KR20030016228A

KR20030016228A - 신경펩티드 ｙ 농도의 감소에 의해 유도되는 체중 감량

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Publication number: KR20030016228A
Application number: KR1020027010680A
Authority: KR
Inventors: 로프터스토마스엠; 타운젠드크레이그에이; 로넷가브리엘; 레인엠다니엘; 쿠하즈다프란시스피
Original assignee: 존스 홉킨스 유니버시티 스쿨 오브 메디슨
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2003-02-26
Also published as: EP1259121A2; AU2001238515A1; CA2400136A1; WO2001060174A3; WO2001060174A2; JP2003528051A

Abstract

본 발명은 신경펩티드 Y(NPY)의 발현 및/또는 분비를 감소시키는 화합물을 동물에게 투여함으로써 동물의 체중 감소를 유도하는 방법을 제공한다. 상기 투여는 직접적으로, 간접적으로, 또는 체액을 통해 실시될 수 있다. 바람직하게는, 이 화합물의 투여는 동물에서 말로닐 CoA 농도를 증가시키는 효과를 갖는다. 본 발명에 따라 투여된 화합물은 치환된 α-메틸렌-β-카르복실-γ-부티로락톤을 비롯한 지방산 신타제(FAS)의 억제제, 또는 말로닐 조효소 A 데카르복실라제(MCD)의 억제제일 수 있다. 이 화합물은 NPY의 발현 및/또는 분비의 양 및/또는 기간을 마른 동물에서 관찰되는 수준으로, 또는 그 이하로 감소시키기에 충분한 양으로 투여되는 것이 바람직하다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 투여는 섭식 동물 또는 포식 동물에서 관찰되는 수준으로 발현 및/또는 분비를 감소시키며, 보다 바람직하게는, 투여는 NPY의 농도를 섭식 동물의 농도 이하로 감소시킨다. 특정 구체예에서, 본 발명은 동물의 섭식 행동을 억제하는 화합물을 투여함으로써 동물의 체중 감소를 유도하는 방법을 제공한다. 이 방법은 호르몬 렙틴의 발현이 결핍된 동물이나, 또는 렙틴의 작용에 대해 내성이 있는 동물에게서 체중 감소를 유도하는 데 특히 유용하다.

Description

신경펩티드 Ｙ 농도의 감소에 의해 유도되는 체중 감량{WEIGHT LOSS INDUCED BY REDUCTION IN NEUROPEPTIDE Y LEVEL}

신체의 지방 질량은, 지방 질량과 섭식 상태를 모니터링하고 식이와 에너지 이용률을 조절하는 복잡한 피드백 경로군에 의해 제어된다. Kennedy가 처음 발표한 리포스탯(lipostat) 모델(Kennedy, G., 1953 "The role of depot fat in the hypothalamic control of food intake in the rat", Proc. Royal Soc. Lodon(Biol), 140:579-592)에 따르면, 지방 조직, 장 및 간, 그리고 췌장으로부터의 말초 신호가 시상하부의 뉴런에 작용하여 에너지 항상성을 조절한다. 관련된 수많은 조절 경로가 최근에 확인되었다.

섭식과 비만의 말초 신호 중 가장 잘 알려진 것으로는 렙틴, 인슐린 및 장포만 펩티드가 있다. 주로 지방세포에 의해 생산되는 사이토카인 관련 호르몬인 렙틴은 지방 질량에 비례하여 분비된다. 따라서, 렙틴은 말초적으로, 그리고 시상하부의 섭식 제어 중심에서 지방 질량의 신호로서 작용하여 섭식을 억제하고 체중 감량을 촉진시킨다(Hwang, C. 등, 1997, "Adipocyte differentiation and leptin expression", Annual Review of Cell & Developmental Biology, 13:231-259). 렙틴 농도는 또한 섭식에 의해 증가되어, 섭식 상태와 비만도를 반영한다.ob/ob마우스(Coleman, D.L., 1978, "Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice, "Diabetologia, 14:141-148)에서 관찰되는 바와 같이, 렙틴의 부족 및 특정 개인에게서 관찰되는 렙틴의 부족(Montague, C. 등, 1997, "Cogenital leptin deficiency is associated with severe early-onset obesity", Nature, 387(6636):903-908)은 심각한 조기-개시성 비만을 초래한다. 췌장 베타 세포에 의해 생산되는 인슐린 역시 비만도에 비례하고 섭식에 반응하여 생산된다. 인슐린은 말초에서 에너지 저장을 촉진하도록 작용하면서, 시상하부에서는 렙틴과 유사한 방식으로 작용하여 섭식을 억제하고 증가된 에너지 이용을 촉진한다(Chavez, M. 등, 1996, "Central insulin and macronutrient intake in the rat", Am. J. Physiol., 271:R727-731). 장 펩티드(예, 봄베신 및 콜레시스토키닌)는 섭식에 반응하여 분비되고, 식사량의 신호로서 작용한다(Laburthe, M. 등, 1994, "Receptors for gut regulatory peptides", Baill Clin. Endocrinol. Metab. 8:77-110). 체액 경로에 의해 작용하는 인슐린과 렙틴과는 달리 이들 신호는 주로 부교감 말초 신경계(즉, 미주 신경)의 구심성 감각 뉴런에 의해 뇌에 전달된다. 섭식 상태의 다른 복부 신호도 유사하게 전달된다.

뇌에서의 섭식과 에너지 이용의 조절은 주로 시상하부에서의 섭식 신호의 통합을 통해 제어된다. 조절성 신경전달물질/신경펩티드의 2가지 상이한 그룹이 개인의 에너지 상태에 따라 조화하여 대향조절된다. 에너지 부족 상태에서는 이러한 현상에 의해 낮은 렙틴 농도로서 신호화되고, 동화작용 신호가 활성화되어 섭식을 자극하고 에너지 이용을 감소시키는 반면, 섭식을 억제하고 에너지 이용을 증가시키는 이화작용 신호는 하향조절된다. 반대로, 에너지 과잉 상태에서는 동화작용 신호가 하향조절되는 반면, 이화작용 신호는 상향조절된다(Loftus, T., 1999, "An Adipocyte-central nervous system regulatory loop in the control of adipose homeostasis", Sem. Cell. Dev. Biol., 10(1):11-18).

가장 잘 알려진 동화작용 신호는 신경펩티드 Y(NPY)다. 이 신경펩티드는 절식에 반응하여 시상하부에서 생성되어(Schwartz, M. 등, 1998, "Effect of fasting and leptin deficiency on hypothalamic neuropeptide Y gene transcription in vivo revealed by expression of a lacZ reporter gene", Endocrinology, 139(5):2629-2635), 섭식을 강력하게 자극한다(O'Shea, D. 등, 1997, "Neuropeptide Y induced feeding in the rat is mediated by a novel receptor", Endocrinology, 138(1):196-202). 섭식 억제성 이화작용 신호 중 몇가지는 그 작용 메카니즘 중에서 NPY 시그널링의 억제를 포함한다. 기타 동화작용 신호는 α-MSH 수용체(하기 참조)를 길항작용하는 아구티 관련 펩티드(AGRP)(Shutter, G.M. 등, 1997, "Hypothalamic expression of ART, a novel gene related to agouti, is up-regulated in obese and diabetic mutant mice, Genes and Development, 11:593-602), 멜라닌 농축 호르몬(MCH)(Ludwig, D. 등, 1998, "Melanin-concentrating hormone: a functional melanocortin antagonist in the hypothalamus", Am. J. Physiol, 274:(E627-633) ,그리고 하이포크레틴 1 및 2로도 알려진 오렉신 A 및 B(Sakurai, T. 등, 1998, "Orexins and orexin receptors: a family of hypothalamic neuropeptides and G-protein-coupled receptors that regulate feeding behavior", Cell, 92(4):573-585)를 포함한다.

