KR20030022106A - 스테롤-특이성 리파아제를 이용하는 스테롤들의 효소적 변형 - Google Patents

스테롤-특이성 리파아제를 이용하는 스테롤들의 효소적 변형 Download PDF

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Abstract

본 발명은 선택적으로 지방-기초 제품으로부터 유도된 것이 아닌 카르복실 지방산(들) 및/또는 이들의 에스테르 유도체(들)이 첨가된 지방-기초 제품을 선택적으로 계면활성제-코팅된, 부동화된 리파아제 복합체의 존재 중에서 유리 스테롤과 접촉시키는 것에 의해 유리 스테롤을 선택적으로 가알코올분해시키는 방법에 관한 것으로, 여기에서 상기 복합체는 높은 수준의 스테롤-특이성 가알코올분해 및/또는 에스테르화 활성 및 최소의 가산분해 및 교차에스테르화 활성을 갖는다. 상기 지방-기초 제품은 영양 제품 또는 식품, 특히 버터지방 또는 화장품 또는 화장-관련 제품들이다. 상기 방법은 부동화된, 바람직하게는 계면활성제-코팅된 리파아제에 의해 그 안에 포함된 어떠한 임의의 유리 콜레스테롤을 선택적으로 에스테르화시키므로써, 실질적으로 무-콜레스테롤 지방-기초 제품들, 특히 버터지방을 포함하는 제품들을 제조하는 방법에 사용될 수 있다. 본 발명은 또한 지방-기초 제품의 에스테르화된 피토스테롤 에스테르(들)로의 동위치적 풍부화를 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 상기 피토스테롤의 에스테르화는 상기 지방-기초 제품 중에 존재하는 어떠한 임의의 유리 콜레스테롤의 에스테르화에 의해 동시적으로 수반된다.

Description

스테롤-특이성 리파아제를 이용하는 스테롤들의 효소적 변형{Enzymatic modification of sterols using sterol-specific lipase}
스테롤들은 8 내지 10의 탄소수의 측쇄와 히드록시기에 연결된 스테로이드 핵을 포함하는 알코올들이다. 이러한 화합물들은 식물 및 동물계에서 폭넓은 분포를 갖는다. 가장 넓게 분포하는 식물 스테롤은 에르고스테롤인 반면, 가장 명백한 동물 스테롤은 콜레스테롤이다.
최근, 동맥경화증의 병인에서 명백한 위험인자들을 구성하는 콜레스테롤을 포함하여 특정의 지질 성분들이 음식물 중에 존재하고 있는 것으로 밝혀지고 있다.이 분야의 연구 결과, 잠재적으로 유해한 지질 및 지질-유사 물질들의 수준을 감소시키는 것과 같이, 폭 넓게 소비되는 여러 음식 제품들의 조성을 변형시키고자 하는 시도가 여러번 있었다.
이 분야에서 특히 현저한 것들로는 음식 제품들의 콜레스테롤 함량 저하를 지향하고 있다. 이러한 점에서, 버터 및 아이스크림과 같은 저-콜레스테롤 또는 무-콜레스테롤 함유 음식물들의 제조에 사용하기 위한 버터지방과 같은 주요 식이성 지방들의 변형 방법 개발에 큰 관심이 모아지고 있다.
일본공개특허공보 제42944/71호는 아세톤 또는 헥산과 같은 유기용제들로 콜레스테롤을 추출하는 수단에 의한 콜레스테롤-저감 재료의 수득 방법을 기술하고 있다. 음식 제품들에서 콜레스테롤 수준을 낮추는 다른 방법은 예를 들면, 중합체-지지디기토닌(digitonin)의 사용에 의하여 음식 제품들로부터 콜레스테롤을 흡착하는 것이다(J. Agric. Food Chem. 38:1839(1990)).
음식으로부터 콜레스테롤을 제거하는 다른 방법은 유리 콜레스테롤을 덜 위해한 또는 무해한 유도체로 전환시키는 것이다. 예를 들면, 미합중국 특허 제4,921,710호는 콜레스테롤의 코프로스탄올(coprostanol)로의 전환에 콜레스테롤 환원효소(cholesterol reductase)를 이용방법을 기술하고 있다.
공지된 다른 변형방법은 유리 콜레스테롤이 콜레스테롤-지방산 에스테르를 형성하도록 효소적으로 전환시키는 것이다. 한 보고서(Kalo, P. et al., 1993, Fat Sci. Technol. 95:58-62)에서, 리파아제-촉매화 인터에스테르화 반응(lipase-catalyzed interesterification reaction) 동안에서 콜레스테롤 에스테르의 형성이 기재되어 있다. 이 연구에서 보고된 콜레스테롤 변형은 트리글리세리드 조성물에서의 소정의 변형물을 얻기 위한 주반응의 부산물이었다.
본 발명의 목적은 스테롤들, 특히 콜레스테롤과 같이 유해한 식이성 스테롤들의 변형 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 버터지방 중의 콜레스테롤을의 중성화 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 버터지방 중에 존재하는 다른 지질 성분들(트리글리세리드들)에 영향을 주지 않으면서 콜레스테롤을 선택적으로 중성화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 지방-기초의 제품, 바람직하게는 영양 및 화장-관련 제품들에 에스테르화된 피토스테롤 에스테르를 풍부하게 하며, 동시에 지방-기초 제품의 유리 콜레스테롤 함량의 감소 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 이들 및 다른 목적들 및 잇점들은 이하의 상세한 설명에 따라 명백해진다.
본 발명은 스테롤들의 선택적 가알코올분해 및/또는 에스테르화를 위한 리파아제들의 이용에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 음식물들, 특히 유지방 중의 유리 콜레스테롤의 선택적 가알코올분해 및/또는 에스테르화를 위한 리파아제들의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 지방-기초의 제품을 에스테르화된 피토스테롤 에스테르(phytosterol ester)로 동위치적으로 풍부하게 하며, 동시에 지방-기초 제품의 유리 콜레스테롤 함량을 감소시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 바람직한 구체적인 실시예들의 상세한 설명 및 첨부된 도면들로부터 보다 명백하게 이해될 수 있으며, 여기에서 도 1은 미처리 무수 우유 지방(AMF ; anhydrous milk fat)에 대한 전형적인 가스크로마토그램이다.
도 2는 미세-수성의 노말-헥산 중에서 엔자이모알크(Enzymoalc)로 처리한 후의 무수 우유 지방에 대한 전형적인 가스크로마토그램이다.
도 3은 효소로의 2차 처리 전 및 후의 무수 우유 지방-트리글리세리드 분획에 대한 전형적인 가스크로마토그램이다.
도 4는 스티그마스테롤(피크 5.10)과 내부 표준물로서의 콜레스테롤(피크 4.75)로 풍부화시킨 무수 우유 지방에 대한 전형적인 가스크로마토그램이다.
도 5는 엔자이모알크 7C로 처리한 후의, 스티그마스테롤로 풍부화된 무수 우유 지방의 샘플에 대한 전형적인 가스크로마토그램이다.
도 6은 4A로 처리한 후의, 피토스테롤로 풍부화된 올리브 오일의 샘플에 대한 전형적인 가스크로마토그램이다.
도 7은 효소 제재 4B, 4C, 4E 및 4F를 이용하여 헥산의 존재하에서 올리브 오일 중에서의 스티그마스테롤의 스티그마스테롤 올레이트로의 전환을 나타내는 도면이다.
도 8은 스티그마스테롤(피크 4.84)로 풍부화시킨 무수 우유 지방의 샘플에 대한 전형적인 가스크로마토그램이다. 콜레스테롤 피크는 4.39의 위치에서 나타난다.
도 9는 엔자이모알크 4C로 처리한 후의, 스티그마스테롤로 풍부화된 무수 우유 지방에 대한 전형적인 가스크로마토그램이다.
