KR20020096677A - 안정화된 효소 결합체 조성물 및 이를 함유하는 화장료 - Google Patents

Abstract

본 발명은 칼슘염에 흡착된 효소 및 수용성 키토산을 함유함을 특징으로 하는 안정화된 효소 결합체 조성물과 이를 함유하는 화장료에 관한 것으로서, 본 발명의 효소 결합체 조성물은 탄산칼슘, 인산칼슘, 스테아린산 칼슘 또는 조류의 난각 유래의 칼슘분말로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 난용성 또는 불용성 칼슘염 분말을 이용하여 단백질 분해효소, 전분 분해효소, 지방분해효소 또는 라이소자임으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 효소가 0.0001∼50중량%의 양으로 포집되어 있는 것을 특징으로 하며 탈 아세틸화된 키토산 또는 그 올리고머를 0.0001∼50중량%의 양으로 함유한다. 또한, 본 발명은 상기 칼슘염 키토산 효소 복합체를 조성물 총중량에 대하여 0.01∼30중량%의 양으로 함유하는 화장료에 관한 것이다.

Description

안정화된 효소 결합체 조성물 및 이를 함유하는 화장료{THE COMPOSITONS OF ENZYME COMPLEX WHICH ENHANCE ENZYME STABILITY AND THE COSMETIC PRODUCT CONTAINING THE COMPLEX}

현재 의료산업, 식품산업, 생물공학, 섬유산업 및 화장품공업 분야 등 다양한 산업 분야에서 효소를 응용하고 있으며 또한 다양한 형태의 효소를 함유한 제품이 상용화되고 있다. 그 중에서 단백질 분해 효소는 전세계적으로 가장 많은 양이 가장 다양한 용도로 이용되고 있는 효소이며, 아미노산의 결합인 펩타이드 결합을 가수분해하는 효소로서, 화장품 산업분야에서는 피부 턴오버를 쉽게 하여 각질을 효과적으로 제거함으로써 피부색이 밝아지며 잔주름을 제거하여 피부를 건강하게 한다는 장점이 있어 현재 식물 유래와 미생물 유래의 단백질 분해 효소를 직접 응용하는 화장품이 증가되고 있는 추세이다.

그러나 이러한 효소는 열, 빛, 압력 등의 물리적인 요인과 pH, 착염 형성제, 효소의 종류에 따른 다양한 형태의 저해제, 각종 금속이온 등의 화학적 요인에 의하여 쉽게 활성을 잃어버리는 성질이 있어 응용성은 크지만 상당히 불안정하여 시간의 경과에 따라 그 활성이 급격히 감소된다. 이러한 효소를 제품에 응용함에 있어서 수송, 고객에게 분배 및 재고품 보관으로 인하여, 효소를 함유한 제품이 제조되어 사용되기까지에는 보통 상당한 시간이 지체되고, 또한 제품이 폭 넓은 온도의 변화를 받을 수 있고, 활성의 감소를 격화시키는 다른 조건에 노출될 수 있으므로 유통기한이 짧고 응용에는 많은 제약이 있는 것이 현실이다.

이러한 단점을 극복하기 위해 현재 응용되고 있는 방법으로서는 효소를 식염 및 완충된 식염과 같은 용액 중에 보존하지만 이들 제품은 온도 압박을 받거나 장기간 저장될 경우 충분한 안정성을 제공하지 못한다.

또한 수분이 없는 형태로 부형제에 혼합하여 사용 직전 또는 사용시 완충액 등에 혼합하여 사용하는 방법을 사용하거나 또 다른 방법으로 효소의 물과의 접촉을 최소화하는 방법으로 유용성 성분에 효소를 분산시키는 방법이 이용되어 왔다. 하지만 이러한 방법은 사용상의 번거로움이 있으며 실재 사용시 이러한 안정화 방법으로 인해 효소의 기능이 제대로 발휘되지 못하는 경우가 많으므로 응용 가능한 분야에 제약이 따르게 된다.

따라서 효소를 수용액 상태에서 안정화시키는 방법이 요구되는데, 이러한 방법에는 대표적으로 효소를 비반응 물질 표면에 부착시키는 흡착법(adsorption)과 물질 내에 가두어 두는 포괄법(entrapment) 등이 있다. 포괄법은 다양한 효소를 고정시킬 수 있어 흡착법보다 더 많이 쓰인다. 그러나 단점으로는 효소 고정화 과정에서 열이나 화학적 처리로 인하여 효소 활성을 상실할 수 있으므로 처리 전후 활성을 유지하는지 등의 효소의 물리화학적 성질을 잘 고려하여야 한다.

키틴은 갑각류의 껍질과 조개, 오징어 골격질의 중요한 구성성분이고, 곤충이나 곰팡이, 버섯류 및 일부 세균 등의 세포벽에 다량 함유되어 있는 다당체로서 N-아세틸글루코스아민(acetylglucosamine)이 β-1,4 결합으로 연결된 염기성 호모폴리머(Homopolymer)이다.