이화작용 신호 중에서, 가장 중심은 α-멜라노사이트 자극 호르몬(α-MSH)이다. 이 펩티드는 에너지 과잉에 반응하여 증가되고, 섭식을 억제하고 이화작용을 촉진한다. α-MSH MC4 수용체에 결실을 보유하는 마우스는 비만을 발달시킨다(Huszar, D. 등, 1997, "Targeted disruption of the melanocortin-4 receptor results in obesity, Cell, 88(1):131-141). 유사하게, 아구티 또는 AGRP와 같은 수용체의 길항물질을 과다발현하는 마우스는 후발성 비만을 발달시킨다(Graham M., S.J. 등, 1997, "Overexpression of Agrt leads to obesity in transgenic mice", Nat. Genetics, 17:273-274). 또 다른 2가지 시상하부 신호인, 코케인 및 암페타민 조절 전사체(CART)(Lambert, P., 1998, "CART peptides in the central control of feeding and interactions with neuropeptide Y", Synapse, 29(4):293-298) 및 코르티코트로핀 분비 호르몬(CRH)(Raber 등, 1997)은 고농도의 렙틴과 같은 섭식 신호에 반응하고 섭식을 억제한다. 뇌에서 섭식 신호를 억제하는 것으로 알려진 다른 신호로는 뉴로텐신(Sahu, A., 1998, "Evidencesuggesting that galanin(GAL), melanin-concentrating hormone(MCH), neurotensin(NT), proopiomelanocortin(POMC) and neuropeptide Y(NPY) are targets of leptin signaling in the hypothalamus", Endocrinology, 139(2):795-798), 글루카곤 유사 펩티드(Turton, M. 등, 1996, "A role for glucagon-like peptide-1 in the central regulation of feeding", Nature, 379(6560): 69-72) 및 세로토닌(Currie, P. 등, 1997, "Stimulation of 5-HT(2A/2C) receptors within specific hypothalamic", Neuroreport, 8(17):3759-3762)을 들 수 있다. 세로토닌은 거식증에서 관찰되는 식욕 억제와 연관되어 있으며, 최근에 중지된 체중 감량 요법인 펜 펜(phen fen)의 표적이다.

C-75는 본원에서 참고로 인용하는 미국 특허 제5,981,575호에 개시된 지방산 신타제(FAS)의 특이적 억제제이다. FAS는 사람과 기타 포유동물에서의 지방산 합성의 주요 생합성 효소 중 하나이다(Wakil, 1989, "Fatty acid synthase, a proficient multifunctional enzyme", Biochemistry, 28:4523-4530). BALB/c 마우스에게 C-75를 투여하면 24시간 내에 총 체중의 10 ∼ 20%를 감소시키며, 이는 투여량에 따른 총 기간에 걸쳐 수일동안 지속된다. 이 기간 후에는 동물에게 뚜렷한 장기간 효과를 나타내지 않으면서 체중은 다시 정상으로 회복된다.

과체중은 선진국에서 주요한 건강 문제로서, 미국 인구의 50% 이상에게 영향을 미치고 있으며(Must 등, 1999, J. Amer. Med. Assoc., 282: 1523), 이환수와 심각도 모두가 증가하고 있다. 이러한 상태는 특히 II형 당뇨병, 심혈관 질환 및 뇌혈관 질환의 위험 증가는 물론, 현저히 증가된 사망률과도 관련이 있다(Must 등,1999). 이러한 건강 문제의 중요성과 몇종의 체중 감량 요법제가 갖는 최근의 어려움들은 신규 체중 감량 요법제의 필요성을 강조한다.

발명의 개요

본 발명의 일 목적은 섭식 행동을 억제하여 체중 감량을 촉진하는 것이다. 이 목적과 다른 목적들은 후술하는 1 이상의 구체예에 의해 충족된다.

일 구체예에서, 본 발명은 동물의 체중 감량을 유도하는 방법을 제공하는데, 이 방법은 신경펩티드 Y(NPY)의 발현 및/또는 분비를 직접적으로 또는 체액에 의해 감소시키는 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함한다. 이 화합물의 투여는 바람직하게 동물에서 말로닐 CoA 농도를 증가시키는 효과를 갖는다. 본 발명에 따라 투여된 화합물은 치환된 α-메틸렌-β-카르복실-γ-부티로락톤을 비롯한 지방산 신타제(FAS)의 억제제, 또는 말로닐 조효소 A 디카르복실라제(MCD)의 억제제일 수 있다. 이 화합물은 NPY의 발현 및/또는 분비의 양 및/또는 기간을 마른 동물에게서 관찰되는 수준으로, 또는 그 이하로 낮추기에 충분한 양으로 투여하는 것이 바람직하다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 투여는 섭식 또는 포식한 동물에게서 관찰되는 수준으로 발현 및/또는 분비를 감소시키며, 보다 바람직하게는 투여는 섭식한 동물의 농도 이하로 NPY 농도를 감소시킨다.

특정 구체예에서, 본 발명은 동물의 섭식 행동을 억제하는 화합물을 투여함으로써 동물의 체중 감량을 유도하는 방법을 제공한다. 이 방법은 호르몬 렙틴의 발현이 부족한 동물이나, 렙틴의 작용에 내성이 있는 동물의 체중 감량을 유도하는 데 특히 유용하다.

또 다른 구체예에서, 본 발명은 발현이 체중 감량의 제어와 관련이 있는 유전자를 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 이 방법은 체중 감량제로 처리한 동물의 조직에서 발현된 mRNA 종과, 대조군 동물의 상응하는 조직에서 발현된 mRNA 종을 비교하는 것을 포함한다. 바람직하게는, 처리 동물은 FAS 억제제로 처리되며, 보다 바람직하게는 FAS 억제제는 치환된 α-메틸렌-β-카르복실-γ-부티로락톤, 예컨대 C-75이다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 발현된 mRNA는 시상하부 조직에서 발현된 mRNA이다. 처리 동물과 대조군 동물간의 mRNA 발현을 비교함으로써, 그 발현이 체중 감량제에 의해 상향조절 또는 하향조절되는 유전자와 관련된 mRNA 종을 동정할 수 있다.

동화작용 및 이화작용 신호의 조합은 신체의 섭식 상태의 지각을 제어한다. 이러한 신호의 제어를 변화시킴으로써, 개인의 식이요법 상태와 관계없이 섭식 또는 절식 상태의 지각을 유발하는 것이 가능하다. 동화작용 신호를 억제하고, 이화작용 신호를 활성화시킴으로써 섭식을 억제함은 물론, 일반적으로 체중 감량에 수반되는 대사율 감소와는 대조적으로 정상 대사율을 유지함으로써 체중 감량을 유도하는 것이 가능하다.

α-메틸렌-β-카르복시-γ-부티로락톤, C-75와 같은 FAS 억제제는 주로 섭식을 억제함으로써 체중 감량을 유도한다는 것이 발견되었다(실시예 1 참조). 충분한 양의 C-75는 모든 섭식 행동을 완전히 차단하게 된다. 또한, 관찰된 체중 감소는 약물 처리 동물의 강제 섭식에 의해 대부분 회복될 수 있다. C-75는 시상하부에서 프로파직(prophagic) 신호 신경펩티드 Y의 발현을 억제하였고, 말로닐-CoA에 의해매개되는 것으로 보이는 렙틴-비의존적 방식으로 작용하였다.

C-75는 대사율에 영향을 줄 수도 있다. C-75 처리는 총 식사량 제한 단독보다 더 많은 체중을 감량시킨다(실시예 2 참조). 포유동물의 절식에 대한 정상적인 반응은 에너지를 보존하기 위해 대사율을 감소시키는 것이다. 섭식 상태의 신호를 신체에 전달하는 작용제는 섭식을 억제함은 물론, 증가된 대사율을 유지하여, 섭식만을 제한한 경우보다 훨씬 많은 체중을 감소시키게 된다. 또한, 이러한 대사율의 증가는 섭식 제한만으로 감량한 체중이 불완전하게 역행될 수 있음을 설명해줄 수 있다.

본 발명을 산출시킨 연구는 부분적으로는 국립보건원으로부터 보조금 번호 DK0923, DK14575, 및 DC02979에 의해, 국방부로부터의 보조금에 의해 지원을 받았다. 미국 정부는 본 발명의 특정 권리를 소유한다.

본 발명은 동물의 체중 감량을 유도하는 방법에 관한 것이다. 부분적으로, 본 발명은 동물의 신경펩티드 Y 농도를 조절함으로써 지방세포 질량을 줄이는 방법에 관한 것이다.

도 1.1은 세룰레닌 및 C-75에 대한 구조(패널 A)와, 대조군 및 C-75 처리 마우스에서의 지방산 합성(패널 B) 및 간 말로닐-CoA 농도(패널 C)를 나타낸 것이다.

