함하는 C형 간염의 예방 및 치료용 약학 조성물.
- 제 2항의 조릿대의 물 추출물, 부탄올 추출물 또는 에틸아세테이트 추출물을 포함하는 C형 간염의 예방 및 치료용 약학 조성물.
- 제 7항에 있어서, 조성물 총중량에 대하여 상기 추출물을 0.5 ~ 50%로 포함하는 조성물.
- C형 간염의 예방 및 치료효과를 나타내는 조릿대의 추출물 또는 극성 용매 가용추출물, 비극성 용매 가용추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강보조식품.
- 제 9항에 있어서, 건강음료인 건강보조식품.
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