키토산은 이러한 키틴을 탈아세틸화하여 얻어지며, IUPAC 명칭은 (1,4)2-아미노-2-데옥시-베타-D-글루코스아민{(1,4)2-amino-2-deoxy-beta-D-Glucosamine}이 다. 또한 키토산은 키틴과 같이 아미노기를 가지는 염기성 다당류로서 1970년경 폐수처리용 중금속 흡착제로 최초로 사용된 이후 의료용 재료, 식품산업, 생물공학, 섬유산업 및 화장품공업 분야 등 다방면에서 응용연구가 활발하다. 특히 키토산은 생체 적합성과 생분해성이 우수하고, 인체에 대한 독성 및 유전독성이 없는 것으로 알려져 왔고, 면역반응 등의 부작용이 적어 의료용 신소재 및 약물 전달체로서 그 전망이 매우 밝다. 또한 증점성, 우수한 보습성, 유연사상성, 피막형성성 등의 특성을 가지고 있어 화장품 원료로서 높은 기능성을 가지고 있다.

따라서 이러한 특징을 가진 키토산을 효소의 안정화에 사용할 경우 인체에 대해 안정하고 피부나 모발과의 친화성이 우수하며 피막형성 및 보습성 등의 부가적인 기능을 기대할 수 있다.

그러나 이러한 키토산은 일반적으로 물이나 알코올에 용해되지 않으며, 포름산, 젖산, 아스코르브산, 초산 등 유기산의 수용액, 묽은 염산과 같은 무기산에 용해되어 일반적으로 pH를 약산성 이상으로 하면 침전하게 된다.

그런데, 많은 종류의 유용성 물질과 단백질 및 효소류는 중성 또는 알칼리영역에서 높은 안정성을 나타내는 경우가 많다. 따라서 최근의 연구자들은 키토산의 중성 또는 알칼리 영역에서의 용해도를 높이기 위해 화학 수식을 가하여 용해도를 높이는 연구를 수행하여 다양한 유도체를 개발하거나, 효소 등을 사용하여 키토산의 분자량을 낮춰 용해도를 향상시킨 수용성 키토산 올리고머를 개발하였다. 그러나, 지금까지 효소의 안정화에는 기존의 키토산을 산성용액에 용해시켜 안정화 보조제로서 이용하여 왔다.

지금까지 시도된 다양한 안정화 방법과 관련한 연구 결과, 칼슘 이온 등의 2가 양이온의 일부가 함유된 효소의 조성물이 효소의 안정성에 많은 도움이 되고 있음이 밝혀지고 있다. 그러나, 탄산칼슘, 인산칼슘, 황산칼슘, 과산화칼슘과 같은 난용성 또는 불용성 염을 안정화 주기제로 사용한 예는 없었다.

본 발명의 목적은 탄산칼슘, 인산칼슘, 스테아린산 칼슘, 황산칼슘, 과산화칼슘 또는 조류의 난각 유래의 칼슘분말로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 난용성 또는 불용성 칼슘염 분말 및 탈아세틸화된 키토산 또는 그 올리고머를 이용하여 단백질 분해효소, 전분 분해효소, 또는 과산화수소 분해효소를 안정화시킨 효소 안정화 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 칼슘염 키토산 효소 복합체를 함유하는 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적 및 작용은 하기 발명의 상세한 설명으로부터 당업자에게 명백하게 드러날 것이다.

본 발명자들은 다양한 종류의 효소를 화장품에 직접 응용하기 위한 연구의 일환으로 우선 단백질 분해효소의 안정성을 향상시킬 목적으로 다양한 안정화 방법을 시도하였으며, 탄산칼슘 또는 조류의 난각 유래의 난용성 또는 불용성 칼슘 분말에 이들 효소를 흡착시킨 후 이를 수용성 키토산 올리고머를 이용하여 피막을 형성하면 종래의 문제점이 해결됨과 동시에 화장료 원료로서의 효능, 효과가 상승한다는 사실을 확인하고 본 발명을 완성하게 되었다.

더욱이 본 발명자들은 불용성 칼슘염을 효소의 안정화 기제로 사용하는 경우 효소의 안정성에 악영향을 미치는 수소이온을 약산의 형태로 전환하고 급격한 pH의 하강을 차단하여 효소를 보호할 수 있다는 것도 발견하였다.

본 발명은 중성 또는 염기성 수용액에서 난용성 또는 불용성을 나타내는 칼슘염, 효소 및 수용성 키토산을 혼합하여 생성되는 칼슘염-효소-키토산 복합체를 함유함을 특징으로 하는 안정화된 효소 결합체 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 중성 또는 염기성 수용액에서 난용성 또는 불용성을 나타내는 칼슘염으로서 탄산칼슘, 인산칼슘, 스테아린산 칼슘, 황산칼슘, 과산화칼슘 또는 조류의 난각 유래의 칼슘분말로부터 1종 또는 2종 이상의 것을 선택하였다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 효소로서 단백질 분해효소, 전분 분해효소, 지방 분해효소 또는 라이소자임으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 것으로서 조성물 전체 대비 0.0001∼50중량%인 것을 특징으로 하는 안정화된 효소 결합체 조성물에 관한 것이다.

