KR20030028253A

KR20030028253A - 잔탄검과 알긴을 이용한 항고지단백혈증 경피투과제제의제조

Info

Publication number: KR20030028253A
Application number: KR1020010060275A
Authority: KR
Inventors: 황성규; 오세영; 이환구
Original assignee: (주)지씨아이; 황성규; 오세영
Priority date: 2001-09-27
Filing date: 2001-09-27
Publication date: 2003-04-08

Abstract

본 발명은 무독성이며 생체 적합성 및 피부투과성이 우수한 천연고분자인 알긴과 잔탄 검을 연고기제로 하고 이에 항고지단백혈증제제인 clofibrate와 일부 PEG, 글리세린 및 올레산과 같은 투과촉진제를 첨가하여 경피투과제제를 제조하고 이에 대한 투과정도와 혈액학적 및 병리조직학적 안전성에 대하여 연구하여 항고지단백혈증제의 경피투과제제의 제조에 관한 것이다.

Description

잔탄검과 알긴을 이용한 항고지단백혈증 경피투과제제의 제조 {Preparation of Transdermal Delivery Agent with Antihyperlipoproteinemic using Xanthane Gum and Algin}

약물을 인체에 전달하는 방법은 다양하다. 약물 전달 방법의 종류와 특성에 따라 주사, 경구, 점막, 피부 투여 및 이식 등으로 분류할 수 있는데, 가장 보편적인 방법이 경구 투여 및 주사 방법이며 가장 큰 비중을 차지하는 것은 경구 투여 방법이다. 기존의 약물 투여 체계에서는 약물이 원하는 국소 부위에서 작용하지 못하고 체내 전체에 확산되므로 약물의 효과를 얻기 위해서는 다량의 약물을 투여해야만 하며 이에 따라 치료 후 잔류 약물에 의한 간독성, 신독성 같은 부작용, 체내에서의 약물의 불안정성 및 일부 약물의 조기 배설에 의한 약물의 손실 등이 문제점으로 지적되고 있다. 또한, 현재 사용하고 있는 약물 투여 체계에서는 의약품이 체내에서 용해, 흡수 및 전달 과정에서 허용 농도 이상 공급되어 독성을 나타내는 부작용을 유발하게 되며 원하는 장소에 전달되지 못하고 신체 전체 부위에 전달되기 때문에 과량의 의약품 투여가 불가피하며 이로 인한 손실 및 부작용은 매우 크다.

Clofibrate는 경구 치료 시작 후 2~5일 내에 콜레스테롤과 LDL(low density lipoprotein) 혈중치를 낮춤으로써 혈장내 중성 지방 농도를 감소시키는 것이 특징이다. 그러나 보고된 부작용으로는 오심, 설사, 체중 증가를 경험하는 환자가 있으며 탈모, 무기력 및 성욕 감퇴 등도 때때로 나타난다고 보고된 바 있다. 더 심한 부작용으로는 독감양(flu-like) 증후군이며 심한 근육 경련, 통증, 경직 및 무력 등이 동반된다. 이 증후군은 약을 먹을 때마다 재발하며 혈장 내 creatine phosphokinase와 glutamic-oxaloacetic transaminse의 증가를 나타낸다.

의약관련 목적으로 사용될 재료는 사용기간 또는 사용 후에도 인체에 안전하며 생체적합성(biocompatibility)이 있어야만 하며 약물을 효과적으로 인체에 공급하고 부작용을 최소화하기 위해서는 적절한 제형의 선택, 안정한 약물의 배합 및 약물전달 메카니즘의 선택이 중요하다. 즉 약물의 방출 조절과 전달 체계가 잘 갖추어져야 하며 여기서 약물 방출 조절이란 약물이 체내로 들어가는 양을 임의로 조절하는 것을 말한다. 즉, 방출량을 제어함으로서 치료의 효과를 증진시키고 그 재료 사용에 따른 안전성을 확인하고자 하는 것이다.