이제 몇몇 부동화된, 선택적으로 계면활성제-코팅된 리파아제 제재들이 놀랍게도 스테롤들의 선택적 가알코올분해 및/또는 에스테르화에 사용될 수 있음이 확인되었다. 이하에서 기술되는 상기 선택적 가알코올분해 및/또는 에스테르화 방법이 동물의 스테롤들, 식물 또는 합성 유래의 스테롤들 등 서로 다른 여러 스테롤들에 적용될 수 있기는 하나, 본 발명 방법의 주요 적용은 식이성 콜레스테롤 및 피토스테롤들의 선택적 가알코올분해 및/또는 에스테르화이다.
본 발명은 일차적으로는 바람직하게 유리 스테롤들의 최대의 가알코올분해 및/또는 에스테르화가 일어나기에 충분한 시간 동안 선택적으로 계면활성제-코팅된것이며, 최소의 가산분해 및 인터에스테르화 활성(acidolytic and interesterification activities)들과 짝지워진 높은 수준의 가알코올분해 및/또는 에스테르화 활성을 갖는 부동화된 리파아제의 복합체와 스테롤들을 접촉시키는 단계와, 계속해서 상기 선택적으로 코팅된, 부동화된 리파아제 복합체와 상기 에스테르화된 콜레스테롤들을 필요한 경우 제거하는 것을 포함하는 유리 스테롤들의 선택적 가알코올분해 및/또는 에스테르화 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법은 다음과 같이 천연의 오일들 및 지방 매질들 중에서 선택적으로 계면활성제-코팅된, 부동화된 리파아제를 사용하여 스테롤들을 가알코올분해 및/또는 에스테르화시키는 것, 즉,
1. 에스테르화:
지방산(또는 그들의 에스테르 유도체)이 가해진 천연의 오일 및 지방 매질에 스테롤-OH를 가하여 에스테르화된 스테롤을 얻는 것;
2. 가알코올분해:
천연의 오일 및 지방 매질(예를 들면, 올리브 오일) 중에 존재하는 트리글리세리드들에 스테롤-OH를 가하여 스테롤-지방 아실 에스테르 + 디아실-글리세롤을 얻는 것;
을 포함한다.
특히, 본 발명은 바람직하게 유리 콜레스테롤의 최대의 가알코올분해가 일어나기에 충분한 시간 동안 최소의 가산분해 및 인터에스테르화 활성들과 짝지워진 높은 수준의 가알코올분해 및/또는 에스테르화 활성을 갖는, 계면활성제-코팅된 불용성 매트릭스 부동화 리파아제 복합체와 유리 콜레스테롤을 접촉시키는 단계와, 계속해서 상기 에스테르화된 콜레스테롤을 상기 리파아제 복합체로부터 제거하는 것을 포함하는 유리 콜레스테롤의 선택적 가알코올분해 및/또는 에스테르화 방법에 관한 것이다.
"선택적 가알코올분해"라는 용어는 앞서 기술한 방법이 지방-기초의 제품, 특히 버터지방 중에 존재하는 트리글리세리드들의 글리세롤 골격(backbone) 상의 지방 아실기들의 동일성 또는 위치상 분포에 명백한 변화를 야기하지 않고, 유리 콜레스테롤을 가알코올분해 또는 에스테르화 시킨다는 것을 의미한다. 본 발명의 바람직한 구체적인 실시예에서, 에스테르화될 유리 콜레스테롤은 버터지방 중에 존재하는 것이다.
본 발명의 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 가알코올분해 및/또는 에스테르화 반응은 미세-수성 환경(microaqueous environment) 중에서 실시된다. 바람직하게는, 상기 미세-수성 환경은 유기 용매에 의해 제공된다. 어떠한 임의의 유기 용매도 사용될 수 있으나, 바람직한 용매는 노말-헥산(n-hexane)이다. 본 발명의 또 다른 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 가알코올분해 및/또는 에스테르화 반응은 무용매 시스템(solvent-free system) 중에서 수행된다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 리파아제는 칸디다 안트아크티카(Candida antarctica), 칸디다 안트아크티카 에이(Candida antarctica A) 및 칸디다 루고사(Candida rugosa)들로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 것이다. 보다 바람직한 실시예에서, 상기 리파아제는 칸디다 안트아크티카 에이 또는 칸디다 루고사들 중 하나이다.
본 발명은 또한 버터지방 제품 전구체 중에 포함된 콜레스테롤을 리파아제로 가알코올분해 및/또는 에스테르화 시키는 것을 포함하는, 실질적으로 콜레스테롤이 제거된 버터지방-함유 제품들을 제조하는 방법을 포함한다. 본 발명의 하나의 구체적인 실시예에서, 상기 방법에 사용된 상기 리파아제는 불용성 매트릭스 상에 부동화된 것이다.
본 발명의 다른 하나의 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 리파아제는 계면활성제-코팅된 것이다. 또한, 보다 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 리파아제는 불용성 매트릭스 상에 부동화되고, 또한 계면활성제-코팅된 것이다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 상기 변형(계면활성제-코팅된)-부동화된 리파아제 복합체는 과립상으로 사용되어 안정성의 상당한 증가 뿐 아니라 활성의 손실 없이 반복적인 효소의 이용을 가능하게 하는 효과를 낳는다.
또 다른 관점에서, 본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된, 변형된, 저-콜레스테롤 버터지방 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 생산된, 변형된 버터지방 조성물을 포함하는 저-콜레스테롤 음식 조성물들에 관한 것이다. 본 발명의 이러한 관점의 바람직한 구체적인 실시예에서, 변형된 버터지방 조성물들을 포함하는 저-콜레스테롤 음식 조성물은 저-콜레스테롤 버터, 코코아 버터, 아이스크림, 커피 미백제(coffee whitener) 및 커피 크림(coffee cream), 치즈, 다른 식이성 제품들 및 다른 스테롤-함유 음식들로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 저-콜레스테롤 음식 조성물들은 스티그마스테롤(stigmasterol) 등과 같은 에스테르화된 식물 스테롤들로 더 풍부화시킨(enriched) 것이다.
또 다른 바람직한 구체적인 실시예에서, 본 발명은 화장품 및/또는 화장품-관련 제품들을 스티그마스테롤 등과 같은 에스테르화된 식물 스테롤들로 풍부화시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 방법들이 어떠한 임의의 적절한 리파아제 또는 리파아제 제재들을 사용하여 수행될 수 있기는 하나, 바람직한 구체적인 실시예에서, 상기 리파아제 또는 리파아제 제재의 원천은 아스퍼질러스 니거(Aspergillus niger), 칸디다 안트아크티카, 칸디다 실린드라세아(Candida cylindracea), 뮤코르 미에헤이(Mucor miehei), 슈도모나스 세파시아(Pseudomonas cepacia), 리조푸스 니베우스(Rhizopus niveus), 리조푸스 아르히쥬스(Rhizopus arrhizus), 호그 판크레아스(Hog pancreas), 아스퍼질러스 오리자에(Aspergillus oryzae), 칸디다 리폴리티카(Candida lipolytica), 뮤코르 자바니쿠스(Mucor javanicus), 페니실리움 로쿠에포르티(Penicillium roqueforti), 슈도모나스 플루오레슨스(Pseudomonas fluorescens), 리조뮤코르 미에헤이(Rhizomucor miehei), 맥아, 크로모박트 비스코슘(Chromobact. viscosum), 슈도모나스 종(Pseudomonas species)으로부터의 지방단백질(lipoprotein), 슈도모나스 종 B(Pseudomonas species B)로부터의 지방단백질, 릴리파아제 에이-10에프지(Lilipase A-10FG), 사이켄 100(Saiken 100), 리파아제 지(Lipase G), 리파아제 엠(Lipase M), 리파아제 에프-에이피-15(Lipase F-AP-15),뉴라아제 에프(Newlase F), 판크레아틴 에프(Pancreatin F), 뉴라아제 에이피6(Newlase AP6), 리파아제 에이와이(Lipase AY), 리파아제 피에스(Lipase PS), 노보자임 525(Novozym 525), 노보자임 868(Novozym 868), 노보자임 388(Novozym 388), 노보자임 398(Novozym 398), 노보자임 435(Novozym 435 ; 부동화된 것), 리포자임 아이엠-60(Lipozyme IM-60 ; 부동화된 것) 및 피피엘(PPL)들로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 앞서의 모든 특징들 및 다른 특징들 그리고 잇점들은 이하의 상세하고도 비제한적인 수치들 및 그들의 바람직한 구체적인 실시예들로부터 명백하게 이해될 수 있는 것이다.