나아가, 본 발명은 상기 안정화된 효소 결합체 조성물을 0.001∼70중량% 함유함을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 화장료 조성물이 피부 화장료 또는 두발 화장료임을 특징으로 하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 탄산칼슘, 인산칼슘, 스테아린산 칼슘, 황산칼슘, 과산화칼슘 또는 조류의 난각 유래의 칼슘분말로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 난용성 또는 불용성 칼슘염 분말을 이용한 것으로 단백질 분해효소, 전분 분해효소, 지방분해효소 또는 라이소자임으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 효소가 0.0001∼50중량%의 양으로 포집되어 있는 것을 특징으로 하며 탈아세틸화된 키토산 또는 그 올리고머를 0.0001∼50중량%의 양으로 함유함을 특징으로 하는 안정화된 효소 결합체 조성물과 이를 함유하는 화장료에 관한 것이다.

본 발명의 목적을 위해 사용되는 불용성 칼슘염은 중성 및 알칼리의 pH에서 난용성 또는 불용성을 나타내는 칼슘염은 제한 없이 사용할 수 있다.

본 발명의 칼슘염에 흡착되는 효소는 각종 단백질 분해효소, 지방분해효소 또는 라이소자임 등이 사용될 수 있으며 0.0001∼50중량%의 양을 흡착시킬 수 있다.

본 발명의 탈아세틸화된 키토산 올리고머는 탈아세틸화도가 50 내지 100%인 키토산으로 분자량은 10,000 내지 1,000,000 이면 본발명에 유효하게 사용될 수 있다.

본 발명의 효소 안정화 조성물은 세안제, 비누, 크림, 연고 등으로 제형화되어 사용될 수 있으나, 어떤 제형으로 제조하여 사용하는가는 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자에 의해 극히 용이하게 결정될 수 있는 사항이다.

또한, 본 발명의 효소안정화 조성물은 폼클렌징, 로숀, 에센스, 화장수 등의 기초 화장품에 편리하게 첨가하여 사용될 수 있다.

세안제 및 비누를 제조하는 경우에는 통상의 세안제 및 비누 베이스에 효소안정화 조성물을 함유시킬 수 있다. 그 밖에는 향료, 색소, 살균제, 산화방지제, 방부제, 보습제 등을 사용할 수 있으며, 물성개선을 목적으로, 점증제, 무기염류, 합성 고분자 물질 등을 사용할 수 있다.

크림을 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W)의 크림베이스에 효소안정화 조성물을 함유시키고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 부가하여 사용할 수 있다.

세안제, 비누 및 크림은 각각 통상적인 제조방법에 따라 용이하게 제조할 수 있으며, 액상, 크림상, 페이스트상 및 고체상 등의 어떠한 형태로든 제조될 수 있다.

본 발명의 효소 안정화 조성물의 제조방법을 상술하면 다음과 같다.

안정화시키고자 하는 효소를 효소가 최상의 안정성을 나타내는 pH 5.0 내지 9.5의 완충액에 용해한다. 이때 효소의 양은 원료 효소의 성상과 활성에 따라 적절한 양을 사용하며 특별한 제한이 없다. 그러나 바람직하게는 0.0001∼50중량%이다. 또한 완충제는 효소 안정화를 저해하지 않는 범위 내에서는 특별한 제약이 있는 것은 아니며, 적절한 완충제로는 식염용액, 붕산염 용액 및 다른 통상의 완충제(예: 인산염 및 시트르산염)와 같은 이분야에 공지된 여러 가지 수용액으로부터 선택할 수 있다. 수용액이 식염 용액인 경우에는 식염 용액 중에 0.1 내지 2%의 염화 나트륨이 함유됨이 통상적으로 바람직하다.

불용성 칼슘 분말은 마쇄기 등을 이용하여 미세하게 분쇄해 표면적을 최대한 증가시키고 준비된 효소용액에 대하여 10∼500중량% 첨가해 균일하게 분산시킨 후 저온에서 방치하여 효소용액을 불용성 칼슘분말에 충분히 흡착되도록 한다. 이때 흡착에 소요되는 시간은 조건에 따라 상이하지만, 0.5 내지 72 시간의 범위 내에 있다.

흡착된 칼슘-효소 복합체는 여과 또는 원심분리하여 흡착되지 않은 효소를 제거한 후 그냥 사용하거나, 저온 건조기 또는 동결건조기(Freezing dryer)를 이용하여 건조한다. 이때 건조에 소요되는 시간은 여러 가지 조건에 따라 상이하며 칼슘-효소 복합체를 키토산 용액에 균일하게 분산할 수 있는 정도면 된다. 예를 들면 동결 건조기를 사용하는 경우 1 내지 120시간의 범위가 바람직하다.

탈아세틸화도가 50∼100%인 키토산 또는 그 올리고머를 효소가 최상의 안정성을 나타내는 pH 5.0 내지 9.5의 완충액에 0.1 내지 10중량% 되게 용해한 후 상기와 같이 하여 얻은 칼슘-효소 복합체를 1 내지 600중량% 균일하게 분산시킨 후 저온에서 방치하여 키토산 또는 키토산 올리고머가 칼슘-효소 복합체에 충분히 피막을 형성하도록 한다. 이때 피막형성에 소요되는 시간은 조건에 따라 상이하지만, 1 내지 72 시간의 범위 내에 있다.