도 1.2는 C-75 또는 RPMI 부형제를 처리한 마우스에 대해 체중(패널 A) 및 먹이 섭취량(패널 B)을 나타낸 것이다.

도 2는 C-75를 처리한 마우스와 처리하지 않은 마우스를 절식 마우스와 비교한 것을 도시한다. 패널(A)는 체중, 패널(B)는 신경펩티드 Y mRNA를 보여준다. 도 2C는 NPY의 대뇌실내 투여에 의한 C-75의 섭식 억제 효과의 역행을 보여주는 것이며, 이는 동물들이 그렇게 하는 것을 저지받지 않는다면 NPY에 대해 반응할 수 있음을 입증하는 것이다. 패널 D는 C-75가 섭식 간격에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 3은ob/ob(렙틴 부족) 마우스에서 C-75 효과의 렙틴 비의존성을 나타낸것이다. 패널 (A)는 렙틴 농도, (B)는 체중 변화, (C)는 대표 개체, (D)는 대조군 간과 처리군 간의 현미경사진을 보여준다.

도 4는 (A)ob/ob마우스와 (B) 야생형 마우스에서 C-75이 혈청 포도당에 미치는 영향을 나타낸 것이다.

도 5에서 패널 (A)는 말로닐-CoA를 매개로 한 FAS의 억제제에 의한 섭식 조절의 모델을 도시한 것이다. 패널 B는 ACC 및 FAS의 억제제의 상호작용을 나타낸 것이다. 패널 (C)는 C-75의 대뇌실내 주사의 효과를 나타낸 것이다.

섭식을 제어하는 데 있어서의 대사의 역할은 잘 규명되어 있다. 포도당(Grossman 등, 1997, Physiol. Behav., 61:169) 또는 지방산(Scharrer, 1999, Nutrition, 15:704)과 같은 생리적 연료의 주입은 오래전부터 섭식을 억제하는 것으로 알려져 있다. 또한, 이러한 기질들의 항대사물질 역시, 2-데옥시글루코스(비대사성 포도당 유사체, Grossman, 등, 1997)의 ICV 투여 후에 관찰되는 것과 같이 섭식의 자극을 유도한다. 간에서의 지방산 산화의 억제제는 섭식을 증가시키기 때문에, 지질 대사의 변화에 의한 섭식의 제어에 대한 선행 연구도 있다(Scharrer, 1999). 그러나, FAS의 억제는 생리적 연료를 추가하지 않아도 섭식 억제성 신호를 유도한다는 점에서 다른 대사성 섭식 제어 메카니즘과는 다르다.

섭식 억제와 지방산 합성 사이의 연계는, 지방산 합성이 에너지 과잉 상태에만 일어나고, 이때 과량의 생리적 연료는 에너지 저장소로 공급된다는 사실과 일치한다. 지방산 합성이 지방산 산화를 조절한다는 잘 규명된 조절 메카니즘이 개시되었다(참조 문헌: Rasmussen 등, 1999, Ann, Rev. Nutri,, 19:463). 이 패러다임에서, FAS의 기질인 말로닐-CoA는 지방산 합성시에 증가하여, 지방산이 카르니틴 팔미토일 트랜스퍼라제 매개로 미토콘드리아로 흡수되는 것을 막는다. 이러한 조절 메카니즘은 지방산 합성과 지방산의 산화가 동시에 일어나는 것을 막는다. 지방산 합성과 관련하여 증가된 말로닐-CoA(미국 특허 출원 제60/164,765호, "Modulation of Celluar Malonyl-CoA Levels as a Means to Selectively Kill Cancer Cells", 본원에서 참고로 인용함)는 유사하게 섭식 제어와 관련된 것일 수 있다.

지방산 합성의 억제는 그 자체가 섭식 억제를 유도하는 것으로 보이지는 않는다. 아세틸 CoA 카르복실라제(ACC)의 억제제인 TOFA(Halvorson 등, 1984, Lipid, 19:851)의 투여에 관한 이전 연구에 따르면, 지방산 합성 경로에서 FAS보다 선행하는 효소가 지방산 합성의 억제를 유도하였지만 섭식을 억제하지는 않았다(Malewiak 등, 1985, Metabolism, 34:604). TOFA 투여는 말로닐-CoA 생산을 차단하는 것으로 예상되며, 따라서 섭식을 억제하지는 못하는 것으로 예상된다. 이와는 달리, C-75에 의한 FAS의 억제는 활성 지방산 합성을 모방할 수 있는 말로닐-CoA 농도의 급격한 증가와, 따라서 섭식 상태를 유도하였다(미국 특허 출원 제60/164,765호 참조).

지방산 합성은 지방산 합성 중에 말로닐-CoA 농도를 증가시켜서, 카르니틴 팔미토일 트랜스퍼라제-1-매개에 의한 지방산의 미토콘드리아로의 흡수를 억제함으로써 지방산 산화를 조절한다. 이는 신호전달 역할을 할 수 있는 분자들인, 세포질 장쇄 지방 아실-CoA 및 디아실글리세롤의 증가를 유도하여, 말로닐-CoA 농도가 생리적 연료의 유용성의 신호로서 작용한다는 가설을 도출하게 된다.

FAS 억제가 NPY 신호전달의 억제를 유도한다는 메카니즘은 지방산 산화에 의한 섭식 제어의 메카니즘과 연관이 있는 것 같지는 않은데, 이는 지방산 산화에 의한 섭식 제어가 시상하부 제어와 무관한 과정인 부교감신경의 감각 뉴런에 의해 매개되기 때문이다(Scharrer, 1999). 이러한 감각 뉴런 역시 장 포만 펩티드와 렙틴에 의한 신호전달에 있어서 일정 역할을 한다는 것이 보고된 바 있다(Niijima 1998, J. Auton. Nerv. Syst., 73:19). 장 펩티드 역시, 이들이 일반적으로 식사량 감소를 유도하지만, 음식 섭취 또는 체중의 전체적인 감소는 유도하지 않기 때문에 이러한 효과의 매개체인 것 같지 않다(West 등, 1984, Am. J. Physiol., 246:R776). 그러나, 구심성 말초 뉴런에 의한 섭식에 미치는 FAS 효과의 매개는 그러한 섭식 신호의 메카니즘일 가능성을 남겨 두는데, 이는 이들 뉴런이 지방산 합성의 주요 장소, 특히 간과 지방 조직으로 신경을 발달시키기 때문이다.

뇌 내부의 선택적인 뉴런 집단, 예컨대 궁형 핵, 소뇌, 뇌간, 해마 및 피질에서 FAS, ACC 및 MCD가 상당히 많이 발현된다는 것이 관찰되었다. 뉴런은 상당 수준의 지방산 합성을 수행하는 것으로 생각되지 않기 때문에 이들 효소의 역할이 무엇인지는 불분명하다. 그러나, 이들 뉴런은 C-75 또는 세룰레닌의 존재하에 말로닐-CoA의 증가를 겪게 되는 기관을 보유한다. [5-³H]-C-75를 이용한 실험은 약물이 뇌로 진입한다는 것으로 보여준다. 따라서, 이들 억제제는 궁형 핵 그 자체의 뉴런 또는 그들에 작용하는 뉴런에서, 섭식 중심을 제어하기 위해 뇌에 직접적으로 작용할 수 있다. 트립토판 히드록실라제 억제제인 파라-클로로-페닐알라닌으로 사전처리함으로써 세로토닌을 고갈시킨 동물에서의 C-75의 효능(Yang 등, 1995, Am. J. Physio., 268:E389)은 신경전달물질이 이러한 효과의 매개체라는 것과 상반된다.

또는, FAS 표적 조직으로부터 시상하부로의 신호는 체액 신호에 의해 매개될 수 있다. 이러한 FAS-관련 신호는 공지된 섭식 억제 호르몬인 렙틴 및 인슐린과, 전구염증성 사이토카인인 종양 괴사 인자-α 및 인터루킨-1β의 전신 분비와 무관한 것으로 보인다. 합성 글루코코르티코이드인 덱사메타손의 투여에 의해서도 이는 역행되지 않는다. 처리된 마우스의 모든 주요 기관의 검시 및 조직학적 분석 결과, 불리한 병변이 없었으며 혈장 알라닌 아미노트랜스퍼라제 활성이 변화되지 않았음이 확인되었다. 또한, C-75에 의해 유도된 체중 감소는 IL-1r 및 TNFαr1a가 부족한 마우스에서 관찰되었는데, 이는 체중 감소가 염증성 반응에 의해 매개된 것이 아님을 암시한다.