발명을 명확하게 하고, 또 발명의 이해를 돕기 위한 목적으로, 본 명세서에서 기술되고 또한 청구되는 바와 같이, 하기의 용어들 및 약어들을 다음과 같이 정의한다.
콜레스테롤 중성화 : 유리 콜레스테롤의 콜레스테롤 에스테르로의 전환
저-콜레스테롤 : 이 용어는 음식 또는 조성물이 낮은 수준의 유리 콜레스테롤 포함을 나타내는 것으로 사용된다.
엔자이모알크 : 달리 표현하지 않는 한, 변형-부동화된 효소를 나타낸다.
A-G : 하기의 표 1에서 기술된 효소 제재들의 서로 다른 형태를 나타낸다.
효소 제재 변형 부동화
A SMS 셀라이트
B SMS 실리카 사이퍼나트 700
C SMS 실리카 사이퍼나트 D17
D SMS 실리카 에어로실 R972
E SMS 실리카 사이퍼나트 22
F SMS 실리카 사이퍼나트 630
G SMO 듀오라이트
SMS ; 솔비톨 모노스테아레이트SMO ; 솔비톨 모노올레이트
전체 방법들
1. 효소의 변형
변형된(계면활성제-코팅된) 리파아제는 국제공개 WO 99/15689호에서 기술된 바에 따라 제조되었으며, 본 명세서에서는 이를 참고로 결합시킨다.
간략하게, 미가공의 효소(crude enzyme ; 300㎎/ℓ단백질)을 4g의 불용성 무기 또는 유기 매트릭스(셀라이트, 실리카겔, 알루미나 또는 폴리프로필렌)를 포함하는 1ℓ의 트리스 완충용액(pH 5.5)에 용해시켰다. 이 용액을 10℃에서 30분간 자석교반기로 격렬하게 교반시켰다. 계면활성제-코팅된, 부동화된 효소 제재들의 경우에서는, 소르비탄 모노스테아레이트(20㎖ 에탄올에 1g이 용해된 용액)를 상기 교반된 효소 용액에 적가시켰다. 모든 효소 제재들(즉, 계면활성제-코팅된, 부동화된 리파아제들 및 부동화된 미가공의 리파아제들)은 10분간 초음파처리(sonicated)된 후, 계속해서 10℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 형성된 침전물을 여과 또는 원심분리(12,000rpm, 4℃)들 중의 어느 하나에 의해 수집하고, 계속해서 -20℃에서 하룻밤 동안 냉동시키고, 동결건조(lyophilization)시켰다.
국제공개 WO 99/15689호에서 기술된 바와 같은, 녹말, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 검(gums), 아가로스 또는 다른 결합제 들과 같은 여러 결합제들을 이용하여 상기 변형-부동화된 리파아제 복합체의 과립화 공정을 수행하였다.
2. 효소적 반응들
2.1 표준 에스테르화 반응 조건들
달리 언급되지 않는 한, 이하의 실시예들에서의 모든 반응들은 하기의 조건들 하에서 수행되었다.
미처리의, 부동화된 또는 변형-부동화된 형태의 리파아제(1㎎ 단백질)를 콜레스테롤(20㎎) 및 스테아린산(20㎎)을 포함하는 노말-헥산의 용액(1)에 가하였다. 상기 반응혼합물을 40℃에서 16시간 동안 교반시켰다. 상기 반응혼합물로부터 샘플들을 취하여 0.45㎛의 멤브레인 필터(membrane filter)로 여과하고, 가스크로마토그래피(GC ; gas chromatography)로 분석하였다.
스테아린산(또는 임의의 다른 지방산)의 존재 중에서 노말-헥산 또는 무용매 형태 중에서의 콜레스테롤에의 리파아제 제재의 첨가는 최적의 에스테르화 활성을 갖는 리파아제 효소의 선택을 위한 것이다. 천연 오일 및 지방 매질 중에서의 상기 반응의 수행을 위해서는, 상기 반응에 별도의 콜레스테롤을 첨가할 필요가 없다.
2.2 무수 우유 지방의 매질 중에서의 가알코올분해 반응
2.2.1무수 우유 지방 중에 풍부화된 콜레스테롤의 중성화
(A) 무수 우유 지방(400㎎) 및 유리 콜레스테롤(20㎎)을 포함하는 1㎖의 노말-헥산에 10㎎의 리파아제(미처리의, 부동화된 또는 변형-부동화된 형태)를 가하였다. 상기 반응혼합물을 60℃에서 14시간 동안 흔들어주었다. 소정의 시간 간격마다, 상기 반응혼합물들로부터 샘플들을 취하여 노말-헥산으로 적절히 희석시키고, 가스크로마토그래피 시스템 내로 주입시켰다.
(B) 50㎎의 리파아제((미처리의, 부동화된 또는 변형-부동화된 형태)를 1g의 무수 우유 지방에 가하였다. 상기 반응혼합물을 60℃에서 14시간 동안 흔들어주었다. 소정의 시간 간격마다, 상기 반응혼합물들로부터 샘플들을 취하여 노말-헥산으로 적절히 희석시키고, 가스크로마토그래피 시스템 내로 주입시켰다.
노말-헥산 또는 무용매 형태 중에서의 콜레스테롤의 무수 우유 지방에 대한 첨가는 단지 설명을 위한 것이다. 천연 오일 및 지방 매질 중에서의 상기 반응의 수행을 위해서는, 상기 반응에 별도의 콜레스테롤을 첨가할 필요가 없다.
2.2.2순수한 무수 우유 지방 중의 스티그마스테롤의 가알코올분해
50㎎의 스티그마스테롤로 풍부화시킨 1.2g의 무수 우유 지방에 100㎎의 리파아제 제재들을 가하였다. 상기 반응혼합물을 60℃에서 14시간 동안 가열시켰다. 소정의 시간 간격마다, 상기 반응혼합물들로부터 샘플들을 취하여 노말-헥산으로 희석시키고(20㎎ 반응혼합물/1㎖ 노말-헥산), 가스크로마토그래피 시스템 내로 주입시켰다.
2.3 올리브 오일 중에서의 가알코올분해 반응
2.3.1유기 용매 중 또는 무용매 시스템 중에서의 올리브 오일 중의 스티그마스테롤의 알코올 분해
(A) 1.5㎖ 노말-헥산 중의 50㎎의 스티그마스테롤로 풍부화시킨 0.5㎖ 올리브 오일에 100㎎의 리파아제 제재들을 가하였다. 상기 반응혼합물을 60℃에서 14시간 동안 가열시켰다. 소정의 시간 간격마다, 상기 반응혼합물들로부터 샘플들을 취하여 노말-헥산으로 희석시키고(50㎕ 반응혼합물/300㎕ 노말-헥산), 가스크로마토그래피 시스템 내로 주입시켰다.
(B) 30㎎의 스티그마스테롤로 풍부화시킨 1㎖ 올리브 오일에 100㎎의 리파아제 제재들을 가하였다. 상기 반응혼합물을 60℃에서 14시간 동안 가열시켰다. 소정의 시간 간격마다, 상기 반응혼합물들로부터 샘플들을 취하여 노말-헥산으로 희석시키고(40㎖ 반응혼합물/600㎖ 노말-헥산), 가스크로마토그래피 시스템 내로 주입시켰다.
3. 가스크로마토그래피
콜레스테롤 및 그의 지방산 에스테르, 지방산들 및 트리글리세리드들의 농도들은 불꽃이온화검출기를 장착한 HP-5890을 사용하여 가스크로마토그래피로 결정하였다. 모세관 컬럼(capillary column, 울트라-1(Ultra-1)(HP;휴렛팩커드)를 하기의 분리조건들 하에서 사용하였다.