피막이 형성된 키토산-칼슘-효소 복합체는 잉여하는 키토산 용액을 여과 또는 원심분리하여 제거하고 사용 목적 및 용도에 따라 적절한 크기 및 형태로 성형할 필요가 있으면 성형한 후 저온 건조기 또는 동결건조기(Freezing dryer)를 이용하여 건조한다. 이때 건조에 소요되는 시간은 여러 가지 조건에 따라 상이하다. 예를 들면 동결 건조기를 사용하는 경우 1 내지 120시간의 범위 내에 있다.

이하, 본 발명을 하기 실시예 및 실험예에 의거하여 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예 및 실험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들 실시예로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

효소용액은 트립신을 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액에 용해하여 1,000unit/㎖가 되게 준비하고, 탄산칼슘은 균일하게 증류수로 2회 세척하여 불순물을 제거하고 건조시킨 후 균일하게 마쇄하여 준비한다. 탈아세틸화도가 80%인 키토산은 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액 100㎖에 3g 가열 용해하여 준비한다. 모든 실험물 및 시약을 4℃가 되게 한 후 트립신 용액 10㎖에 마쇄된 탄산칼슘 5g을 가해 균일하게 분산시킨 후 4℃에서 18시간 방치하여 효소용액을 칼슘분말에충분히 흡착되도록 하였다.

흡착된 칼슘-효소 복합체로부터 흡착되지 않은 잉여 효소액을 원심분리하여 제거하고 동결건조기(Freezing dryer)를 이용하여 충분히 건조하였다.

준비된 칼슘-효소 복합체 5g에 키토산용액 10㎖을 가하여 균일하게 분산시킨 후 4℃에서 18시간 방치하여 효소용액에 키토산이 충분히 피막을 형성하도록 하였다.

칼슘-효소-키토산 복합체로부터 반응하지 않은 잉여 키토산 용액을 원심분리하여 제거하고 동결건조기(Freezing dryer)를 이용하여 충분히 건조한 후 균일하게 마쇄하여 탄산칼슘-효소-키토산 복합체 4.5g을 수득하였다.

실시예 2

효소용액은 서브틸리신 칼스버그를 pH 8.5 트리스 아미노메탄-염산 완충액에 용해하여 1,000 unit/㎖가 되게 준비하고, 실시예 1과 같은 실험방법으로 탄산칼슘-효소-키토산 복합체 4.3g을 수득하였다.

실시예 3

효소용액은 트립신을 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액에 용해하여 1,000 unit/㎖ 가 되게 준비하고, 가농(유)에서 입수한 계란 유래 난각분말을 증류수로 2회 세척하여 불순물을 제거하고 건조시킨 후 균일하게 마쇄하여 준비한다.

실시예 1과 같은 실험방법으로 난각분말-효소-키토산 복합체 4.1g을 수득하였다.

실시예 4

효소용액은 트립신을 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액에 용해하여 1,000unit/㎖가 되게 준비하고, 인산칼슘 분말을 증류수로 2회 세척하여 불순물을 제거하고 건조시킨 후 균일하게 마쇄하여 준비한다. 실시예 1과 같은 실험방법으로 인산칼슘-효소-키토산 복합체 4.0g을 수득하였다.

실시예 5

효소용액은 α-전분분해효소(1,4-α-D-Glucan-Glucanohydrolase)를 pH 6.5 인산칼륨 완충액에 용해하여 500 unit/㎖가 되게 준비하고, 실시예 1과 같은 실험방법으로 탄산칼슘-효소-키토산 복합체 4.5g을 수득하였다.

실시예 6 및 비교예 6: 안정화된 효소조성물 함유 젤 조성물의 제조

하기 표 1에 나타낸 바와 같은 조성비로 실시예 1에서 수득한 트립신 안정화 조성물을 호모믹서기에서 교반, 강력, 탈기, 냉각시켜 조성물질을 균일하게 혼합시킴으로써 단백질 분해효소 함유 젤 조성물을 제조하였다.

원료명(중량%)	실시예 6	비교예 6
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	적량	적량
DL-판텐올	0.3	0.3
1,3-부틸렌글리콜	5.0	5.0
카르복시비닐 폴리머	0.2	0.2
세테아릴 알코올/세테아릴 글루코사이드	2.0	2.0
피이지-20/메칠글루코스세스퀴 스테아레이트	1.0	1.0
디메치콘	3.0	3.0
이소스테아릴락테이트	4.0	4.0
세탄올	3.0	3.0
트리에탄올아민	0.2	0.2
트립신안정화 조성물	0.1	-
트립신완충액 용해물	-	0.1
방부제	적량	적량
향료	적량	적량
정제수	잔량	잔량

실시예 7 및 비교예 7: 단백질 분해효소 함유 크림 조성물의 제조

하기 표 2에 나타낸 바와 같은 조성비로 실시예 1 에서 수득한 트립신 안정화 조성물과 크림 베이스의 혼합물을 호모믹서기에서 교반, 강력, 탈기, 냉각시켜 조성물질을 균일하게 혼합시킴으로써 여드름유발 억제성 크림 조성물을 조성하였다.