NPY 외에도, 여러 다른 조절 분자가 시상하부에서 결합하여 섭식을 제어한다(Loftus, 1999). 이들 신호의 발현은, 섭식 상태와 비만도에 따라서 NPY와 공조하여(예, 아구티 관련 펩티드) 또는 NPY에 대항하여 조화롭게 조절된다. C-75에 의한 NPY의 제어는 이들 동시조절된 분자들로 확장될 수도 있다.

말로닐-CoA에 대해 제안되는 한가지 역할은 이들이 베타 세포에서 영양분 자극 인슐린 분비의 매개역할을 한다는 것이다. 시상하부에서 섭식을 조절하는 포도당 감지 뉴런은, 글루코키나제의 발현 및 ATP-감수성 칼륨 채널(20)을 비롯하여 베타 세포와 많은 특징들을 공유한다. 본 명세서에 기록된 데이타는 말로닐-CoA가 시상하부 뉴런의 연료 상태의 신호를 전달할 수 있다는 예상을 지지한다.

비만 관련 질병이 점차적으로 증가하고 있으므로, 지방 균형의 제어에 대한 메카니즘은 더욱 중요한 건강 문제로 대두되고 있다. 이와 함께, 본 발명의 연구는 섭식 제어에 있어서 FAS가 하는 역할의 증거를 제공한다. FAS의 상이한 2가지 억제제, 즉 C-75와 세룰레닌에 의해 입증된 바와 같이, 이 효소는 식욕과 체중의 제어에 대한 강력한 치료 표적이다.

체중 감량제

본 발명에 따른 체중 감량제는 신경펩티드 Y의 발현 및/또는 분비를 방해하고, 섭식 활동을 차단 또는 감소시키는 작용제이다. 작용제를 동물에게 투여하고 처리된 동물의 뇌에서 NPY 농도를 측정함으로써(예, 마우스 뇌에 대해 실시예 2에 기술), 또는 시상하부 배양물에서 NPY 발현을 측정함으로써(예컨대, Loudes 등(1999), "Distinct populations of hypothalamic dopaminergic neurons exhibit differential responses to brain-derived neurotrophic factor(BNDF) and neurotrophin-2(NT3)". European Journal of Neuroscience, 11:617-624; Loudes 등(2000), "Brain-derived neurotrophic factor but not neurotrophin-3 enhances differentiation of somatostatin neurons in hypothalamic cultures", Neuroendocrinology, 72(3):144-53, 본원에서 참고로 인용함) NPY 발현을 감소시키는 능력에 대해 후보 작용제를 테스트할 수 있다. 대안의, 또는 보충 테스트로서, 체중 감량제를 테스트 동물의 대뇌실내에 주사하고, 테스트 동물의 섭식 행동을 모니터링할 수 있다(실시예 2 참조). 본 발명의 바람직한 체중 감량제는 섭식 행동을억제하는 것으로 예상된다.

FAS 억제제는 본 발명에 따른 체중 감량제로서 바람직하다. 보다 바람직한 것은 신경펩티드 Y의 발현 및/또는 분비의 감소를 유도하는 FAS 억제제이다. 치료 화합물은 적어도 유사한 농도에서 다른 세포 활성에는 임의의 유의적인(직접적인) 영향을 주지 않으면서 FAS 활성을 억제하고/하거나 말로닐 CoA의 농도를 증가시키는 화합물이 바람직하다. 말로닐 CoA를 증가시키기에 적절한 화합물로는 미국 특허 출원 제60/164,749호, 제60/164,765호 및 제60/164,768호(본원에서 참고로 인용함)에 개시된 것들을 입수할 수 있다. 특히 바람직한 치료 화합물은 적어도 유사한 농도에서 다른 세포 활성에는 임의의 유의적인(직접적인) 영향을 주지 않으면서 동물 세포에서 FAS 활성을 직접적으로 감소시키는 화합물이다. 전술한 바와 같이, FAS 활성을 감소시키는 화합물은 일반적으로 말로닐 CoA의 농도를 증가시키는 경향이 있다.

FAS 억제제

다양한 화합물들이 지방산 신타제(FAS)를 억제하는 것으로 밝혀졌으며, 본 발명에 사용하기에 적절한 FAS 억제제의 선택은 당업자의 기술 범위에 속하는 것이다. FAS를 억제하는 화합물은, 정제된 효소를 이용하여 지방산 신타제 활성을 억제하는 화합물을 능력을 테스트함으로써 동정할 수 있다. 지방산 신타제 활성은 NADPH의 산화를 기초로 하여 분광학적으로, 또는 방사능표지된 아세틸- 또는 말로닐-CoA의 혼입을 측정함으로써 방사능을 사용하여 측정할 수 있다(Dils 등, Methods Enzymol., 35:74-83). FAS 억제제는 미국 특허 제5,759,837호에 예시되어있으며, 바람직한 FAS 억제제, 즉 α-메틸렌-β-카르복시-γ-부티로락톤의 합성 방법은 미국 특허 제5,981,575호에 기재되어 있고, 상기 두 문헌은 본 명세서에서 참고로 인용한다.

적절한 FAS 억제제는 미국 특허 제5,981,575호의 실시예 7과, 미국 특허 제5,759,837호(둘다 본원에서 참고로 인용함)에 예시된 간단한 테스트에 의해 동정할 수 있다. 일반적으로, 이 테스트는 FAS 억제제, 통상 세룰레닌이 세포독성을 나타내는 종양 세포주를 이용한다. 이러한 세포주에는 SKBR-3, ZR-75-1, 그리고 바람직하게는 HL60을 포함된다. 적절한 FAS 억제제는 이러한 세포주의 성장을 억제하게 되지만, 세포는 FAS 효소의 생성물(지방산)의 외부 공급에 의해 구조된다. 외인성 지방산(예, 팔미테이트 또는 올레이트)의 존재 또는 부재하에 세포 성장을 측정할 경우, 특수한 FAS 억제제에 의한 억제는 지방산에 의해 경감된다.

다른 방법으로는, 적절한 FAS 억제제는 높은 치료 지수에 의해 특징을 규명할 수 있다. 억제제는 세포 배양물에서 지방산 합성을 50%까지 억제시키는 데 요구되는 농도(IC₅₀또는 ID₅₀)에 의해 특징화될 수 있다. 높은 치료 지수를 갖는 FAS 억제제는 외인성 지방산의 존재하의 세포 성장의 억제제 대한 IC₅₀보다 더 낮은 농도(IC₅₀으로 측정시)에서 지방산 합성을 억제한다. 이들 두가지 세포 작용에 대한 영향이 더 큰 차이를 보이는 억제제가 보다 바람직하다. 지방산 합성의 바람직한 억제제는 지방산 합성 활성에 대한 IC₅₀이 외인성 지방산의 존재하의 세포 성장에대해 측정한 억제제의 IC₅₀보다 적어도 1 로그 낮은, 보다 바람직하게는 적어도 2 로그 낮은, 보다 더 바람직하게는 적어도 3 로그 낮은 것이다.

요법

본 발명에 따른 사람 요법은 세포내 지방 저장의 감소와 지방세포 질량의 감소를 유도한다. 이는 하기 표에 열거된 1차적 및/또는 2차적 효과를 보유하는 것으로 예측할 수 있다. 본 발명에 따른 화합물을 이용한 요법은 간 지방의 감소를 유도하고, 이는 알콜중독자의 경변 속도 또는 발생률을 감소시킬 수 있다(참조 문헌의 예, French, 1989, Clinical Biochemistry, 22:41-9; Clements 등, 1995, Am. J. Respir. Crit. Care Med., 151:780-784, 본원에서 참고로 인용함). 유사하게, 지방간을 지닌 사람(예, II형 당뇨병 환자 또는 비만인 사람)은 본 발명의 작용제의 투여를 통해 간 지방이 감소(이는 간 생검에 의해 검출될 수 있음)되는 이익을 얻을 수 있다. 증가된 인슐린 반응성은 감소된 지방세포 질량의 직접적인 결과이다. 감소된 지방세포 질량은 동맥 혈관 질환, 발작 등의 위험을 감소시킨다. 증가된 저밀도 지단백질(LDL)을 갖는 환자에서, 이러한 방법은 LDL 농도를 낮추는 데 이용될 수 있다. 따라서, 본 발명의 방법은 특히 과체중인 사람, 당뇨병 환자 및 알코올 중독증 환자에게 적용가능하다. 이 방법은 비만과 이의 합병증을 치료하기 위한 프로그램의 일부로서 대체적으로 유용하다. 예를 들어, 비만인 사람은 골관절염에 걸리기 쉽고, 본 발명의 방법은 이 질환의 영향을 감소시키거나, 또는 개시를 지연시킬 수 있다.