무수 우유 지방 샘플들에 대하여: 주입기(injector) 및 검출기(detector) 온도들은 365℃로, 초기 컬럼 온도는 150℃로 하고, 계속해서 1분간 등온으로 유지시키고, 그 후, 오븐 온도는 20℃/분의 속도로 365℃까지 상승시켰다.
올리브 오일 샘플들에 대하여: 주입기(injector) 및 검출기(detector) 온도들은 365℃로, 초기 컬럼 온도는 200℃로 하고, 계속해서 1분간 등온으로 유지시키고, 그 후, 오븐 온도는 25℃/분의 속도로 365℃까지 상승시켰다.
4. 박층크로마토그래피(TLC) 동정 스프레이 용액
5㎖의 아세트산, 16.8㎖의 황산 및 453㎖의 에탄올을 혼합하여 염색 용액을 제조하였다. 11.3㎖의 파라-아니스알데히드(para-anisaldehyde)를 상기 용액에 가하고, 상기 시약을 밀봉된 용기에 보관시켰다.
5. 엔자이모알크 7C로 처리된 무수 우유 지방 샘플의 크로마토그래피에 의한 분리
실리카겔 컬럼 상에서 지방들로부터 콜레스테롤 및 콜레스테롤 에스테르를 분리시켜 유리 콜레스테롤의 결정을 위한 정량적 분석을 수행하였다. 평량된 지방 샘플(100㎎)을 하기의 용리액에 용해시키고, 실리카겔 60(활성 II-III) 컬럼에 도입시켰다. 헥산 중의 2% 디에틸 에테르 용액 15컬럼용적; 헥산 중의 5% 디에틸 에테르 용액 10컬럼용적; 디에틸 에테르의 10컬럼용적들로 상기 컬럼을 용리시켰다.
가스크로마토그래피에 의해, 콜레스테롤은 분획 III 및 분획 IV의 결합된 분획들에서 결정되었으며, 콜레스테롤 에스테르는 분획 I에서 결정되었다.
6. 효소원들
다음의 실시예들 중의 일부들에서, 상기 리파아제들은 형태의 축약어로 나타내었으며, 하기 표 2에 이들 효소들에 대한 축약명 즉, 엔자이모알크n, 미생물원, 상품명 및 제조업자의 정보들을 나타내었다.
효 소 미생물원 상품명 제조업자
엔자이모알크 1 슈도모나스 에스피피. 지방단백질 풀루카(Fluka)
엔자이모알크 2 슈도모나스 에스피피. 비지방단백질 풀루카
엔자이모알크 3 칸디다 안트아크티카 풀루카
엔자이모알크 4 칸디다 안트아크티카 A 노보자임 868 노보 노르디스크(Novo Nordisk)
엔자이모알크 5 크로모박테리움 비스코슘 리파아제 LP 아사히(Asahi)
엔자이모알크 6 슈도모나스 세파시아 리파아제 PS 아마노(Amano)
엔자이모알크 7 칸디다 루고사 리파아제 AY 아마노
〔실시예 1〕
유리 콜레스테롤과 유리 지방산들의 에스테르화
앞서 기술된 "전체 반응들"의 반응조건들을 이용하여 순수한 콜레스테롤을 에스테르화시키는 능력에 대하여 서로 다른 유기체들로부터 수득된, 여러 미처리된 그리고 변형된 리파아제들을 시험하였다. 상기 변형된 리파아제들은 필수적으로 그 내용이 전체적으로 본 명세서에서 참고로 결합된 국제공개 WO 99/15689호에서 기술된 바에 따라 미처리된 효소를 소르비탄 모노스테아레이트 또는 다른 지방산 당 에스테르로 코팅하여 제조되었다.
변형된 리파아제들의 경우에서, 상기 에스테르화 반응은 미세-수성의 노말-헥산 또는 무용매 시스템에서 수행되었다. 그러나, 미처리된 리파아제들이 시험되는 경우에는, 소량의 물(전체 용매의 대략 1중량% 까지)이 첨가되었다. 상기 용매시스템에 대한 이러한 물의 첨가는 일반적으로 트리아실글리세롤 분자(즉, 지방들 및 오일들)의 가수분해를 개시시킨다. 서로 다른 유기체들로부터 수득된 리파아제들(미처리된 것과 변형된 상태의 것)의 에스테르화 활성에 대한 대조 데이터들을 표 3에 나타내었다. 이 표에서, 효소들의 에스테르화 활성들은 콜레스테롤의 그의 지방산(스테아레이트) 에스테르로의 전환율(중량/중량)로 나타내었다.
리파아제 콜레스테롤 전환율(%)(미처리된 리파아제) 콜레스테롤 전환율(%)(변형된 리파아제)
아스퍼질러스 니거 0 3
칸디다 안트아크티카 12 67
칸디다 실린드라세아 2 0
뮤코르 미에헤이 0 0
슈도모나스 세파시아 0 2
리조푸스 니베우스 0 2
리조푸스 아르히쥬스 0 0
호그 판크레아스 0 0
아스퍼질러스 오리자에 0 4
칸디다 리폴리티카 0 0
뮤코르 자바니쿠스 0 0
페니실리움 로쿠에포르티 0 0
슈도모나스 플루오레슨스 1 7
리조뮤코르 미에헤이 0 5
맥아 0 0
크로모박트 비스코슘 1 63
슈도모나스 종으로부터의 지방단백질 16 34
슈도모나스 종 B로부터의 지방단백질 23 71
릴리파아제 에이-10에프지 0 0
사이켄 100 0 0
노보자임 525 0 0
노보자임 868 7 32
노보자임 388 0 0
노보자임 398 0 0
노보자임 435(부동화된 것) 0 0
리포자임 아이엠-60(부동화된 것) 0 0
피피엘 0 3
표 3에서의 결과들은 리파아제 PS, 리파아제 AY, 크로모박트 비스코슘 리파아제 및 칸디다 안트아크티카 리파아제들과 마찬가지로 지방단백질 리파아제들 두가지 모두 역시 그들의 미처리된 형태에서 분명한 에스테르화 활성을 나타낸 반면에, 시험된 다른 미처리된 효소들은 매우 낮은 활성 또는 에스테르화 반응을 촉매하지 못하는 것으로 명백하게 나타나고 있다. 시험된 거의 모든 리파아제들이 변형 후에 증가된 활성을 나타내기는 하였으나, 가장 뚜렷한 증가는 크로모박트 비스코슘, 노보자임 868 및 지방단백질 리파아제들 두가지 모두들에서 나타났다.
〔실시예 2〕
유리 콜레스테롤과 유리 지방산들의 에스테르화 : 미처리-부동화된 효소들과 변형-부동화된 효소들의 비교
상기 실시예 1에서 결정된, 가장 활성이 강한 효소들 7가지들을 선택하여 이후의 연구에 사용하였다. 실리카 매트릭스에 부동화된 경우에서의 미처리된 효소에 의해 촉매화된 콜레스테롤 전환과 유사하게 부동화된 경우에서의 계면활성제-변형 효소에 의해 촉매화된 콜레스테를 전환 간의 비교가 이루어졌다.
계면활성제 변형 및 부동화 단계들을 실질적으로 국제공개 WO 99/15689호에 기술된 바에 따라 실시하였으며, 그 내용들을 본 명세서에 참고로 결합시켰다. 간략하게, 미가공의 효소(300㎎/ℓ단백질)을 4g의 불용성 무기 또는 유기 매트릭스(셀라이트, 실리카겔, 알루미나 또는 폴리프로필렌)를 포함하는 1ℓ의 트리스 완충용액(pH 5.5)에 용해시켰다. 이 용액을 10℃에서 30분간 자석교반기로 격렬하게 교반시켰다. 계면활성제-코팅된, 부동화된 효소 제재들의 경우에서는, 소르비탄 모노스테아레이트(20㎖ 에탄올에 1g이 용해된 용액)을 상기 교반된 효소 용액에 적가시켰다. 모든 효소 제재들(즉, 계면활성제-코팅된, 부동화된 리파아제들 및 부동화된 미가공의 리파아제들)은 10분간 초음파처리(sonicated)된 후, 계속해서 10℃에서 3시간 동안 교반시켰다. 형성된 침전물을 여과 또는 원심분리(12,000rpm, 4℃)들 중의 어느 하나에 의해 수집하고, 계속해서 -20℃에서 하룻밤 동안 냉동시키고, 동결건조시켰다.