원료명(중량%)	실시예 7	비교예 7
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	적량	적량
DL-판텐올	0.3	0.3
베타인	4.0	4.0
폴리소스베이트 60	1.0	1.0
아라키딜 알코올/베헤닐 알코올/아라키딜 글루코사이드	1.5	1.5
스테아린산	2.0	2.0
사이크로메치콘	4.0	4.0
이소스테아릴락테이트	3.0	3.0
트리에탄올아민	0.04	0.04
폴리아크릴아미드/c13-14이소파라핀/라우레스-7	0.5	0.5
트립신안정화 조성물	0.1	-
트립신완충액 용해물	-	0.1
방부제	적량	적량
향료	적량	적량
정제수	잔량	잔량

실시예 8 및 비교예 8: 단백질분해효소 함유 유액 조성물의 제조

하기 표 3에 나타낸 바와 같은 조성비로 실시예 1에서 수득한 트립신 안정화 조성물과 유액 베이스의 혼합물을 호모믹서기에서 교반, 강력, 탈기, 냉각시켜 조성물질을 균일하게 혼합시킴으로써 단백질분해효소 함유 유액 조성물을 조성하였다.

원료명	실시예 8	비교예 8
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	적 량	적 량
소듐라우릴설페이트	10.0	10.0
라우라키드디이에이	3.0	3.0
이소스테아릴락테이트	2.0	2.0
글리세린	10.0	10.0
히드록시에칠셀룰로오스	50.0	50.0
트립신 안정화 조성물	0.1	-
트립신 완충액 용해물	-	0.1
방부제	적 량	적 량
향 료	적 량	적 량
정제수	잔 량	잔 량

실시예 9 및 비교예 9: 단백질 분해효소 함유 클렌징 젤 조성물의 제조

하기 표 4에 나타낸 바와 같은 조성비로 실시예 1에서 수득한 트립신 안정화 조성물과 클렌징 젤 베이스의 혼합물을 호모믹서기에서 교반, 강력, 탈기, 냉각시켜 조성물질을 균일하게 혼합시킴으로써 클렌징 젤 조성물을 조성하였다.

원료명	실시예 9	비교예 9
에칠렌디아민테트라초산디나트륨	적 량	적 량
소듐라우릴설페이트	10.0	10.0
라우라키드디이에이	3.0	3.0
이소스테아릴락테이트	2.0	2.0
글리세린	10.0	10.0
히드록시에칠셀룰로오스	50.0	50.0
트립신 안정화 조성물	0.1	-
트립신 완충액 용해물	-	0.1
방부제	적 량	적 량
향 료	적 량	적 량
정제수	잔 량	잔 량

비교예 1

트립신을 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액에 용해하여 1,000 unit/㎖가 되게 준비하고 소디움아자이드(Sodium azide)를 0.02% 되게 첨가, 용해하여 4℃ 에서 보관한다.

비교예 2

서브틸리신 칼스버그를 pH 8.5 트리스 아미노메탄-염산 완충액에 용해하여 1,000 unit/㎖가 되게 준비하고 소디움아자이드(Sodium azide)를 0.02% 되게 첨가, 용해하여 4℃에서 보관한다.

비교예 3

α-전분분해효소를 pH 6.5 인산칼륨 완충액에 용해하여 500 unit/㎖가 되게준비하고 소디움아자이드(Sodium azide)를 0.02% 되게 첨가, 용해하여 4℃에서 보관한다.

비교예 4

효소용액은 트립신을 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액에 용해하여 1,000 unit/㎖가 되게 준비하고 탄산칼슘은 균일하게 증류수로 2회 세척하여 불순물을 제거하고 건조시킨 후 균일하게 마쇄하여 준비한다. 모든 실험물 및 시약을 4℃가 되게 한 후 트립신 용액 10㎖에 마쇄된 탄산칼슘 5g을 가해 균일하게 분산시킨 후 4℃에서 18시간 방치하여 효소용액을 칼슘분말에 충분히 흡착되도록 하였다.

흡착된 칼슘-효소 복합체는 잉여하는 효소액을 원심분리하여 제거하고 동결건조기(Freezing dryer)를 이용하여 충분히 건조한다.

비교예 5

효소용액은 트립신을 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액에 용해하여 1,000 unit/㎖가 되게 준비하고 여기에 염화칼슘을 50mM 되게 용해하고 소디움아자이드(Sodium azide)를 0.02% 되게 첨가, 용해하여 4℃에서 보관한다.

비교예 10

효소용액은 트립신을 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액에 용해하여 2,000 unit/㎖가 되게 준비하고, 탈아세틸화도가 80%인 키토산은 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액 100㎖에 6g 가열 용해하여 준비한다. 모든 실험물 및 시약을 4℃가 되게 한 후 트립신 용액 10㎖에 키토산용액 10㎖을 가하여 균일하게 분산시킨 후 4℃에서 18시간 방치한 후 동결건조기(Freezing dryer)를 이용하여 충분히 건조한 후 균일하게 마쇄하여 효소-키토산 복합체 4.5g을 수득하였다.

시험예 1단백질 분해효소 활성 확인 실험

유제 카제인을 0.6g을 효소가 최적활성을 나타내는 완충액 100㎖에 용해시킨다.

효소용액은 완충액을 사용하여 효소활성이 10∼20 unit/㎖ 정도 되게 조제한다. 시험용액 1㎖을 정확히 취하고, 37±1℃에서 3분간 방치한 후 사전에 37±1℃로 보온하여 둔 카제인 용액 5.0 ㎖을 가하여 즉각 진탕 혼합한다.