· 실시예 1

[경피투과제제의 제조]

경피투과제제의 제조는 용매인 탈이온수에 알긴 및 잔탄 검의 양을 각각 일정하게 취하여 용해시켰다. 이때, 각각 수용액상에서 점성을 나타내므로 기계식 교반기를 사용하여 일정 시간 동안 균일하게 분산, 용해되도록 하였다. 예로서 잔탄 검을 기제로 사용하고 약물로 clofibrate를, 투과 촉진제로서 PEG 600을 사용한 경피투과제제의 경우는 잔탄 검을 일정량 취하여 멸균한 초증류수에 넣고 기계식 교반기를 사용하여 완전 용해시켰다. 이때 기포가 발생하므로 초음파 발생기를 사용하여 기포를 없애주었다. 물리적 방법인 초음파를 이용하면 가수 분해에 의한 부분적인 분자량 감소를 예상할 수 있으나 본 연구에서는 평균 1시간 교반 중 15분의 간격마다 2분간의 일시적인 초음파 방법을 택하여 분자량 감소를 최소화시키려 했으며 액의 점도가 높을 경우 진동이 커서 가수 분해가 용이한 저주파보다는 고주파를 사용하여 기포 생성을 억제시켰다. 제조한 경피투과제제는 밀봉하여 사용할 때까지 PE병에 보관하고 실험때 마다 적량을 덜어 사용하였으며 3일에 1회씩 육안적, 후각적 조사를 통한 경피투과제제의 안정성 관찰을 실시하였다.

[실험 군의 설정]

대상 실험동물은 (주)대한실험동물센터에서 체중 100∼150g의 특정 병원체 부재(Specific Pathogen Free, SPF) 숫컷 SD(Sprague-Dawley)계 랫드를 분양 받아서 일주일간 적응 순화시킨 후 건강한 동물을 선택하여 일반 실험 환경조건에서 15마리씩 넣어 군분리를 시행하여 실험하였으며 먹이와 음용수 섭취는 배합사료와 일반 수도수를 실험동물에 자유로이 공급하였다. 적응 사육기간을 거친 후 외관상 피부에 상처나 흔적이 없는 것을 선택하여 실험하였다. 실험에 사용한 동물은 in vitro 실험에 사용된 피부 적출 대상과 in vivo실험에 사용된 대조군과 약물의 경피투과 제제 실험군으로 구분하였으며, Table 1과 2에 in vitro 및 in vivo 실험에사용된 동물군을 나타내었다.

· 실시예 2

[In vitro에서의 경피투과]

확산 장치를 사용한 약물의 in vitro 투과 실험에는 다양한 종류의 피부 모델을 사용한다. 예를 들면 랫드, hairless mouse, dog, rabbit, rhesus monkey, pig, snake skin 및 human candaver skin 등이 폭넓게 이용된다. In vitro 투과 실험에서의 적절한 피부 모델의 선정은 in vivo에서의 경피투과제제들의 약물 동태학적 거동을 사람이 아닌 동물을 사용하여 예측할 수 있다는 점에서 매우 중요하다. 본 실험에서는 사람의 피부와 유사한 투과 특성을 갖는 동물 중에서 랫드를 선택하여 실험을 진행하였다. 동일한 조건으로 제조된 여러 종류의 경피투과제제를 in vitro에서의 피부투과 실험을 위해 막으로 사용할 랫드의 피부를 적출하였다. 랫드의 피부 적출을 위한 수술 도구는 모두 고압 증기 멸균 처리하였으며 랫드는 클로로포름을 사용하여 마취하였고, 등 부위의 털을 전기 제모기로 피부에 상처가 나지 않도록 조심스럽게 제거한 후 소독한 다음 멸균된 수술용 칼로 표피를 가로, 세로 각각 5.0cm로 절개하여 피부를 적출하여 피하지방과 혈관 등을 상하지 않게 조심스럽게 제거하였다. 이렇게 적출한 랫드의 피부를 즉시 수평막셀 중앙에 고정시킨 후 경피투과실험을 진행하였다. 본 실험에서는 확산셀 형태의 수평막셀을 사용하여 투과 실험을 진행하였으며 장치를 Fig. 1에 나타내었다. 적출한 랫드의 피부가 고정된 투과셀 상층에 제조한 경피투과제제를 동량 적가하고 생체 혈류 속도를 유지하여 37±0.5℃로 유지된 항온조에서 실험하였다. 또한 자석 교반기를 사용하여 막 주위의 농도 분극이나 boundary resistance를 제거하였다. 투과가 진행되는 동안 투과 정도는 분광 광도법으로 측정하였으며 이때 sink condition을 유지하였다. 채취된 시료는 millipore filter(pore size : 0.2㎛)로 여과한 후 UV spectrophotometer를 이용하여 각 약물의 최대 흡수 파장(λ_max)에서 흡광도를 측정하였으며 각 실험은 3회 실시하여 그 평균값을 사용하였다.