감소된 세포내 지방 저장과 지방세포 질량의 감소의 효과

근육 손실이 없는 체중 감량

간 지방의 감소

인슐린 반응성 증가(특히, II형 당뇨병에서)

혈압 감소

동맥 혈관 질환 감소

내독소 매개 간 손상을 비롯한 지방 변화와 관련된 간 손상에 대한 감수성 감소

체중 감량을 유도하기 위한 본 발명의 방법은 척추동물, 특히 포유동물을 비롯하여 동물에게 적용가능하다. 특히 적절한 동물로는 가금류, 돼지, 소, 양과 같은 식용 동물, 그리고 근육 질량의 감소없이 지방 축적을 감소시키는 것이 동물의 건강이나 경제적 이유로 바람직 할 수 있는 기타 동물을 들 수 있다. 유사하게, FAS 억제제와 같은 본 발명에 따른 치료 화합물은, 수의학적인 건강상의 이유로, 특히 본 발명의 의학적 치료 용도에 대해 본 명세서에서 제시한 이유와 유사한 이유로, 개, 고양이, 말 및 기타 동물들에게 본 발명의 방법에 따라 투여될 수 있다. 이러한 방법에 따라 화합물을 투여하기 위한 프로토콜은 의약 절차, 본원에서 제공하는 시험관내 및 생체내 데이타로부터, 표준 수의학적 약리 원리의 관점에서 다양한 동물에게 적용될 수 있다. 일반적으로, 이러한 방법은 수유 동물에게는 적용되지 않는다.

본 발명에 따른 치료는 본 발명에 따른 화합물(예, α-메틸렌-β-카르복시- γ-부틸로락톤과 같은 FAS 억제제)을 치료 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 본 발명의 화합물 중 임의의 것을 함유하는 약학 조성물은 약물과 질병의 선택에 따라 필요한 대로 비경구(피하, 근육내, 정맥내, 복강내, 늑막내, 소낭내, 또는포막내), 국소, 경구, 직장, 또는 비측 경로로 투여될 수 있다.

본 발명에 따른 치료 화합물은 화합물과 약학적 허용 담체를 함유하는 약학 조성물로 제제화되는 것이 바람직하다. 치료 화합물은 리포좀으로, 또는 에어로졸 형태의 투여에 적합하게 제제화될 수 있다. 약학적 허용 담체내의 활성 물질의 농도는 용해도에 따라 달라진다. 특정 조성물 또는 용도에 사용되는 투여량은 특정 유형의 질환의 요구사항 및 담체 물질의 특성과 용량에 의해 부과되는 제약에 따라 결정된다. 약학 조성물은 다른 성분이 치료가 무효가 될 정도로 본 발명에 따른 화합물의 유효성을 감소시키지 않는다면 다른 성분들도 포함할 수 있다. 약학적 허용 담체는 잘 알려져 있으며, 제약 업계의 기술자들는 특정 투여 경로에 적합한 담체를 쉽게 선택할 수 있다(예컨대, 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, 1985] 참조).

투여량과 치료 기간은 약물의 치료 지수, 질병 유형, 환자 나이, 환자 체중 및 독성의 내성을 비롯한 다양한 인자에 따라 좌우된다. 투여량은 일반적으로 혈청 농도가 약 1 ng ∼ 약 100 ㎍/㎖, 바람직하게는 10 ng/㎖ ∼ 약 10 ㎍/㎖가 되도록 선택된다. 바람직하게, 초기 투여량 농도는 시험관내 모델, 예컨대 치료 지수를 결정하는 데 사용되는 모델과, 생체내 모델과 임상 실험에서 효과적인 것으로 나타난 주변 농도에서 최대 허용량 이하를 달성하는 이들의 능력을 기초로 하여 선택된다. 통상적인 투여량은 약 혈중 100 ng/㎖이다. 표준 임상 절차는 화학요법이 개개의 환자에 맞게 조정될 수 있고, 치료제의 전신 농도가 정기적으로 모니터링될 수 있는 것을 선호한다. 특정 환자에 대한 특정 약물의 투여량과 치료 기간은 표준 약학적 방법을 이용하여 상기한 요인들을 고려하여 숙련된 임상의에 의해 결정될 수 있다. 치료에 대한 반응은 본 발명에 따른 화합물의 혈액 분석 또는 체액 농도의 분석, 해당 조직 내의 화합물 또는 그 농도로 환자의 질병 상태를 모니터링할 수 있다면 활성의 측정에 의해 모니터링할 수 있다. 숙련된 임상의는 이러한 측정에 의해 나타나는 치료에 대한 반응을 기초로 하여 투여량과 치료 기간을 조정할 수 있을 것이다,

본 발명의 치료 화합물, 예컨대 FAS 억제제는 신경펩티드 Y의 분비를 제어하는 데 필요한 농도를 기초로 투여되는 것이 바람직하다. 특히, 당업자라면 피험체의 NPY 농도가 정상 섭식 후의 농도로, 또는 그 이하로 유지되도록 FAS 억제제를 투여하는 것이 바람직하다. 유효 NPY 농도를 섭식 후에 관찰되는 농도로, 또는 그 이하로 유지하면 섭식 행동을 억제하게 되고, 이는 체중 감량과 지방 조직 질량의 감소를 유도하게 된다.

전술한 조성물은 또 다른 치료 성분과 배합되거나, 함께 또는 공동으로 사용될 수 있다. 지방산 합성의 억제제, 또는 억제제의 공동작용적 배합은 물론 치료 대상 동물에 대한 치사량 이하의 농도(투여량과 치료 기간을 기초로 함)로 투여되어야 한다. 투여는 주요 기관을 비가역적으로 손상시키지 않는 농도로 투여되거나, 또는 간 기능, 신장 기능, 심폐 기능, 위장관 기능, 비뇨생식기 기능, 피부 기능, 근골격 기능, 또는 신경 기능을 영구적으로 감소시키는 않는 농도로 투여되는 것이 바람직하다. 다른 한편으로, 차후에 재생되는 일부 세포(예, 자궁내막 세포)를 사멸시키는 농도의 억제제의 투여가 반드시 배제되어야 하는 것은 아니다.

본 발명은 신경펩티드 Y를 체중 조절에 관여하는 경로의 주요 성분으로서 동정한 것 외에도, 그 발현이 체중 감량 조절과 관련이 있는 기타 유전자를 동정하기 위한 스크리닝 방법을 제공한다. 이러한 스크리닝은 체중 감량제로 처리된 동물의 조직에서 발현된 mRNA 종을 대조군 동물의 상응하는 조직에서 발현된 mRNA 종과 비교하여 수행될 수 있다. 처리된 동물의 선택된 조직으로부터 얻은 총 mRNA를 입수하는 절차는 외인성 NPY로 처리한 마우스에 대해 실시예 2에 기재되어 있다. 당업자라면 처리하에 발현된 mRNA와 대조군 상태에서 발현된 mRNA를 입수하고 비교하는 다른 적절한 절차를, 예컨대 사람 게놈 프로젝트로부터 알려진 기법을 적용함으로써 쉽게 제공할 수 있다. 또한, 감법 억제(subtraction supression) 하이브리드화, 마이크로어레이, 또는 칩 기술을 차별적으로 발현되는 mRNA에 대해 스크리닝하는 데 사용할 수 있다(역시 Lockhart, 등(2000), "Genomics, gene expression and DNA arrays", Nature 405:827-836, 본원에서 참고로 인용함). 이 방법의 바람직한 구체예에서, 발현된 mRNA는 대조군 및 처리군의 시상하부 조직에서 발현된 mRNA이다. 치환된 α-메틸렌-β-카르복실-γ-부티롤락톤인 체중 감량제, 예컨대 C-75는 이 방법에 따른 비교를 위해 동물을 처리하는 데 바람직한 물질이다. 처리된 동물과 대조군 동물간의 mRNA 발현을 비교함으로써, 그 발현이 체중 감량제에 의해 상향조절되거나 하향조절되는 유전자와 관련이 있는 mRNA 종을 동정할 수 있다.