이 용액을 37℃에서 10분간 방치한 후, 트리클로로아세트산 용액 5.0 ㎖을 가하여 즉각 진탕 혼합한다. 이 용액을 또 다시 37℃에서 30분간 방치한 후 원심분리(10min×10,000g)하여, 여액 1 ㎖을 정확히 취하고 0.55 M 무수탄산나트륨 용액 2.5 ㎖ 및 희석한 폴린(folin`s) 용액(3배 희석) 0.5 ㎖을 가하여 30±2℃에서 30분간 방치한 후, 그 액을 흡광도 측정법에 의해 660㎚에서 흡광도 A₁을 측정하였으며, 별도로 효소용액 1㎖을 정확히 취하여 트리클로로아세트산 용액 5.0 ㎖을 가하고 진탕 혼합한 다음 카제인 용액 5.0 ㎖을 가해 30±2℃에서 30분간 방치한 후, 상기 방법과 같은 방법으로 발색시킨 후 그 액을 흡광도 측정법에 의해 660㎚에서흡광도 A₂를 측정한다. 보정한 흡광도(A₁-A₂)를 구한 후 가수분해된 물질 중에 함유된 티로신과 트립토판의 양을 측정하여 단백질 분해 활성을 측정하였다. 단백질 분해활성 1 단위(unit)는 1분간 1㎍의 티로신 또는 트립토판을 생성하는 효소량으로 정의하였다.

시험예 2전분분해효소 활성확인 실험

용성 전분 1g을 효소가 최적활성을 나타내는 완충액 100㎖에 용해시킨다.

효소용액은 완충액을 사용하여 효소활성이 10∼20 unit/㎖ 정도 되게 조제한다. 효소용액 1㎖을 정확히 취하고, 37±1℃ 에서 3분간 방치한 후 사전에 37±1℃로 보온하여 둔 용성 전분액 5.0 ㎖, 맥클베인(Mcllvaine)완충액 3㎖과 0.1% 염화칼슘액 1㎖을 가하여 즉각 진탕 혼합한다.

이 용액을 37℃ 에서 30분간 방치한 후, 반응액 0.2㎖을 취하여 요오드시액 10㎖에 가하고 이 용액을 물을 대조액으로 하여 흡광도 측정법에 의해 660㎚에서 흡광도 A₁을 측정하였으며, 별도로 효소용액 1㎖을 정확히 취하여 100℃에서 30분간 가열하여 효소를 변성시킨 효소용액을 상기한 방법과 같은 방법으로 효소반응 후 발색시켜 그 액을 흡광도 측정법에 의해 660㎚에서 흡광도 A₂를 측정한다. 별도로 증류수 1㎖을 정확히 취하여 상기한 방법과 같은 방법으로 효소반응 후 발색시켜 그 액을 흡광도 측정법에 의해 660㎚에서 흡광도 A_st를 측정하고 [수학식1]에 의하여 소화시킨 전분의 양을 구하고 전분 분해활성 1 단위(unit)는 30분간 10㎎의 용성전분을 소화시키는 효소량으로 정의하였다.

시험예 3안정화된 효소조성물의 수용액 상태에서의 시간경과에 따른 효소활성의 변화

실시예 1 및 비교예 4와 비교예 10에서 수득한 안정화 조성물은 1g을 소디움아자이드 (Sodium azide)가 0.02% 되게 첨가된, pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액 20㎖에 분산하여 밀폐된 용기에 옮긴 후 37℃ 항온조에 30일간 보관하고, 비교예 1과 5에서 수득한 시료는 밀폐된 용기에 옮긴 후 37℃ 항온조에 30일간 보관하고 각각의 시료는 보관 기간에 따라 실험예 1의 방법으로 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

구분	보존온도(℃)	보존기간 별 상대활성(%)
		초기활성	1주	2주	3주	4주
실시예 1	37	100	97	91	86	83
비교예 1	37	100	8	6	2	0
비교예 4	37	100	77	61	49	28
비교예 5	37	100	83	56	45	21
비교예 10	37	100	95	51	38	17

표 5는 효소 안정화 기제로서 탄산칼슘에 트립신을 흡착시키고 수용성 키토산으로 피막을 형성시켜 제조된 안정화 조성물과 키토산 피막을 형성시키지 않은 조성물, 완충액에 트립신을 용해한 조성물 및 완충액에 트립신을 용해하고 수용성 칼슘염을 첨가한 조성물의 시간경과에 따른 효소활성 변화를 나타낸 것으로, 안정화 기제로 불용성 칼슘염과 피막형성제로 키토산을 사용한 조성물의 효소활성은 1개월 경과시에도 효소활성의 상당량을 보존하고 있었으나, 완충액에 효소를 용해한 비교예 1은 시간 경과에 따라 효소활성이 급격하게 감소되었다. 또한 불용성 키토산만을 이용한 조성물과 수용성 키토산염을 첨가한 경우도 비교예 1보다는 효소활성 감소 정도가 완만하였으나, 시간 경과에 따라 효소 활성이 많이 감소하였다.