에스테르화 반응 조건들은 10㎎의 부동화된 효소가 사용된 것(0.5중량%의 반응혼합물 중에서의 최종 단백질 함량으로 주어짐)을 제외하고는 상기 실시예 1에서 기술된 바대로이다.
이 비교 연구의 결과들을 하기 표 4에 나타내었다.
리파아제 콜레스테롤 전환율(%)
미처리-부동화된 효소 변형-부동화된 효소
엔자이모알크 1 16 41
엔자이모알크 2 26 77
엔자이모알크 3 14 24
엔자이모알크 4 9 35
엔자이모알크 5 11 67
엔자이모알크 6 15 69
엔자이모알크 7 11 48
상기 결과들은 선택된 리파아제들이 부동화 및 계면활성제 처리에 의해 변형되는 경우가 미처리의 또는 변형 공정 없이 부동화된 효소들에 비해 콜레스테롤 전환에 대해 보다 효율적인 촉매라는 것을 입증하고 있다.
〔실시예 3〕
콜레스테롤 및 트리글리세리드들 간에서의 가알코올분해 반응에 대한 변형-부동화된 리파아제들의 선택성의 증명
수성 매질 중에서, 리파아제들은 트리아실글리세롤들의 에스테르 결합을 가수분해시켜 부분 글리세리드들과 유리 지방산들을 형성한다. 비수성 매질 중에서 리파아제들은 또한 두 개의 서로 다른 트리글리세리드 분자들 사이에서(분자간 에스테르화) 또는 하나의 트리글리세리드 분자와 하나의 지방산의 사이에서(가산분해)의 둘 중의 어느 하나의 교차에스테르화 반응들을 촉매할 수 있다. 이 과정에서, 지방산들의 아실기들은 글리세롤 골격 상에서 두 개의 반응하는 기질들 사이에서 특이적으로 또는 비특이적으로 교환될 수 있다. 가알코올분해에 대한 선택성을 갖는 효소 제재들을 선택하기 위하여, 실시예 2에서 시험된 7종의 효소들의 활성을 두 가지 모델 반응들 즉,
1. 트리팔미틴 및 라우릴산 간의 가산분해 반응
2. 콜레스테롤 및 트리팔미틴 간의 가알코올분해 반응
들에서 시험하였다.
1. 가산분해 반응들은 다음과 같이 실시되었다:
트리팔미틴(4㎎) 및 라우릴산(4㎎)을 1㎖ 노말-헥산에 용해시켰다. 변형-부동화 리파아제(0.5중량% 단백질의 양을 포함하는 제재의 양)를 가하고, 상기 반응혼합물을 40℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 트리팔미틴 전환율(중량/중량)으로 표현된 이들 실험들의 결과들을 하기 표 5에 나타내었다.
변형-부동화된 리파아제 트리팔미틴 전환율(%)
엔자이모알크 1 165
엔자이모알크 2 42
엔자이모알크 3 57
엔자이모알크 4 5
엔자이모알크 5 23
엔자이모알크 6 21
엔자이모알크 7 8
비록 시험된 모든 리파아제들이 가산분해 활성을 갖기는 하나, 엔자이모알크4인 칸디다 안트아크티카 A(노보자임 868, 노보 노르디스크, 덴마크)로부터 파생된 리파아제 및 엔자이모알크 7인 칸디다 루고사(리파아제 AY, 아마노, 일본)로부터 파생된 피라아제들에서 가장 낮은 가산분해 활성이 관찰되었다.
시험된 다른 리파아제들은 보다 높은 수준의 가산분해 활성을 나타내어, 이들이 이 처리에 적용된 버터지방 샘플들 중에 존재하는 트리글리세리드들의 글리세롤 골격 상에서의 지방산들의 위치상 분포를 변화시키는 원인이 되고 있음을 나타내고 있다.
2. 가알코올분해 반응들은 다음과 같이 실시되었다:
콜레스테롤(5㎎) 및 트리팔미틴(5㎎)을 노말-헥산(1㎖)에 용해시켰다. 변형-부동화 리파아제(10㎎; 단백질 함량 0.5중량%)를 가하고, 상기 반응혼합물을 40℃에서 4시간 동안 교반시켰다. 이 실험의 결과들을 하기 표 6에 나타내었다.
서로 다른 리파아제 제재들의 존재 하에서의 가알코올분해 반응에서의 트리팔미틴 전환
변형-부동화된 리파아제 트리팔미틴 전환율(%)
엔자이모알크 1 69
엔자이모알크 2 68
엔자이모알크 3 42
엔자이모알크 4 61
엔자이모알크 5 32
엔자이모알크 6 19
엔자이모알크 7 47
가장 낮은 수준의 가산분해 활성을 갖는 엔자이모알크 4 및 엔자이모알크 7들의 리파아제들(표 5)이 분명한 수준의 가알코올분해 활성을 나타내고 있음을 표6에서 볼 수 있다.
에스테르화, 가알코올분해 및 가산분해 반응들에서의 7종의 선택된 리파아제들의 활성을 하기 표 7에 요약하였다.
에스테르화, 가산분해 및 가알코올분해 반응들에서의 리파아제 제재 활성의 요약
변형-부동화된 리파아제 에스테르화 활성1 가알코올분해 활성2 가산분해 활성3
엔자이모알크 1 41 69 65
엔자이모알크 2 77 68 42
엔자이모알크 3 24 42 57
엔자이모알크 4 35 61 5
엔자이모알크 5 67 32 23
엔자이모알크 6 69 19 21
엔자이모알크 7 48 47 8
1 : 콜레스테롤과 스테아린산 간의 에스테르화 반응에서의 콜레스테롤의 전환으로 주어짐
2 : 콜레스테롤과 트리팔미틴 간의 가알코올분해 반응에서의 트리팔미틴의 전환으로 주어짐
3 : 스테아린산과 트리팔미틴 간의 가산분해 반응에서의 트리팔미틴의 전환으로 주어짐
표 7의 요약으로부터, 엔자이모알크 4 및 엔자이모알크 7의 두 가지 효소들이 매우 낮은(또는 0) 가산분해 활성, 낮거나 완만한 에스테르화 활성 및 비교적 높은 가알코올분해 활성을 갖고 있음을 알 수 있다. 따라서, 이들 두 효소들은 스테롤들의 선택적 가알코올분해 및/또는 에스테르화에 특히 적절한 것으로 고려될 수 있으며, 그에 따라 이하의 실시예들에서 기술된 연구에 사용되기 위해 선택되었다.
〔실시예 4〕
무수 우유 지방 중의 콜레스테롤의 리파아제-촉매화 중성화
무수 우유 지방 중의 콜레스테롤의 리파아제-촉매화 가알코올분해 반응들을 다음과 같이 수행하였다.
10㎎의 리파아제(미처리의, 부동화된 또는 변형-부동화된 형태)를 1g의 무수 우유 지방에 가하였다. 이 반응 혼합물을 60℃에서 14시간 동안 흔들어주었다. 소정의 시간 간격마다, 상기 반응혼합물들로부터 샘플들을 취하여 노말-헥산으로 적절히 희석시키고, 가스크로마토그래피 시스템 내로 주입시켰다(상기 "전체 반응들"을 참조).
반응하는 동안에, 콜레스테롤 피크의 세기(intensity)는 감소되는 반면에 형성된 디글리세리드들로 중첩되기 때문에 폭이 확장되었다.
반응 공정을 계속하기 위하여, 무수 우유 지방에 유리 콜레스테롤(시그마 컴퍼니, 세인트 루이스, 미국 소재)을 20㎎ 콜레스테롤/1g 무수 우유 지방의 비율로 첨가시켜 풍부화 시켰다.
도 1은 미처리 무수 우유 지방에 대한 전형적인 가스크로마토그램을 나타내고 있다. "전체 반응들"에서 기술된 가스크로마토그래피의 조건들 하에서 종합 콜레스테롤의 지연시간(retention time)은 4.89분이다. 도 1에서의 주 피크(main peak)들은 무수 우유 지방 중에 존재하는 트리글리세리드들을 나타낸다.