본 발명의 보다 완전한 이해를 돕기 위해, 여러 실시예를 후술한다. 그러나, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 개시된 특정 구체예에 한정되지 않으며, 이들 실시예는 단지 예시를 목적으로 한 것이다.

실시예 1: FAS 및 지방산 합성의 억제제

도 1.1(패널 A)는 C-75 및 세룰레닌의 화학 구조를 도시한 것이다. 이들 화합물의 억제 효과는 BALB/c 마우스에서 입증되었다.

암컷 BALB/c 마우스를 200 ㎕ RPMI 중의 C-75 0.6 mg, 또는 부형제 대조군 으로 IP 주사로 처리하였다(군당 3마리). 3시간 후, 동물들을 죽이고, 약 5 mg의 지방 조직을 [U-¹⁴C]-아세테이트로 표지하고, 지질을 추출하고, 카운팅하였다(A. Rashid 등, Am. J. Pathol. 150(1997)]. 결과는 도 1.1(패널 B)에 도시되어 있다. C-75는 부형제 대조군에 비해 지방조직의 지방산 합성을 현저히 억제하였다. 값은 평균 +/- SEM(*P<0.05)을 나타낸다.

수컷 BALB/c 마우스(군당 4마리)에게 위관영양법으로 2 g/kg의 텍스트로스를 투여하였다. 15분 후 마우스에게 20 mg/kg C-75 또는 RPMI 부형제를 복강 주사하였다. 처리한지 1시간 후, 간을 신속하게 제거하여 동결시키고 액체 질소에서 분쇄하였으며, HClO₄로 추출하여 말로닐-CoA에 대해 분석하였다[J.D. McGray, M.J. Stark, D.W. Foster., J. Biol. Chem. 253, 8291(1978)]. 결과는 도 1.1(패널 C)에 도시되어 있다. C-75를 복강 주사한 마우스는 지방산으로의¹⁴C-아세테이트의 혼입이 95% 감소되었고, FAS의 주요 기질인 간 말로닐-CoA의 농도가 110% 증가하였다. 패널 B 및 C에 도시된 실험은 2회 반복하였다.

실시예 1A: C-75가 마우스의 체중 및 먹이 섭취량에 미치는 효과

C-75 처리가 마우스의 섭식 행동과 체중에 미치는 효과는 신속하고 급격하였다. 1회 처리는 24시간 내에 총 체중의 20%를 감소시켰다(도 1.2A). 이러한 체중 감소는 용량 의존적 방식으로 나타났으며, 용량이 증가하는 기간 동안 지속되었다. 모든 경우에 있어서, 처리된 동물들은 약물의 효과가 사라진 후 감량된 체중을 회복하였으며, 이는 지속적인 소모의 유도와 상반되는 것이다. 마우스는 이러한 처리에 대해 내성이 있었으며, 유일한 분명한 효과는 과다한 체중의 감소였다. 처리된 마우스로부터 얻은 조직의 조직학적 분석 결과, 불리한 병변의 징후는 나타내지 않았음이 밝혀졌다(도시하지 않음).

체중이 19∼22 g인 수컷 BALB/c 마우스의 체중을 달고, 1회의 복강내(I.P.) 주사로 처리하여, 대사성 케이지에서 사육하였다. 체중(도 1.2A) 및 먹이 섭취량(도 1.2B)은 24시간 간격으로 모니터링하였다. 도 1.2A는 7.5(Δ), 15(o) 또는 30(□) mg/kg의 C-75 또는 RPMI 부형제()를 처리한 마우스에서 초기 체중에서부터의 평균 변화를 +/- SEM으로 표현하여 도시한 것이다. 도 1.2B는 RPMI 부형제(검은 막대) 또는 15 mg/kg C-75(회색 막대)로 처리된 마우스에 대한 처리 후 매일마다 총 먹이 섭취량을 도시한 것이다.

지방산 합성의 억제제는 신규 지방산 합성의 억제로 인해 트리글리세리드 축적을 막고, 이러한 방식으로 체중에 영향을 주는 것으로 생각된다. 실제로, C-75는 세포 배양물에서 3T3-L1 지방세포에 의한 세포질 트리글리세리드 축적을 현저히 감소시킨다(도시하지 않음). 그러나, C-75에 의해 유도된 급격한 체중 감소는 지방산/트리글리세리드 생합성의 차단에 의해 일어나는 것이 아닐 수 있다. 오히려, C-75 처리에 대한 반응으로 관찰되는 체중 감소의 주 원인은 섭식을 억제한 것에 있다. 지방 질량의 감소는 절식에서 관찰되는 일반적인 현상인 체중의 감소와 동반되었다. 체중 1 kg당 15 mg의 투여는 처음 24시간에 걸쳐 먹이 섭취량을 90% 이상 감소시켰다(도 1.2B). 그 후 약물 효과가 사라짐에 따라 48∼72시간에 걸쳐 섭식 행동은 점차 정상으로 회복되었다. C-75에 의해 유도된 체중 감소에서 섭식 억제의 역할은, 약물 처리된 동물들의 강제 섭식이 관찰된 체중 감소를 거의 회복시켰던 연구에 의해 검증되었다.

섭식 억제와 함께, 오줌의 배설량이 유사하게 줄어든 것으로 알 수 있듯이 물의 섭취도 다소 감소되었다(도시하지 않음). 물의 섭취가 직접적으로 억제되었다기보다, 이는 식이를 통한 염과 기타 용질의 섭취가 감소된 것에 기인하는 삼투압 균형의 변화와 함께 일어나는 것이다. 그러나, 관찰된 체중 감소의 일정 부분은 물에 의한 것일 가능성도 존재한다.

실시예 2: 섭식 및 절식 상태에서의 C-75에 의한 섭식의 조절: NPY의 역할

체중 감소가 전적으로 섭식의 억제에 의한 것인지를 확인하기 위해, 섭식을 완전히 억제하는 C-75의 투여량으로 처리한 것과 절식을 비교하였다. 절식 및 C-75 모두 대조군에 비해 현저한 체중 감소를 유도하였다. 그러나, 다수의 실험에서, C-75 처리 마우스는 절식된 동물들에 비해 더 많은 체중이 감소되었다(도 2A). 절식에 대한 정상적인 반응은 에너지 저장소의 고갈을 제한하기 위해 에너지 이용률을 감소시키는 것이다(Loftus, 1999), C-75 처리가 "지각된 섭식 상태"를 유도한다면, 정상적인 대사율의 유지는 물론, 섭식의 억제를 가능하게 할 수 있다.

19∼21 g의 수컷 BALB/c 마우스의 체중을 미리 측정하고, 부형제 또는 30 mg/kg C-75를 처리한 후, 자유롭게 식이하게 하거나, 또는 먹이에 대한 접근을 완전 봉쇄하였다(절식). 24시간 후, 마우스의 체중을 측정하였다. 초기 체중의 변화는, 평균 +/-SEM(n=7)으로 나타내어 도 2A에 도시하였다. C-75 처리 마우스는 절식 동물에 비해 45% 더 체중이 감소되었다.

체중의 제어는, 비만도와 섭식 상태를 모니터링하고 섭식과 에너지 이용률을 조절하는 공조성 신경펩티드군에 의해 시상하부에서 통합된다. 이 과정에서 중심적인 조절자는 신경펩티드 Y(NPY)다(Loftus, 1999, Sem. Cell. Dev. Biol., 19:11). 궁형 핵에서, NPY의 농도는 절식 상태에서 증가하여(Schwartz 등, 1998, Endocrinology, 139:2629), 섭식의 강력한 자극제로서 작용한다(O'Shea 등, 1998, Endocrinology, 138:196-202). C-75가 시상하부에서의 NPY 조절을 변화시킬 수 있는지를 확인하기 위해, 도 2A에 도시된 바와 같이 섭식, 절식 및 C-75-처리 마우스로부터 현미해부한 시상하부 조직으로 노던 블롯 분석을 실시하여 NPY 발현을 관찰하였다.