[실험 결과]

지용성 약물인 clofibrate의 함량을 달리하여 경피투과제제를 제조하여 투과 실험을 하였으며, 투과 촉진제로 글리세린, PEG 및 올레산을 첨가하여 경피투과제제를 제조하여 투과 촉진제의 영향을 실험하였다. 지용성 약물인 clofibrate를 사용하여 in vitro에서 진행한 투과 실험에서의 전제적인 투과 양상은 4시간 전후에서 정상상태에 이르고 있고, 20시간의 투과량은 잔탄 검제제의 경우가 가장 높았다. 투과속도계산 결과에서 보면 잔탄 검제제의 경우가 다른 제제들의 경우 보다 빠른 속도를 보였고, 약물의 함량이 많은 경우가 그렇지 않은 경우 보다 투과속도가 약간 빠르게 나타났다. 지용성인 clofibrate는 lag time의 증감과 상관없이 잔탄 검의 투과속도가 가장 빠르게 나타났는데 이는 일정 시간의 lag time에 도달 후 지용성 물질을 잘 투과시키는 생체 피부가 지용성인 clofibrate를 투과시키기 때문이라 생각된다. 투과제의 첨가에 따른 투과 실험의 결과를 투과 촉진제의 종류에 따라 약물의 함량은 일정하게 하고 알긴과 잔탄 검으로 구분해서 얻어진 결과를Fig. 2와 3에 나타내었다.

약물인 clofibrate의 투과속도가 상대적으로 빠른 키토산과 xanthan gum에 약물의 함량을 고정하고 투과 촉진제로 글리세린, PEG 600, 올레산을 첨가한 경피투과제제의 투과 실험을 진행해서 투과촉진제를 첨가했을 경우에 그렇지 않은 경우에 비해 lag time과 투과속도가 빠르게 나타났다. 특히 PEG 600을 사용했을 경우가 가장 빠른 투과속도를 나타냈고 글리세린, 올레산의 순으로 투과속도의 증가를 나타냈다.

즉, 경피투과 촉진제의 효과 발현에는 기제의 성질이 크게 영향을 미친다. 예를 들면 기제와 촉진제간의 공용매 효과에 의해 기제중 약물의 용해도가 변하면 겉보기에 같은 농도라도 약물의 기제중 열역학적 활동도가 변하기 때문에 피부 투과량이 변할 수 있으며 기제의 차이로 투과 촉진제 자체의 피부 투과성에 영향을 받을수 있으리라 생각된다. 확산 현상의 결정 인자중 하나인 분배 계수나 활동도 계수를 포괄적으로 이해하는데 유용한 개념이 용해도 파라미터이다. 이중 약물과 투과촉진제의 지용성을 분배계수로 표현하며 일반적으로 약물과 투과 촉진제의 친유성이 증가하게 되면 분배 계수도 증가하여 피부 투과속도도 증가한다. 이러한 용해도 파라미터는 유사한 분자간의 응집력을 나타내며 일반적으로 약물의 친유성이 증가하면 용해도 파라미터는 작아진다. 즉, 포화 용해도 이하의 농도 범위에서는 약물과 기제 또는 기제와 투과 촉진제간의 용해도 파라미터 차이가 클수록 투과계수가 증가한다. 상용 연고 기제 중 일부 사용되는 PEG 600은 글리세린 보다 지용성 약물인 clofibrate에 대해 피부내의 지방과 단백질의 유동성(fluidity)과 피부 각질의 lipophilicity를 증가시킴으로서 각질로의 약물 분배를 촉진한다고 생각된다. 이와 같이 투과 촉진제를 사용함으로써 약물의 투과도를 증가시킬 수 있었다.