이 연구에서 5종의 서로 다른 리파아제 제재들이 다음과 같이 사용되었다:
무수 우유 지방(400㎎) 및 유리 콜레스테롤(20㎎)을 포함하는 1㎖의 노말-헥산에 10㎎의 리파아제(미처리의, 부동화된 또는 변형-부동화된 형태)를 가하였다. 이 반응혼합물을 40℃에서 14시간 동안 흔들어주었다. 소정의 시간 간격마다, 상기 반응혼합물들로부터 샘플들을 취하여 노말-헥산으로 적절히 희석시키고, 가스크로마토그래피 시스템 내로 주입시켰다(상기 "전체 반응들"을 참조). 이 연구 결과들을 하기 표 8에 나타내었으며, 유리 콜레스테롤의 콜레스테롤 에스테르로의 전환율(중량%)로 나타내었다.
서로 다른 6종의 리파아제 제재들을 사용하는 콜레스테롤의 전환
리파아제 제재 콜레스테롤의 전환율(중량%)
검정(효소가 가해지지 않음) 0
엔자이모알크 4A 95
미처리된 엔자이모알크 4 0
미처리된 엔자이모알크 4(실리카 상에의 부동화) 60
엔자이모알크 7A 98
미처리된 엔자이모알크 7 70
상기 변형-부동화된 엔자이모알크 4를 이용하는 콜레스테롤의 그의 지방산 에스테르들로의 전환율이 대략 95%인 반면에 무수 우유 지방을 상기 변형-부동화된 엔자이모알크 7로 처리하였을 경우에 가알코올분해 반응에서 소모된 콜레스테롤은 98%이었음이 표 8에 나타나 있다. 엔자이모알크 4(칸디다 안트아크티카 A ; 상기 표 2를 참조)의 제조에 사용된 효소에 대응하는 미처리된 효소의 제재는 이 반응에서 비활성이었음에 비해, 실리카 상에 부동화시킨 경우의 동일한 미처리된 효소는 유리 콜레스테롤의 60%를 그의 지방산 에스테르들로 전환시킬 수 있었다. 도 2는 앞서 기술된 반응조건들 하(콜레스테롤로 풍부화시키지 않음)에서 엔자이모알크 7로 처리한 후의 무수 우유 지방에 대한 전형적인 가스크로마토그램이다. 후속의 반응에서, 4.74분의 지연시간에서 나타난 피크가 명백하게 감소되고 그리고 확대되었음이 이 도면에 나타나 있다. 반응경로는 실리카겔 상에서 수행된 박막크로마토그래피에 의해 추적되었다. 10㎕의 샘플을 500㎕의 헥산에 희석시켰다. 이 샘플 1㎕를 콜레스테롤 및 콜레스테롤 스테아레이트의 기준점을 갖는 플레이트 상에 적용시켰다. 상기 플레이트를 헥산 중의 25% 에테르의 용액으로 잘 포화된 유리실(glasschamber) 내에서 전개시켰다. 7㎝의 전개 후, 상기 전개된 플레이트를 유리실로부터 제거하고, 공기-건조시켰다. 점들의 동정은 파라-아니스알데히드의 산성 용액을 사용하여 수행하였다. 이 반응의 공정 동안에, 콜레스테롤 에스테르에 들어맞는 점들이 나타났으며(Rf(콜레스테롤 스테아레이트) = 0.9), 반응 동안에 생성된 디글리세리드들에 속하는 것으로 보여지는 소수의 새로운 점들이 콜레스테롤 영역에서 나타났다. 박막크로마토그래피를 잘 살펴보면, 콜레스테롤 표준물에 들어맞는 점이 없음을 알 수 있다. 더욱이, 콜레스테롤 표준물의 색상은 선홍색인 반면에 다른 점들은 모랫빛(sandier)으로 나타났다.
상기 반응 공정 동안에 트리글리세리드들의 함량이 변하지 않는다는 것을 증명하기 위하여, 상기 생성물을 컬럼크로마토그래피(column chromatography ; 실리카겔, 헥산-에테르)에 적용시켰다. 에스테르들의 혼합물은 순수한 헥산으로 용리시킨 반면에, 트리글리세리드들의 혼합물은 헥산 중의 2% 에테르의 혼합물로 용리시켰다. 보다 극성인 분획들은 순수한 에테르로 용리시켰다. 상기 트리글리세리드들의 분획으로부터 얻은 용매들을 합하고, 증발시킨 후, 동일한 효소(엔자이모알크 7)를 이용하여 후속의 효소적 반응에 적용시켰다. 하룻밤 동안의 반응 후, 10㎕의 샘플을 헥산으로 희석시키고, 가스크로마토그래피에 주입시켰다. 도 3은 2차 효소적 반응 전, 후의 트리글리세리드들의 스펙트럼들을 나타낸다. 여기에는 분명한 스펙트럼 상의 변화가 없었다는 것 즉, 상기 트리글리세리드들의 함량이 전혀 변하지 않았거나 또는 극히 적은 변화만이 있었으며, 상기 효소는 콜레스테롤-특이적이고,선택적이라는 것을 보여주고 있다.
〔실시예 5〕
무수 우유 지방에의 스티그마스테롤 에스테르의 풍부화
스티그마스테롤의 리파아제-촉매화 가알코올분해를 무수 우유 지방 중에서 다음과 같이 수행하였다:
50㎎ 스티그마스테롤을 포함하는 1.2g 무수 우유 지방에 100㎎ 리파아제(미처리의 또는 변형-부동화된 형태)들을 가하였다. 이 반응혼합물을 60℃에서 14시간 동안 흔들어주었다. 소정의 시간 간격마다, 상기 반응혼합물로부터 샘플을 취하여, 노말-헥산으로 적절히 희석시키고, 가스크로마토그래피에 주입시켰다(상기 "종합 방법들"을 참조). 내부 표준물로 기능하도록 콜레스테롤을 상기 샘플들 각각에 가하였다. 상기 콜레스테롤은 상기 효소가 상기 반응으로부터 여과되어 제거된 후, 상기 반응혼합물의 상기 샘플에 가해지거나 또는 내부에 효소가 없는 상기 반응혼합물로부터 취해진 샘플에 가해졌다.
전환율은 반응의 개시(t = 0, 효소를 가하기 전)에서의 스티그마스테롤/콜레스테롤의 비율과 14시간 후의 동일한 비율을 비교하는 것으로부터 계산되었다. 서로 다른 7종의 리파아제 제재들이 이 연구에 사용되었다. 이 연구의 결과들을 하기 표 9에 나타내었으며, 유리 스티그마스테롤의 스티그마스테롤 에스테르들의 전환율(중량%)로 나타내었다.
서로 다른 효소적 제재들을 이용하는 스티그마스테롤의 스티그마스테롤 올레이트로의 전환율(%)
효소 제재 스티그마스테롤의 전환율(중량%)
검정(효소가 가해지지 않음) 0
엔자이모알크 4B 65
엔자이모알크 4C 70
엔자이모알크 4D 71
미처리의 엔자이모알크 4 20
실리카 상에 부동화된, 미처리의 엔자이모알크 4 21
미처리된 엔자이모알크 7 60
엔자이모알크 7B 64
엔자이모알크 7G 84
상기 변형-부동화된 효소들 4 및 7(서로 다른 매트릭스를 적용)을 이용하는 스티그마스테롤의 그의 올레인산 에스테르로의 전환율이 미처리의 효소를 이용하는 경우의 전환율을 비교하는 엔자이모알크 4 보다 훨씬 더 높고, 엔자이모알크 7 보다 높은 것으로 표 9에 나타나 있다.
도 4는 스티그마스테롤(피크 5.14)과 효소를 가하기 전 내부 표준물로서의 콜레스테롤(피크 4.73)로 풍부화시킨 무수 우유 지방의 크로마토그램을 나타내고 있다. 콜레스테롤과 스티그마스테롤 두 가지 모두의 농도들이 거의 동일하다는 것을 알 수 있다.