실험예 4안정화된 효소조성물의 수용액 상태에서의 시간경과에 따른 효소활성의 변화

실시예 2에서 수득한 안정화 조성물은 1g을 소디움아자이드(Sodium azide)가 0.02% 되게 첨가된, pH 8.5 트리스 아미노메탄-염산 완충액 20㎖에 분산하여 밀폐된 용기에 옮긴 후 37℃ 항온조에 30일간 보관하고, 비교예 2에서 수득한 시료는 밀폐된 용기에 옮긴 후 37℃ 항온조에 30일간 보관하고 각각의 시료는 보관 기간에 따라 실험예 1의 방법으로 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 6에 나타내었다.

구분	보존온도(℃)	보존기간 별 상대활성(%)
		초기활성	1주	2주	3주	4주
실시예 2	37	100	95	88	86	81
비교예 2	37	100	80	50	24	10

표 6은 효소 안정화 기제로서 탄산칼슘에 서브틸리신을 흡착시키고 수용성 키토산으로 피막을 형성시켜 제조된 안정화 조성물과 완충액에 효소를 용해한 조성물의 시간경과에 따른 효소활성 변화를 나타낸 것으로, 안정화 기제로 불용성 칼슘염과 피막형성제로 키토산을 사용한 조성물의 효소활성은 1개월 경과시에도 효소활성의 상당량을 보존하고 있었으나, 완충액에 효소를 용해한 비교예 2는 시간 경과에 따라 효소활성이 급격하게 감소되었다.

실험예 5안정화된 효소조성물의 수용액 상태에서의 시간경과에 따른 효소활성의 변화

실시예 5에서 수득한 안정화 조성물은 1g을 소디움아자이드(Sodium azide)가 0.02% 되게 첨가된, pH 6.5 인산칼륨 완충액 20㎖에 분산하여 밀폐된 용기에 옮긴 후 37℃ 항온조에 30일간 보관하고, 비교예 3에서 수득한 시료는 밀폐된 용기에 옮긴 후 37℃ 항온조에 30일간 보관하고 각각의 시료는 보관 기간에 따라 실험예 2의 방법으로 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 7에 나타내었다.

구분	보존온도(℃)	보존기간 별 상대활성(%)
		초기활성	1주	2주	3주	4주
실시예 5	37	100	90	84	80	74
비교예 3	37	100	74	52	31	19

표 7은 효소 안정화 기제로서 탄산칼슘에 α-전분분해효소를 흡착시키고 수용성 키토산으로 피막을 형성시켜 제조된 안정화 조성물과 완충액에 효소를 용해한 조성물의 시간경과에 따른 효소활성 변화를 나타낸 것으로, 안정화 기제로 불용성 칼슘염과 피막형성제로 키토산을 사용한 조성물의 효소활성은 1개월 경과시에도 효소활성의 상당량을 보존하고 있었으나, 완충액에 효소를 용해한 비교예 3은 시간 경과에 따라 효소활성이 급격하게 감소되었다.

실험예 6안정화된 효소조성물의 안정화 기제별 수용액 상태에서의 시간경과에 따른 효소활성의 변화

실시예 1과 실시예 3 내지 4에서 수득한 안정화 조성물은 1g을 소디움아자이드(Sodium azide)가 0.02% 되게 첨가된, pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액 20㎖에 분산하여 밀폐된 용기에 옮긴 후 37℃ 항온조에 30일간 보관하고, 비교예 1에서 수득한 시료는 밀폐된 용기에 옮긴 후 37℃ 항온조에 30일간 보관하고 각각의 시료는 보관 기간에 따라 실험예 1의 방법으로 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.

구분	보존온도(℃)	보존기간 별 상대활성(%)
		초기활성	1주	2주	3주	4주
실시예 1	37	100	97	91	86	83
실시예 3	37	100	92	86	80	72
실시예 4	37	100	95	88	83	80
비교예 1	37	100	8	6	2	0

표 8은 효소 안정화 기제로서 탄산칼슘에 트립신을 흡착시키고 수용성 키토산으로 피막을 형성시켜 제조된 안정화 조성물과 난각 칼슘 분말에 흡착시킨 조성물, 인산칼슘을 이용한 조성물 및 완충액에 트립신만을 용해한 조성물의 시간경과에 따른 효소활성 변화를 나타낸 것으로, 완충액에 트립신 만을 용해한 조성물이 시간경과에 따라 급격한 활성의 감소를 나타낸 것과 비교할 때 불용성 칼슘염을 이용한 실시예 1, 3 과 4의 경우 1개월 경과시에도 효소활성의 상당량을 보존하고 있었다. 안정화 기제로 사용된 불용성 칼슘염의 종류에 따른 안정화 정도는 여러 가지 변수에 따라 많은 차이를 나타내겠지만 탄산칼슘이 가장 우수하였으며, 인산 칼슘, 난각칼슘의 순으로 높은 안정성을 나타내었다.

시험예 7단백질 분해효소 함유 화장료의 시간경과에 따른 효소활성의 변화

실시예 6 내지 9 및 비교예 6 내지 9에서 수득한 단백질 분해효소 함유 화장료 조성물은 밀폐된 용기에 옮긴 후 37℃ 항온조에 30일간 보관하고 각각의 시료는보관 기간에 따라 시료 1g을 pH 8.0 트리스 아미노메탄-염산 완충액 10㎖에 분산하여 실험예 1의 방법으로 활성을 측정하였다. 그 결과를 표 9, 10, 11 및 12에 나타내었다.