· 실시예 3

[In vivo에서의 경피투과]

경피제제나 외용제제류(크림, 연고, 용액)의 in vivo 실험은 인체를 모델로 수행하는 것이 바람직하지만 사용량이 적기 때문에 혈중 농도의 검증이 어렵고 특히 용량증가로 인해 독성의 우려가 있을 때에 동물 모델을 선정하게 된다. 사람이 아닌 동물을 모델로 선정하는 경우에는 경피투과의 유사성, 동물 모델 구입의 용이성, 단가및 취급성이 고려되어야 하는데 본 in vivo 실험의 경우에는 in vitro 실험에서 사용된 동물 모델인 랫드를 선택하여 실험을 수행하였다. 제조된 여러 종류의 경피투과제제를 in vivo에서의 실험을 위해 in vitro에서의 실험과 같은 방법으로 랫드의 등 부위를 전기 제모기를 사용하여 가로, 세로 10cm 정도를 제거하였다. 제모된 부위에 동량의 경피투과제제를 오전과 오후 1일 2회씩 일정한 시간에 도포하였으며 이때 약제를 도포하기 전에 랫드의 임상적 증상과 사망유무를 관찰하고 체중을 측정하였다. 약제의 도포는 3일간 하였으며 부검을 하여 혈액학적 분석과 병리 조직학적 분석을 실시하였다.

1) 혈액학적 검사

랫드의 희생 전 24시간을 물만 공급하고 절식시키고 경추 탈골법으로 희생한 다음 신속히 복부 정중선을 절개하여 심장에서 채혈하였다. 심장에서 채혈한 혈액은 ethylenediaminetetraacetic acid-sodium salt(EDTA-Na)로 항응고 처리하고 자동혈구 계산기를 이용하여 백혈구(WBC), 적혈구(RBC), 혈색소량(HGB), 적혈구 용적(HCT), 평균적혈구 용적(MCV), 평균 적혈구 혈색소량(MCH), 평균 적혈구 혈색소농도(MCHC)를 측정하였고, 백혈구의 감별검사(differential counts)로서 혈소판수(PLT), 림프구(lymphocyte), 호중구(neutrophil), 단핵구(monocyte), 호산구(eosinophil), 호염기구(basophil) 등의 혈액학적 검사를 하였다.

2) 피부 병리 조직학적 검사

경피투과제제를 피부에 적용했을 때 사용한 기제 및 흡수 촉진제 등에 의하여 피부에 유해한 결과를 나타내지 않아야 한다. 따라서 경피투과용 겔, 크림, 연고 및 경피투과제제에 대한 피부 조직학적 평가가 필요하다. 즉 피부 자극 여부와 홍반의 유무 외에도 피부 조직에 대한 변화 등을 고려할 필요가 있다. 랫드에 대해 제조한 경피투과제제로 인한 피부의 조직변화를 관찰하기 위하여 정상 피부와 관찰할 부위의 피부를 떼어내어 filter paper에 편평하게 부착한 후 10% 중성 포르말린에 3일이상 충분히 고정하고 일반적인 조직 처리 과정을 거쳐서 파라핀 포매한 후 nicrotome으로 박편을 만들고 hematoxylin과 eosin으로 염색하여 현미경으로 50∼100의 배율에서 관찰하였다.

[실험 결과]

In vitro 실험을 통해서 최적 조성의 처방 및 투과 실험을 수행하더라도 in vivo와의 상관성 및 예측이 없다면 실제 적용이 어렵다. 또한 실제 실험 동물 적용을 통해 투과 정도 및 피부 독성학 특성인 자극성 및 알레르기 유무 등을 확인한 후 생체에서의 안전성과 약물 동태학적 특성을 연구하여야 한다.

In vitro에서 약물에 대해 빠른 투과 결과를 보인 알긴 및 잔탄 검 기제를 선택하고 약물은 clofibrate를 선택하여 in vitro에서와 같은 방법으로 제조된 경피투과제제를 사용해서 in vivo에서 연구를 진행하였다.

실험 시작전후 변화

육안적 관찰로서 실험기간 중 사망한 랫드는 없었으며, 대조군을 포함한 모든 군에서 유의한 임상 증상은 발견되지 않았으며 시작과 종료 체중 변화, 즉 증체량은 대조군에서 가장 높았으나 실험군과의 유의한(P < 0.05) 차이는 인정되지 않았다.