도 5는 엔자이모알크 7c로 처리한 후의 무수 우유 지방 샘플의 크로마토그램을 나타내고 있다. 콜레스테롤 농도는 도 4에서와 동일하지만, 스티그마스테롤의 농도는 도 4에서 나타난 스티그마스테롤의 농도 보다 훨씬 낮게 나타나 있다.
〔실시예 6〕
유기 용매들 중의 스티그마스테롤의 리파아제-촉매화 가알코올분해
올리브 오일 중의 스티그마스테롤의 리파아제-촉매화 가알코올분해를 하기의 반응조건들을 이용하여 수행하였다:
1.5㎖ 중의 노말-헥산 중의 50㎎ 스티그마스테롤로 풍부화시킨 0.5㎖ 올리브 오일에 100㎎의 리파아제 제재들을 가하였다. 계속해서, 상기 반응혼합물을 60℃로 가열시키고, 60℃에서 흔들어주면서 22시간 동안 배양시켰다. 앞서 기술한 바와 같이, 소정의 시간 간격에서 샘플들을 취하고, 노말-헥산으로 희석(50㎕ 반응혼합물/300㎕ 노말-헥산)시킨 후, 가스크로마토그래피 시스템에 주입시켰다. 서로 다른 리파아제 제재들에 대한 스티그마스테롤의 그에 대응하는 올레이트 에스테르로의 전환율(%)을 하기 표 10 및 도 7에 요약하였다.
효소 제재들 4B, 4C, 4E, 4F들을 이용하는 헥산 중, 올리브 오일 중의 스티그마스테롤의 스티그마스테롤 올레이트로의 전환
시간(시) 엔자이모알크 4B 엔자이모알크 4C 엔자이모알크 4E 엔자이모알크 4F
0 0 0 0 0
0.5 9 9
1 18 10 13
1.5 28
2 16
3 31 39 21 31
5.5 49
6 55 46
7 32
9 59 60 57
10.5 51
22 77 84 60 74
〔실시예 7〕
무용매 시스템 중의 스티그마스테롤의 리파아제-촉매화 가알코올분해
무용매 시스템에서의 올리브 오일 중, 스티그마스테롤의 스티그마스테롤 에스테르로의 리파아제-촉매화 전환을 하기의 반응 조건들을 이용하여 수행하였다:
30㎎ 스티그마스테롤로 풍부화시킨 1㎖ 올리브 오일에 100㎎의 리파아제 제재들을 가하였다. 계속해서, 상기 반응혼합물을 60℃로 14시간 동안 가열시켰다. 이 기간 후에, 앞서 언급한 바와 같이 샘플들을 취하여 노말-헥산으로 희석(40㎎ 반응혼합물/600㎕ 노말-헥산)시키고, 가스크로마토그래피 시스템에 주입시켰다.
서로 다른 효소 제재들에 대한 올리브 오일 중의 스티그마스테롤의 전환에 대한 정량적 결과들을 하기 표 11 및 표 12에 나타내었다.
서로 다른 엔자이모알크 4의 제재들을 이용하는 스티그마스테롤 올레이트에로의 스티그마스테롤 전환
효소 제재 스티그마스테롤의 전환율(중량%)
미처리의 엔자이모알크 4 12
엔자이모알크 4E 85
엔자이모알크 4B 97
엔자이모알크 4F 82
엔자이모알크 4C 95
엔자이모알크 4D 90
엔자이모알크 4G 72
서로 다른 엔자이모알크 7의 제재들을 이용하는 스티그마스테롤 올레이트에로의 스티그마스테롤 전환
효소 제재 스티그마스테롤의 전환율(중량%)
미처리의 엔자이모알크 7 17
엔자이모알크 7D 42
엔자이모알크 7G 72
두 엔자이모알크 4 및 엔자이모알크 7 제재들 모두는 용매가 가해지지 않은 조건들 하에서 엔자이모알크 4의 경우에서 주어지는 95% 스티그마스테롤 전환율 이상의 매우 높은 활성이었다.
〔실시예 8〕
피토스테롤들의 혼합물로의 올리브 오일의 풍부화
90% 피토스테롤(이들 중에는 베타-시토스테롤(beta-sitosterol), 캄페스테롤(campesterol), 스티그마스테롤, 브라시카스테롤(brassicasterol) 및 시토스타놀(sitostanol)들이 있음)을 포함하는 10중량% 피토스테롤 혼합물 ADM 제품 코드 040095로 올리브 오일을 풍부화시켰다.
도 6은 하룻밤 동안의 반응 후의 반응 생성물들을 나타내고 있다. 상기 피토스테롤 에스테르들의 지연시간이 7.69 내지 7.10분의 범위 이내에 존재하는 반면에, 피토스테롤들의 지연시간은 3.73 내지 3.01분의 범위 이내에 존재한다. 에스테르-함량이 알코올성 반응물 보다 훨씬 높다는 것을 도 6에 통해 알 수 있다. 가알코올분해 반응 후에 올리브 오일 중의 디글리세리드 함량이 약간 증가되었다.
〔실시예 9〕
유리 버터지방 콜레스테롤 및 스티그마스테롤로 풍부화시킨 버터지방의 동시적 중성화
스티그마스테롤의 스티그마스테롤 에스테르로의 리파아제-촉매화 전환 및 무수 우유 지방 중의 콜레스테롤의 동시적으로의 중성화를 하기의 반응 조건들을 이용하여 수행하였다:
20㎎ 스티그마스테롤로 풍부화시킨 1㎖ 무수 우유 지방에 100㎎의 리파아제 제재들을 가하였다. 계속해서 상기 반응혼합물을 40℃로 14시간 동안 가열시켰다. 이 기간 후에, 앞서 언급한 바와 같이 샘플들을 취하여 노말-헥산으로 희석(40㎎ 반응혼합물/600㎕ 노말-헥산)시키고, 가스크로마토그래피 시스템에 주입시켰다.
도 8은 효소 첨가 전의, 스티그마스테롤(피크 4.84)로 풍부화시킨 무수 우유 지방의 크로마토그램을 나타내고 있다. 콜레스테롤 피크는 4.39분의 지연시간에서 나타난다.
도 9는 효소적 반응 후의 무수 우유 지방 샘플의 크로마토그램을 나타내고있다. 콜레스테롤 피크가 사라지고, 그리고 스티그마스테롤 피크의 세기가 감소되고 있음을 알 수 있다.
이 실시예는 동일한 샘플 내에 두 가지 모두가 존재하는 경우에서 상기 효소가 동시적으로 콜레스테롤을 중성화시키고 그리고 스티그마스테롤을 에스테르화시킬 수 있는 반면에, 샘플 지방 구조는 변하지 않거나 또는 단지 약간만 변화시키고 있음을 입증하고 있다.
본 발명의 특정의 구체적인 실시예들은 설명을 위하여 기술되어진 것이며, 본 발명은 당 분야의 숙련된 자들에게는 청구범위들의 정신들로부터 벗어나거나 또는 청구범위들의 관점을 초과하지 않으면서, 여러 변형들, 변경들 및 적용들이 가능함은 이해될 수 있는 것이다.
따라서, 본 발명은 음식물들, 특히 버터지방(butterfat) 중의 유리 콜레스테롤의 선택적 가알코올분해 및/또는 에스테르화를 위한 리파아제들의 이용에 관한 것이다. 본 발명은 또한 상기 지방-기초의 제품에 에스테르화된 피토스테롤 에스테르(phytosterol ester)를 풍부하게 하며, 동시에 지방-기초 제품의 유리 콜레스테롤 함량을 감소시키는 방법을 제공하는 효과가 있다.