구분	보존온도(℃)	보존기간 별 상대활성(%)
		초기활성	1주	2주	3주	4주
실시예 6	37	100	95	88	82	78
비교예 6	37	100	36	19	8	0

표 9는 효소 안정화 기제로서 탄산칼슘에 트립신을 흡착시키고 수용성 키토산으로 피막을 형성시켜 제조된 안정화 조성물을 함유한 젤 조성물과 완충액에 용해한 트립신을 함유한 젤조성물의 시간경과에 따른 효소활성 변화를 나타낸 것으로, 안정화 기제로 불용성 칼슘염과 피막형성제로 키토산을 사용한 조성물의 효소활성은 1개월 경과시에도 효소활성의 상당량을 보존하고 있었으나, 완충액에 효소를 용해한 비교예 6은 시간 경과에 따라 효소활성이 급격하게 감소되었다.

구분	보존온도(℃)	보존기간 별 상대활성(%)
		초기활성	1주	2주	3주	4주
실시예 7	37	100	92	84	79	75
비교예 7	37	100	30	15	4	0

표 10은 트립신 안정화 조성물을 함유한 크림 조성물과 완충액에 용해한 트립신을 함유한 크림 조성물의 시간경과에 따른 효소활성 변화를 나타낸 것으로, 안정화 기제로 불용성 칼슘염과 피막형성제로 키토산을 사용한 조성물의 효소활성은 1개월 경과시에도 효소활성의 상당량을 보존하고 있었으나, 완충액에 효소를 용해한 비교예 7은 시간 경과에 따라 효소활성이 급격하게 감소되었다.

구분	보존온도(℃)	보존기간 별 상대활성(%)
		초기활성	1주	2주	3주	4주
실시예 8	37	100	89	81	72	68
비교예 8	37	100	24	11	0	0

표 11은 트립신 안정화 조성물을 함유한 유액 조성물과 완충액에 용해한 트립신을 함유한 유액 조성물의 시간경과에 따른 효소활성 변화를 나타낸 것으로, 안정화 기제로 불용성 칼슘염과 피막형성제로 키토산을 사용한 조성물의 효소활성은 1개월 경과시에도 효소활성의 상당량을 보존하고 있었으나, 완충액에 효소를 용해한 비교예 8은 시간 경과에 따라 효소활성이 급격하게 감소되었다.

구분	보존온도(℃)	보존기간 별 상대활성(%)
		초기활성	1주	2주	3주	4주
실시예 9	37	100	96	87	85	81
비교예 9	37	100	57	34	22	12

표 12는 트립신 안정화 조성물을 함유한 클렌징 젤 조성물과 완충액에 용해한 트립신을 함유한 클렌징 젤 조성물의 시간경과에 따른 효소활성 변화를 나타낸 것으로, 안정화 기제로 불용성 칼슘염과 피막형성제로 키토산을 사용한 조성물의 효소활성은 1개월 경과시에도 효소활성의 상당량을 보존하고 있었으나, 완충액에 효소를 용해한 비교예 9는 시간 경과에 따라 효소활성이 급격하게 감소되었다.

소화된 전분의 양(㎎)=(A₂-A₁)÷A_st×50×희석배수

이상에서 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 칼슘염에 흡착된 효소 및 수용성 키토산을 함유함을 특징으로 하는 안정화된 효소 결합체 조성물은 수용액 상태의 효소에 높은 안정성을 부여하여 효소의 수용액 상태에서의 장기간 보관을 가능하게 하며, 다양한 형태의 제품화 응용 가능성을 높일 수 있다. 따라서, 칼슘염에 흡착된 효소 및 수용성 키토산을 함유함을 특징으로 하는 안정화된 효소 결합체 조성물과 이를 함유하는 화장료는 효소가 지닌 원래 효과를 유효하게 나타낼 수 있다.

Claims (6)

1. 중성 또는 염기성 수용액에서 난용성 또는 불용성을 나타내는 칼슘염, 효소 및 수용성 키토산을 혼합하여 생성되는 칼슘염-효소-키토산 복합체를 함유함을 특징으로 하는 안정화된 효소 결합체 조성물
2. 제1항에 있어서, 상기 중성 또는 염기성 수용액에서 난용성 또는 불용성을 나타내는 칼슘염으로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 스테아린산 칼슘, 황산칼슘, 과산화칼슘 또는 조류의 난각 유래의 칼슘분말로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 것임을 특징으로 하는 안정화된 효소 결합체 조성물
3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 효소는 단백질 분해효소, 전분 분해효소, 지방 분해효소 또는 라이소자임으로부터 선택된 1종 또는 2종 이상의 것으로서 조성물 전체 대비 0.0001∼50중량%인 것을 특징으로 하는 안정화된 효소 결합체 조성물
4. 제1항 또는 제2항의 안정화된 효소 결합체 조성물을 함유함을 특징으로 하는 화장료 조성물
5. 제3항의 안정화된 효소 결합체 조성물을 함유함을 특징으로 하는 화장료 조성물
6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 피부 화장료 또는 두발 화장료임을 특징으로 하는 화장료 조성물