도 2A에 도시된 마우스의 뇌로부터 시상하부 영역을 현미해부하여 총 RNA를 분리하였다. NPY 및 S26(로딩 대조군)에 대해 랜덤 프라이밍 프로브를 사용하여 RNA로 노던 블롯 분석을 실시하였다(Feinberg 등, 1983, Anal. Biochem., 132:6). 총 RNA를 얻기 위한 조직의 추출은 P. Chomczynski 및 N. Sacchi의 문헌[Anal. Biochem. 162, 156(1987)]에 기재된 대로 실시하였다. T. Brown, K. Mackey의 문헌[Current Protocols in Molecular Biology, F. Ausubel 등, Eds.(John Wileyand Sons, New York, 1997), pp. 4.9.1-4.9.16]에 기재된 바와 같이 총 RNA 15 ㎍으로 노던 블롯 분석을 실시하였다. 예상한 바와 같이, 절식은 NPY mRNA 발현을 현저히 상승조절하였다(도 2B). 그러나, C-75 처리된 마우스에서의 시상하부 NPY mRNA의 농도는, 이들이 먹지 못하였고 절식 상태를 나타내었음에도 불구하고 섭식 대조군의 것에 비해 더 낮았다. 이는 C-75가 적어도 부분적으로는 프로파직 NPY 신호를 차단함으로써 섭식을 억제한다는 것을 암시한다.

이러한 발견을 검증하기 위해, NPY가 C-75에 의해 유도된 섭식의 억제를 역행시키는 능력을 조사하였다. 마우스에게 30 mg/kg의 C-57을 복강 주사하여 사전처리하였다. 4시간 후, 마우스에게 메토판을 흡입시켜서 마취시키고, 500 ng NPY(총 부피 2.5 ㎕) 또는 인공 CSF 부형제를 직접 대뇌실내에 주사하였다. 마우스를 대사성 케이지에 넣고, 18시간에 걸쳐 섭식 행동을 관찰하고, 먹이 섭취량을 모니터링하였다. 그 결과는 도 2C에 도시되어 있다. C-75/NPY 처리된 마우스에 의한 1시간 내의 총 먹이 섭취량은 NPY를 단독으로 처리한 마우스와 유사하였고, C-75 처리 마우스보다는 9배 많았다.

부형제 또는 C-75로 사전처리된 마우스에게 NPY 500 ng을 대뇌실내(ICV) 주사하자 갑자기 폭식이 유도된 반면, 부형제의 ICV 주사는 섭식에 영향을 주지 않았다. 이러한 NPY의 투여에 의한 섭식 효과는 1시간 내에 완전히 사라졌지만, C-75 처리 마우스에서 총 먹이 섭취량을 현저히 증가시키기에는 충분하였다(도 2C). 이러한 결과는 노던 블롯 분석으로부터 예상되는 바와 같이 NPY의 섭식 제어 경로 하류가 C-75 처리 마우스에서는 온전하고, C-75는 NPY 분비의 상류에 작용한다는 것을 확인해준다.

C-75가 섭식에 미치는 효과는, 상향조절된 NPY 농도를 나타내고 폭식을 하는 절식된 마우스로도 조사하였다. 마우스를 24시간 동안 절식시켜서 폭식을 유도하였다. 실험전(naive) 마우스(처리전)에서 초기 섭식 간격[먹이 제공과 섭식 개시 사이의 시간(초)]을 측정하였다. 그 후 마우스에게 30 mg/kg의 C-75 또는 RPMI 부형제를 I.P. 주사로 처리하고, 주사 후 20분, 40분 및 60분에 섭식 간격을 측정하였다. 그 결과는 도 2D에 도시되어 있다. 섭식이 1000초(실험적 컷오프) 내에 개시될 경우 관찰을 종결하였다. 시간은 평균 +/- SEM(n=4)을 나타낸다.

처리 전에, 모든 동물은 먹이를 제공하지 3분 내로 게걸스럽게 먹기 시작하였다. 그러나, C-75 처리의 20분 내에, 마우스는 섭식에 대한 모든 흥미를 상실한 반면, 부형제 처리된 마우스는 먹이 제공 3분 내에 먹이를 먹기 시작하였다(도 2D). 이들 동물들에서는 이미 NPY mRNA 농도가 상향조절되었다는 사실은 C-75가 NPY 분비 또는 섭식 행동의 다른 조절자에 대한 또 다른 작용을 지녀야 한다는 것을 암시한다.

실시예 3: C-75 작용의 렙틴 비의존성 및 ob / ob 마우스의 처리

섭식 제어에 있어서 NPY 기능을 조절하는 주요 신호 중 하나는 렙틴이다. 이 호르몬은 C-75 처리에서 관찰되는 것과 유사한 방식으로 섭식 상태에서 증가하고 NPY 생산 및 섭식을 억제한다(Schwarz 등, 1996, Diabetes, 45:531). 렙틴은 그 주요 생산 장소인 백색 지방 조직이고(Zhang 등, 1994, Nature, 372:425), 고농도의 FAS를 발현한다는 점에서 매력적인 후보물질이다. NPY의 신호 매개 C-75 조절로서의 렙틴의 분비 증가를 테스트하기 위해, 혈청 레틴 농도를 섭식(명 사이클의 종반부), 절식 및 C-75 처리 마우스에서 평가하였다. RPMI 부형제(o) 또는 30 mg/kg C-75(■)를 복강 주사하여 처리하고 자유롭게 식이하게 한 BALB/c 마우스, 또는 24시간 동안 절식시킨() 마우스의 체중을 측정하고, 참수시켜서, 방혈하였다. 혈청 렙틴 농도는 쿠안티킨 쥐 렙틴 ELISA(R&D 시스템즈)를 사용하여 측정하고, 총 체중에 대해 플로팅하였다(도 3A). 렙틴 농도의 증가보다는 감소가 관찰되었다. 이러한 감소는 C-75의 처리에 의한 체중의 감소, 아마도 체지방의 감소와 상관성이 있다(도 3A). 이는 체중 감소 중의 렙틴 농도의 정상적 조절과 일관성이 있으며(Boden 등, 1996, J. Clin. Endocrinol. Metab., 81:3419), 렙틴은 C-75 신호를 매개하지 않는다는 것을 나타낸다. 같은 동물로부터 얻은 백색 지방 조직에서의 렙틴 mRNA의 농도의 노던 블롯 분석(전술한 바와 같이 실시)은 이러한 관찰을 지지한다(데이타는 도시하지 않음).

렙틴 비의존적 메카니즘은 C-75가 기능적인 렙틴을 발현하지 않는ob/ob마우스의 비만도를 감소시키는 데 효과적이어야 한다는 것을 제시하였다(Schwartz 등, 1996). 이는 2주간의 처리 과정이 C-75 처리 동물에서는 체중의 현저한 감소를 초래한 반면, 부형제 처리 마우스는 체중을 유지하였다는 사실로 확인되었다(도 3B). 수컷ob/ob마우스(C57BL/6OlaHsd-Lep^ob, 할란)에게 RPMI 부형제(o) 또는 22 mg/kg C-75()를 복강 주사로 처리하고, 매 3일마다 체중 변화를 모니터링하여 평균 +/- SEM으로 나타내었다. 이러한 효과의 크기는 대표적인 C-75 처리ob/ob마우스 및 대조군 처리ob/ob마우스를 조사하면 쉽게 확인된다(도 3C 참조, 이는 처리 종반부(14일)에 도 3B로부터의 대표적인 부형제 및 C-75 처리된 마우스를 나타낸다).

C-75 처리는 체중 감소를 초래하였음은 물론,ob/ob마우스의 극심한 비만도로부터 야기되는 병리적인 결과의 상당부분을 교정하였다. 부형제 및 C-75 처리된 마우스(도 3B로부터)로부터 얻은 간 표본을 포르말린에 고정시키고 파라핀 포매하였다. 조직 절편(4 ㎛)을 헤마톡실린과 에오신으로 염색하였다. C-75 처리 마우스로부터 얻은 간의 조직학적 검사 결과, 대조군ob/ob마우스에서 관찰되는 간비대와 지방간이 현저히 감소되었음이 확인되었다(도 3D, 크기 막대 = 50 ㎛). 백색 지방 조직의 분석은 평균 지방세포 크기가 급격히 감소되었음을 입증하였다(도시하지 않음). 지방산 합성의 주요 조직에서 조차도 동물들의 만성 치료로부터 야기되는 조직학적 이상이 관찰되지 않았다. C-75가 렙틴 비의존적 메카니즘을 통해 작용한다는 관찰은 렙틴 효과에 비교적 저항성인 것으로 생각되는 대부분의 비만인 사람들에게 특히 희망적인 것이다(Caro 등, 1996, Lancer, 348:159).