Claims (34)

  1. 선택적으로 지방-기초 제품으로부터 유도된 것이 아닌 카르복실 지방산(들) 및/또는 이들의 에스테르 유도체(들)이 첨가된 지방-기초 제품을 선택적으로 계면활성제-코팅된, 부동화된 리파아제 복합체의 존재 중에서 상기 유리 스테롤의 가알코올분해 및/또는 에스테르화가 일어나기에 충분한 시간 동안 유리 스테롤과 접촉시키고, 후속해서 선택적으로 코팅되고, 부동화된 리파아제 복합체를 선택적으로 제거하는 것을 포함하며, 상기 복합체는 높은 수준의 스테롤-특이성 가알코올분해 및/또는 에스테르화 활성 및 최소의 가산분해 및 교차에스테르화 활성을 갖는 것을 특징으로 하는 유리 스테롤의 선택적 가알코올분해 방법.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 스테롤이 콜레스테롤임을 특징으로 하는 상기 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 스테롤이 피토스테롤임을 특징으로 하는 상기 방법.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 피토스테롤이 스티그마스테롤임을 특징으로 하는 상기 방법.
  5. 제 1 항에 있어서, 선택적으로 계면활성제-코팅된, 상기 부동화된 리파아제 복합체가 과립 형태임을 특징으로 하는 상기 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 지방-기초 제품이 음식 또는 영양 제품들임을 특징으로 하는 상기 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 지방-기초 제품이 화장품 또는 화장-관련 제품임을 특징으로 하는 상기 방법.
  8. 제 1 항에 있어서, 상기 콜레스테롤 에스테르가 상기 리파아제 복합체로부터 선택적으로 제거되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  9. 제 2 항에 있어서, 상기 스테롤이 버터지방의 성분임을 특징으로 하는 상기 방법.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응이 미세-수성 환경 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  11. 제 10 항에 있어서, 상기 미세-수성 환경이 유기 용매에 의해 제공되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  12. 제 11 항에 있어서, 상기 유기 용매가 노말-헥산인 것을 특징으로 하는 상기방법.
  13. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 반응이 무-유기용매 시스템 내에서 수행되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  14. 제 1 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리파아제가 칸디다 안트아크티카, 칸디다 안트아크티카 A 및 칸디다 루고사들로 이루어지는 그룹 중에서 선택된 것임을 특징으로 하는 상기 방법.
  15. 제 1 항, 제 2 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 실질적으로 무-콜레스테롤 지방-기초 제품을 제조하기 위하여 상기 부동화된 리파아제에 의해 상기 제품의 전구체 내에 포함된 콜레스테롤을 에스테르화 시키고, 선택적으로 그 결과의 에스테르화된 콜레스테롤을 상기 리파아제 복합체로부터 제거하는 것을 포함함을 특징으로 하는 상기 방법.
  16. 제 15 항에 있어서, 상기 실질적으로 무-콜레스테롤 제품이 버터지방-함유 제품임을 특징으로 하는 상기 방법.
  17. 제 15 항 및 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리파아제가 불용성의 매트릭스 상에 부동화된 것임을 특징으로 하는 상기 방법.
  18. 제 15 항 및 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리파아제가 계면활성제-코팅된 것임을 특징으로 하는 상기 방법.
  19. 제 15 항 및 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리파아제가 불용성의 매트릭스 상에 부동화되고, 그리고 계면활성제-코팅된 것임을 특징으로 하는 상기 방법.
  20. 제 15 항에 있어서, 상기 실질적으로 무-콜레스테롤 제품이 음식 제재임을 특징으로 하는 상기 방법.
  21. 제 1 항, 제 2 항 및 제 8 항 중 어느 한 항에 따라 생산된, 변형된 버터지방 조성물.
  22. 제 15 항, 제 16 항 및 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 변형된 버터지방 조성물을 포함하는 저-콜레스테롤 음식 제재.
  23. 제 21 항에 있어서, 상기 음식 제재가 저-콜레스테롤 버터, 코코아 버터, 무수 우유 지방, 아이스크림, 커피 미백제 및 커피 크림, 치즈, 다른 식이성 제품들, 다른 콜레스테롤-함유 음식물들 및 인지질 함유 음식물들로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 상기 저-콜레스테롤 음식 제재.
  24. 제 1 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 리파아제가 아스퍼질러스 니거, 칸디다 안트아크티카, 칸디다 실린드라세아, 뮤코르 미에헤이, 슈도모나스 세파시아, 리조푸스 니베우스, 리조푸스 아르히쥬스, 호그 판크레아스, 아스퍼질러스 오리자에, 칸디다 리폴리티카, 뮤코르 자바니쿠스, 페니실리움 로쿠에포르티, 슈도모나스 플루오레슨스, 리조뮤코르 미에헤이, 맥아, 크로모박트 비스코슘, 슈도모나스 종으로부터의 지방단백질, 슈도모나스 종 B로부터의 지방단백질, 릴리파아제 에이-10에프지, 사이켄 100, 리파아제 지, 리파아제 엠, 리파아제 에프-에이피-15, 뉴라아제 에프, 판크레아틴 에프, 뉴라아제 에이피6, 리파아제 에이와이, 리파아제 피에스, 노보자임 525, 노보자임 868, 노보자임 388, 노보자임 398, 노보자임 435(부동화된 것), 리포자임 아이엠-60(부동화된 것) 및 피피엘들로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것임을 특징으로 하는 상기 방법.
  25. (1) 지방-기초 제품에 적어도 하나의 피토스테롤을 가하는 단계;
    (2) (a) 적어도 하나의 카르복실 지방산 또는 그의 에스테르 유도체의 혼합물을 상기 혼합물에 선택적으로 가하는 단계;
    (3) (a) 또는 (b) 높은 수준의 스테롤-특이성 가알코올분해 및/또는 에스테르화 활성 및 최소의 가산분해 및 교차에스테르화 활성들을 갖는, 부동화된 리파아제 복합체를 상기 혼합물에 가하는 단계, 상기 복합체는 선택적으로 계면활성제-코팅된 것임;
    (4) 상기 유리 스테롤의 최대 가알코올분해 및/또는 에스테르화가 일어나기에 충분한 시간 동안 상기 반응혼합물을 배양하는 단계;
    (5) 상기 반응의 완료 후, 상기 부동화된 리파아제 복합체를 선택적으로 제거하는 단계; 및
    (6) 상기 (4)의 단계에서 수득된, 에스테르화된 콜레스테롤을 선택적으로 제거하는 단계;
    들을 포함하여 이루어지는 것을 특징으로 하는 지방-기초 제품의 동위치적 풍부화를 위한 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 상기 지방-기초 제품이 음식 또는 식이성 제품임을 특징으로 하는 상기 방법.
  27. 제 25 항에 있어서, 상기 지방-기초 제품이 화장품 또는 화장-관련 제품임을 특징으로 하는 상기 방법.
  28. 제 25 항에 있어서, 상기 피토스테롤의 에스테르화가 상기 지방-기초 제품 중에 존재하는 어떠한 임의의 유리 콜레스테롤의 에스테르화에 의해 동시적으로 수반되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  29. 제 25 항에 있어서, 상기 피토스테롤의 에스테르화가 상기 지방-기초 제품 중에 존재하는 콜레스테롤의 에스테르화 전 또는 후에 수행되는 것을 특징으로 하는 상기 방법.
  30. 제 25 항 내지 제 27 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 피토스테롤이 스티그마스테롤임을 특징으로 하는 상기 방법.
  31. 제 25 항에 따른 방법에 의해 제조된, 에스테르화된 피토스테롤 에스테르(들)로 풍부화시킨 것을 특징으로 하는 지방-기초 제품.
  32. 제 25 항에 따른 방법에 의해 제조된, 에스테르화된 피토스테롤 에스테르(들)로 풍부화시킨 및/또는 콜레스테롤 수준을 낮춘 것을 특징으로 하는 지방-기초 제품.
  33. 제 32 항에 있어서, 상기 음식 제재가 저-콜레스테롤 버터, 코코아 버터, 무수 우유 지방, 아이스크림, 커피 미백제 및 커피 크림, 치즈, 다른 식이성 제품들, 다른 콜레스테롤-함유 음식물들 및 인지질 함유 음식물들로 이루어지는 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 상기 지방-기초 제품.
  34. 제 27 항에 따른 방법에 의해 수득된, 에스테르화된 피토스테롤 에스테르(들)로 풍부화시킨 화장품 및/또는 화장-관련 제품들.
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