혈액학적 검사

Table 3의 혈액학적 분석 결과에서 보면 일반적으로 랫드의 정상 범위 백혈구(WBC)수를 7.3∼12.7×10³/μL로 나타낸다면, 각 실험군의 범위는 정상 범위 내에 있는 것으로 판단되었다. 적혈구(RBC)도 역시 정상 범위가 7.2∼8.5×10⁶/μL임을 감안하면, 각 실험군의 범위는 정상 범위 내에 있는 것으로 판단되었다. 헤모글로빈(HGB)은 정상 범위를 14.0∼15.6g/dL로 보면, 분석 결과 실험군의 범위는 정상 범위 내에 있는 것으로 판단되었다. 혈구용적(HCT)은 정상 범위를 41.1∼51.1%로 보면 잔탄 검군에서 유의한(P < 0.05) 결과를 보였지만 비교적 정상 범위에 속하는 것을 볼 수 있다. 평균 적혈구 용적(MCV)은 정상 범위를 52.6∼65.4fL로 보면, 대조군을 포함한 모든 군에서 정상 범위에 속하는 것으로 볼 수 있다. 평균 적혈구 혈색소량(MCH)은 정상 범위를 16.5∼21.3pg임을 감안하면, 역시 대조군을 포함한 각 실험군에서 정상 범위내에 있는 것으로 판단되었다. 평균 적혈구 혈색소 농도(MCHC)는 30.3∼34.7g/dL를 정상 범위로 보면 대조군 및 각 실험군에서 비교적 정상 범위에 포함되는 것을 확인할 수 있었다. 혈소판수(PLT)는 367∼573×10³/μL를 정상 범위로 보았을 때, 대조군을 포함한 각 실험군에서 모두 정상 범위를 보였다.

Table 4에 나타낸 백혈구 감별검사 결과에서 호중구는 정상 범위가 9~25%,1.10~4.0×10³/μL로서 대부분의 실험군이 정상범위 내에 있지만 일부 실험군에서 유의한(P < 0.05) 결과도 보였으나 비교적 정상 범위에는 속하는 것으로 나타났으며 그 외에 림프구, 단핵구 등도 비교적 정상 범위에 속하였다.

호산구는 정상 범위를 0.0∼0.6%, 0.03∼0.06×10³/μL로, 호염기구는 0.0∼1.0%, 0.1∼0.15×10³/μL로 보고하고 있으나, 본 실험에서는 일부 실험군에서 유의한(P < 0.05) 결과를 보였지만 대체로 모든 실험군에서 정상 범위에 있는 결과를 나타내었다. 일부 실험군에서 호산구가 유의한(P < 0.05) 결과를 나타낸 것은 호산구의 역할이 이물질 침입에 대한 해독작용인데 빠른 투과속도를 나타낸 기제 약물들이 피부를 통하여 투과됨으로써 나타나는 일시적 호산구의 증가 때문이라 생각된다.

이와 같이 혈액학적 검사 결과 천연고분자 기제 또는 투과 촉진제들이 비교적 생체에 대한 큰 영향이 없는 것으로 나타났으며 이는 생체 적용시 기제에 대한안전성을 나타내 주는 것이라 생각한다.

병리조직학적 관찰

In vivo에서 경피투과제제 적용 실험 후 랫드 피하 조직의 병리·조직학적 검사를 실시한 결과, Fig. 4(a)의 정상적인 피부 조직은 바르게 배열된 교원 섬유(collagen fiber)와 고르게 분포되어 있는 섬유아 세포(fibroblast)가 관찰되고 있다. 역시 Fig. 4(b)와 Fig. 4(c)의 경피투과제제 1일 2회씩 3일 도포 한 후알긴과 잔탄 검 조직도 정상 피부 조직과 같이 어떠한 병변도 관찰되지 않았다.

.

Claims

알긴과 잔탄 검을 이용한 항고지단백혈증 경피투과제제의 제조방법과 경피 투과효과
항고지단백혈증 경피투과제제에 대한 PEG, 글리세린 및 올레산등의 투과촉진제의 첨가에 따른 경피 투과효과