실시예 4: C-75 처리는 ob / ob 마우스에서 고혈당을 교정한다.

ob/ob마우스는 비만 외에도, 혈당의 심각한 증가와 관련된 당뇨병을 진행시킨다. C-75는 부형제 처리 마우스에서 관찰되는 고혈당증을, 평균 혈청 포도당 농도를 거의 3배 감소시켜서 교정하였다(도 4A). 수컷ob/ob마우스(n=3)에 C-75 또는 부형제를 2주간 처리하고(도 3B 및 C), 같은 나이의 미처리 C57BL/6j 마우스(+/+)와 비교하였다. 야생형 마우스의 24시간 IP 처리는 절식으로 인한 것이상으로 혈청 포도당에 영향을 주지 않았다. 체중이 상당히 감소된ob/ob마우스에게서 혈중 포도당의 표준화가 유발되었는데, 이는 C-75로 정상 마우스를 급격히 처리한 것이 섭식의 억제로부터 유발되는 것 외에는 혈청에 영향을 주지 않았기 때문이다(도 4B). 수컷 BALB/c 마우스(n=7)를 24시간 동안 절식시키거나, 또는 30 mg/kg C-75 또는 RPMI 부형제를 복강 주사하고 24시간 동안 자유롭게 식이하게 하였다. 두 경우 모두, 동물을 희생시키고 혈청을 수집하여 포도당 분석을 실시하였다: Ref Lab^TMGLU(캘리포니아주 카말릴로에 소재하는 메디칼 어낼러시스 시스템즈, 인코포레이티드). 이들 데이타는 비만인 사람의 75% 이상이 렙틴 효과에 대해 내성이 있기 때문에, C-75의 렙틴 비의존성의 중요성을 강조한다. 두 패널은 2 실험의 대표이다.

실시예 5: 말로닐 CoA에 의한 섭식의 조절

도 5A는 말로닐-CoA를 매개로 한 FAS의 억제제에 의한 섭식 조절의 모델을 나타낸 것이다. 이 모델은 FAS 억제제에 의한 섭식 억제가 ACC의 억제제에 의해 완화되어야 한다는 것을 예측하게 한다. 이를 테스트하기 위해, 마우스에게 ACC 억제제 TOFA 또는 부형제를 ICV 주사에 의해 사전처리하고, IP 투여한 C-75가 섭식을 억제하는 능력을 조사하였다. BALB/c 마우스를 메토판으로 마취시키고, TOFA 2 ㎍ 또는 DMSO 부형제 2 ㎍을 ICV 주사하였다. 2시간 회복 후, 마우스에게 kg당 15 mg의 C-75 또는 RPMI 부형제를 IP 주사하고, 2시간에 걸쳐 총 먹이 섭취량을 모니터링하였다. C-75 처리된 마우스에서 TOFA는 거의 먹이 섭취량을 회복하였는데(도5B), 이는 말로닐-CoA가 섭식 억제를 매개한다는 가설을 지지하는 것이다. 또한, 마우스에게 RPMI 또는 C-75를 2.5 ㎍/㎕ 또는 5 ㎍/㎕로 ICV 주사하고, 2시간(쉐이드) 및 4(솔리드)에 걸쳐 먹이 섭취량을 모니터링하였다. 중추에 투여된 TOFA의 효능은 작용의 중추신경계(CNS) 메카니즘을 나타내는 것이다. C-75의 ICV 투여는 섭식을 82%까지 억제하였고(도 5C), 이는 C-75의 중추 표적 작용을 지지하는 것이다. 도 5(B) 및 (C)는 각각에 대해 N=3인 3회의 실험(총 9)으로부터 얻은 결과를 합한 것이다.

실시예 6: 말로닐-CoA 대사의 면역조직화학적 위치화

효소 지방산 신타제, 아세틸-CoA 카르복실라제 알파 이소형 및 말로닐-CoA 데카르복실라제에 대해 특이적인 항체를 사용하는 신경 조직내의 각각의 효소의 존재를 검출하였다. 이들 항체를 사용하여 면역조직화학적 표준 검출 방법에 의해 측정시, 지방산 신타제, 아세틸-CoA 카르복실라제 알파 이소형 및 말로닐-CoA 데카르복실라제는 모두 마우스의 시상하부의 궁형 핵에 공존하였다. 궁형 핵은 시상하부의 식욕 제어에 있어서 중요하다.

분명한 이해를 목적으로, 구체예와 더불어 예시와 실시예에 의해 본 발명을 어느 정도 상세히 설명하였지만, 다른 측면, 이점 및 변형은 당업자에게 명백할 것이다. 전술한 설명과 실시예는 예시를 목적으로 한 것으로, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 임상 의학, 생리학, 약리학 및/또는 관련 분야의 기술자가 숙지하고 있는 본 발명을 수행하기 위한 전술한 방식들의 변형은 본 발명의 범위에 속하는 것이며, 이는 첨부하는 청구범위에 의해서만 한정된다.

본 명세서에서 언급한 모든 공보 및 특허 출원은 당업자의 기술 수준을 나타낸 것이다. 모든 공보 및 특허 출원은 각각의 개별 공보 또는 특허 출원이 구체적이고 개별적으로 참고문헌에 포함되는 것으로 표시되는 것과 같은 정도로 본 명세서에서 참고문헌으로 포함한다.

Claims

신경펩티드 Y(NPY)의 발현 및/또는 분비를 감소시키는 화합물을 동물에게 투여하는 것을 포함하는, 동물의 체중 감소를 유도하는 방법.
제1항에 있어서, 화합물의 투여가 동물에서 말로닐 CoA 농도를 증가시키는 것이 방법.
제1항에 있어서, 화합물은 지방산 신타제(FAS)의 억제제이고, NPY의 발현 및/또는 분비를 감소시키기에 충분한 양으로 투여되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 화합물은 치환된 α-메틸렌-β-카르복실-γ-부티로락톤인 것인 방법.
제1항에 있어서, 화합물은 말로닐 조효소 A 데카르복실라제(MCD)의 억제제인 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, 화합물은 NPY의 발현을 적어도 섭식 동물에게서 관찰되는 농도로 감소시키기에 충분한 양으로 투여되는 것인 방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항에 있어서, NPY의 발현 및/또는 분비는 FAS를 발현하는 세포에서 감소되는 것인 방법.
제1항에 있어서, 화합물의 투여는 동물에서 섭식 행동을 억제하는 것인 방법.
제1항에 있어서, 동물은 렙틴의 발현이 결핍되어 있거나, 또는 렙틴에 대해 내성이 있는 것인 방법.
후보 화합물을 동물 또는 시상하부 배양물에 투여하는 단계; 및

신경펩티드 Y의 발현 또는 분비를 모니터링하는 단계

를 포함하는, 체중 감량제를 동정하는 데 사용하기 위한 스크리닝 방법.
제10항에 있어서, 처리된 동물에 대해 섭식의 빈도 감소 또는 섭식의 강도 감소를 모니터링하는 것인 방법.
제10항에 있어서, 후보 화합물은 주사에 의해 동물에게 투여하는 것인 방법.
제12항에 있어서, 화합물은 복강내 또는 대뇌실내로 투여하는 것인 방법.
제10항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 후보 화합물은 효소 지방산 신타제의 억제제인 것인 방법.
체중 감량제를 동물에게 투여하는 단계; 및

체중 감량제로 처리한 동물에서 발현된 mRNA 종과 대조군 동물에서 발현된 mRNA 종을 비교하는 단계

를 포함하는, 그 발현이 체중 감소의 조절과 관련이 있는 유전자를 동정하기 위한 스크리닝 방법으로서, 차별적으로 발현되는 mRNA 종은 체중 감소의 조절과 관련이 있는 것인 방법.
제15항에 있어서, 체중 감량제는 C-75와 같은 치환된 α-메틸렌-β-카르복실-γ-부티로락톤인 것인 방법.
제15항에 있어서, 발현된 mRNA 종의 비교는 시상하부 mRNA에 한정되는 것인 방법.